專利名稱：一種三聚氰胺半抗原與抗原及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種三聚氰胺半抗原與抗原及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
三聚氰胺(Melamine)，分子式C3N6H6，簡(jiǎn)稱三胺，是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物。三聚氰胺呈弱堿性，與鹽酸、硫酸、硝酸、乙酸、草酸等都能形成三聚氰胺鹽。三聚氰胺是重要的氮雜環(huán)有機(jī)化工原料，在中性或微堿性情況下，與甲醛縮合而成各種羥甲基三聚氰胺，但在微酸性環(huán)境中(pH5. 5 6. 5 )與羥甲基的衍生物進(jìn)行縮聚反應(yīng)而生成樹(shù)脂產(chǎn)物。三聚氰胺是一種用途廣泛的基本有機(jī)化工中間產(chǎn)品，最主要的用途是作為生產(chǎn)三聚氰胺甲醛樹(shù)脂的原料。該樹(shù)脂硬度比脲醛樹(shù)脂高，不易燃，耐水、耐熱、耐老化、耐電弧、耐化學(xué)腐蝕，有良好的絕緣性能、光澤度和機(jī)械強(qiáng)度，廣泛運(yùn)用于木材、塑料、涂料、造紙、紡織、皮革、電氣、醫(yī)藥等行業(yè)。三聚氰胺還可以作阻燃劑、減水劑、甲醛清潔劑等。
三聚氰胺目前被認(rèn)為毒性輕微，大鼠口服的半數(shù)致死量大于3 g / kg體重。動(dòng)物長(zhǎng)期攝入三聚氰胺會(huì)造成生殖、泌尿系統(tǒng)的損害，膀胱、腎部結(jié)石，并可進(jìn)一步誘發(fā)膀胱癌。
蛋白質(zhì)主要由氨基酸組成，其含氮量一般不超過(guò)30%，而三聚氰胺分子中含氮量為66%左右。常用的蛋白質(zhì)測(cè)試方法"凱氏定氮法"是通過(guò)測(cè)出含氮量乘以6.25來(lái)估算蛋白質(zhì)含量，因此，添加三聚氰胺會(huì)使得食品的蛋白質(zhì)測(cè)試含量虛高，從而使劣質(zhì)食品和飼料在檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)只做粗蛋白質(zhì)簡(jiǎn)易測(cè)試時(shí)蒙混過(guò)關(guān)。食品和飼料工業(yè)蛋白質(zhì)含量測(cè)試方法的缺陷，加之三聚氰胺作為一種白色結(jié)晶粉末，沒(méi)有什么氣味和味道，食品與飼料中摻雜了三聚氰胺后也不易被發(fā)現(xiàn)，為此三聚氰胺也常被不法商人用作食品添加劑，以提升食品檢測(cè)中的蛋白質(zhì)含量指標(biāo)，因此三聚氰胺也被人們稱為"蛋白精"。因此，需要靈敏、準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種可用作三聚氰胺半抗原和三聚氰胺抗原的化合物及其制備方法。
本發(fā)明所提供的可用作三聚氰胺半抗原的化合物，具有式I所示分子結(jié)構(gòu)。
3,CH^CH2—CH2COOH
HN
H，N
NH,
(式I )
本發(fā)明所提供的可用作三聚氰胺抗原的化合物，是式I所示化合物與載體蛋白的偶聯(lián)物。
所述載體蛋白可為牛血清白蛋白、人血清白蛋白、蘭素蛋白或卵清白蛋白，最優(yōu)選為牛血清白蛋白。
本發(fā)明所提供的制備式I所示化合物的方法，包括如下步驟將2-氯-4， 6-二氨基-1， 3， 5-三嗪和對(duì)氨基苯丁酸混合，在堿性、無(wú)水的環(huán)境下，在7(TC-80。C的溫度下，回流反應(yīng)24-30小時(shí)，得到式I所示的化合物；
2-氯-4，6-二氨基-1,3，5-三嗪與對(duì)氨基苯丁酸的投料摩爾比為1: (1-3)，優(yōu)選為l: 1。
本發(fā)明所提供的制備上述三聚氰胺抗原化合物的方法，包括如下步驟
1) 將式I所示化合物、N,N-二甲基甲酰胺、N，N' -二環(huán)己基碳化二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺混合，在2(TC-3(TC的條件下，反應(yīng)12-18小時(shí)，得到溶液I ;溫度優(yōu)選為25°C，時(shí)間優(yōu)選為12小時(shí)；
2) 向溶液I中加入載體蛋白，在20。C-3(TC的條件下，反應(yīng)12-20小時(shí)，得到上述偶聯(lián)物(即三聚氰胺抗原化合物)；溫度優(yōu)選為25。C，時(shí)間優(yōu)選為12小時(shí)；
所述步驟l)中，所述式I所示化合物、N，N-二甲基甲酰胺、N，N' -二環(huán)己基碳化二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺的投料摩爾數(shù)比為1: 1: 1: 1。
所述式I所示化合物與載體蛋白的投料摩爾數(shù)比為(6-8) : 1，優(yōu)選為7: 1。
含羧基半抗原先與碳二亞胺類物質(zhì)反應(yīng)生成不穩(wěn)定的類酸酐中間體，然后再與蛋白質(zhì)的氨基反應(yīng)生成酰胺和脲衍生物。
其中，載體蛋白可為牛血清白蛋白、人血清白蛋白、蘭素蛋白或卵清白蛋白，最優(yōu)選為牛血清白蛋白。
上述三聚氰胺半抗原或三聚氰胺抗原化合物在制備三聚氰胺抗體中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
由上述任一所述化合物免疫動(dòng)物得到的抗體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述抗體具體為單克隆抗體。
上述任一所述化合物和/或抗體在檢測(cè)三聚氰胺中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
鑒于食品和飼料工業(yè)蛋白質(zhì)含量測(cè)試方法的缺陷，本發(fā)明依靠免疫學(xué)、免疫化學(xué)基本原理和殘留分析技術(shù)手段，設(shè)計(jì)、合成小分子目標(biāo)分析物半抗原，并與載體蛋白偶聯(lián)，制備有效人工抗原，免疫動(dòng)物制備針對(duì)小分子分析物特異性抗體。利用抗原抗體的特異性免疫學(xué)反應(yīng)和易被檢測(cè)識(shí)別的標(biāo)記物的放大作用，定量的檢測(cè)樣本中微量小分子目標(biāo)分析物，具有特異、靈敏、準(zhǔn)確、快速、方便、廉價(jià)等特點(diǎn)。
本發(fā)明以4， 6-二氨基-2-氯-1， 3， 5-三嗪(CAAT)為起始物質(zhì)，應(yīng)用對(duì)氨基苯丁酸上的氨基上的氫原子取代CAAT分子上的氯原子，從而獲得能與載體蛋白直接偶聯(lián)的活性基團(tuán)，獲得三聚氰胺半抗原氨基苯丁酸代二胺-s-三嗪，簡(jiǎn)稱p-ABTAAT，然后以活性酯法與載體蛋白(牛血清蛋白BSA)偶聯(lián)制備人工抗原。將人工抗原免疫動(dòng)物后產(chǎn)生了針對(duì)三聚氰胺的高親和力的特異性抗體。本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)便可行、成本較低，半抗原產(chǎn)率較高，為快速檢測(cè)食品中的三聚氰胺殘留提供了必備的^石出。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用本發(fā)明的抗原免疫動(dòng)物得到的抗血清的效價(jià)可達(dá)l: 8X104，
最低檢測(cè)限為49 ng/L，半抑制濃度為257 ng/L，產(chǎn)生的抗體的特異性高、靈敏度高、準(zhǔn)確度高。本發(fā)明的抗原和/或抗體，可用于建立競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附分析技術(shù)，從而用于快速檢測(cè)食品中的三聚氰胺殘留，較現(xiàn)有的色譜法比，具有成本低廉、操作簡(jiǎn)單、樣品前處理簡(jiǎn)便、方便快捷的特點(diǎn)，還減少由于采用HPLC、 GC檢測(cè)而使用的甲醇、乙腈等有機(jī)溶劑對(duì)環(huán)境的污染，適合于大規(guī)模檢測(cè)，克服了現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)中對(duì)三聚氰胺樣品預(yù)處理復(fù)雜、耗時(shí)、且需要大量有機(jī)溶劑萃取，以及在檢測(cè)過(guò)程中要用到精密昂貴的檢測(cè)儀器而不適于推廣使用等缺點(diǎn)。本發(fā)明的制備方法的產(chǎn)率高。因此，本發(fā)明的抗原及抗體及方法具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1為三聚氰胺抗原的合成圖。
圖2為三聚氰胺半抗原質(zhì)譜圖。
圖3為三聚氰胺抗原的紫外光譜圖。
5圖4為三聚氰胺抗原的分子結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
實(shí)施例1、三聚氰胺半抗原與三聚氰胺抗原的制備與鑒定 三聚氰胺半抗原及抗原的合成如圖1所示。 一、三聚氰胺半抗原的合成與鑒定
1、 三聚氰胺半抗原的合成
稱取2-氯-4, 6-二氨基-1， 3, 5-三嗪(CAAT) 0. 430 g (3 mmol)懸浮于經(jīng)Na2S04 處理的IO mL無(wú)水乙醇提中，加入0.5 g (3 mmol)的對(duì)氨基苯丁酸(2-氯-4， 6-二氨基-1，3，5-三嗪與對(duì)氨基苯丁酸的投料摩爾比為1: 1)，加入K0H，使K0H的終 濃度為85%。溫度為75。C條件下水浴回流24小時(shí)，分別在16小時(shí)和19小時(shí)的時(shí) 候，加入0.37 g對(duì)氨基苯丁酸(2.0 mmol)和85%K0H (180 mg， 2.7 mmol)。產(chǎn)物 過(guò)濾，減壓蒸餾，獲得油狀物質(zhì)。產(chǎn)物溶解于30 mL 5%的碳酸鈉溶液，lOmL二氯 甲烷洗滌兩次，水相用濃鹽酸調(diào)pH至l，收集沉淀，干燥獲得產(chǎn)品。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重 復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)。獲得目的產(chǎn)物(半抗原)195mg，產(chǎn)率為68%，命名為p-ABTAAT。 產(chǎn)率的計(jì)算公式為產(chǎn)率二實(shí)際得到的產(chǎn)物的量/理論上得到的產(chǎn)物的量X 100%。
2、 三聚氰胺半抗原的鑒定
取上述產(chǎn)物經(jīng)ESI質(zhì)譜測(cè)定其結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其分子離子峰為289(M+1)(見(jiàn)圖2)。 半抗原化合物的元素分析結(jié)果(%): C， 54.16; H， 5.59; N， 29.15; 0， 11.10。
由上可知，化合物的分子量為288，分子中含有2個(gè)0， 13個(gè)C。說(shuō)明三聚氰胺半
抗原合成成功。三聚氰胺半抗原的分子結(jié)構(gòu)式如式I所示
6二、三聚氰胺抗原的合成與鑒定
1、 三聚氰胺抗原的合成
p-ABTAAT溶解于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，分別加入N， N， -二環(huán)己基碳二亞 胺(DCC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) (p-ABTAAT、 DMF、 DCC和NHS的投料物質(zhì) 的量比為l: 1: 1: 1) ， 25。C下攪拌反應(yīng)12小時(shí)，離心，除去沉淀，得到溶液I ; 向溶液I中加入溶有100 mg牛血清蛋白(BSA)的水溶液5 mL (p-ABTAAT與牛血 清蛋白的投料物質(zhì)的量比為7: 1) ， 25'C下攪拌反應(yīng)12小時(shí)。將溶液裝入透析袋， 用蒸餾水透析5天，離心分離出上清液，即得到三聚氰胺免疫原p-ABTAAT-BSA。三 聚氰胺半抗原的化學(xué)名稱為氨基苯丁酸代二胺-s-三嗪，分子量為288。計(jì)算產(chǎn)率。 產(chǎn)率的計(jì)算公式為產(chǎn)率=實(shí)際得到的產(chǎn)物的量/;理論得到的產(chǎn)物的量X10(m。實(shí) 驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)。結(jié)果目的產(chǎn)物的產(chǎn)率為57.2%。
2、 三聚氰胺抗原的鑒定
按合成三聚氰胺抗原反應(yīng)所用的半抗原、載體蛋白與偶聯(lián)產(chǎn)物的比例，分別進(jìn) 行紫外(200 nm-400 nm)掃描鑒定，并通過(guò)比較三者在同一波長(zhǎng)下的吸光值計(jì)算 其結(jié)合比。
由圖3紫外光譜圖可知，產(chǎn)物的紫外光譜圖與牛血清蛋白(BSA)相比發(fā)生了 明顯變化，說(shuō)明半抗原已經(jīng)與BSA成功偶聯(lián)制得三聚氰胺人工抗原。經(jīng)計(jì)算，三聚 氰胺半抗原與BSA的結(jié)合比為17: 1。三聚氰胺抗原的分子結(jié)構(gòu)式示意圖如圖4所 示。
實(shí)施例2、三聚氰胺半抗原與三聚氰胺抗原的制備與鑒定 一、三聚氰胺半抗原的合成與鑒定 1、三聚氰胺半抗原的合成
稱取2-氯-4,6-二氨基-1，3，5-三嗪(CAAT)懸浮于經(jīng)Na2S04處理的10 mL無(wú) 水乙醇提中，加入對(duì)氨基苯丁酸(2-氯-4，6-二氨基-1,3,5-三嗪與對(duì)氨基苯丁酸的 投料摩爾比為1:2)，加入KOH，使K0H的終濃度為85y。。溫度為7CTC條件下水浴回 流26小時(shí)，分別在16小時(shí)和19小時(shí)的時(shí)候，加入0. 37 g對(duì)氨基苯丁酸(2. 0 mmol) 和85呢K0H (180 mg， 2.7 mmol)。產(chǎn)物過(guò)濾，減壓蒸餾，獲得油狀物質(zhì)。產(chǎn)物溶解 于30 mL 5%的碳酸鈉溶液，10 raL二氯甲烷洗滌兩次，水相用濃鹽酸調(diào)pH至l，收 集沉淀，干燥獲得產(chǎn)品。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)。獲得目的產(chǎn)物(半抗原)產(chǎn)率為67%，命名為p-ABTAAT-1。產(chǎn)率的計(jì)算公式為產(chǎn)率=實(shí)際得到的產(chǎn)物的量/ 理論上得到的產(chǎn)物的量X 100%。 2、三聚氰胺半抗原的鑒定
取上述產(chǎn)物經(jīng)ESI質(zhì)譜測(cè)定其結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其分子離子峰為289 (M+l)。半抗原 化合物的元素分析結(jié)果(％): C， 54.16; H， 5.59; N， 29.15; 0， 11.10。由上可 知，化合物的分子量為288，分子中含有2個(gè)0， 13個(gè)C。初步說(shuō)明三聚氰胺半抗 原合成成功。三聚氰胺半抗原的分子結(jié)構(gòu)式如式I所示。
二、三聚氰胺抗原的合成與鑒定
1、 三聚氰胺抗原的合成
p-ABTAAT-l溶解于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，分別加入N,N， -二環(huán)己基碳二 亞胺(DCC)和N-羥基琥拍酰亞胺(NHS) (p-ABTAAT-1、 DMF、 DCC和NHS的投料
物質(zhì)的量比為l: 1: 1: 1) ， 2(TC下攪拌反應(yīng)14小時(shí)，離心，除去沉淀，得到溶
液I ;向溶液I中加入溶有100 mg牛血清蛋白(BSA)的水溶液5 mL (p-ABTAAT-1 與牛血清蛋白的投料物質(zhì)的量比為6: 1) ， 20。C下攪拌反應(yīng)14小時(shí)。將溶液裝入 透析袋，用蒸餾水透析5天，離心分離出上清液，即得到三聚氰胺免疫原。計(jì)算產(chǎn)
率。產(chǎn)率的計(jì)算公式為產(chǎn)率=實(shí)際得到的產(chǎn)物的量/;理論得到的產(chǎn)物的量X100。/0。
實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)。結(jié)果目的產(chǎn)物的產(chǎn)率為57%。
2、 三聚氰胺抗原的鑒定
按合成三聚氰胺抗原反應(yīng)所用的半抗原、載體蛋白與偶聯(lián)產(chǎn)物的比例，分別進(jìn) 行紫外(200 nm-400 nm)掃描鑒定，并通過(guò)比較三者在同一波長(zhǎng)下的吸光值計(jì)算 其結(jié)合比。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。結(jié)果表明，產(chǎn)物的紫外光譜圖與牛血清蛋白(BSA) 相比發(fā)生了明顯變化，說(shuō)明半抗原已經(jīng)與BSA成功偶聯(lián)制得三聚氰胺人工抗原。經(jīng) 計(jì)算，三聚氰胺半抗原與BSA的結(jié)合比為17: 1。
實(shí)施例3、三聚氰胺半抗原與三聚氰胺抗原的制備與鑒定 一、三聚氰胺半抗原的合成與鑒定 1、三聚氰胺半抗原的合成
稱取2-氯-4， 6-二氨基-1， 3， 5-三嗪(CAAT)懸浮于經(jīng)Na2S04處理的10 mL無(wú) 水乙醇提中，加入對(duì)氨基苯丁酸(2-氯-4，6-二氨基-1，3,5-三嗪與對(duì)氨基苯丁酸的 投料摩爾比為1:3)，加入KOH，使KOH的終濃度為85%。溫度為80。C條件下水浴回
8流30小時(shí)，分別在16小時(shí)和19小時(shí)的時(shí)候，加入0. 37 g對(duì)氨基苯丁酸(2. 0 ramol) 和85y。K0H (180 mg， 2.7 mmol)。產(chǎn)物過(guò)濾，減壓蒸餾，獲得油狀物質(zhì)。產(chǎn)物溶解 于30 mL 5%的碳酸鈉溶液，10 mL二氯甲烷洗滌兩次，水相用濃鹽酸調(diào)pH至l，收 集沉淀，干燥獲得產(chǎn)品。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)。獲得目的產(chǎn)物(半抗原) 產(chǎn)率為66%，命名為p-ABTAAT-2。產(chǎn)率的計(jì)算公式為產(chǎn)率=實(shí)際得到的產(chǎn)物的量/ 理論上得到的產(chǎn)物的量X 100%。 2、三聚氰胺半抗原的鑒定
取上述產(chǎn)物經(jīng)ESI質(zhì)譜測(cè)定其結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其分子離子峰為289 (M+l)。半抗原 化合物的元素分析結(jié)果(％): C， 54.16; H， 5.59; N， 29.15; 0， 11.10。由上可 知，化合物的分子量為288，分子中含有2個(gè)0， 13個(gè)C。說(shuō)明三聚氰胺半抗原合 成成功。三聚氰胺半抗原的分子結(jié)構(gòu)式如式I所示。
二、三聚氰胺抗原的合成與鑒定
1、 三聚氰胺抗原的合成
p-ABTAAT-2溶解于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，分別加入N，N， -二環(huán)己基碳二 亞胺(DCC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) (p-ABTAAT-2、 DMF、 DCC和NHS的投料
物質(zhì)的量比為l: 1: 1: 1) ， 3(TC下攪拌反應(yīng)18小時(shí)，離心，除去沉淀，得到溶
液I ;向溶液I中加入溶有100 mg牛血清蛋白(BSA)的水溶液5 mL (p-ABTAAT-2 與牛血清蛋白的投料物質(zhì)的量比為8: 1) ， 2(TC下攪拌反應(yīng)20小時(shí)。將溶液裝入 透析袋，用蒸餾水透析5天，離心分離出上清液，即得到三聚氰胺免疫原。計(jì)算產(chǎn) 率。產(chǎn)率的計(jì)算公式為產(chǎn)率=實(shí)際得到的產(chǎn)物的量/;理論得到的產(chǎn)物的量X10(Fo。 實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)。結(jié)果目的產(chǎn)物的產(chǎn)率為56%。
2、 三聚氰胺抗原的鑒定
按合成三聚氰胺抗原反應(yīng)所用的半抗原、載體蛋白與偶聯(lián)產(chǎn)物的比例，分別進(jìn) 行紫外(200 nm-400 nm)掃描鑒定，并通過(guò)比較三者在同一波長(zhǎng)下的吸光值計(jì)算 其結(jié)合比。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。結(jié)果表明，產(chǎn)物的紫外光譜圖與牛血清蛋白(BSA) 相比發(fā)生了明顯變化，說(shuō)明半抗原已經(jīng)與BSA成功偶聯(lián)制得三聚氰胺人工抗原。經(jīng) 計(jì)算，三聚氰胺半抗原與BSA的結(jié)合比為17: 1。
實(shí)施例4、通過(guò)三聚氰胺抗體檢測(cè)本發(fā)明抗原的效果 一、三聚氰胺抗血清的制備以實(shí)施例l制得的抗原為免疫原。實(shí)驗(yàn)選用體2 kg左右，健康的新西蘭大白 兔。實(shí)驗(yàn)免疫劑量基礎(chǔ)免疫0.5 1.0 mg/kg，加強(qiáng)免疫劑量1.0 1.5 mg/kg，用 稀釋液稀釋適量免疫原，加入等體積弗氏完全佐劑，充分乳化，在兔背部皮內(nèi)多點(diǎn) 注射進(jìn)行首免。2周后，取同樣量抗原加弗氏不完全佐劑乳化后進(jìn)行背部皮下多點(diǎn) 注射，每2周加強(qiáng)免疫一次。從第三次加強(qiáng)免疫開(kāi)始，每次免疫后第8天于兔子耳 緣靜脈采血，測(cè)定效價(jià)。
待免疫血清效價(jià)上去之后，就可采血。采血后將血液先置室溫一段時(shí)間待其凝 固，再放4。C冰箱中3 4小時(shí)，待血塊收縮后，離心，分離出血清。
二、 三聚氰胺抗體效價(jià)的測(cè)定
免疫復(fù)合物按常規(guī)方法免疫兔子。從第三次加強(qiáng)免疫開(kāi)始，每次免疫后第7天 于兔子耳緣靜脈采血。血清經(jīng)適當(dāng)稀釋后用間接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA測(cè)定效價(jià)。 六免后，兔子獲得了高效價(jià)的抗體，抗血清的效價(jià)為l: 8X104。
三、 抗血清最低檢測(cè)限(LOD值)和半數(shù)抑制量(IC5。)的檢測(cè) 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma Aldrich公司；CAS號(hào)108-78-1。 用方陣滴定法確定抗原(載體蛋白為卵清蛋白，制備方法同實(shí)施例l所示)和
三聚氰胺抗體的工作濃度，抗原的工作濃度為2pg/mL，三聚氰胺抗體的工作濃度為 1/80000 (ug/ml)。
用不同濃度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液做實(shí)驗(yàn)溶液，其濃度如下Ong/mL、 32ng/mL、 64ng/mL、 128ng/mL、 256ng/mL、 512ng/mL、 lpg/mL、 2ng/mL。采用8組平行試驗(yàn) (n=8)。
間接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA方法用上述工作濃度的抗原包被酶標(biāo)板，將實(shí)驗(yàn)溶液與抗 體溶液同時(shí)加入酶標(biāo)板小孔中，同時(shí)設(shè)置空白孔(將添加的抗體溶液換成高純水， 其它一致)和陰性對(duì)照孔(將添加的實(shí)驗(yàn)溶液用PBS溶液代替，其它一致)，37°C 溫育0.5h，倒出孔內(nèi)液體，用洗滌液(10XPBST)洗滌3-5次，將酶標(biāo)板倒置在吸水 紙上拍打；加入酶標(biāo)二抗溶液于酶標(biāo)板小孔中，37。C溫育0.5h，用洗滌液重復(fù)洗 3-5次，吸干；加入底物顯色溶液到酶標(biāo)板小孔中，室溫下反應(yīng)10-15min，用酶標(biāo) 儀在波長(zhǎng)450nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)。以吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，以三聚氰胺實(shí)驗(yàn)溶液 濃度的logw值為橫坐標(biāo)，繪制半對(duì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。結(jié)果表明標(biāo)準(zhǔn)曲線具有完整的反 S形狀，并具有上平臺(tái)和下平臺(tái)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的平行測(cè)定次數(shù)8次，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好，
10相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(變異系數(shù))均在15%以內(nèi)。
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出得出10%抑制量和半數(shù)抑制量(IC5。)，比較檢測(cè)靈敏度。
抑制率以下式計(jì)算
抑制率(0/0)= (OD鵬-ODm,n)-(ODx-ODm,n) 乂 10()%
(OD咖x-OD誦)
式中OD,為不加標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)的吸光值(即陰性對(duì)照)，OD,為標(biāo)準(zhǔn)品x時(shí)的吸光 值，OD^為空白對(duì)照孔的吸光值。
由上述公式計(jì)算得三聚氰胺抗體在緩沖液中的LOD值為49 ng/mL，半數(shù)抑制量 (IC50)為257 ng/mLo
四、三聚氰胺抗體特異性測(cè)定
抗體特異性是指它同特異性抗原結(jié)合的能力與同該抗原類似物結(jié)合能力的比 較。常用交叉反應(yīng)活性作為評(píng)價(jià)的重要標(biāo)準(zhǔn)。交叉反應(yīng)越小，抗體的特異性則越好。
將特異性抗原及其類似物做系列稀釋，分別與同一種三聚氰胺抗體和三聚氰胺 標(biāo)準(zhǔn)品建立間接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA方法，并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。在標(biāo)準(zhǔn)曲線上找出抑制率50% 的劑量和類似物抑制率50%的劑量，再計(jì)算出各類似物的交叉反應(yīng)率。
本實(shí)驗(yàn)選擇的三聚氰胺同系物為三聚氰酸、4, 6-二氨基-2-羥基-l， 3， 5-三嗪、 三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺、四環(huán)素、慶大霉素、氨芐青霉素。
用樣品稀釋液將各同系物分別稀釋成如下濃度0ng/mL、 32ng/mL、 64ng/mL、 128ng/mL、 256ng/mL、 512ng/mL、 l嗎/mL。
按照實(shí)驗(yàn)三中所述方法，各自建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定抑制中濃度ICs。。
交叉反應(yīng)率(％)=(引起50%抑制三聚氰胺的濃度/引起50%抑制類似物濃 度)x 100%。
實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)。結(jié)果，各類似物的交叉反應(yīng)率(％):三聚 氰胺100.0，三聚氰酸<10.0， 4,6-二氨基-2-羥基-1，3，5-三嗪<0. 1，三聚氰酸一 酰胺<0.1,三聚氰酸二酰胺〈0. 1，慶大霉素<0. 1，四環(huán)素<0. 1，氨芐青霉素<0. 1。
1權(quán)利要求
1、一種化合物，其分子結(jié)構(gòu)式如式I所示 id="icf0001" file="A2009100856440002C1.tif" wi="75" he="40" top= "45" left = "57" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>(式I)。
2、 一種化合物，是權(quán)利要求l中所述化合物與載體蛋白的偶聯(lián)物。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物，其特征在于所述載體蛋白為牛血清白蛋 白、人血清白蛋白、血藍(lán)蛋白或卵清白蛋白。
4、 一種制備權(quán)利要求1中式I所示的化合物的方法，包括如下步驟將2-氯 -4， 6-二氨基-1， 3， 5-三嗪和對(duì)氨基苯丁酸混合，在堿性、無(wú)水的環(huán)境下，在7(TC-80 "C的溫度下，回流反應(yīng)24-30小時(shí)，得到式I所示的化合物。
5、 一種制備權(quán)利要求2中所述化合物的方法，包括如下步驟1) 將式I所示化合物、N，N-二甲基甲酰胺、N，N， -二環(huán)己基碳化二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺混合，在2(TC-3(TC的條件下，反應(yīng)12-18小時(shí)，得到溶液I ;溫 度優(yōu)選為25°C，時(shí)間優(yōu)選為12小時(shí)；2) 向所述溶液I中加入載體蛋白，在2(TC-3(TC的條件下，反應(yīng)12-20小時(shí)， 得到權(quán)利要求2中所述偶聯(lián)物；溫度優(yōu)選為25°C，時(shí)間優(yōu)選為12小時(shí)。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述載體蛋白為牛血清白蛋白、 人血清白蛋白、血藍(lán)蛋白或卵清白蛋白。
7、 權(quán)利要求l、 2或3所述化合物在制備三聚氰胺抗體中的應(yīng)用。
8、 由權(quán)利要求2或3所述化合物免疫動(dòng)物得到的抗體。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的抗體，其特征在于所述抗體為單克隆抗體。
10、 權(quán)利要求1、 2或3所述化合物和/或權(quán)利要求8或9中所述抗體在檢測(cè)三 聚氰胺中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種三聚氰胺半抗原與抗原及其制備方法與應(yīng)用。該制備式I所示的化合物的方法，包括如下步驟將2-氯-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪和對(duì)氨基苯丁酸混合，在堿性、無(wú)水的環(huán)境下，在70℃-80℃的溫度下，回流反應(yīng)24-30小時(shí)，得到式I所示的化合物；2-氯-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪與對(duì)氨基苯丁酸的投料摩爾比為1∶(1-3)，優(yōu)選為1∶1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用本發(fā)明的抗原免疫動(dòng)物得到的抗血清的效價(jià)可達(dá)1∶8×10⁴，最低檢測(cè)限為49ng/mL，半抑制濃度為257ng/mL，產(chǎn)生的抗體的特異性高、靈敏度高、準(zhǔn)確度高。因此，本發(fā)明的抗原及抗體及方法具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C07D251/00GK101643453SQ20091008564
公開(kāi)日2010年2月10日 申請(qǐng)日期2009年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月27日
發(fā)明者吳小平, 飛 徐, 娜 李, 江海洋, 王戰(zhàn)輝, 米鐵軍, 阮永磊 申請(qǐng)人:北京維德維康生物技術(shù)有限公司