專利名稱：一種與植物分蘗數(shù)目相關(guān)的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種與植物分蘗數(shù)目相關(guān)的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
上個(gè)世紀(jì)第一次綠色革命中，育種專家培育出半矮桿的水稻和小麥品種，大大提高了作物的抗倒伏能力，成功解決了高產(chǎn)與倒伏的矛盾，從而將世界糧食產(chǎn)量提高了約2. 5倍，為解決世界糧食問題做出了巨大貢獻(xiàn)。然而當(dāng)時(shí)對與引起這場革命的基因-植物激素赤霉素的合成與信號傳導(dǎo)基因SD1和RHT1的分子本質(zhì)并不清楚。今天，我們已經(jīng)可以有目的的探索發(fā)現(xiàn)能影響作物產(chǎn)量的基因，從而利用基因工程手段加以利用，使作物產(chǎn)量能再次"革命性"提高。 油菜素內(nèi)酯是一類重要的植物激素，參與了植物生長與發(fā)育的許多過程，其中最明顯的作用是控制植株的高度與葉夾角。植株的高度與植物抗倒伏能力直接相關(guān)，而葉夾角也與植物的密植能力以及植物捕捉陽關(guān)的能力密切相關(guān)。緊湊的株型能夠大大減少植物葉片的互相遮陰，從而提高每個(gè)葉片對光的捕捉能力，提高群體的光合作用能力，最終提高群體的作物產(chǎn)量。近來，研究人員又發(fā)現(xiàn)油菜素內(nèi)酯還能夠促進(jìn)水稻分蘗的發(fā)生以及光合作用的同化產(chǎn)物從源到庫的運(yùn)輸，從而促進(jìn)水稻種子的灌漿結(jié)實(shí)(Wu， C.Y. ， Trieu，A. ， Radhakrishnan， P. ， Kwok， S. F. ， Harris, S. ， Zhang， K. ， Wang， J. ， Wan， J. ， Zhai， H.，Takatsuto， S. ， Matsumoto， S. ， Fujioka， S. ， Feldma皿，K. A. and Pe皿ell， R. I. (2008)Brassinosteroids regulate grain filling in rice.Plant Cell，20，2130_2145.)。
近二十年來在模式植物擬南芥中，油菜素內(nèi)酯的合成和信號傳導(dǎo)途徑都已經(jīng)研究的比較清楚(Gend皿，J. M. and Wang， Z. Y. (2007)Multiple mechanismsmodulatebrassinosteroid signaling. Curr Opin Plant Biol，10，436—441. 山i，J. andJin， H. (2007)Regulation of brassinosteroid signaling. Trends Plant Sci，12，37-41.)，然而在重要的單子葉模式植物水稻中，還知之甚少。在合成途徑中，已經(jīng)鑒定出基因D2、 Dll、 0sDWARF4和BRD1 ;在信號傳導(dǎo)途徑中，主要是發(fā)現(xiàn)了基因0sBRI和OsBZRl。在已經(jīng)鑒定出的有限的基因中，有兩個(gè)基因的表達(dá)抑制植株被證明能夠大大提高水稻的產(chǎn)量。第一個(gè)是一個(gè)水稻油菜素內(nèi)酯合成基因0sDWARF4的突變體osdwarf4-l (Sakamoto, T.，Morinaka， Y. ，Ohnishi，T. ， S皿ohara， H. ，F(xiàn)ujioka，S. ， Ueguchi—Tanaka， M. ，Mizutani，M.，Sakata， K. ， Takatsuto， S. ， Yoshida， S. ， Tanaka， H. ， Kitano， H. and Matsuoka， M. (2006)Erect leaves caused by brassinosteroid deficiencyincrease biomass productionand grain yield in rice. Nat Biotechnol， 24， 105—109.)。由于此突變體具有明顯的較小的葉夾角，因此特別適合于密植。田間試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，施加同樣的標(biāo)準(zhǔn)肥料，但在高密度種植條件下(44.4plants/m)，突變體植株能夠提高約32X產(chǎn)量。另一個(gè)例子是采用基因工程手段抑制油菜素內(nèi)酯受體編碼基因OsBRIl而獲得的兩個(gè)轉(zhuǎn)基因株系BKD11和BKD22 (Morinaka， Y. ， Sakamoto, T. ， Inukai， Y. ， Agetsuma， M. ， Kitano， H. ， Ashikari，M. and Matsuoka， M. (2006)Morphologicalalteration caused by brassinosteroid
3insensitivity increases the biomass and grainproduction of rice.Plant Physiol，141,924-931.)。同樣的，這兩個(gè)株系由于具有直立的葉片，在密植條件下能提高水稻產(chǎn)量10% 35%左右。最近，另外一個(gè)研究組報(bào)導(dǎo)了過表達(dá)一個(gè)油菜素內(nèi)酯合成基因從而提高水稻產(chǎn)量的例子。這種過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因水稻雖然葉片夾角變大，植物略微比野生型高，但是由于其具有更多的分蘗數(shù)，并且種粒變大變重，所以也能大大提高水稻的產(chǎn)量(Wu，C. Y.，Trieu， A. ， Radhakrishnan， P. ， Kwok， S. F. ， Harris, S. ， Zhang， K. ， Wang， J. ， Wan， J. ， Zhai，H. ， Takatsuto， S. ， Matsumoto， S. ， Fujioka， S. ， Feldma皿，K. A. and Pe皿ell， R. I. (2008)Brassinosteroids regulate grain filling in rice.Plant Cell，20，2130_2145.)。這些例子給我們提供了一個(gè)新的思路通過靈活調(diào)控油菜素內(nèi)酯在植物體內(nèi)的水平來提高水稻的產(chǎn)量。 由于油菜素內(nèi)酯自身在植物體內(nèi)的代謝平衡受到復(fù)雜的調(diào)控，因此進(jìn)一步搞清楚它的信號傳導(dǎo)途徑以及信號傳導(dǎo)與合成之間反饋調(diào)控的關(guān)系，對于最終更好的利用基因工程手段調(diào)節(jié)其在植物體內(nèi)的水平從而為分子育種服務(wù)非常重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種與植物分蘗數(shù)目相關(guān)的蛋白及其編碼基因。 本發(fā)明所提供的與植物分蘗數(shù)目相關(guān)的蛋白，名稱為DLT，來源于稻屬水稻(Oryza
sativa L.)，是如下1)或2)的蛋白質(zhì): 1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； 2)將序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物分蘗數(shù)目相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。 序列表中的序列2由617個(gè)氨基酸殘基組成，為了使1)中的DLT便于純化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。 表1.標(biāo)簽的序列
標(biāo)簽殘基序列
Poly-Arg5-6(通常為5個(gè))RRRRR
Poly-His2-10(通常為6個(gè))朋朋朋
FLAG8DYKDDDDK
Str印一tagII8WSHPQFEK
c_myc10EQKLISEEDL 上述2)中的DLT可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述2)中的DLT的編碼基因可通過將序列表中序列1的自5'末端第771-2624位堿基所示
4的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對的錯(cuò)義
突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表l所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。 上述與植物分蘗數(shù)目相關(guān)蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。 與植物分蘗數(shù)目相關(guān)蛋白的編碼基因具體可為如下1)_4)中任一所述的基因 1)其編碼序列是序列表中序列1的自5'末端第771-2624位脫氧核糖核苷酸； 2)其核苷酸序列是序列表中的序列1 ; 3)在嚴(yán)格條件下可與序列表中序列1限定的DNA序列雜交且編碼上述與植物分蘗 數(shù)目相關(guān)蛋白的DNA分子； 4)與1)的基因具有90%以上的同源性，且編碼上述與植物分蘗數(shù)目相關(guān)蛋白的 DNA分子。 所述步驟4)中的基因，與1)的基因最好有95%以上的同源性。 序列表中的序列1由3084個(gè)堿基組成，其開放閱讀框架(ORF)為自5'末端第
771-2624位堿基，編碼氨基酸序列是序列表中序列2的DLT。 上述嚴(yán)格條件可為在6 X SSC， 0. 5% SDS的溶液中，在65。C下雜交，然后用2 X SSC， 0. 1 % SDS和1 X SSC， 0. 1 % SDS各洗膜一次。 擴(kuò)增上述DLT基因全長或任一片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。 含有上述與植物分蘗數(shù)目相關(guān)蛋白編碼基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)
胞系和重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。 可用現(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有DLT基因的重組表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載 體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等，如pCAMBIA1302、 pCAMBIA3301、 pCAMBIA1300、pBI121、pBinl9、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表達(dá)載體。 攜帶有本發(fā)明與油菜素內(nèi)酯信號傳導(dǎo)相關(guān)蛋白編碼基因DLT的植物表達(dá)載體可通過Ti質(zhì) 粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法 轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞或組織中。被轉(zhuǎn)化的植物宿主是可以分蘗的植物，如水稻、小麥等。
使用DLT基因構(gòu)建重組植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種 增強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動(dòng)子、泛生 素基因Ubiquitin啟動(dòng)子(pUbi)或水稻actinl啟動(dòng)子等，它們可單獨(dú)使用或與其它的植 物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括 翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子 等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起 始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起 始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。 為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所用植物表達(dá)載體進(jìn)行 加工，如加入可在植物中表達(dá)可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素 酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物或潮霉素磷酸轉(zhuǎn) 移酶標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。 所述重組表達(dá)載體具體可為在pCAMBIA1302的多克隆位點(diǎn)間插入序列表中序列1 的自5'末端第771-2624位脫氧核苷酸得到的重組表達(dá)載體pCAMBIA1302-DLT。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種提高植物分蘗數(shù)目的方法。
5
本發(fā)明所提供的提高植物分蘗數(shù)目的方法，是將上述與植物分蘗數(shù)目相關(guān)蛋白的
編碼基因DLT導(dǎo)入植物中，得到分蘗數(shù)目提高的轉(zhuǎn)基因植物。 所述植物為可以分蘗的植物，如水稻、小麥等。 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。 本發(fā)明所提供的培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將上述與植物分蘗數(shù)目相關(guān)蛋白的編 碼基因DLT導(dǎo)入植物中，得到轉(zhuǎn)基因植物。該轉(zhuǎn)基因植物的分蘗數(shù)目明顯增多。
所述植物為可以分蘗的植物，如水稻、小麥等。 本發(fā)明利用一個(gè)水稻半矮化少分蘗的突變體，使用圖位克隆技術(shù)克隆出DLT基因 并進(jìn)行了分子互補(bǔ)驗(yàn)證。油菜素內(nèi)酯的敏感性測試以及油菜素內(nèi)酯相關(guān)基因的表達(dá)分析表 明，DLT參與了油菜素內(nèi)酯的信號傳導(dǎo)過程從而控制著水稻的高度、分蘗以及其它表型。將 DLT基因轉(zhuǎn)入水稻中發(fā)現(xiàn)，DLT基因表達(dá)水平升高的轉(zhuǎn)基因水稻分蘗數(shù)目明顯增多。本發(fā)明 在利用基因工程手段調(diào)控植物激素水平進(jìn)行分子育種提高作物產(chǎn)量上具有潛在的應(yīng)用價(jià) 值。


圖1為突變體水稻與野生型水稻的表型比較。 圖2為轉(zhuǎn)入DLT基因的陽性株系的PCR電泳檢測圖和表型圖。 圖3為葉夾角敏感性測試。 圖4為DLT基因在不同器官和組織中的表達(dá)情況。
圖5為DLT基因的表達(dá)水平受油菜素內(nèi)酯的負(fù)調(diào)控。
圖6為DLT突變體中油菜素內(nèi)酯相關(guān)基因的表達(dá)。
圖7為轉(zhuǎn)基因水稻中DLT基因的表達(dá)水平鑒定及表型。
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和生物材 料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。 下述實(shí)施例中涉及的水稻品種為中花11、明恢63和Shiokari，以上水稻品種均來 自中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所。 實(shí)施例1、與植物分蘗數(shù)目相關(guān)蛋白DLT及其編碼基因的獲得
1 、突變體的獲得及其表型 從一個(gè)水稻突變體庫(來自中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所)中發(fā)現(xiàn)一個(gè) 矮化的突變體，此突變體不僅植株高度半矮而且分蘗數(shù)目明顯減少，該突變體的表型如圖1 所示。其中，WT為野生型水稻，dlt為上述篩選得到的突變體水稻。此突變體水稻的植株高 度約為野生型水稻中花ll的60%，分蘗數(shù)目約為野生型水稻的一半，且株型緊湊、葉片和 穗部直立、植株育性下降、倒二莖節(jié)比例明顯下調(diào)；顯微切片觀察發(fā)現(xiàn)，突變體水稻的細(xì)胞 長度變小、細(xì)胞排列相對紊亂。以上表型結(jié)果表明，上述獲得的突變體水稻是一個(gè)比較典型 的油菜素內(nèi)酯缺陷突變體。
2、采用圖位克隆技術(shù)獲得DLT基因 對上述步驟1獲得的突變體水稻進(jìn)行遺傳分析，結(jié)果表明，此突變體水稻的表型是由一個(gè)隱性的單基因控制的。將上述步驟1獲得的突變體水稻與明恢63進(jìn)行雜交，構(gòu)建 了 &代群體進(jìn)行圖位克隆。將控制突變體水稻表型的基因定位到第六染色體的短臂端一個(gè) 約1300Kbp的區(qū)域。因?yàn)橹g沒有其它分子標(biāo)記可用，計(jì)算遺傳距離發(fā)現(xiàn)，候選基因距離一 個(gè)分子標(biāo)記約0. 5厘摩爾根的遺傳距離。在此區(qū)域發(fā)現(xiàn)一個(gè)注釋為GRAS家族蛋白的編碼 基因(http:〃www. tigr. org/)，測序發(fā)現(xiàn)此基因編碼區(qū)有62個(gè)堿基的缺失，將此基因命名 為DLT。 DLT的核苷酸序列如序列表中序列1所示，其編碼的氨基酸序列如序列表中序列2 所示。 3、互補(bǔ)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 從一個(gè)BAC克隆0SJNBa0038F22(購自Arizona Genomics Institute)上，利用限 制性酶BamHI和Kpnl (購自Promega公司)雙酶切，切下來一個(gè)7577個(gè)堿基的片段，此片 段含有上述DLT基因的全序列。回收此片段，連接到雙元載體pCAMBIA1300(購自Cambia， 澳大禾U亞，http:〃www. cambia.org/daisy/cambia/home.html)上，并轉(zhuǎn)化導(dǎo)入農(nóng)桿菌 AGL1(購自ATCC)中，利用其侵染上述步驟1篩選得到的突變體水稻的愈傷組織，具體方法 參見如下參考文獻(xiàn)易自力，曹守云，王力，何鍶潔，儲成才，唐祚舜，周樸華，田文忠.提高 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻頻率的研究，遺傳學(xué)報(bào).2001,28(4) :352-358。經(jīng)潮霉素抗性篩選獲得再 生植株后，利用缺失片段兩端的引物正向引物5' -CATCAATCCATTGCAGGGACGAT-3'和反向 引物5'-CGTTGAGCGTGAAGTGCAGGAA-3'對再生植株的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選陽性株 系。PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖2a所示。其中，dlt-C表示篩選得到的陽性株系水稻的PCR擴(kuò)增結(jié) 果，WT表示野生型水稻的PCR擴(kuò)增結(jié)果，dlt表示上述步驟1篩選得到的突變株水稻的PCR 擴(kuò)增結(jié)果。324bp條帶表示缺失了 62個(gè)堿基的條帶，說明此株系背景為突變體水稻；386bp 條帶表示轉(zhuǎn)入了 DLT基因得到陽性植株。上述各株系水稻的表型如圖2b所示，結(jié)果表明， 篩選得到的陽性株系水稻的表型恢復(fù)正常，說明DLT基因是導(dǎo)致突變體水稻不正常表型的 基因。 實(shí)施例2、DLT基因參與油菜素內(nèi)酯的信號傳導(dǎo) 1 、突變體水稻和野生型水稻對油菜素內(nèi)酯的敏感性比較 按照文獻(xiàn)Hong， Z. ， Ueguchi-Tanaka， M. ， Umemura， K. ， Uozu， S. ， Fujioka， S. ， Takatsuto， S. ， Yoshida， S. ， Ashikari， M. ， Kitano， H. and Matsuoka， M. (2003)A ricebrassinosteroid_deficient mutant, ebisu dwarf (d2)， is caused by a loss of function of anew member of cytochrome P450. Plant Cell, 15， 2900-2910.的方法采用 微滴法測試野生型水稻和上述實(shí)施例1篩選得到的突變體水稻的葉夾角對油菜素內(nèi)酯的 敏感性。將野生型水稻中花ll(來自于中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所)和上述實(shí)施 例1篩選得到的突變體水稻的種子經(jīng)過兩天3(TC萌發(fā)后，選取萌發(fā)狀態(tài)一致的種子播種在 水中，3(TC光照培養(yǎng)箱里再經(jīng)過三天的生長(10小時(shí)光照/14小時(shí)黑暗)，然后將lul分別 溶解有0ng、10ng、100ng和1000ng油菜素內(nèi)酯(E1641，購自Sigma公司)的乙醇滴到水稻 第二個(gè)葉片的頂端。同樣條件下再經(jīng)過三天生長后，比較此葉片與葉鞘的夾角。結(jié)果如圖 3a所示。其中，WT為野生型水稻，dlt為上述篩選得到的突變體水稻。結(jié)果表明，上述實(shí)施 例1篩選得到的突變體水稻對不同濃度的油菜素內(nèi)酯基本沒有反應(yīng)，而野生型水稻對油菜 素內(nèi)酯比較敏感，滴加的油菜素內(nèi)酯濃度越高，葉片與葉鞘的夾角越大。
另 一 禾中敏感性更高的方法(Wada， K. ， Marumo， S. ， Ikekawa， N. ， Morisaki，M. andMori， K. (1981)Brassinolide and homobrassinolide promotion of lamina inclination ofrice seedlings. Plant Cell Physiol. ， 22， 323—325.)是4f里予生型7JC稻和 上述實(shí)施例1篩選得到的突變體水稻的種子在3(TC經(jīng)過兩天的萌發(fā)后，選取萌發(fā)狀態(tài)一致 的種子播種在浸水的絲網(wǎng)上，在30。C完全黑暗的條件下經(jīng)過8天的生長，取最上面一段帶 有1個(gè)葉片和1個(gè)葉鞘的部分，葉片和葉鞘均保留lcm的長度，將此段植株黑暗條件下浮于 純水上24小時(shí)后，分別置于不含油菜素內(nèi)酯和油菜素內(nèi)酯的終濃度為5ng/ml的2. 5mmo1/ L馬來酸鉀溶液中，再經(jīng)過48小時(shí)后，比較葉片夾角的大小。結(jié)果如圖3b所示。其中，WT 為野生型水稻，dlt為上述篩選得到的突變體水稻。-BL表示將水稻置于不含油菜素內(nèi)酯的 馬來酸鉀溶液中，+81^表示將水稻置于油菜素內(nèi)酯的終濃度為5ng/ml的馬來酸鉀溶液中。 結(jié)果表明，上述實(shí)施例1篩選得到的突變體水稻對油菜素內(nèi)酯的敏感性明顯低于野生型水 稻。 2、 DLT基因在不同組織中的表達(dá)情況 取上述實(shí)施例1篩選得到的突變體水稻不同器官或組織，分別提取其RNA，采用購 自Promega公司的匪LV逆轉(zhuǎn)錄酶并參照相應(yīng)的使用方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后利用實(shí)時(shí)熒光 定量PCR技術(shù)，根據(jù)廠家(Bio-Rad公司)提供的使用方法，在PCR體系中加入SYBR green I熒光染料，在熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司)上檢測DLT基因的表達(dá)情況；同時(shí)以水稻 ACTIN1基因?yàn)閮?nèi)參。檢測DLT基因的正向引物的序列為5'-TGCGGATACTCAACGCCATCA-3'， 反向引物的序列為5' -ACTCGCCGACTCCGGTGATC-3';檢測ACTIN1基因的正向引物的序列 為5' -AGCAACTGGGATGATATGGA-3'，反向引物的序列為5' -CAGGGCGATGTAGGAAAGC-3'。實(shí) 驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，DLT基因在不同器官和組織中的表達(dá)情況如圖4所示，縱軸表示各器官和組 織中DLT基因與ACTIN1基因的表達(dá)量之比。其中，圖4a為DLT基因在根、莖、葉和花中的 表達(dá)情況，圖4b為DLT基因在不同莖節(jié)中的表達(dá)情況。 結(jié)果表明，DLT基因在花、莖和根中的表達(dá)量相對較高，在葉片中的表達(dá)量較低； 在不同莖節(jié)中發(fā)現(xiàn)，DLT基因在倒二節(jié)中的表達(dá)量比在其它節(jié)的表達(dá)量都低。這種表達(dá)情 況與其特異縮短的倒二節(jié)比例相對應(yīng)，也與已經(jīng)報(bào)道的OsBRI的表達(dá)模式(Yamamuro， C.， Ihara， Y. ， Wu， X. ， Noguchi， T. ， Fujioka， S. ， Takatsuto， S. ， Ashikari， M. ， Kitano， H. and Matsuoka，M. (2000)Loss of function of a rice brassinosteroidinsensitivel homolog prevents internode elongation and bending of the lamina joint. Plant Cell,12， 1591-1606.)相一致。說明DLT基因參與了油菜素內(nèi)酯的信號傳導(dǎo)途徑。
3、DLT基因受油菜素內(nèi)酯負(fù)調(diào)節(jié) 將l咖ol/L油菜素內(nèi)酯(E1641，購自Sigma公司)噴灑到萌發(fā)一周的野生型水稻 Shiokari幼苗上，噴后不同的時(shí)間點(diǎn)取水稻提取其RNA，反轉(zhuǎn)錄后利用定量PCR技術(shù)檢測 DLT基因的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，將沒有噴灑油菜素內(nèi)酯前水稻中DLT基因的表達(dá)水平設(shè) 定為1，噴灑油菜素內(nèi)酯后不同時(shí)間點(diǎn)DLT基因的表達(dá)情況如圖5a所示。結(jié)果表明，噴灑油 菜素內(nèi)酯后，DLT基因的表達(dá)水平逐漸降低，在12小時(shí)后到達(dá)最低，約為處理前的40%。
進(jìn)而采用上述相同方法檢測在油菜素內(nèi)酯合成突變體d2-l和dll-2(Hong， Z. ， Ueguchi—Tanaka， M. ， Umemura， K. ， Uozu， S. ， Fujioka， S. ， Takatsuto， S. ， Yoshida， S. ， Ashikari， M. ， Kitano， H. and Matsuoka， M. (2003)A rice brassinosteroid_deficientmutant，ebisu dwarf(d2)，is caused by a loss of function
8of a new member of cytochromeP450. Plant Cell, 15，2900—2910. Tanabe，S. ， Ashikari， M. ， Fujioka， S. ， Takatsuto， S. ， Yoshida， S. ， Yano， M. ， Yoshimura， A. ， Kitano， H.， Matsuoka，M. ，F(xiàn)ujisawa，Y. ，Kato，H.and Iwasaki，Y. (2005)A novel cytochrome P450 is implicated in brassinosteroidbiosynthesis via the characterization of a rice dwarf mutant, dwarf11， with reduced seedlength. Plant Cell,17，776-790.)中DLT基 因的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，將DLT基因在野生型水稻Shiokari中的表達(dá)水平設(shè)定為 1，計(jì)算DLT基因在這兩個(gè)合成突變體中與野生型中表達(dá)水平的比值。DLT基因在野生型水 稻Shiokari、油菜素內(nèi)酯合成突變體d2-l和dll_2中的表達(dá)情況如圖5b所示。結(jié)果表明， DLT基因在油菜素內(nèi)酯合成突變體d2-l和dll-2中的表達(dá)量比在野生型水稻Shiokari中 的表達(dá)量明顯升高。 以上結(jié)果說明，DLT基因的表達(dá)受油菜素內(nèi)酯的負(fù)調(diào)控。
4、突變體水稻中與油菜素內(nèi)酯相關(guān)基因的表達(dá) 采用熒光定量PCR方法檢測上述實(shí)施例1篩選得到的突變體水稻中幾個(gè)已知的 油菜素內(nèi)酯合成基因D2、 Dll、 0sCPD、 0sBR6ox和兩個(gè)可能在油菜素內(nèi)酯信號傳導(dǎo)下游受 其誘導(dǎo)的基因0sXTRl、0sBLE2的表達(dá)水平。其中擴(kuò)增基因D2、D11和0sCPD的引物序列見 參考文獻(xiàn)Shimada， A. ， Ueguchi-Tanaka， M. ， Sakamoto, T. ， Fujioka， S. ， Takatsuto， S.， Yoshida， S. ， Sazuka， T. ， Ashikari， M. and Matsuoka， M. (2006) The rice SPI亂Y gene functions as a negative regulator of gibberellin signaling bycontrolling the suppressive function of the DELLA protein, SLRl， and modulatingbrassinosteroid synthesis. Plant J， 48， 390-402.擴(kuò)增基因0sBR6ox的引物的正向序列為 5' -CAGGTACGGGAGCGTGTT-3',反向序列為5' -TGAAGCCTTGGTAGTAGTTGGT-3'。擴(kuò)增基 因0sXTRl的引物序列見參考文獻(xiàn)Duan， K. ， Li， L. ， Hu， P. ， Xu， S. P. ， Xu， Z. H. and Xue， H. W. (2006)Abrassinolide-suppressed rice MADS-box transcription factor, OsMDPl， has a negativeregulatory role in BR signaling. Plant J，47， 519-531 。 擴(kuò)增基因 0sBLE2的引物序列見參考文獻(xiàn)Yang，G. ，Matsuoka，M. ， Iwasaki， Y. and Komatsu， S. (2003) A novelbrassinolide-enhanced gene identified by cDNA microarray is involved in the growth ofrice. Plant Mol Biol， 52， 843-854。將野生型水稻中花11中上述各基因的 表達(dá)水平設(shè)定為1，計(jì)算上述各基因在突變體水稻中和野生型水稻中表達(dá)水平的比例。實(shí)驗(yàn) 設(shè)三次重復(fù)，結(jié)果如圖6所示。 結(jié)果表明，幾個(gè)已知的油菜素內(nèi)酯合成基因D2、 Dll、 0sCPD、 0sBR6ox在突變體水 稻中的表達(dá)都有明顯的積累，說明由于信號傳導(dǎo)的缺陷，導(dǎo)致了對上游合成基因的反饋調(diào) 控；而對于兩個(gè)可能在油菜素內(nèi)酯信號傳導(dǎo)下游受其誘導(dǎo)的基因0sXTRl、0sBLE2的表達(dá)水 平的檢測結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)，這些基因的表達(dá)下調(diào)，說明由于DLT基因的缺失導(dǎo)致信號傳導(dǎo)的弱
化而引起下游基因被誘導(dǎo)的強(qiáng)度減弱。 實(shí)施例3 、轉(zhuǎn)DLT基因的水稻分蘗數(shù)目增多 1、含有DLT基因的表達(dá)載體的構(gòu)建 利用PCR方法，以5' -CCATGGATGTTGGCGGGTTGCTCGTTCTCGT-3'為正向引物，以5' -AGATCTGATGTTGGCGGGTTGCTCGTTCTCGT-3'為反向引物，從水稻基因組DNA中擴(kuò)增出DLT基 因的開放閱讀框序列，即序列表中序列1的自5'末端第771-2621位堿基。在正、反向引物末端分別添加限制性酶Ncol和BglII的酶切位點(diǎn)。將PCR產(chǎn)物回收后連接入pMD18-T載 體(購自TAKARA公司)中，經(jīng)測序確保正確后利用Ncol與BglII進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物連 接入雙元表達(dá)載體pCAMBIA1302(購自Cambia，澳大利亞，http:〃麗w. cambia. org/daisy/ cambia/home. html)中，即得到含有DLT基因的重組表達(dá)載體pCAMBIA1302_DLT。
2、轉(zhuǎn)DLT基因的水稻的獲得、篩選以及鑒定將上述步驟1構(gòu)建的重組表達(dá)載體1302-35S-DLT通過農(nóng)桿菌AGL1 (購自ATCC) 導(dǎo)入到水稻品種中花ll的愈傷組織中，具體的轉(zhuǎn)化篩選方法參見如下文獻(xiàn)易自力，曹守 云，王力，何鍶潔，儲成才，唐祚舜，周樸華，田文忠.提高農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻頻率的研究，遺傳 學(xué)報(bào)，2001，2S(4) :352-358。經(jīng)抗性篩選獲得10株T。代轉(zhuǎn)基因陽性植株。
3、DLT基因表達(dá)水平的鑒定及相應(yīng)表型 分別提取此10株T。代轉(zhuǎn)基因陽性植株的RNA，采用熒光定量PCR技術(shù)檢測DLT基 因的表達(dá)水平，具體檢測方法同實(shí)施例2。將野生型水稻中花11中DLT基因的表達(dá)水平設(shè) 定為l，計(jì)算DLT基因在轉(zhuǎn)基因株系和野生型水稻中表達(dá)水平的比例。實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，DLT 基因的表達(dá)情況如圖7a所示。其中7株T。代轉(zhuǎn)基因陽性植株的DLT基因表達(dá)水平大大上 調(diào)。對此7株T。代轉(zhuǎn)基因陽性植株進(jìn)行表型觀察，結(jié)果表明，其中DLT基因表達(dá)水平升高 大于100倍的5株T。代轉(zhuǎn)基因陽性植株均表現(xiàn)出巻葉、葉夾角增大、分蘗增多、稍微矮化的 表型，如圖7b中5號植株；而另外兩株T。代轉(zhuǎn)基因陽性植株中，DLT基因表達(dá)水平的升高 小于野生型100倍，表現(xiàn)出明顯的分蘗數(shù)目增多、植株稍變高，如圖7b中10號植株。
以上結(jié)果說明，DLT基因表達(dá)水平的增加能導(dǎo)致水稻植株產(chǎn)生更多的分蘗。
序列表 〈110〉中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所 〈120〉 一種與植物分蘗數(shù)目相關(guān)的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用 〈130〉CGGNARZ82117 〈160>2 〈210>1 〈211>3084 〈212>DNA 〈213〉水稻(Oryza sativa L.)
〈400〉 1gagtg卿gtg卿gagtgag3gC3gag3CC3CC3CC3CCgg卿ggttegtg卿g郷603gtggt皿tggtg3ggC33Ca卿gteggttccatttcatatcatcactaggategcgte120gtttgteggctgcatctccatctccatcgccattgattcgcattgcatccatcattttag180gatgttctactegggttcttgatttttcttttggtttgttgttttgacga240tgttgggattcgccgcctgctgctcgtcgtcgtcgtcgccccgtgcgggc300tctgccccggcatgtccgatcgttcgtgatttgttttttctacatgttttagggcccatt360tgttcttgatcctattctttgattcttttgtactaagcattcteaggcgaagccacccat420tctttcctgcagcccccatctgatctcaca■ctctctctttttttctcagttttttctttg ttgatttect gaccaaattc tttggaagaa540c朋c皿gatcatctggtttttatctgctca ttcttttgte catcgaatca tetecatttc600
10
cattccaccaaagccttegccagateccac卿g卿gtgtgagag^atC3g3gtg3g3660朋C3g3gg3gg朋g朋g朋g朋g皿gacgagg郷郷agg郷郷agcElgg郷ElggEl720ggaggtctcttcttggcacgtcgcgttccggcgagtgacgtgtctccgggatgttggcgg780gttgctcgttctcgtcgtcgtgagcaccgcgcagcgtttcgacatcctcc840cctgcggcttctccaagcgcggcagccgcggcgacggcgccgccccgcgggtcgccggcg■acgccaggagcggcgccaccacctgctccttccggacgcaccccgcgccgccggtcaccc960agtccgtgtcCtggggCgCC朋gccggagcccggcggc皿tggc皿tggcgcccaccgcg1020ccgtteagcgggcgcatgacg郷acgcggtcg郷agtetggccccattgttcgcgcca1080agcggacgcgg3tgggcggcgacggcgatg郷tetggttccatcaatccElttgCElgggEl1140cgatgc朋gcgEicggcggcggg卿郷ag郷郷cggagtcttcttgg1200tgccgagcgcggcggcgttcccgcacggcatggccgccgcggggccatcgctggccgcgg1260cc朋g朋ggaggagtecagcaagtcgccgtccgactcgtcgtcctcgtcgggcacggacg1320gcggctcgtcggcgatgatgccgccgccgcagccgcccgagttcgacgcgElgg雄ggCg1380tgccggcgccggggc郷cggagcggg郷cgctggagctggtgcgcgcgctcaccgcgt1440gcgccgactccctctccgccggc皿ccacgaggccgcc皿ctectecctggcccggctcg1500gcg卿tggcctcgccggcggggcccacgccgatgcaccgcgtggccgcctecttcaccg1560aggcgctcgcgctccgcgtcgtgcgcatgtggccgcacatgttcgacatcggcccgccgc1620gggagctcaccgacgacgccttcggcggcggcgacgacgacgccatggcgctgcggatec1680tcaacgccatcacgcccatcccgaggttcctgcacttcacgctc皿cgagcgcctcctcc1740gcgagttcgaggggC3Cg3gcgcgtccacgtcatcgacttcgacatc朋gcaggggctcc1800aatggccgggcttgctccagagcctggccgcgcgggcggtgcctccggcgcacgtgcgga1860tcaccggagtcggcgagtcg郷c郷agctgcaggagacggg賜cgcggctggcgcgcg1920tcgccgccgcgctcggcctggcgttcgagttccacgccgtggtcgaccggctcgaggacg1980tccgcctgtggatgctccacgtc皿gcgcggcgagtgcgtggccgtg皿ctgcgtcctcg2040ccatgcaccgcctgctccgcgacgacgccgcgctgaccgacttcctggggctegcgcgca2100gcacgggcgccaccatcctcctcctcggcgcggcggcctcaactcgggga2160ggtggg郷cgcggttcgcgcgcgcgctgcggtectecgccgcggcgttcg3CgCggtgg22203CgCggCggggctgccggaggcgagccccgggcgg郷agatgttcgcgc2280ggg卿tccgcaacgcggtggcgttcgagggccccgagcggttcgagcgcC3Cg3g3gCt2340tcgccgggtggcggcggcgcgcggcgggttc皿g皿cgccggcatcggcg2400agcgcgaggcgEltgC郷ggcgcatgatcgcgggccggac朋gtecaccg2460tgcaggcgcacggcggcggcggragcggcggcggcg郷cgctcacgctccggtggctgg2520accagccgctgtecaccgtgacggcgtggaCgCCggCgggcgacggcgcggg郷CElgCEl2580ccgtgtcggcgtccacaacagcatcacattCtC3gC皿3gcteagctgacgEltg朋tggt2640g￡ltteggtg￡lctttttttecagtgcttcttttgttaatga2700tgattegttcatecagtetgacaattcttttetecattcagag朋皿g皿2760朋ggtgtegttttttgttttategattgat郷tgg腿g2820attcaatttttegattgteattctttateaatettcttttggctgttgagagagagtccc2880ctgc朋朋tgtagctgcatgteg皿ga皿g3gcagtegat3gattegcag2940
11
gggcagcatc tctcacagtc actettagtg tctccggctg ttetteteca acattettet3000tecaatcaaa ttctttcatc attcattcte catgtaatct ctgttcagaa tcagaatgaa3060atgaaacatg tgttatattt ctcc3084〈210>2〈211>617〈212>PRT〈213>水稻(0ryza sativaL.)〈400>2MetLeuAlaGlyCysSerPheSerSerSerArgHisGinMetSerThr151015AlaGinArgPheAsplieLeuProCysGlyPheSerLysArgGlySer202530ArgGlyAspGlyAlaAlaProArgValAlaGlyAspAlaArgSerGly354045AlaThrThrCysSerPheArgThrHisProAlaProProValThrGin505560SerValSerTrpGlyAlaLysProGluProGlyGlyAsnGlyAsnGly65707580AlaHisArgAlaValLysArgAlaHisAspGluAspAlaValGluGlu859095TyrGlyProlieValArgAlaLysArgThrArgMetGlyGlyAspGly100105110AspGluValTrpPheHisGinSerlieAlaGlyThrMetGinAlaThr115120125AlaAlaGlyGluGlyGluGluAlaGluGluGluLysValPheLeuVal130135140ProSerAlaAlaAlaPheProHisGlyMetAlaAlaAlaGlyProSer145150155160LeuAlaAlaAlaLysLysGluGluTyrSerLysSerProSerAspSer165170175SerSerSerSerGlyThrAspGlyGlySerSerAlaMetMetProPro180185190ProGinProProGluPheAspAlaArgAsnGlyValProAlaProGly195200205GinAlaGluArgGluAlaLeuGluLeuValArgAlaLeuThrAlaCys210215220AlaAspSerLeuSerAlaGlyAsnHisGluAlaAlaAsnTyrTyrLeu225230235240AlaArgLeuGlyGluMetAlaSerProAlaGlyProThrProMetHis
245250255ArgValAlaAlaTyrPheThrGluAlaLeuAlaLeuArgValValArg260265270MetTrpProHisMetPheAsplieGlyProProArgGluLeuThrAsp275280285AspAlaPheGlyGlyGlyAspAspAspAlaMetAlaLeuArglieLeu290295300AsnAlalieThrProlieProArgPheLeuHisPheThrLeuAsnGlu305310315320ArgLeuLeuArgGluPheGluGlyHisGluArgValHisVallieAsp325330335PheAsplieLysGinGlyLeuGinTrpProGlyLeuLeuGinSerLeu340345350AlaAlaArgAlaValProProAlaHisValArglieThrGlyValGly355360365GluSerArgGinGluLeuGinGluThrGlyAlaArgLeuAlaArgVal370375380AlaAlaAlaLeuGlyLeuAlaPheGluPheHisAlaValValAspArg385390395400LeuGluAspValArgLeuTrpMetLeuHisValLysArgGlyGluCys405410415ValAlaValAsnCysValLeuAlaMetHisArgLeuLeuArgAspAsp420425430AlaAlaLeuThrAspPheLeuGlyLeuAlaArgSerThrGlyAlaThr435440445lieLeuLeuLeuGlyGluHisGluGlyGlyGlyLeuAsnSerGlyArg450455460TrpGluAlaArgPheAlaArgAlaLeuArgTyrTyrAlaAlaAlaPhe465470475■AspAlaValAspAlaAlaGlyLeuProGluAlaSerProAlaArgAla485490495LysAlaGluGluMetPheAlaArgGlulieArgAsnAlaValAlaPhe500505510GluGlyProGluArgPheGluArgHisGluSerPheAlaGlyTrpArg515520525ArgArgMetGluAspGlyGlyGlyPheLysAsnAlaGlylieGlyGlu530535540ArgGluAlaMetGinGlyArgMetlieAlaArgMetPheGlyProAsp545550555560
Lys Tyr Thr Val Gin Ala His Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Glu
565 570 575 Ala Leu Thr Leu Arg Trp Leu Asp Gin Pro Leu Tyr Thr Val Thr Ala
580 585 590 Trp Thr Pro Ala Gly Asp Gly Ala Gly Gly Ser Thr Val Ser Ala Ser
595 600 605Thr Thr Ala Ser Hi s Ser Gin Gin Ser
610 615
1權(quán)利要求
一種蛋白，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物分蘗數(shù)目相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。
2. 權(quán)利要求l所述蛋白的編碼基因。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述蛋白的編碼基因?yàn)槿缦?)_4)中任一所述的基因1) 其編碼序列是序列表中序列1的自5'末端第771-2624位脫氧核糖核苷酸；2) 其核苷酸序列是序列表中的序列1 ;3) 在嚴(yán)格條件下可與序列表中序列1限定的DNA序列雜交且編碼上述與植物分蘗數(shù)目 相關(guān)蛋白的DNA分子；4) 與l)的基因具有90X以上的同源性，且編碼上述與植物分蘗數(shù)目相關(guān)蛋白的DNA 分子。
4. 含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和重組菌。
5. 擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述基因的全長或任一片段的引物對。
6. 權(quán)利要求1所述的蛋白或權(quán)利要求2或3所述的基因在提高植物分蘗數(shù)目中的應(yīng)用。
7. —種提高植物分蘗數(shù)目的方法，是將權(quán)利要求2或3所述的編碼基因轉(zhuǎn)入植物中，得 到分蘗數(shù)目提高的的轉(zhuǎn)基因植物。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述植物為水稻或小麥。
9. 一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將權(quán)利要求2或3所述的編碼基因轉(zhuǎn)入植物中，得到 轉(zhuǎn)基因植物。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述植物為水稻或小麥。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種與油菜素內(nèi)酯信號傳導(dǎo)相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。該蛋白，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物分蘗數(shù)目相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明利用一個(gè)水稻半矮化少分蘗的突變體克隆出DLT基因并進(jìn)行了分子互補(bǔ)驗(yàn)證。結(jié)果表明，DLT參與了油菜素內(nèi)酯的信號傳導(dǎo)過程從而控制著水稻的高度、分蘗以及其它表型。將DLT基因轉(zhuǎn)入水稻中發(fā)現(xiàn)，DLT基因表達(dá)水平升高的轉(zhuǎn)基因水稻分蘗數(shù)目明顯增多。本發(fā)明在利用基因工程手段調(diào)控植物激素水平進(jìn)行分子育種提高作物產(chǎn)量上具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號C07K14/415GK101768213SQ20081024736
公開日2010年7月7日 申請日期2008年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月30日
發(fā)明者儲成才, 劉文波, 方軍, 朱立煌, 李峰, 童紅寧, 金蕓 申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所