專(zhuān)利名稱(chēng)：：具有抗腫瘤作用的烏骨藤碳-21甾體皂苷混合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種從中藥烏骨藤(AfaM&mhte腦ch/"w)中提取分離得到的具有抗腫瘤作用的碳一21甾體苷混合物一烏骨藤總苷H和以該類(lèi)化合物為活性成分的藥物組合物，以及它們?cè)诳鼓[瘤方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：癌癥是當(dāng)今世界最大的疑難病癥之一。大量的臨床和實(shí)驗(yàn)研究證明，中醫(yī)藥在癌癥的防治和康復(fù)方面具有重要的作用，從中草藥中尋找抗癌活性成分，不僅對(duì)發(fā)現(xiàn)新藥有很大潛力，而且可為設(shè)計(jì)更理想的新藥提供獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)。因此，很多國(guó)家和制藥企業(yè)把抗癌藥物開(kāi)發(fā)的重點(diǎn)逐步轉(zhuǎn)向天然藥物。烏骨藤，為蘿摩科植物，具有清熱解毒、化痰軟堅(jiān)之功效。以烏骨藤單味制成的制靴'消癌平片"和"消癌平注射液"臨床用于治療食道癌、胃癌、肺癌、肝癌，取得較好的療效，但存在以下幾個(gè)問(wèn)題(l)提取工藝有待改進(jìn)"消癌平片"系烏骨藤水提取后加工制成的片劑，每日服用量24-30片。成分復(fù)雜，成品體積大，有效成分相對(duì)含量低，生物利用度低，服用量大；"消癌平注射液"系烏骨藤水提取浸膏，加聚山梨酯80加工制成的注射劑，以聚山梨酯80作增溶劑，毒副作用大。(2)質(zhì)量控制技術(shù)落后"消癌平片"質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅有理化鑒別項(xiàng)；"消癌平注射液"用分光光度法測(cè)定總酚酸的含量。(3)有效成分有待確證。烏骨藤中綠原酸等酚酸類(lèi)成分僅為其抗炎有效成分，而其中的抗癌有效成分尚不明確。近年來(lái)，隨著新的提取分離技術(shù)的產(chǎn)生，并應(yīng)用于藥物的生產(chǎn)中，同時(shí)政府十分重視提高中藥產(chǎn)品的附加值和技術(shù)含量，從而提高藥物的療效。因此十分有必要對(duì)烏骨藤抗腫瘤作用有效成分進(jìn)行進(jìn)一步的研究與開(kāi)發(fā)，闡明其中的有效成分或有效部位，這不僅對(duì)加快傳統(tǒng)中藥產(chǎn)業(yè)改造，實(shí)施中藥現(xiàn)代化工程及促進(jìn)醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展有重要意義，而且對(duì)創(chuàng)制具有我國(guó)特色、擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)、并符合國(guó)際規(guī)范的新藥有重要的指導(dǎo)意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是通過(guò)現(xiàn)代化學(xué)和藥理手段，從烏骨藤中提取分離出具有抗腫瘤作用的碳一21甾體苷混合物一烏骨藤總苷H。本發(fā)明從烏骨藤中提取分離具有抗腫瘤作用的碳一21甾體苷類(lèi)化合物，得到5種碳一21甾體苷，分別為通光藤苷A，通光藤苷B，通光藤苷C，通光藤苷D，MarsdenosideK，以及包含這5種碳一21甾體苷的混合物一烏骨藤總苷H。該混合物中，一般地其碳一21甾體苷類(lèi)化合物的重量含量^80%。烏骨藤總苷H的制備方法，該方法包括以下步驟a.將烏骨藤的莖粉碎后，以乙醇提?。籦.乙醇提取液濃縮后經(jīng)硅膠柱層析，氯仿一乙醇進(jìn)行梯度洗脫；c.用薄層層析檢測(cè)層析流分，具有相同單一斑點(diǎn)的流分合并濃縮，得到含上述碳一21甾體苷類(lèi)化合物的流份即為烏骨藤總苷H。本發(fā)明提取的烏骨藤總苷H，在動(dòng)物體內(nèi)抗腫瘤試驗(yàn)中，對(duì)小鼠移植性腫瘤S18。肉瘤及H22實(shí)體瘤具有明顯的抑制作用。本發(fā)明中烏骨藤總苷H所包含的5種碳一21甾體皂苷是下列5個(gè)化學(xué)結(jié)構(gòu)所示的5種甾體皂苷元之一與同一種糖鏈形成的5種糖苷，其中R為糖鏈。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>通光藤苷元乙通光藤苷A中，苷元為通光藤苷元乙-I，R為葡萄吡喃糖基-(1—4)-6-去氧-3-(9-甲基-^D-阿洛吡喃糖基-(1—4)-^D-夾竹桃吡喃糖基。通光藤苷B中，苷元為通光藤苷元乙-II，R為3-CS^D-葡萄吡喃糖基-(1—4)-6-去氧-3-0-甲基-AD-阿洛吡喃糖基-(1—4)-^D-夾竹桃吡喃糖基。通光藤苷C中，苷元為通光藤苷元乙-III，R為3-O^D-葡萄吡喃糖基o=c通光藤苷元乙-1ROH通光藤苷元乙-II<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>-(1—4)-6-去氧-3-0-甲基-^D-阿洛吡喃糖基-(1—4)-^D-夾竹桃吡喃糖基。通光藤苷D中，苷元為通光藤苷元乙-IV，R為葡萄吡喃糖基-(1—4)-6-去氧-3-0-甲基-^D-阿洛吡喃糖基-(1—4)-^D-夾竹桃吡喃糖基。MarsdenosideK中，苷元為11-oc-(9-苯甲?；?12-p-(9-乙?；?通光藤苷元乙，R為3力，D-葡萄吡喃糖基-(1—4)-6-去氧-3-6>-甲基-^D-阿洛吡喃糖基-(l—4)-^D-夾竹桃吡喃糖基。本發(fā)明提供的碳一21甾體皂苷以及包含有碳一21甾體皂苷的烏骨藤總苷H的制備方法如下烏骨藤用乙醇等作為提取溶劑進(jìn)行提取，將提取濃縮得到的浸膏經(jīng)硅膠柱層析，用薄層層析檢測(cè)層析流分，合并具有相同單一斑點(diǎn)的流分，濃縮，得到烏骨藤總苷H。將烏骨藤總苷H經(jīng)Rp—18低壓柱或制備型HPLC(高效液相)分離和純化，分得通光藤苷A，通光藤苷B，通光藤苷C，通光藤苷D，MarsdenosideK。通過(guò)酸水解以及紫外光譜儀、紅外光譜儀、電噴霧質(zhì)譜儀、核磁共振氫譜儀、核磁共振碳譜儀等光譜分析技術(shù)，得到上述5種碳-21甾體苷的化學(xué)結(jié)構(gòu),依次為通光藤苷元乙-I3-0-AD-葡萄吡喃糖基-(1—4)-6-去氧-3-0-甲基-^D-阿洛吡喃糖基-(1—4)-^D-夾竹桃吡喃糖苷；通光藤苷元乙-II3-O-AD-葡萄吡喃糖基-(1—4)-6-去氧-3-0-甲基-^D-阿洛吡喃糖基-(1—4)-^D-夾竹桃吡喃糖苷；通光藤苷元乙-1113-0-^D-葡萄吡喃糖基-(1—4)-6-去氧-3-0-甲基-^D-阿洛吡喃糖基-(1—4)-/WD-夾竹桃吡喃糖苷；通光藤苷元乙-IV葡萄吡喃糖基-(1—4)-6-去氧_3-0—甲基—^D—阿洛吡喃糖基—(1—4)-^D—夾竹桃吡喃糖苷；ll-a—6>-苯甲?；?12-p-O-乙酰基-通光藤苷元乙3-O-^D-葡萄吡喃糖基-(1—4)-6-去氧-3-O-甲阿洛吡喃糖基-(1—4)-AD-夾竹桃吡喃糖苷。本發(fā)明的藥物組合物含有治療有效量的烏骨藤總苷H，以及含有一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明的烏骨藤總苷H和藥物組合物可用于制備治療抗腫瘤的藥物。本發(fā)明藥物組合物的各種劑型可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)生產(chǎn)方法制備。例如使烏骨藤總苷H與一種或多種載體混合，然后將其制成所需的劑型。本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選含有烏骨藤總苷H占總重量比為0.1%99.5%。最優(yōu)選含有活性成分占總重量比為0.5%95%。對(duì)本發(fā)明中的烏骨藤總苷H進(jìn)行了小鼠移植性腫瘤S18。肉瘤及？122實(shí)體瘤體內(nèi)抗腫瘤試驗(yàn)，以及對(duì)環(huán)磷酰胺抑制小鼠移植性腫瘤S18Q肉瘤及1122實(shí)體瘤的增效作用。(一)烏骨藤總苷H對(duì)小鼠移植性腫瘤S1SQ肉瘤體內(nèi)抗腫瘤試驗(yàn)。1.方法在無(wú)菌條件下取生長(zhǎng)79天的小鼠移植性腫瘤S，腹水，用4倍體積生理鹽水稀釋?zhuān)谛∈笠父C皮下接種0.2mL/只，接種次日隨機(jī)分組，每組10只。設(shè)空白對(duì)照組，烏骨藤總苷H的不同濃度給藥劑量組，環(huán)磷酰胺(CTX)組。接種次日起烏骨藤總苷H組每天灌胃給藥1次，連用10天，CTX組腹腔注射給藥2天，每天1次。停藥次日動(dòng)物稱(chēng)體重，處死后剝離瘤塊，稱(chēng)瘤重。按下式計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑制率。抑瘤率=(1-實(shí)驗(yàn)組平均瘤重/對(duì)照組平均瘤重)><100%。所得數(shù)據(jù)用平均值士標(biāo)準(zhǔn)差表示，并用t檢驗(yàn)法比較各組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2.結(jié)果見(jiàn)表1表l不同濃度烏骨藤總苷H對(duì)小鼠S，腫瘤的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注:與空白對(duì)照組比較，**P<0.01(二)烏骨藤總苷H對(duì)小鼠H22實(shí)體瘤體內(nèi)抗腫瘤試驗(yàn)。l.方法在無(wú)菌條件下取生長(zhǎng)7~9天的小鼠移植性腫瘤H22腹水，用4倍體積生理鹽水稀釋?zhuān)谛∈笠父C皮下接種0.2mL/只，接種次日隨機(jī)分組，每組10只。設(shè)空白對(duì)照組，烏骨藤總苷H的不同濃度給藥劑量組，環(huán)磷酰胺(CTX)組。接種次日起烏骨藤總苷H組每天灌胃給藥1次，連用10天，CTX組腹腔注射給藥2天，每天1次。停藥次日動(dòng)物稱(chēng)體重，處死后剝離瘤塊，稱(chēng)瘤重。按下式計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑制率。抑瘤率=(1-實(shí)驗(yàn)組平均瘤重/對(duì)照組平均瘤重)><100%。所得數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并用t檢驗(yàn)法比較各組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2.結(jié)果見(jiàn)表2_表2不同濃度烏骨藤總苷H對(duì)小鼠Hb腫瘤的抑制作用組別藥物濃度瘤重(g)抑瘤率(％)(mg/kg)空白對(duì)照組烏骨藤總苷H低劑量組100烏骨藤總苷H中劑量組200烏骨藤總苷H高劑量組300CTX組40注:與空白對(duì)照組比較，**P<0.01(三)烏骨藤總苷H對(duì)環(huán)磷酰胺抑制小鼠移植性腫瘤S18Q的增效作用試驗(yàn)。l.方法在無(wú)菌條件下取生長(zhǎng)79天的小鼠移植性腫瘤S，腹水，用4倍體積生理鹽水稀釋?zhuān)谛∈笠父C皮下接種0.2mL/只，接種次日隨機(jī)分組，每組10只。設(shè)生理鹽水對(duì)照組，烏骨藤總苷H高、中、低劑量組，環(huán)磷酰胺(CTX)單用組，化療藥物與烏骨藤總苷H合用組。接種次日起每天給藥1次，連用10天，聯(lián)合給藥組每天先腹腔注射給化療藥物，6小時(shí)后再灌胃給烏骨藤總苷H。停藥次日動(dòng)物稱(chēng)體重，處死后剝離瘤塊，稱(chēng)瘤重。按下式計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑制率。抑瘤率=(l-實(shí)驗(yàn)組平均瘤重/對(duì)照組平均瘤重)X100%。兩藥合用后是否增效，按下式計(jì)算q值—_^yi_q=EA+(1-EA)Eb式中EA為A藥抑瘤率，EB為B藥抑瘤率，EAB為兩藥合用的抑瘤率，q^.851.15為兩藥作用相加，q>1.25為兩藥作用增強(qiáng)(或協(xié)同)，q<0.85為兩藥拮抗。2.97±0.382.29±0.3322.72.05±0.3131.01.90±0.3436.21.23±0.2558.62.結(jié)果見(jiàn)表3表3不同濃度烏骨藤總苷H對(duì)小鼠S，腫瘤CTX化療的增效作用<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>說(shuō)明烏骨藤總苷H與CTX合用對(duì)抑制小鼠S，腫瘤有相加作用。(四)烏骨藤總苷H對(duì)環(huán)磷酰胺抑制小鼠移植性腫瘤H22的增效作用試驗(yàn)。l.方法在無(wú)菌條件下取生長(zhǎng)79天的小鼠移植性腫瘤3Hb腹水，用4倍體積生理鹽水稀釋?zhuān)谛∈笠父C皮下接種0.2mL/只，接種次日隨機(jī)分組，每組10只。設(shè)生理鹽水對(duì)照組，烏骨藤總苷H高、中、低劑量組，環(huán)磷酰胺(CTX)單用組，化療藥物與烏骨藤總苷H合用組。接種次日起每天給藥1次，連用10天，聯(lián)合給藥組每天先腹腔注射給化療藥物，6小時(shí)后再灌胃給烏骨藤總苷H。停藥次日動(dòng)物稱(chēng)體重，處死后剝離瘤塊，稱(chēng)瘤重。按下式計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑制率。抑瘤率=(l-實(shí)驗(yàn)組平均瘤重/對(duì)照組平均瘤重)X100%。兩藥合用后是否增效，按下式計(jì)算q值3—EA+(1-Ea)Eb式中EA為A藥抑瘤率，EB為B藥抑瘤率，EAB為兩藥合用的抑瘤率，qi.851.15為兩藥作用相加，q>1.25為兩藥作用增強(qiáng)(或協(xié)同)，q0.85為兩藥拮抗。2.結(jié)果見(jiàn)表4表4不同濃度烏骨藤總苷H對(duì)小鼠H22腫瘤CTX化療的增效作用<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>說(shuō)明烏骨藤總苷H與CTX合用對(duì)抑制小鼠H22腫瘤有相加作用。下面對(duì)本發(fā)明中的烏骨藤總苷H進(jìn)行碳-21甾體皂苷含量測(cè)定來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)驗(yàn)烏骨藤總苷H中碳-21甾體皂苷的含量測(cè)定1.實(shí)驗(yàn)儀器與試劑(1)恒溫水浴鍋W501，上海申生科技有限公司。(2)電子天平Sartorius,BP211D，德國(guó)。(3)紫外可見(jiàn)分光光度儀TU-1800型，北京普析通用儀器公司。(4)試劑硫酸、茴香酸、乙醇、甲醇均為分析純。(5)對(duì)照品采用自制的通光藤苷B為對(duì)照品，純度為98.0%。(6)茴香醛硫酸顯色劑的配制量取茴香醛0.2mL與硫酸2.0mL，加無(wú)水乙醇37.8mL混勻，即得。2.含量測(cè)定2.1對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取干燥至恒重的對(duì)照品5.05mg，置于10mL量瓶中，加乙醇液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液(每lmL含通光藤苷B0.505mg)。2.2供試品溶液的制備精密稱(chēng)取烏骨藤總苷H12mg用乙醇定容至IOmL量瓶(1.20mg/mL)，搖勻，即得。112.3測(cè)定方法精密吸取濃度為1.20mg/mL的烏骨藤總苷H0.5mL至具塞試管中，揮千溶劑，分別加入0.5mL茴香醛硫酸顯示劑于IO(TC下反應(yīng)15分鐘，冰水浴10分鐘終止反應(yīng)，精密加入IOmL甲醇于432nm處測(cè)定吸收度值。2.4檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇標(biāo)準(zhǔn)品溶液吸收波長(zhǎng)的掃描精密量取0.5mL通光藤苷B對(duì)照品溶液(O0.505mg/mL)至具塞試管中，揮干溶劑，分別加入0.5mL茴香醛硫酸顯示劑于10(TC下反應(yīng)15分鐘，冰水浴10分鐘終止反應(yīng)，精密加入IOmL甲醇，在紫外分光光度計(jì)上400-600nm范圍內(nèi)掃描。結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)品溶液在432nm處有最大吸收。樣品溶液吸收波長(zhǎng)的掃描精密量取0.5mL供試品溶液(01.20mg/mU至具塞試管中，揮干溶劑，分別加入0.5mL茴香醛硫酸顯示劑于IO(TC下反應(yīng)15分鐘，冰水浴10分鐘終止反應(yīng)，精密加入10mL甲醇，在紫外分光光度計(jì)上400-600nm范圍內(nèi)掃描。結(jié)果樣品溶液在432nm處有最大吸收。2.5線(xiàn)性關(guān)系的考察精密稱(chēng)取通光藤苷B5.05mg用95%乙醇定容至10mL量瓶(0.505mg/mL)，分別精密吸取濃度為0.505mg/mL的通光藤苷B0.1mL，0.2mL，0.3mL，0.4mL，0.5mL，0.6mL，0.7mL，0.8mL，0.9mL，1.1mL，1.3mL至具塞試管中，揮干溶劑，分別加入0.5mL茴香醛硫酸顯示劑于10(TC下反應(yīng)15分鐘，冰水浴10分鐘終止反應(yīng)，精密加入10mL甲醇，照紫外一可見(jiàn)分光光度法(中國(guó)藥典72005年版一部附錄VA)在432nm波長(zhǎng)處測(cè)定，結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y二0.0129x十0.0178，R2=0.9993，i兌明本品濃度在5.05-65.65嗎.mL—'范圍內(nèi)，與吸收度之間呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖1。2.6樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)精密量取0.5mL供試品溶液至具塞試管中，揮干溶劑，分別加入0.5mL茴香醛硫酸顯示劑于10(TC下反應(yīng)15分鐘，冰水浴10分鐘終止反應(yīng)，精密加入10mL甲醇，分別于Omin，5min，10min，15min，20min，30min在紫外分光光度計(jì)上432nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。結(jié)果RSD為1.16%，說(shuō)明樣品溶液在30min內(nèi)穩(wěn)定。2.7儀器精密度精密吸取供試品溶液于432nm處測(cè)定吸收度值。連續(xù)測(cè)定6次，結(jié)果RSD為0.05%。2.8重復(fù)性試驗(yàn)精密稱(chēng)取烏骨藤總苷H6份分別依法測(cè)定吸收度值。結(jié)果平均含量為83.47%，RSD為1.63%2.9加樣回收率試驗(yàn)稱(chēng)取烏骨藤總苷H各6mg置10mL量瓶中，分別精密加入濃度為5.1mg/mL的對(duì)照品lmL，用甲醇定容，混勻。分別依法測(cè)定吸收度值，計(jì)算，即得，結(jié)果平均回收率為99.3%，RSD為2.16%。'2.IO樣品含量測(cè)定依法制備供試品溶液并測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表5:表5烏骨藤總苷H樣品含量測(cè)定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，闡明了烏骨藤中抗腫瘤的有效成分，去除了現(xiàn)有產(chǎn)品中大量的雜質(zhì)，工藝簡(jiǎn)單方便，質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)有針對(duì)性。圖1為通光藤苷B標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖具體實(shí)施方式以下通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例l:烏骨藤總苷H的制備烏骨藤莖粉碎后，用70%乙醇回流3次，每次1小時(shí)，合并提取液，減壓回收溶劑，得乙醇提取物，該提取物經(jīng)硅膠柱層析，以氯仿一乙醇進(jìn)行梯度洗脫，用薄層層析檢測(cè)層析流分，合并具有相同單一斑點(diǎn)的流分，濃縮，分得l、2、3、4、5、6、7、8、9個(gè)流分，其中流分8即為烏骨藤總苷H。烏骨藤總苷H，黃棕色粉末，Lieberman-Burchard和Keller-Killiani反應(yīng)均呈陽(yáng)性，顯示為含2—去氧糖的甾體化合物。實(shí)施例2制備通光藤苷A烏骨藤莖粉碎后，用70%乙醇回流3次，每次1小時(shí)，合并提取液，減壓回收溶劑，得乙醇提取物，該提取物經(jīng)硅膠柱層析，以氯仿一乙醇進(jìn)行梯度洗脫，用薄層層析檢測(cè)層析流分，合并具有相同單一斑點(diǎn)的流分，濃縮，分得l、2、3、4、5、6、7、8、9個(gè)流分，將流分8經(jīng)低壓Rp-18柱(甲醇水)分離和制備HPLC(甲醇水)純化后，得到通光藤苷A。通光藤苷A，白色無(wú)定形粉末，即142-144。C，[oc]哲-16.1。(MeOH;c=0.5)'，分子式C48H7401S。經(jīng)光譜數(shù)據(jù)分析和理化性狀測(cè)定與文獻(xiàn)報(bào)道(ShujiMiyakawa，KimikoYamaura,KojiHayashietal.FiveglycosidesfromtheChinesedrug'tong-guan-san，Thestemsofifensofevi/ste"s"'5"5"i艇Phytochemistry1986，25(12):2861-2865)的通光藤苷A完全一致。實(shí)施例3制備通光藤苷B烏骨藤莖粉碎后，用70%乙醇回流3次，每次1小時(shí)，合并提取液，減壓回收溶劑，得乙醇提取物，該提取物經(jīng)硅膠柱層析，以氯仿一乙醇進(jìn)行梯度洗脫，用薄層層析檢測(cè)層析流分，合并具有相同單一斑點(diǎn)的流分，濃縮，分得l、2、3、4、5、6、7、8、9個(gè)流分，將流分8經(jīng)低壓Rp_18柱(甲醇水)分離和制備HPLC(甲醇水)純化后，得到通光藤苷B。通光藤苷B，白色無(wú)定形粉末，mpl33-134°C，[oc]哲+11.5。(MeOH;c二O.5)，分子式C51H82019。經(jīng)光譜數(shù)據(jù)分析和理化性狀測(cè)定與文獻(xiàn)報(bào)道(ShujiMiyakawa，KimikoYamaura,KojiHayashietal.FiveglycosidesfromtheChinesedrug'tong—guan—san，Thestemsof■/J/ansote/zist6vsci6"5"i歷s.Phytochemistry1986，25(12):2861-2865)的通光藤苷B完全一致。實(shí)施例4制備通光藤苷C烏骨藤莖粉碎后，用70%乙醇回流3次，每次1小時(shí)，合并提取液，減壓回收溶劑，得乙醇提取物，該提取物經(jīng)硅膠柱層析，以氯仿一乙醇進(jìn)行梯度洗脫，用薄層層析檢測(cè)層析流分，合并具有相同單一斑點(diǎn)的流分，濃縮，分得l、2、3、4、5、6、7、8、9個(gè)流分，將流分8經(jīng)低壓Rp-18柱(甲醇水)分離和制備HPLC(甲醇水)純化后，得到通光藤苷C。通光藤苷C，白色無(wú)定形粉末，mpl29-131°C，[a]哲+15.5。(Me0H;cO.5)，分子式C53H76019。經(jīng)光譜數(shù)據(jù)分析和理化性狀測(cè)定與文獻(xiàn)報(bào)道(ShujiMiyakawa,KimikoYamaura，KojiHayashietal.FiveglycosidesfromtheChinesedrug'tong-guan—san':Thestemsof船rsofe/7J.ste/sci'5^j'鵬.Phytochemistry1986，25(12):2861-2865)的通光藤苷C完全一致。實(shí)施例5制備通光藤苷D烏骨藤莖粉碎后，用70%乙醇回流3次，每次1小時(shí)，合并提取液，減壓回收溶劑，得乙醇提取物，該提取物經(jīng)硅膠柱層析，以氯仿一乙醇進(jìn)行梯度洗-脫，用薄層層析檢測(cè)層析流分，合并具有相同單一斑點(diǎn)的流分，濃縮，分得l、2、3、4、5、6、7、8、9個(gè)流分，將流分8經(jīng)低壓Rp-18柱(甲醇水)分離和制備HPLC(甲醇水)純化后，得到通光藤苷D。通光藤苷D，白色無(wú)定形粉末，mpl39-14rC，[a]哲+16.5。(MeOH;c=0.5)，分子式C51H8。019。經(jīng)光譜數(shù)據(jù)分析和理化性狀測(cè)定與文獻(xiàn)報(bào)道(ShujiMiyakawa，KimikoYamaura,KojiHayashietal.FiveglycosidesfromtheChinesedrug'tong—guan—san，ThestemsofJkr5"ofe/7J's^e/jscissi/ffs.Phytochemistry1986，25(12):2861-2865)的通光藤苷D完全一致。實(shí)施例6制備MarsdenosideK烏骨藤莖粉碎后，用70%乙醇回流3次，每次1小時(shí)，合并提取液，減壓回收溶劑，得乙醇提取物，該提取物經(jīng)硅膠柱層析，以氯仿一乙醇進(jìn)行梯度洗脫，用薄層層析檢測(cè)層析流分，合并具有相同單一斑點(diǎn)的流分，濃縮，分得l、2、3、4、5、6、7、8、9個(gè)流分，將流分8經(jīng)低壓Rp-18柱(甲醇水)分離和制備HPLC(甲醇水)純化后，得到MarsdenosideK。MarsdenosideK，白色無(wú)定形粉末，即135-137。C，[ot]帶-5.5。(MeOH;c二O.5)，分子式C5(,H720,9。經(jīng)光譜數(shù)據(jù)分析和理化性狀測(cè)定與文獻(xiàn)報(bào)道(DengJ，LiaoZX，ChengDF.Threenewpolyoxypregnaneglycosidesfromi/arsote/w's7b腦ki服HelvChimAct，2005(88):2675-2682)的MarsdenosideK完全一致。權(quán)利要求1、一種從烏骨藤中提取得到的碳-21甾體苷類(lèi)混合物-烏骨藤總苷H，其特征在于主要為5種碳-21甾體苷類(lèi)化合物，通光藤苷A，通光藤苷B，通光藤苷C，通光藤苷D，MarsdenosideK，這5種碳-21甾體苷是下列5個(gè)化學(xué)結(jié)構(gòu)所示的5種甾體皂苷元之一與同一種糖鏈形成的5種糖苷，其中R為糖鏈。通光藤苷元乙-I通光藤苷元乙-II通光藤苷元乙-III通光藤苷元乙-IV11-α-O-苯甲?；?12-β-O-乙?；?通光藤苷元乙2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的碳一21甾體苷類(lèi)混合物，其特征在于5種化合物為通光藤苷A中，苷元為通光藤苷元乙-I,R為3-0-^D-葡萄吡喃糖基-(l一4)-6-去氧-3-6>-甲基-AD-阿洛吡喃糖基-(l—4)-^D-夾竹桃吡喃糖基；通光藤苷B中，苷元為通光藤苷元乙-n，R為3-0-^D-葡萄吡喃糖基-(1—4)-6-去氧-3-0-甲基-^D-阿洛吡喃糖基-(1—4)-^D-夾竹桃吡喃糖基；通光藤苷C中，苷元為通光藤苷元乙-m，R為3-0-^D-葡萄吡喃糖基-(1—4)-6-去氧-3-0-甲基-^D-阿洛吡喃糖基-(1—4)-^D-夾竹桃吡喃糖基；通光藤苷D中，苷元為通光藤苷元乙-IV，R為3-CS^D-葡萄吡喃糖基-(1—4)-6-去氧-3-0-甲基-^D-阿洛吡喃糖基-(1—4)-/WD-夾竹桃吡喃糖基；MarsdenosideK中，苷元為11-a-(9-苯甲酰基-12-f3-(9-乙酰基-通光藤苷元乙,，R為3-0-^D-葡萄吡喃糖基-(1—4)-6-去氧-3-0-甲基-^D-阿洛吡喃糖基-(1一4)-^D-夾竹桃吡喃糖基。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的碳一21甾體苷混合物一烏骨藤總苷H，其特征在于為包含有烏骨藤碳一21甾體苷類(lèi)化合物通光藤苷A，通光藤苷B，通光藤苷C，通光藤苷D，MarsdenosideK這5種碳一21甾體苷的任意組合的混合物。.4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的碳一21甾體苷混合物一烏骨藤總苷H，其特征在于其中烏骨藤碳一21甾體苷類(lèi)化合物的重量含量大于或等于80%。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的碳一21甾體苷混合物一烏骨藤總苷H的制備方法，該方法包括以下步驟a.將烏骨藤的莖粉碎后，以乙醇提??；b.乙醇提取液濃縮后經(jīng)硅膠柱層析，氯仿一乙醇進(jìn)行梯度洗脫；c.用薄層層析檢測(cè)層析流分，具有相同單一斑點(diǎn)的流分合并濃縮，得到含上述碳一21甾體苷類(lèi)化合物的流份，即為烏骨藤總苷H。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的碳一21甾體苷混合物一烏骨藤總苷H，其特征在于抗腫瘤有效量的與藥學(xué)上可接受的載體所組成的藥物組合物。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的碳一21甾體苷混合物一烏骨藤總苷H，其特征在于該混合物具有對(duì)抗腫瘤方面的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明屬醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及從中藥烏骨藤(Marsdeniatenacissima)中提取分離得到的具有抗腫瘤作用的碳-21甾體苷類(lèi)混合物，這種混合物主要包含有5種碳-21甾體苷類(lèi)化合物，這5種化合物分別為通光藤苷A，通光藤苷B，通光藤苷C，通光藤苷D，MarsdenosideK。這種甾體苷化合物總重量含量≥80％的混合物被定名為烏骨藤總苷H。本發(fā)明還涉及該化合物的制備方法，以該化合物為活性成分的藥物組合物，以及本發(fā)明化合物和藥用組合物在抗腫瘤藥物方面的應(yīng)用。文檔編號(hào)C07J71/00GK101215313SQ20081005904公開(kāi)日2008年7月9日申請(qǐng)日期2008年1月7日優(yōu)先權(quán)日2008年1月7日發(fā)明者葉益萍,徐世芳,李曉譽(yù),陳峰陽(yáng)申請(qǐng)人:浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院