專利名稱：磺胺二甲基嘧啶抗原及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及磺胺二甲基嘧啶抗原及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
磺胺二甲嘧啶(Sulfamethazine, SM2)，是一種人工合成的抗菌素，其性質(zhì)穩(wěn) 定、抑菌譜廣、毒性小、口服易吸收且價(jià)格低廉，對(duì)畜禽疾病控制與治療起重要作 用，是畜牧業(yè)上應(yīng)用最廣泛、應(yīng)用量最大的藥物之一。但是由于它在體內(nèi)的作用時(shí) 間和代謝時(shí)間較長(zhǎng)，易殘留在動(dòng)物體內(nèi)，通過(guò)任何途徑攝入都有可能在人體中蓄積。 藥物蓄積濃度超過(guò)一定值對(duì)人體機(jī)能是有害的，長(zhǎng)期蓄積則會(huì)導(dǎo)致磺胺藥抗藥性的 產(chǎn)生，造成耐藥菌的流行性感染，且有潛在的致癌性。因此，聯(lián)合國(guó)食品法典委員 會(huì)和許多國(guó)家規(guī)定，食品和飼料中磺胺二甲噴啶等磺胺類物質(zhì)單個(gè)均不得超過(guò)100 y g/kg。 2002年12月我國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào)文件規(guī)定在所有食品動(dòng)物的肌肉、 脂肪、肝和腎中最高殘留限量100ug/kg，并將其列為獸藥殘留監(jiān)控的重點(diǎn)。
目前，獸藥殘留檢測(cè)常用的方法有氣相色譜、高效液相色譜以及氣質(zhì)聯(lián)用等理 化分析方法。雖然這些方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，但是樣品前處理操作步驟繁瑣， 成本較高，也不適用于大批量樣品的篩選檢測(cè)。免疫化學(xué)分析鑒于在抗原抗體的定 性定量方面獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和操作簡(jiǎn)便快速、成本低、靈敏度較高、分析樣本量大的優(yōu) 點(diǎn)彌補(bǔ)了理化分析的不足，在磺胺藥物的殘留檢測(cè)中起著越來(lái)越重要的作用。
影響免疫化學(xué)分析質(zhì)量的根本因素是抗體的特異性與親和性，這些性質(zhì)又決定 于免疫半抗原分子的結(jié)構(gòu)，因此免疫半抗原的分子設(shè)計(jì)與合成是產(chǎn)生特異性抗體和 建立小分子獸藥殘留快速檢測(cè)技術(shù)的最基礎(chǔ)和最關(guān)鍵的步驟。
目前磺胺單個(gè)藥物抗體的制備一般采用重氮化法直接偶聯(lián)蛋白，或采用戊二醛 法與載體蛋白偶聯(lián)。最近也有報(bào)道磺胺二甲基嘧啶先與琥珀酸酐偶聯(lián)，增加一個(gè)四 個(gè)碳原子的間隔臂，以完全暴露磺胺二甲胺基嘧啶結(jié)構(gòu)。但是含有四個(gè)碳原子的間 隔臂可以在空間中自由旋轉(zhuǎn)，使連接的磺胺二甲基嘧啶分子有可能被載體蛋白遮 蔽，影響動(dòng)物機(jī)體的識(shí)別。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種磺胺二甲基嘧啶抗原及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的磺胺二甲基嘧啶抗原，是將磺胺二甲基嘧啶半抗原與載體蛋白 偶聯(lián)獲得的抗原。
磺胺二甲基嘧啶半抗原是一種化合物，其結(jié)構(gòu)為式I所示。
磺胺二甲基嘧啶半抗原也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
其中，磺胺二甲基嘧啶半抗原與所述載體蛋白以酰胺鍵偶聯(lián)。所述載體蛋白可 以為牛血清白蛋白或卵清蛋白。
磺胺二甲基嘧啶半抗原可以按照如下的方法制備
在丙酮或N，N-二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亞砜(DMS0)和無(wú)水吡啶混合物 中，磺胺二甲基嘧啶與馬來(lái)酸酐在6(TC反應(yīng)，得到的產(chǎn)物用乙酸乙酯萃取，獲得所 述化合物。所述丙酮與無(wú)水吡啶的體積比為8: (1-5)。所述磺胺二甲基嘧啶與馬 來(lái)酸酐物質(zhì)的量的比為l: (4-6)。
本發(fā)明的磺胺二甲基嘧啶半抗原最大程度地保留磺胺二甲基嘧啶的特征結(jié)構(gòu)， 同時(shí)在磺胺二甲基嘧啶的-NH2位置，把-朋2通過(guò)化學(xué)合成改造成-NH-C0CH=CHC00H， 使其具有一定長(zhǎng)度的剛性連接臂，又具有與蛋白質(zhì)偶聯(lián)的-C00H;而且含有雙鍵的 四碳間隔臂，既有利于充分暴露出磺胺二甲基嘧啶，又可以限制間隔臂的隨意旋轉(zhuǎn)， 從而避免磺胺二甲基嘧啶被載體蛋白遮蔽，影響動(dòng)物免疫系統(tǒng)的識(shí)別。用本發(fā)明的 磺胺二甲基嘧啶半抗原可合成的磺胺二甲基嘧啶抗原。
本發(fā)明的磺胺二甲基嘧啶抗原采用馬來(lái)酸酐作為磺胺二甲基嘧啶和載體蛋白 的間隔臂，馬來(lái)酸酐分子中含有一個(gè)雙鍵，可以大大降低磺胺二甲基噴啶在空間的 自由旋轉(zhuǎn)，提高動(dòng)物機(jī)體識(shí)別的幾率，從而制備出具有更高親和力和特異性的抗體。
本發(fā)明的磺胺二甲基嘧啶抗原免疫動(dòng)物，所得抗體的效價(jià)、特異性、親和力都 比較好。所得抗體用于ELISA方法檢測(cè)磺胺二甲基嘧啶，最低檢測(cè)限可達(dá)1. 0 ng/mL (1 ppb)，檢測(cè)靈敏度高，與其他磺胺類藥物交叉反應(yīng)率低。
本發(fā)明的磺胺二甲基嘧啶半抗原及磺胺二甲基嘧啶抗原的合成方法簡(jiǎn)單，純度
4和產(chǎn)率高。本發(fā)明的磺胺二甲基嘧啶抗原、磺胺二甲基嘧啶半抗原可以用于磺胺藥
物的殘留檢測(cè)。


圖1為磺胺二甲基嘧啶半抗原負(fù)離子質(zhì)譜圖。
圖2為磺胺二甲基嘧啶抗原的紫外光譜圖。
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中如無(wú)特殊說(shuō)明所用方法均為常規(guī)方法，所用試劑均可從商業(yè)途徑 獲得。
實(shí)施例1、制備磺胺二甲基嘧啶半抗原
1) 將l.O g磺胺二甲基嘧啶溶解于80 mL丙酮中，加入IO mL無(wú)水吡啶，混 勻致其完全溶解；
2) 將2.0 g馬來(lái)酸酐溶于20 mL無(wú)水丙酮，與1)的到的混合液，60° C下水 浴回流2小時(shí)，溶液顏色逐漸變紅，至反應(yīng)結(jié)束時(shí)，反應(yīng)液顏色變?yōu)楹谏?br> 3) 蒸干丙酮和吡啶，獲得黑色油狀物質(zhì)，加入100mL5y。(質(zhì)量百分含量)碳 酸鈉溶液，用20 mL 二氯甲垸洗滌兩遍；
4) 調(diào)pH值至中性，加入50mL乙酸乙酯提取，棄去水相，減壓干燥，獲得磺 胺二甲基嘧啶半抗原825 mg，產(chǎn)率為82.5%。
2.磺胺二甲基嘧啶半抗原的結(jié)構(gòu)鑒定
所得磺胺二甲基嘧啶半抗原，用質(zhì)譜確定其結(jié)構(gòu)，質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果如圖l所示， 其ESI分子離子峰為375 (M-l)。
元素分析(％，計(jì)算值)C， 53.32; H， 4.47; N， 15.55; 0， 17.76; S， 8. 90。
磺胺二甲基嘧啶半抗原的結(jié)構(gòu)式如式I所示
<formula>formula see original document page 5</formula>式I
實(shí)施例2、制備磺胺二甲基嘧啶抗原1) 制備磺胺二甲基嘧啶抗原
稱取10 mg實(shí)施例1的磺胺二甲基嘧啶半抗原溶解于5 mL N， N-二甲基甲酰胺 (DMF)中，超聲使之完全溶解，并以冷乙醇冷卻；然后加入IO mg的N，N， -二環(huán) 己基碳化二亞胺(DCC)和5 mg N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，室溫反應(yīng)過(guò)夜；最后逐 滴加入牛血清白蛋白或卵清蛋白的碳酸溶液(50 mg牛血清白蛋白或卵清蛋白溶解 于5mL0.01M的碳酸溶液中)，繼續(xù)攪拌4小時(shí)；然后將反應(yīng)液裝入透析袋，在4°C 用生理鹽水溶液透析48小時(shí)，換水6次。將透析液在無(wú)菌條件下通過(guò)0. 2 um的 濾膜，獲得磺胺二甲基嘧啶抗原(SM2-BSA)或包被抗原(SM2-OVA)，分裝于安培瓶 中，-2(TC保存。
2) 磺胺二甲基嘧啶抗原的鑒定
磺胺二甲基嘧啶抗原用PBS配成溶液進(jìn)行紫外(200-400 nm)光譜掃描，以l mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)作為對(duì)照。
紫外(200-400 nm)光譜掃描結(jié)果見(jiàn)圖2，磺胺二甲基嘧啶抗原的紫外圖譜與 BSA相比發(fā)生了明顯變化，說(shuō)明磺胺二甲基嘧啶半抗原與載體蛋白BSA成功偶聯(lián)， 經(jīng)計(jì)算實(shí)施例1的磺胺二甲基嘧啶半抗原與載體蛋白的結(jié)合比為11: 1。3) 抗原免疫動(dòng)物及ELISA競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)
新西蘭大白兔10只，隨機(jī)分成兩組，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組以2)制備的磺 胺二甲基嘧啶抗原進(jìn)行免疫，對(duì)照組以牛血清蛋白(BSA)作為抗原進(jìn)行免疫。每 只兔子每次免疫lmg/mL (以BSA量計(jì))，每?jī)芍苊庖咭淮?，共免?次，第三次免 疫之后7天，耳緣靜脈采血，進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA分析。
1. 包被用包被緩沖液將包被抗原(SM2-OVA)稀釋為系列濃度，每一濃度包 被一行，100 uL/孔，4'C過(guò)夜；
2. 洗滌與封閉傾去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗滌3次，每次3分鐘。每孔加入 150 uL封閉液，37。C恒溫封閉lh，然后洗滌3次，每次3分鐘；
3. 加樣將50 uL多抗IgG與等體積倍比稀釋的磺胺二甲嘧啶標(biāo)準(zhǔn)液加到酶 標(biāo)板上反應(yīng)，每孔100 w L， 37。C反應(yīng)1小時(shí)，洗滌同步驟2。然后每孔加入100 u L 服P-羊抗兔IgG， 37。C反應(yīng)l小時(shí)，洗滌同步驟2;
4. 顯色測(cè)定每孔加入TMB溶液100 uL， 37。C顯色20 min，然后每孔加入 50 iiL 2 mol L—1貼04以終止反應(yīng)，最后用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的0D柳^值。
間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA結(jié)果表明，第6次免疫之后獲得了高特異性的抗體，效價(jià)高達(dá)1: 51200。
建立間接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA方法檢測(cè)磺胺二甲基嘧啶，經(jīng)測(cè)定最佳包被抗原的濃度 為0. 02 ix g/ml，抗血清最佳稀釋度為20000X 。
0ng/ml、 0. 5ng/ml、 lng/ml、 2ng/ml、 4ng/ml、 8ng/ml、 16ng/ml、 32ng/ml 不同濃度梯度的磺胺二甲基嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA試驗(yàn)。由ELISA 方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線得出該方法的檢測(cè)靈敏度高。
結(jié)果表明半數(shù)抑制量(IC5。)為3ng/ml，最低檢測(cè)限可達(dá)1.0 ng/mL (1 ppb)， 在0.3 ng/mL-30ng/ml范圍內(nèi)，抑制率與藥物濃度的對(duì)數(shù)值呈顯著的線性關(guān)系，相 關(guān)系數(shù)為r=0. 9924。
選擇與磺胺二甲基嘧啶結(jié)構(gòu)類似的6種磺胺類藥物測(cè)定交叉反應(yīng)率。通過(guò)繪制 各種藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別得到其半數(shù)抑制量(IC5。)。交叉反應(yīng)越小，表明該抗體 的特異性越高。
結(jié)果表明，該抗體對(duì)磺胺二甲嘧啶(SM2)、磺胺甲氧嘧啶(SM》、磺胺間甲 氧嘧啶(SMM)、磺胺嘧啶(SD )、磺胺喹惡啉(SQ )、磺胺甲惡唑(SMZ)、磺胺地 索辛(SDM )的交叉反應(yīng)率分別為100%、 <10%、 〈1%、 〈1% 、 〈2%、 <0. 1%和〈0. 01%。
建立間接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA方法。在倍比稀釋的實(shí)驗(yàn)組兔血清(磺胺二甲基嘧啶抗 原免疫)中加入100ng/mL的磺胺二甲嘧啶進(jìn)行抑制檢測(cè)，比較加入磺胺二甲基嘧 啶和未加磺胺二甲基嘧啶兩者所得OD值的差異。
分析結(jié)果表明，與陰性對(duì)照(未加磺胺二甲基嘧啶)相比，吸光值明顯下降，隨著 血清稀釋倍數(shù)的增加，吸光值呈明顯的遞減梯度。說(shuō)明獲得的兔血清能夠特異性地 識(shí)別磺胺二甲基嘧啶。
權(quán)利要求
1、一種化合物，其結(jié)構(gòu)為式I所示。 式I。
2、 磺胺二甲基嘧啶抗原，是將權(quán)利要求l所述的化合物與載體蛋白偶聯(lián)獲得的 抗原。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的磺胺二甲基嘧啶抗原，其特征在于權(quán)利要求l所述 的化合物與所述載體蛋白以酰胺鍵偶聯(lián)。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的磺胺二甲基嘧啶抗原，其特征在于所述載體蛋 白為牛血清白蛋白或卵清蛋白。
5、 權(quán)利要求1所述化合物在磺胺藥物的殘留檢測(cè)中的應(yīng)用。
6、 權(quán)利要求2或3所述磺胺二甲基嘧啶抗原在磺胺藥物的殘留檢測(cè)中的應(yīng)用。
7、 制備權(quán)利要求1所述化合物的方法，在丙酮或二甲基甲酰胺或二甲基亞砜和 無(wú)水吡啶混合物中，磺胺二甲基嘧啶與馬來(lái)酸酐反應(yīng)，得到的產(chǎn)物用乙酸乙酯萃取， 獲得所述化合物。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述丙酮與無(wú)水吡啶的體積比為8: (1-5)。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述磺胺二甲基嘧啶與馬來(lái)酸酐物質(zhì)的量的比為1:(4-6)。
10、 制備權(quán)利要求2-4中任一所述磺胺二甲基嘧啶抗原的方法，是先制備權(quán)利要 求1所述化合物，然后將所述的化合物與載體蛋白偶聯(lián)獲得的抗原。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種磺胺二甲基嘧啶抗原及其制備方法與應(yīng)用。該磺胺二甲基嘧啶抗原是將磺胺二甲基嘧啶半抗原與載體蛋白偶聯(lián)獲得的抗原。磺胺二甲基嘧啶半抗原是一種化合物，其結(jié)構(gòu)為式I所示。該磺胺二甲基嘧啶抗原免疫動(dòng)物可以制備出具有更高親和力和特異性的抗體。本發(fā)明的磺胺二甲基嘧啶抗原可以用于磺胺藥物的殘留檢測(cè)。
文檔編號(hào)C07D239/69GK101565405SQ20091008564
公開(kāi)日2009年10月28日 申請(qǐng)日期2009年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月27日
發(fā)明者丁雙陽(yáng), 靜 張, 張素霞, 江海洋, 沈建忠, 王戰(zhàn)輝, 肖希龍 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)