專利名稱：制備高純度澤拉木醛的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及從南蛇藤植物中分離得到高純度澤拉木醛的方法，尤其涉
及用高速逆流色譜法(HSCCC)從南蛇藤植物中分離得到高純度澤拉木醛 的方法。
背景技術：
南蛇藤(Ce/a^n^ oA,cm^m Thumb)是我國民間常用的一種植物藥， 有驅風除濕，活血解毒消腫功效，主治筋骨疼痛，四肢麻木，風濕性關節(jié) 炎，腰腿痛，閉經，小兒驚風，痧癥，痢疾，腫毒，跌打損傷(守立人.現(xiàn) 代中藥學大辭典(下冊)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社.2001. 1457)。南蛇藤主 要藥用成分有倍半萜及倍半萜衍生物、生物堿、三萜、黃酮等四類物質， 其中三萜類成分主要存在于南蛇藤屬植物的根皮中，主要類型有羽扇豆垸 型和齊墩果酸型。澤拉木醛(Zeylasteral)是藥理活性很強的五環(huán)三萜類化合 物。
澤拉木醛有抗菌活性，報道有抗革蘭氏陽性菌、OmA^za/^ca^菌、 ^Sac〃/z^ swZ "/^菌等的、活'性(de Le6n L, Beltrdn B, Moujir L. Antimicrobial activity of 6-oxophenolic triterpenoids. Mode of action against S鎖7/m Planta Med[J]. 2005 Apr;71(4):313-9)。
澤拉木醛藥理活性顯著，但其在自然界中存在量不多，少有報道分離 得到此化合物，而且其易混雜雜質，因此至今有大量研究人員正在探索理 想的分離純化方法。
文獻報道了用柱層析方法得到澤拉木醛單體的方法(Gamlath， C; Studies on terpenoids and steroids. Part 10. Structures of four new natural phenolic D:A-friedo-24-noroleanane triterpenoids. J Chem Soc, Perkin Trans 1 1987,2849):從衛(wèi)矛科植物姑A:ooAm z^/am'ca植物莖表皮，分別用熱石 油醚和熱苯溶劑提取后濃縮，石油醚部位經過柱層析后得到澤拉木醛。但該方法操作步驟繁瑣，過程中損失大，從而回收率低。
高速逆流色譜(High Speed Countercurrent Chromatography ， 簡稱 HSCCC)是國際上于上世紀80年代以來在液-液分配色譜基礎上發(fā)展起來 的新型分離技術，其分離原理是利用螺旋柱在高速行星運動時產生的巨大 離心力，使螺旋柱中互不相溶的兩相不斷混合，達到穩(wěn)定的流體動力學平 衡態(tài)，此時在螺旋柱中任何一部分，兩相溶劑都反復進行著混合和靜置的 分配過程，這一過程頻率極高，當柱心以800rpm旋轉時，頻率超過每秒13 次。流動相不斷地穿過固定相，同時保留其中的一相(固定相)，利用恒流 泵連續(xù)輸入另一相(流動相)，流動相載著溶質(樣品)進入螺旋柱并不斷反復 穿過固定相，使樣品在兩相之間也不斷反復地進行分配，由于樣品中各組 分在兩相中分配系數(shù)不同，導致在螺旋柱中的移動速度不同，因而能使樣 品各組分按分配系數(shù)的次序，依次得到分離。
高速逆流色譜作為一種新型的分離技術，有許多優(yōu)點是傳統(tǒng)液-固色 譜無法比擬的,因而有很廣闊的應用前景。首先，它的流動相、間定相均 為液體，不需要固體載體，避免了液-固色譜常會造成的固體載體對樣品 的不可逆吸附，可以保證樣品在不損失任何一種組分的情況下得到分離, 理論上樣品回收率相當高；其次，它的分離效率高，可以達到幾千個理論 塔板數(shù)，尤其在天然產物組分分離提取中有較高的分離度，有的樣品經過 一次分離就可以得到一個甚至多個單體，并且分離時間也短， 一般是幾個 小時即可完成一次分離此外，它使用常規(guī)試劑，有廣泛的液-液分配體 系可供選擇，體系更換方便、快捷它的進樣量大，可以從毫克到克量級， 進樣體積可達20mL以上，這對于樣品的純化制備顯示出驚人的優(yōu)勢。
'但欲用HSCCC進行成功的分離，選擇適宜的溶劑系統(tǒng)非常重要。不 同的溶劑系統(tǒng)，具有不同的上、下相之比，其粘度、極性、密度等性質相 差甚遠，對相同的成分具有不同的溶解、分配能力，形成分配系數(shù)的差異， 對分離效果產生不同的影響。目前，溶劑體系的選擇還沒有一套完整的理 論依據。另外，在選定了溶劑體系后，有時需要對四個儀器運行參數(shù)(溫 度、轉速、流動相流速、進樣體積)進行設定。

發(fā)明內容
5由于澤拉木醛在自然界中存在量不多，少有報道分離得到此化合物， 而且其容易混雜雜質，因此至今有大量研究人員正在探索理想的分離純化
方法。本發(fā)明提供一種制備高純度澤拉木醛的方法，其特征在于，所述澤 拉木醛從南蛇藤植物中分離得到。
澤拉木醛為首次從南蛇藤植物中提取分離得到?？梢允褂帽绢I域技術 人員所熟知的技術，例如高速逆流色譜法、柱層析法或薄層柱層析法將澤 拉木醛從南蛇藤植物中提取分離。
采用柱層析法將澤拉木醛從南蛇藤植物中提取分離的具體操作步驟 如下
南蛇藤干燥根皮用二氯甲烷冷浸提取，回收溶劑得粗提干燥物(樣 品)，用硅膠拌樣并上柱，用流動相洗脫，合并流份，濃縮后得到純澤拉 木醛。
采用薄層層析法將澤拉木醛從南蛇藤植物中提取分離的具體操作步 驟如下
南蛇藤干燥根皮用二氯甲垸冷浸提取，回收溶劑得粗提干燥物(樣 品)，精確稱取二氯甲垸粗提干燥物并溶解，全部點樣在自制薄層硅膠板 上，用展開劑展開，澤拉木醛斑點約走至薄層板中部，刮下含該斑點的硅 膠層，洗脫此硅膠層，濃縮后得到純澤拉木醛。
本發(fā)明優(yōu)選采用高速逆流色譜法將澤拉木醛從南蛇藤植物中提取分
采用高速逆流色譜法制備高純度澤拉木醛時，該方法包括制備構成 固定相和流動相的溶劑體系；設置恒溫循環(huán)器的溫度；調節(jié)流動相流速； 調節(jié)主機轉速；其特征在于，所述溶劑體系由石油醚、乙醇和水組成，三 種組分的體積比為9 12: 9 10: 1 1.1，該溶劑體系的上相為固定相， 下相為流動相。
在不破壞體系平衡的調節(jié)下，可在上述范圍內任意調節(jié)石油醚乙醇 水的體積比，優(yōu)選的體積比為10: 10: 1或10: 9: l或ll: 9: 1.1。
恒溫循環(huán)器的溫度須控制在22 27卩，優(yōu)選25。C;主機轉速須控制在 800 880rpm范圍內，優(yōu)選840rpm;流動相的流速須控制在l.0 2.2ml/min 范圍內，優(yōu)選1.6ml/min。其具體操作步驟如下
南蛇藤干燥根皮(湖南省南部山區(qū)所產)用二氯甲烷冷浸提取，每次 冷浸24小時，再回收溶劑，重復三次，得褐色干燥粉末狀物質，即為粗提 干燥物，精確稱取二氯甲烷粗提干燥物，用固定相溶解樣品，開啟恒溫循 環(huán)器并設置溫度，用雙泵等比例同時泵入流動相(下相)和固定相(上相)，當 溶劑從管路出口流出時，停止泵入固定相，設定流動相流速，同時啟動主 機電機，調節(jié)轉速，十幾分鐘后，管柱內溶劑達成動態(tài)平衡，管柱出口處
只有流動相流出。通過進樣器注入樣品，設定檢測器的波長為254nm，在 進樣后約90分鐘至380分鐘出現(xiàn)澤拉木醛峰，收集該流份，濃縮后得到純 澤拉木醛單體。
采用本發(fā)明可以從南蛇藤植物中分離得到純度較高的澤拉木醛。特別 是采用高速逆流色譜法制備高純度澤拉木醛時，由于采用了合理的溶劑體 系，控制主機轉速和流動相流速等工藝條件，可從南蛇藤植物中分離得到 高純度的澤拉木醛。且該分離純化過程條件溫和，分離時間短，由于不引 入酸堿，從而減少了化合物化學性質的變化，保持化合物的穩(wěn)定而減少損 失，化合物不流失也不存在死吸附。
具體實施例方式
實施例1
高速逆流色譜法得到澤拉木醛
南蛇藤干燥根皮IOO克(湖南省南部山區(qū)所產)用二氯甲烷冷浸提取，
每次冷浸24小時，再回收溶劑，重復三次，得褐色干燥粉末狀物質，即 為粗提干燥物，精確稱取二氯甲烷粗提干燥物11.2克。
精確稱取二氯甲垸粗提干燥物1克，用石油醚乙醇水(溶劑體積 比10: 10: 1)溶劑系統(tǒng)的上相溶解樣品，開啟恒溫循環(huán)器，設置溫度為 25攝氏度，以該溶劑系統(tǒng)上相為固定相，下相為流動相，用雙泵等比例同 時泵入流動相(下相)和固定相(上相)，當溶劑從管路出口流出時，停
止泵入固定相，設定流動相流速為2ml/min，同時開啟主機電機，調節(jié)轉 速為880rpm，十幾分鐘后，管柱內溶劑系統(tǒng)達成動態(tài)平衡，管柱出口處只 有流動相流出。通過進樣器注入樣品，設定波長為254nm，在進樣后約150
7分鐘出現(xiàn)澤拉木醛峰，收集該流分，濃縮后得到純澤拉木醛35mg，純度 大于99.5%，相對進樣前收率為3.5%，相對于藥材0.392%。
實施例2
高速逆流色譜法得到澤拉木醛
精確稱取二氯甲烷粗提干燥物1.2克，用石油醚乙醇水(溶劑體 積比10: 9: 1)溶劑系統(tǒng)的上相溶解樣品，開啟恒溫循環(huán)器，設置溫度為 24攝氏度，以該溶劑系統(tǒng)上相為固定相，下相為流動相，用雙泵等比例同 時泵入流動相(下相)和固定相(上相)，當溶劑從管路出口流出時，停
止泵入固定相，設定流動相流速為1.8ml/min，同時開啟主機電機，調節(jié) 轉速為860rpm，十幾分鐘后，管柱內溶劑系統(tǒng)達成動態(tài)平衡，管柱出口處 只有流動相流出。通過進樣器注入樣品，設定波長為254nm，在進樣后約 250分鐘出現(xiàn)澤拉木醛峰，收集該流分，濃縮后得到純澤拉木醛38mg，純 度大于98.5%，相對進樣前收率為3.16%，相對于藥材0.355%。
實施例3
高速逆流色譜法得到澤拉木醛
精確稱取二氯甲烷粗提干燥物1.6克，用石油醚乙醇水(溶劑體 積比9: 10: 1)溶劑系統(tǒng)的上相溶解樣品，開啟恒溫循環(huán)器，設置溫度為 23攝氏度，以該溶劑系統(tǒng)上相為固定相，下相為流動相，用雙泵等比例同 時泵入流動相(下相)和固定相(上相)，當溶劑從管路出口流出時，停
止泵入固定相，設定流動相流速為2.2ml/min，同時開啟主機電機，調節(jié) 轉速為840rpm，十幾分鐘后，管柱內溶劑系統(tǒng)達成動態(tài)平衡，管柱出口處 只有流動相流出。通過進樣器注入樣品，設定波長為254nm，在進樣后約 90分鐘出現(xiàn)澤拉木醛峰，收集該流分，濃縮后得到純澤拉木醛45mg，純 度大于98.5%，相對進樣前收率為2.813%，相對于藥材0.315%。
實施例4
高速逆流色譜法得到澤拉木醛
精確稱取二氯甲烷粗提干燥物0.8克，用石油醚乙醇水(溶劑體積比10: 10: 1.1)溶劑系統(tǒng)的上相溶解樣品，開啟恒溫循環(huán)器，設置溫 度為26攝氏度，以該溶劑系統(tǒng)上相為固定相，下相為流動相，用雙泵等 比例同時泵入流動相(下相)和固定相(上相)，當溶劑從管路出口流出
時，停止泵入固定相，設定流動相流速為1.4ml/min，同時開啟主機電機， 調節(jié)轉速為820rpm，十幾分鐘后，管柱內溶劑系統(tǒng)達成動態(tài)平衡，管柱出 口處只有流動相流出。通過進樣器注入樣品，設定波長為254nm，在進樣 后約220分鐘出現(xiàn)澤拉木醛峰，收集該流分，濃縮后得到純澤拉木醛27mg， 純度大于98%，相對進樣前收率為3.375%，相對于藥材0.378%。
實施例5
高速逆流色譜法得到澤拉木醛
精確稱取二氯甲垸粗提干燥物1.9克，用石油醚乙醇水(溶劑體 積比12: 10: 1.1)溶劑系統(tǒng)的上相溶解樣品，開啟恒溫循環(huán)器，設置溫
度為22攝氏度，以該溶劑系統(tǒng)上相為固定相，下相為流動相，用雙泵等
比例同時泵入流動相(下相)和固定相(上相)，當溶劑從管路出口流出
時，停止泵入固定相，設定流動相流速為lml/min，同時開啟主機電機， 調節(jié)轉速為800rpm，十幾分鐘后，管柱內溶劑系統(tǒng)達成動態(tài)平衡，管柱出 口處只有流動相流出。通過進樣器注入樣品，設定波長為254nm，在進樣 后約380分鐘出現(xiàn)澤拉木醛峰，收集該流分，濃縮后得到純澤拉木醛62mg， 純度大于99%，相對進樣前收率為3.26%，相對于藥材0.365%。
實施例6
高速逆流色譜法得到澤拉木醛
精確稱取二氯甲烷粗提干燥物2克，用石油醚乙醇水(溶劑體積 比ll: 9: 1.1)溶劑系統(tǒng)的上相溶解樣品，開啟恒溫循環(huán)器，設置溫度為 27攝氏度，以該溶劑系統(tǒng)上相為固定相，下相為流動相，用雙泵等比例同 時泵入流動相(下相)和固定相(上相)，當溶劑從管路出口流出時，停
止泵入固定相，設定流動相流速為2.2ml/min，同時開啟主機電機，調節(jié) 轉速為870rpm，十幾分鐘后，管柱內溶劑系統(tǒng)達成動態(tài)平衡，管柱出口處 只有流動相流出。通過進樣器注入樣品，設定波長為254nm，在進樣后約190分鐘出現(xiàn)澤拉木醛峰，收集該流分，濃縮后得到純澤拉木醛68mg，純 度大于98.5%，相對進樣前收率為3.40%，相對于藥材0.381%。
實施例7
柱層析方法得到澤拉木醛
南蛇藤干燥根皮100克用二氯甲烷冷浸提取，每次冷浸24小時，再 回收溶劑，重復三次，得褐色干燥粉末狀物質，即為粗提干燥物，精確稱 取二氯甲烷粗提干燥物11.4克(樣品)，用200-300目的硅膠15克拌樣， 用1500克200-300目硅膠上柱，流動相石油醚乙酸乙酯(溶劑體積比 10: l)洗脫，得到約180個流份，第75-94流份合并濃縮后得到純澤拉木 醛273mg，純度約為95%，相對進樣前收率為3.11%，相對于藥材0.273%。
實施例8 .柱層析方法得到澤拉木醛
南蛇藤干燥根皮100克用二氯甲垸冷浸提取，每次冷浸24小時，再 回收溶劑，重復三次，得褐色干燥粉末狀物質，即為粗提干燥物，精確稱 取二氯甲烷粗提干燥物10.9克(樣品)，用200-300目的硅膠15克拌樣， 用1500克200-300目硅膠上柱，流動相石油醚丙酮(溶劑體積比12: 1) 洗脫，得到約200個流份，第83-110流份合并濃縮后得到純澤拉木醛 260mg，純度約為95.5%，相對進樣前收率為2.83%，相對于藥材0.260%。
實施例9
薄層層析方法得到澤拉木醛
南蛇藤干燥根皮100克用二氯甲垸冷浸提取，每次冷浸24小時，再 回收溶劑，重復三次，得褐色干燥粉末狀物質，即為粗提干燥物，精確稱 取二氯甲垸粗提干燥物11.3克(樣品)，精確稱取二氯甲烷粗提干燥物1 克并溶解，全部點樣在自制薄層硅膠板上，用石油醚乙酸乙酯(溶劑體
積比3: l)作展開劑，澤拉木醛斑點約走至薄層板中部，刮下含該斑點的
硅膠層，用甲醇洗脫此硅膠層，濃縮后得到純澤拉木醛31.5mg，純度約為 97%，相對進樣前收率為3.15%，相對于藥材0.356%。實施例10
薄層層析方法得到澤拉木醛
南蛇藤干燥根皮100克用二氯甲烷冷浸提取，每次冷浸24小時，再 回收溶劑，重復三次，得褐色干燥粉末狀物質，即為粗提干燥物，精確稱 取二氯甲垸粗提干燥物11.3克(樣品)，精確稱取二氯甲垸粗提干燥物1 克并溶解，全部點樣在自制薄層硅膠板上，用石油醚丙酮(溶劑體積比 7: 2)作展開劑，澤拉木醛斑點約走至薄層板中部，刮下含該斑點的硅膠
層，用甲醇洗脫此硅膠層，濃縮后得到純澤拉木醛32.1mg，純度約為97%, 相對進樣前收率為3.21%，相對于藥材0.362%。
權利要求
1. 制備高純度澤拉木醛的方法，其特征在于，所述澤拉木醛從南蛇藤植物中分離得到。
2. 如權利要求1所述的制備高純度澤拉木醛的方法，其特征在于，采用高速逆流色譜法、柱層析法或薄層柱層析法將所述澤拉木醛從南蛇藤植 物中分離得到。
3. 如權利要求2所述的制備高純度澤拉木醛的方法，其特征在于，采 用高速逆流色譜法將所述澤拉木醛從南蛇藤植物中分離得到。
4. 如權利要求3所述的制備高純度澤拉木醛的方法，其特征在于，所 述方法包括制備構成固定相和流動相的溶劑體系；設置恒溫循環(huán)器的溫 度；調節(jié)流動相流速；調節(jié)主機轉速；其特征在于，所述溶劑體系由石油 醚、乙醇和水組成，三種組分的體積比為9 12: 9 10: 1 1.1，該溶劑 體系的上相為固定相，下相為流動相。
5. 如權利要求4所述的制備高純度澤拉木醛的方法，其特征在于，所 述恒溫循環(huán)器的溫度為22 27°〇。
6. 如權利要求5所述的制備高純度澤拉木醛的方法，其特征在于，所 述恒溫循環(huán)器的溫度為25"C。
7. 如權利要求4所述的制備高純度澤拉木醛的方法，其特征在于，所 述流動相的流速為1.0 2.2ml/min。
8. 如權利要求7所述的制備高純度澤拉木醛的方法，其特征在于，所 述流動相的流速為1. 6ml/min 。
9. 如權利要求4所述的制備高純度澤拉木醛的方法，其特征在于，所 述主機轉速為800 880rpm。
10. 如權利要求9所述的制備高純度澤拉木醛的方法，其特征在于，所 述主機轉速為840rpm。
11. 如權利要求4所述的制備高純度澤拉木醛的方法，其特征在于，所述溶劑體系的三種組分的體積比為10: 10: 1。
12. 如權利要求4所述的制備高純度澤拉木醛的方法，其特征在于，所述溶劑體系的三種組分的體積比為10: 9: 1。
13.如權利要求4所述的制備高純度澤拉木醛的方法，其特征在于，所 述溶劑體系的三種組分的體積比為ll: 9: 1.1。
全文摘要
制備高純度澤拉木醛的方法，其特征在于，所述澤拉木醛從南蛇藤植物中分離得到。優(yōu)選用高速逆流色譜法。該方法分離條件溫和，分離效率高，且分離時間短，能得到高純度的澤拉木醛。
文檔編號C07J63/00GK101519421SQ20081003390
公開日2009年9月2日 申請日期2008年2月26日 優(yōu)先權日2008年2月26日
發(fā)明者翔 倪, 楊培明, 歐陽丹薇, 肖婕妤, 許海燕, 佳 陳 申請人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院