專利名稱：三聚氰胺半抗原與抗原及其制備方法與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及三聚氰胺半抗原與抗原及其制備方法與應用。
背景技術：
三聚氰胺(Melamine )，分子式C3N6H6，簡稱三胺，是一種三嗪類含氮雜環(huán)有 機化合物。三聚氰胺呈弱堿性，與鹽酸、硫酸、硝酸、乙酸、草酸等都能形成三聚 氰胺鹽。三聚氰胺是重要的氮雜環(huán)有機化工原料，在中性或微堿性情況下，與甲醛 縮合而成各種羥甲基三聚氰胺，但在微酸性環(huán)境中(pH5. 5 6. 5)與羥甲基的 衍生物進行縮聚反應而生成樹脂產物。三聚氰胺的主要用途是一種用途廣泛的基本 有機化工中間產品，最主要的用途是作為生產三聚氰胺甲醛樹脂的原料。該樹脂硬 度比脲醛樹脂高，不易燃，耐水、耐熱、耐老化、耐電弧、耐化學腐蝕，有良好的 絕緣性能、光澤度和機械強度，廣泛運用于木材、塑料、涂料、造紙、紡織、皮革、 電氣、醫(yī)藥等行業(yè)。三聚氰胺還可以作阻燃劑、減水劑、甲醛清潔劑等。
三聚氰胺目前被認為毒性輕微，大鼠口服的半數致死量大于3 g/kg體重。動 物長期攝入三聚氰胺會造成生殖、泌尿系統的損害，膀胱、腎部結石，并可進一步 誘發(fā)膀胱癌。
蛋白質主要由氨基酸組成，其含氮量一般不超過30%，而三聚氰胺分子中含氮 量為66%左右。常用的蛋白質測試方法"凱氏定氮法"是通過測出含氮量乘以6.25 來估算蛋白質含量，因此，添加三聚氰胺會使得食品的蛋白質測試含量虛高，從而 使劣質食品和飼料在檢驗機構只做粗蛋白質簡易測試時蒙混過關。食品和飼料工業(yè) 蛋白質含量測試方法的缺陷，加之三聚氰胺作為一種白色結晶粉末，沒有什么氣味 和味道，食品與飼料中摻雜了三聚氰胺后也不易被發(fā)現，為此三聚氰胺也常被不法 商人用作食品添加劑，以提升食品檢測中的蛋白質含量指標，因此三聚氰胺也被人 們稱為"蛋白精"。因此，需要靈敏、準確、快速的檢測方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的是提供一種可用作三聚氰胺半抗原和三聚氰胺抗原的化合 物及其制備方法。
本發(fā)明所提供的可用作三聚氰胺半抗原的化合物，具有式I所示分子結構。(式I )。
本發(fā)明所提供的可用作三聚氰胺抗原的化合物，是式I所示化合物與載體蛋白
的偶聯物。其分子結構示意圖如圖4所示。
所述載體蛋白可為牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血藍蛋白或卵清白蛋白，最 優(yōu)選為牛血清白蛋白。
本發(fā)明所提供的制備式I所示化合物的方法，包括如下步驟將三聚氰胺與馬 來酸酐混合，在溫度為60°C-7(TC的條件下反應12-18小時，得到式I所示化合物; 溫度優(yōu)選為66°C，時間優(yōu)選為12小時；
所述三聚氰胺與馬來酸酐的投料物質的量比為l: (1-2)，優(yōu)選為l: 1。 本發(fā)明所提供的制備三聚氰胺抗原化合物的方法，包括如下步驟
1) 將式I所示化合物、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基 硫代琥珀酰亞胺混合，在溫度為20。C-3(TC的條件下，反應12-18小時，得到溶液
I;其中，溫度優(yōu)選為25"C，時間優(yōu)選為12小時；
2) 將載體蛋白加入所述溶液I中，在溫度為2(TC-3(TC的條件下，反應4-6 小時，得到所述偶聯物(即三聚氰胺抗原)；其中，溫度優(yōu)選為25。C，時間優(yōu)選為 4小時；
所述步驟l)中，式I所示化合物、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸 鹽、N-羥基硫代琥珀酰亞胺的投料物質的量比為1:(1-1.5) : 1，優(yōu)選為1: 1.2:
所述載體蛋白與式I所示化合物的投料物質的量比為(8-10) : 1，優(yōu)選為8:
其中，載體蛋白可為牛血清白蛋白、人血清白蛋白、蘭素蛋白或卵清白蛋白， 最優(yōu)選為牛血清白蛋白。上述三聚氰胺半抗原化合物或三聚氰胺抗原化合物在制備三聚氰胺抗體中的 應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
由上述任一所述化合物免疫動物得到的抗體也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述抗 體具體為單克隆抗體。
上述任一所述化合物和/或抗體在檢測三聚氰胺中的應用也屬于本發(fā)明的保護 范圍。
鑒于食品和詞料工業(yè)蛋白質含量測試方法的缺陷，本發(fā)明依靠免疫學，免疫化 學基本原理和殘留分析技術手段，設計、合成小分子目標分析物半抗原，并與載體 蛋白偶聯，制備有效人工抗原，免疫動物制備針對小分子分析物的特異性抗體。利 用抗原抗體的特異性免疫學反應和易被檢測識別的標記物的放大作用，定量的檢測 樣本中微量小分子目標分析物，具有特異、靈敏、準確、快速、方便、廉價等特點。
實驗結果表明，用本發(fā)明的抗原免疫動物得到的抗血清的效價可達l: 2X105，
最低檢測限為12 ng/mL，半抑制濃度為75 ng/mL，產生的抗體的特異性高、靈敏 度高、準確度高。本發(fā)明的抗原和/或抗體，可用于建立競爭酶聯免疫吸附分析技 術，從而用于快速檢測食品中的三聚氰胺殘留，較現有的色譜法比，具有成本低廉、 操作簡單、樣品前處理簡便、方便快捷的特點，還減少由于采用HPLC、 GC檢測而 使用的甲醇、乙腈等有機溶劑對環(huán)境的污染，適合于大規(guī)模檢測。本發(fā)明的制備方 法的產率高。因此，本發(fā)明的抗原及抗體及方法具有廣闊的應用前景。


圖l為三聚氰胺抗原的合成圖。
圖2為三聚氰胺半抗原質譜圖。
圖3為三聚氰胺抗原的紫外光譜圖。
圖4為三聚氰胺抗原的分子結構示意圖。
具體實施例方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。 馬來酸酐的分子C4H203。
實施例l、三聚氰胺半抗原與三聚氰胺抗原的制備與鑒定 三聚氰胺半抗原及抗原的合成如圖1所示。 一、三聚氰胺半抗原的合成與鑒定1、 三聚氰胺半抗原的合成
稱取三聚氰胺與馬來酸酐置于50 mL三角燒瓶中(三聚氰胺與馬來酸酐的投料 物質的量的比為l: 1)，并加入5mL二甲亞砜(DMSO)，置于66。C水浴鍋中，反 應12小時，得到溶液I，其中含有目的產物。計算目的產物的產率。產率的計算 公式為產率=實際得到的產物的質量/理論上得到產物的質量乂100%。實驗設3次 重復，目的產物的產率為46.7%。
2、 三聚氰胺半抗原的鑒定
取上述目的產物經ESI質譜測定其結構，發(fā)現其分子離子峰為223 (M-1)(見 圖2)。半抗原化合物的元素分析結果(%): C， 37. 50; H， 3. 60; N， 37. 49; 0， 21. 41。 由上可知，化合物的分子量為224，分子中含有三個0，四個C。初步說明三聚氰胺 半抗原合成成功，目的產物的分子結構式如式I所示
o o
(式I)。
(二)三聚氰胺抗原的合成與鑒定
1、 三聚氰胺抗原的合成
稱取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HC1)和N-羥基硫代 琥珀酰亞胺(NHS)加入到實驗一得到的溶液I中(式I所示化合物、EDC.HC1、 NHS 的投料物質的量比為l: 1.2: 1。)，攪拌混勻，置25'C反應12小時，得到溶液II;
稱取牛血清白蛋白50 mg溶解于3 mL碳酸溶液中，在磁力攪拌下，逐滴加入 到溶液II中(牛血清白蛋白與式I所示化合物的摩爾數比為為8: 1)， 25X:繼續(xù)攪 拌4 h;待反應完畢，將反應液裝入透析袋，在4'C用生理鹽水溶液透析72 h，換 水6次，即得到目的產物三聚氰胺抗原；分裝于安培瓶中，-20°<:保存。計算產率， 產率=實際得到的產物的質量/理論上得到產物的質量乂100%。實驗設3次重復，結 果取平均數。目的產物三聚氰胺抗原的產率為41. 4%。
2、 三聚氰胺抗原的鑒定按合成三聚氰胺抗原反應所用的半抗原、載體蛋白與偶聯產物的比例，分別進
行紫外(200 nm-400 nm)掃描鑒定，并通過比較三者在同一波長下的吸光值計算 其結合比。結果如圖3所示。實驗設3次重復。
由圖3紫外光譜圖可知，產物的紫外光譜圖與牛血清蛋白(BSA)相比發(fā)生了 明顯變化，說明半抗原已經與BSA成功偶聯制得三聚氰胺抗原。經計算，三聚氰胺 半抗原與BSA的結合摩爾比為22 : 1。三聚氰胺抗原的分子結構示意圖如圖4所示。
實施例2、三聚氰胺半抗原及抗原的制備
一、 三聚氰胺半抗原的合成與鑒定
1、 三聚氰胺半抗原的合成
稱取三聚氰胺與馬來酸酐置于50 mL三角燒瓶中(三聚氰胺與馬來酸酐的投料 物質的量比為l: 1.5)，并加入5mL二甲亞砜(DMSO)，置于60'C水浴鍋中，反 應14小時，得到溶液I，其中含有目的化合物。實驗設3次重復。目的產物(即 式I所示化合物)的產率為46%。
2、 三聚氰胺半抗原的鑒定鑒定方法同實施例1中所述一致。鑒定得到的產 物的結構式如式I所示。
二、 三聚氰胺抗原的合成與鑒定
1、 三聚氰胺抗原的合成
稱取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HC1)和N-羥基硫代 琥珀酰亞胺(NHS)加入到上述得到的溶液I中(步驟一得到的化合物、EDC.HC1 與NHS的投料物質的量比為1: 1: 1)，攪拌混勻，置2(TC反應14小時，得到溶液 II;稱取牛血清白蛋白50 mg溶解于3 mL碳酸溶液中，在磁力攪拌下，逐滴加入 到溶液II中(牛血清白蛋白與步驟一得到的化合物的投料物質的量比為9: 1)， 20 "C繼續(xù)攪拌5h;待反應完畢，將反應液裝入透析袋，在4'C用生理鹽水溶液透析72 h，換水6次，即得到目的產物(三聚氰胺抗原)；分裝于安培瓶中，-2(TC保存。 實驗設3次重復，目的產物三聚氰胺抗原的產率為41%。
2、 三聚氰胺抗原的鑒定
按合成三聚氰胺抗原反應所用的半抗原、載體蛋白與偶聯產物的比例，分別進 行紫外(200 nm-400 nm)掃描鑒定，并通過比較三者在同一波長下的吸光值計算 其結合比。實驗設3次重復。結果產物的紫外光 圖與牛血清蛋白(BSA)相比發(fā)生了明顯變化，說明半抗原已經與BSA成功偶聯制得三聚氰胺抗原。經計算，三聚 氰胺半抗原與BSA的結合摩爾比為22 : 1。
實施例3、三聚氰胺半抗原及抗原的制備
一、 三聚氰胺半抗原的合成與鑒定
1、 三聚氰胺半抗原的合成
稱取三聚氰胺與馬來酸酐置于50 mL三角燒瓶中(三聚氰胺與馬來酸酐的投料 物質的量比為l: 2)，并加入5mL二甲亞砜(DMSO)，置于70。C水浴鍋中，反應 18小時，得到溶液I，其中含有目的化合物。實驗設3次重復。目的產物的產率為 46. 2%。
2、 三聚氰胺半抗原的鑒定鑒定方法同實施例1中所述一致。鑒定得到的產 物的結構式如式I所示。
二、 三聚氰胺抗原的合成與鑒定
1、 三聚氰胺抗原的合成
稱取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HC1)和N-羥基硫代 琥珀酰亞胺(NHS)加入到上述得到的溶液I中(步驟一得到的化合物、EDC.HC1 與NHS的投料物質的量比為1: 1.5: 1)，攪拌混勻，置3(TC反應18小時，得到溶 液II;稱取牛血清白蛋白50 mg溶解于3 mL碳酸溶液中，在磁力攪拌下，逐滴加 入到溶液II中(牛血清白蛋白與步驟一得到的化合物的投料物質的量比為10: 1)， 3(TC繼續(xù)攪拌6h;待反應完畢，將反應液裝入透析袋，在4C用生理鹽水溶液透析 72h，換水6次，即得到目的產物(三聚氰胺抗原)；分裝于安培瓶中，-2(TC保存。 實驗設3次重復，目的產物三聚氰胺抗原的產率為40.8%。
2、 三聚氰胺抗原的鑒定
按合成三聚氰胺抗原反應所用的半抗原、載體蛋白與偶聯產物的比例，分別進 行紫外(200 nm-400 nm)掃描鑒定，并通過比較三者在同一波長下的吸光值計算 其結合比。實驗設3次重復。結果產物的紫外光譜圖與牛血清蛋白(BSA)相比發(fā) 生了明顯變化，說明半抗原已經與BSA成功偶聯制得三聚氰胺抗原。經計算，三聚 氰胺半抗原與BSA的結合摩爾比為22 : 1。
實施例4、通過三聚氰胺抗體檢測本發(fā)明抗原的效果一、 三聚氰胺抗血清的制備
實驗選用5只7周齡，體重2公斤左右，健康的新西蘭大白兔，分別編號l-5。 實驗免疫劑量基礎免疫為0. 5 1. 0 mg/kg，加強免疫劑量為1. 5 mg/kg，用稀釋液 稀釋適量三聚氰胺抗原，加入等體積弗氏完全佐劑，充分乳化，在兔背部皮內多點 注射進行首免。2周后，取同樣量抗原加弗氏不完全佐劑乳化后進行背部皮下多點 注射，每2周加強免疫一次。從第三次加強免疫開始，每次免疫后第8天于兔子耳 緣靜脈采血，測定效價。
每次采血后應將血液先置室溫一段時間待其凝固，再放4X:冰箱中3 4小時， 待血塊收縮后，離心，分離出血清。
二、 三聚氰胺抗體效價的測定
免疫復合物按常規(guī)方法免疫了5只兔子。從第三次加強免疫開始，每次免疫后 第8天于兔子耳緣靜脈采血。血清經適當稀釋后用間接競爭性ELISA測定效價。 五免后，兔子獲得了高效價的抗體，抗血清的效價為l: 2X105。
三、 抗血清最低檢測限(LOD值)和半數抑制量(IC5。)的檢測 三聚氰胺標準品購自Sigma Aldrich公司；CAS號108-78-1。 用方陣滴定法確定抗原(載體蛋白為卵清蛋白，制備方法同實施例l所示)和
三聚氰胺抗體的工作濃度，抗原的工作濃度為l嗎/mL，三聚氰胺抗體的工作濃度為 1/20000 (ug/ml)。
用不同濃度的三聚氰胺標準品溶液做實驗溶液，其濃度如下Ong/mL、 12.5ng/mL、 25ng/mL、 50ng/mL、 100ng/mL、 250ng/mL、 500ng/mL、 lttg/mL。采用 8組平行試驗(n二8)。
間接競爭性ELISA方法用上述工作濃度的抗原包被酶標板，將實驗溶液與抗 體溶液同時加入酶標板小孔中，同時設置空白孔(將添加的抗體溶液換成高純水， 其它一致)和陰性對照孔(將添加的實驗溶液用PBS溶液代替，其它一致)，37°C 溫育0.5h，倒出孔內液體，用洗滌液(10XPBST)洗滌3-5次，將酶標板倒置在吸水 紙上拍打；加入酶標二抗溶液于酶標板小孔中，37。C溫育0.5h，用洗滌液重復洗 3-5次，吸干；加入底物顯色溶液到酶標板小孔中，室溫下反應10-15min，用酶標 儀在波長450nm處測定吸光度值A。以吸光度值A為縱坐標，以三聚氰胺實驗溶液 濃度的logw值為橫坐標，繪制半對數標準曲線圖。結果表明標準曲線具有完整的反S形狀，并具有上平臺和下平臺，標準曲線的平行測定次數8次，實驗重復性良好，
相對標準偏差(變異系數)均在15%以內。
根據標準曲線得出得出10%抑制量和半數抑制量(IC5。)，比較檢測靈敏度。 抑制率以下式計算
抑制率(％)= (OD咖x-GD誦)-(ODx-GD咖)x 10()%
(ODmax-ODmin)
式中OD,x為不加標準品時的吸光值(即陰性對照)，ODx為標準品x時的吸光 值，0D^為空白對照孔的吸光值。
由上述公式計算得三聚氰胺抗體在緩沖液中的LOD值為12ng/raL，半數抑制量 (IC50)為75 ng/mL
四、三聚氰胺抗體特異性測定
抗體特異性是指它同特異性抗原結合的能力與同該抗原類似物結合能力的比 較。常用交叉反應活性作為評價的重要標準。交叉反應越小，抗體的特異性則越好。
本實驗選擇的三聚氰胺同系物為三聚氰酸、4， 6-二氨基-2-羥基-l， 3， 5-三嗪、 三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺、四環(huán)素、慶大霉素、氨芐青霉素。
用樣品稀釋液將各同系物分別稀釋成如下濃度0ng/mL、 12.5ng/mL、 25ng/mL、 50ng/mL、 100ng/mL、 250ng/mL、 500ng/mL。
按照實驗三中所述方法，各自建立標準曲線，測定抑制中濃度ICs。。
交叉反應率(％)=(引起50%抑制三聚氰胺的濃度/引起50%抑制類似物濃 度)x 100%。
實驗設3次重復，結果取平均數。結果，各類似物的交叉反應率(％):三聚 氰胺100.0，三聚氰酸<10.0，其4,6-二氨基-2-羥基-1，3，5_三嗪<0.5，三聚氰酸 一酰胺<0.01，三聚氰酸二酰胺〈0.01，四環(huán)素〈0.01，慶大霉素<0.01，氨芐青霉素 〈0.01。本發(fā)明抗體與三聚氰胺類似物的交叉反應率很小，說明抗體的特異性好。
權利要求
1、一種化合物，其分子結構式如式I所示 id="icf0001" file="A2009100856490002C1.tif" wi="73" he="44" top= "45" left = "32" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>(式I)。
2、 一種化合物，是權利要求1中所述式I所示化合物與載體蛋白的偶聯物。
3、 根據權利要求2所述的化合物，其特征在于所述載體蛋白為牛血清白蛋 白、人血清白蛋白、血藍蛋白或卵清白蛋白。
4、 一種制備權利要求1中所述式I所示化合物的方法，包括如下步驟將三聚氰胺與馬來酸酐混合，在溫度為6(TC-7(TC的條件下反應12-18小時，得到式I 所示化合物；溫度優(yōu)選為66T:，時間優(yōu)選為12小時。
5、 一種制備權利要求2中所述化合物的方法，包括如下步驟1) 將式I所示化合物、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基 硫代琥珀酰亞胺混合，在溫度為2(TC-3(TC的條件下，反應12-18小時，得到溶液I;其中，溫度優(yōu)選為25-C，時間優(yōu)選為12小時；2) 將載體蛋白加入所述溶液I中，在溫度為20'C-3(TC的條件下，反應4-6 小時，得到權利要求2中所述化合物。
6、 根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述載體蛋白為牛血清白蛋白、 人血清白蛋白、血藍蛋白或卵清白蛋白。
7、 權利要求l、 2或3所述化合物在制備三聚氰胺抗體中的應用。
8、 由權利要求2或3所述化合物免疫動物得到的抗體。
9、 根據權利要求8所述的抗體，其特征在于所述抗體為單克隆抗體。
10、 權利要求1、 2或3所述化合物和/或權利要求8或9中所述抗體在檢測三 聚氰胺中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種三聚氰胺半抗原與抗原及其制備方法與應用。該制備式I所示化合物的方法包括如下步驟將三聚氰胺與馬來酸酐混合，在溫度為60℃-70℃℃的條件下反應12-18小時，得到式I所示化合物。實驗結果表明，用本發(fā)明的抗原免疫動物得到的抗血清的效價可達1∶2×10⁵，最低檢測限為12ng/mL，半抑制濃度為75ng/mL，產生的抗體的特異性高、靈敏度高、準確度高。因此，本發(fā)明的抗原及抗體及檢測方法具有廣闊的應用前景。
文檔編號C07D251/00GK101643454SQ200910085649
公開日2010年2月10日 申請日期2009年5月27日 優(yōu)先權日2009年5月27日
發(fā)明者吳小平, 靜 張, 飛 徐, 江海洋, 王亞輝, 王戰(zhàn)輝, 阮永磊 申請人:北京維德維康生物技術有限公司