專利名稱：高速逆流色譜法制備高純度扁蒴藤素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用高速逆流色譜法(HSCCC)制備高純度扁蒴藤素的方法。
背景技術(shù)：
南蛇藤(Ce/aWn^ oAz'cw/a^^ Thumb)是我國民間常用的一種植物藥， 有驅(qū)風(fēng)除濕，活血解毒消腫功效，主治筋骨疼痛、四肢麻木、風(fēng)濕性關(guān)節(jié) 炎、腰腿痛、閉經(jīng)、小兒驚風(fēng)、痧癥、痢疾、腫毒、跌打損傷(守立人.現(xiàn) 代中藥學(xué)大辭典(下冊)[M].北京人民衛(wèi)生出版社.2001. 1457)。南蛇藤 主要藥用成分有倍半萜及倍半萜衍生物、生物堿、三萜、黃酮等四類物質(zhì)， 其中三萜類成分主要存在于南蛇藤屬植物的根皮中，主要類型有羽扇豆烷 型和齊墩果酸型。扁蒴藤素(Pristmerin)是藥理活性很強(qiáng)的五環(huán)三萜類化合 物，具有顯著的抗腫瘤、抗炎活性。
扁蒴藤素在體外的抗癌活性篩選中，對P388 (ICso為0.267pg/mL)及 LAX細(xì)胞(ICso為0.018^g/mL)有很強(qiáng)的抑制作用(蔣毅等.南蛇藤活性成 分的研究.中草藥1996; 27 (2) : 73)。扁蒴藤素在體外對HL-60細(xì)胞 的生長有明顯抑制作用，處理時(shí)間在24~72h時(shí)抑制率與濃度呈正相關(guān)， ICs。分別為1.79、 0.39、 0.72和0.83ml/L。對？62+-抗壞血酸誘導(dǎo)的大鼠心、 肝、腎組織勻漿MDA生成均有明顯抑制作用，說明扁蒴藤素既有抗氧化 作用，也有抗腫瘤作用(陳長瑞，李文廣等.扁蒴藤素的抗氧化與抗腫瘤 作用[J].中藥藥理與臨床，2002; 18(5): 20-21)。扁蒴藤素還有抗瘧作用 (Katchrinnee Pavanand,et al: Schizontocidal activity of Ce/aWrws Willd Against / /a膽o&謂/a/一arw,'w vitro, Phytotherapy Research 1989;3(4):136 139〕。扁蒴藤素腹腔注射0.156-0.625 mg. kg"或 肌肉注射1~4 mg'kg—1明顯抑制小鼠耳腫和足腫(P〈0.05);肌肉注射2~4 mg.kg"明顯抑制小鼠毛細(xì)血管通透性增高(P〈0.05);肌肉注射1 2mg4g—1 抑制大鼠腹膜炎白細(xì)胞滲出、蛋白質(zhì)滲出及NAG釋放，降低NO含量，抑制MDA生成，增強(qiáng)SOD及CAT活性。扁蒴藤素表現(xiàn)出明顯的抗炎作 用；抗炎作用可能與其抑制NO生成、清除氧自由基、抗脂質(zhì)過氧化、穩(wěn) 定溶酶體膜有關(guān)。
扁蒴藤素藥理活性，特別其抗腫瘤活性非常顯著，自然界中含量低， 且容易混有雜質(zhì)。經(jīng)過HPLC測定，發(fā)現(xiàn)扁蒴藤素在南蛇藤根皮部位含量 很高，超過1%，利用此方法可以簡單的從南蛇藤根皮粗提物中得到量多、 高純度扁蒴藤素。文獻(xiàn)報(bào)道了用柱層析方法得到扁蒴藤素單體的方法(蔣 毅等.南蛇藤活性成分的研究.中草藥1996; 27 (2) : 73 ):南蛇藤根 1500g，粉碎，用石油醚提取3次。濃縮提取液得7.22g半固體狀物。通過 低壓硅膠柱層析分離，以不同比例的石油醚-乙酸乙酯洗脫，得到單體扁蒴 藤素。但該方法操作步驟繁瑣，過程中損失大，從而回收率低。
高速逆》H色i普(High Speed Countercurrent Chromatography ， 簡禾爾 HSCCC)是國際上于上世紀(jì)80年代以來在液-液分配色譜基礎(chǔ)上發(fā)展起來 的新型分離技術(shù)，其分離原理是利用螺旋柱在高速行星運(yùn)動(dòng)時(shí)產(chǎn)生的巨大 離心力，使螺旋柱中互不相溶的兩相不斷混合，達(dá)到穩(wěn)定的流體動(dòng)力學(xué)平 衡態(tài)，此時(shí)在螺旋柱中任何一部分，兩相溶劑都反復(fù)進(jìn)行著混合和靜置的 分配過程，這一過程頻率極高，當(dāng)柱心以800rpm旋轉(zhuǎn)時(shí),頻率超過每秒13 次。流動(dòng)相不斷地穿過固定相，同時(shí)保留其中的一相(固定相)，利用恒流 泵連續(xù)輸入另一相(流動(dòng)相)，流動(dòng)相載著溶質(zhì)(樣品)進(jìn)入螺旋柱并不斷反復(fù) 穿過固定相，使樣品在兩相之間也不斷反復(fù)地進(jìn)行分配，由于樣品中各組 分在兩相中分配系數(shù)不同，導(dǎo)致在螺旋柱中的移動(dòng)速度不同，因而能使樣 品各組分按分配系數(shù)的次序，依次得到分離。
高速逆流色譜作為一種新型的分離技術(shù)，有許多優(yōu)點(diǎn)是傳統(tǒng)液-固色 譜無法比擬的,因而有很廣闊的應(yīng)用前景。首先，它的流動(dòng)相、間定相均 為液體，不需要固體載體，避免了液-固色譜常會(huì)造成的固體載體對樣品 的不可逆吸附，可以保證樣品在不損失任何一種組分的情況下得到分離, 理論上樣品回收率相當(dāng)高；其次，它的分離效率高，可以達(dá)到幾千個(gè)理論 塔板數(shù)，尤其在天然產(chǎn)物組分分離提取中有較高的分離度，有的樣品經(jīng)過 一次分離就可以得到一個(gè)甚至多個(gè)單體，并且分離時(shí)間也短， 一般是幾個(gè) 小時(shí)即可完成一次分離此外，它使用常規(guī)試劑，有廣泛的液-液分配體
4系可供選擇體系更換方便、快捷它的進(jìn)樣量大，可以從毫克到克量級(jí), 進(jìn)樣體積可達(dá)20mL以上，這對于樣品的純化制備顯示出驚人的優(yōu)勢。
但欲用HSCCC進(jìn)行成功的分離，選擇適宜的溶劑系統(tǒng)非常重要。不 同的溶劑系統(tǒng)，具有不同的上、下相之比，其粘度、極性、密度等性質(zhì)相 差甚遠(yuǎn)，對相同的成分具有不同的溶解、分配能力，形成分配系數(shù)的差異， 對分離效果產(chǎn)生不同的影響。目前，溶劑體系的選擇還沒有一套完整的理 論依據(jù)。另外，在選定了溶劑體系后，有時(shí)需要對四個(gè)儀器運(yùn)行參數(shù)(溫 度、轉(zhuǎn)速、流動(dòng)相流速、進(jìn)樣體積)進(jìn)行設(shè)定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服傳統(tǒng)分離技術(shù)的缺陷，采用高速逆流 色譜技術(shù)(HSCCC)制備高純度扁蒴藤素。該方法分離條件溫和，分離效率 高，且分離時(shí)間短，能得到高純度的扁蒴藤素。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下
高速逆流色譜法制備高純度扁蒴藤素的方法，包括制備構(gòu)成固定相 和流動(dòng)相的溶劑體系；設(shè)置恒溫循環(huán)器的溫度；調(diào)節(jié)流動(dòng)相流速；調(diào)節(jié)主 機(jī)轉(zhuǎn)速；其特征在于，所述溶劑體系由石油醚、乙醇和水組成，三種組分 的體積比為9 12: 9 10: 1 1.1，該溶劑體系的上相為固定相，下相為 流動(dòng)相。
在不破壞體系平衡的調(diào)節(jié)下，可在上述范圍內(nèi)任意調(diào)節(jié)石油醚乙醇 水的體積比，優(yōu)選的體積比為10: 10: 1或10: 9: l或ll: 9: 1.1。
恒溫循環(huán)器的溫度須控制在22 27'C，優(yōu)選25"C;主機(jī)轉(zhuǎn)速須控制在 800 880rpm范圍內(nèi)，優(yōu)選840rpm;流動(dòng)相的流速須控制在1.0 2.2ml/min 范圍內(nèi)，優(yōu)選1.6ml/min。
本發(fā)明的具體操作步驟如下
南蛇藤干燥根皮(湖南省南部山區(qū)所產(chǎn))用二氯甲垸冷浸提取，每次
冷浸24小時(shí)，再回收溶劑，重復(fù)三次，得褐色干燥粉末狀物質(zhì)，即為粗提 干燥物，精確稱取二氯甲烷粗提干燥物，用固定相溶解樣品，開啟恒溫循 環(huán)器并設(shè)置溫度，用雙泵等比例同時(shí)泵入流動(dòng)相(下相)和固定相(上相)，當(dāng) 溶桐從管路出口流出時(shí)，停止泵入固定相，設(shè)定流動(dòng)相流速，同時(shí)啟動(dòng)主
5機(jī)電機(jī)，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速，十幾分鐘后，管柱內(nèi)溶劑達(dá)成動(dòng)態(tài)平衡，管柱出口處
只有流動(dòng)相流出。通過進(jìn)樣器注入樣品，設(shè)定檢測器的波長為254nm，在 進(jìn)樣后約105分鐘至430分鐘出現(xiàn)扁蒴藤素峰，收集該流份，濃縮后得到純 扁蒴藤素單體。
由于采用了合理的溶劑體系，控制主機(jī)轉(zhuǎn)速和流動(dòng)相流速等工藝條 件，用本發(fā)明方法可得到高純度的扁蒴藤素。且該分離純化過程條件溫和， 分離時(shí)間短，由于不引入酸堿，從而減少了化合物化學(xué)性質(zhì)的變化，保持 化合物的穩(wěn)定而減少損失，化合物不流失也不存在死吸附。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1
南蛇藤干燥根皮IOO克(湖南省南部山區(qū)所產(chǎn))用二氯甲烷冷浸提取， 每次冷浸24小時(shí)，再回收溶劑'，重復(fù)三次，得褐色干燥粉末狀物質(zhì)，即 為粗提干燥物，精確稱取二氯甲垸粗提干燥物11.2克。
精確稱取二氯甲烷粗提干燥物1克，用石油醚乙醇水(溶劑體積 比10: 10: 1)溶劑系統(tǒng)的上相溶解樣品，開啟恒溫循環(huán)器，設(shè)置溫度為 25攝氏度，以該溶劑系統(tǒng)上相為固定相，下相為流動(dòng)相，用雙泵等比例同 時(shí)泵入流動(dòng)相(下相)和固定相(上相)，當(dāng)溶劑從管路出口流出時(shí)，停
止泵入固定相，設(shè)定流動(dòng)相流速為2ml/min，同時(shí)開啟主機(jī)電機(jī)，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn) 速為880rpm，十幾分鐘后，管柱內(nèi)溶劑系統(tǒng)達(dá)成動(dòng)態(tài)平衡，管柱出口處只 有流動(dòng)相流出。通過進(jìn)樣器注入樣品，設(shè)定波長為254nm，在進(jìn)樣后約180 分鐘出現(xiàn)扁蒴藤素峰，收集該流分，濃縮后得到純扁蒴藤素102mg，純度 大于99.5%，相對進(jìn)樣前收率為10.2%，相對于藥材1.142%。
實(shí)施例2
精確稱取二氯甲烷粗提干燥物1.2克，用石油醚乙醇水(溶劑體 積比10: 9: 1)溶劑系統(tǒng)的上相溶解樣品，開啟恒溫循環(huán)器，設(shè)置溫度為 24攝氏度，以該溶劑系統(tǒng)上相為固定相，下相為流動(dòng)相，用雙泵等比例同 時(shí)泵入流動(dòng)相(下相)和固定相(上相)，當(dāng)溶劑從管路出口流出時(shí)，停 止泵入固定相，設(shè)定流動(dòng)相流速為1.8ml/min，同時(shí)開啟主機(jī)電機(jī)，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為860rpm，十幾分鐘后，管柱內(nèi)溶劑系統(tǒng)達(dá)成動(dòng)態(tài)平衡，管柱出口處 只有流動(dòng)相流出。通過進(jìn)樣器注入樣品，設(shè)定波長為254nm，在進(jìn)樣后約 295分鐘出現(xiàn)扁蒴藤素峰，收集該流分，濃縮后得到純扁蒴藤素114mg， 純度大于99%，相對進(jìn)樣前收率為9.50%，相對于藥材1.064%。
實(shí)施例3
精確稱取二氯甲烷粗提干燥物1.6克，用石油醚乙醇水(溶劑體 積比9: 10: 1)溶劑系統(tǒng)的上相溶解樣品，開啟恒溫循環(huán)器，設(shè)置溫度為 23攝氏度，以該溶劑系統(tǒng)上相為固定相，下相為流動(dòng)相，用雙泵等比例同 時(shí)泵入流動(dòng)相(下相)和固定相(上相)，當(dāng)溶劑從管路出口流出時(shí)，停
止泵入固定相，設(shè)定流動(dòng)相流速為2.2ml/min，同時(shí)開啟主機(jī)電機(jī)，調(diào)節(jié) 轉(zhuǎn)速為840rpm，十幾分鐘后，管柱內(nèi)溶劑系統(tǒng)達(dá)成動(dòng)態(tài)平衡，管柱出口處 只有流動(dòng)相流出。通過進(jìn)樣器注入樣品，設(shè)定波長為254nm，在進(jìn)樣后約 105分鐘出現(xiàn)扁蒴藤素峰，收集該流分，濃縮后得到純扁蒴藤素143mg， 純度大于99%，相對進(jìn)樣前收率為8.938%，相對于藥材1.001%。
實(shí)施例4
精確稱取二氯甲烷粗提干燥物0.8克，用石油醚乙醇水(溶劑體
積比10: 10: 1.1)溶劑系統(tǒng)的上相溶解樣品，開啟恒溫循環(huán)器，設(shè)置溫
度為26攝氏度，以該溶劑系統(tǒng)上相為固定相，下相為流動(dòng)相，用雙泵等
比例同時(shí)泵入流動(dòng)相(下相)和固定相(上相)，當(dāng)溶劑從管路出口流出
時(shí)，停止泵入固定相，設(shè)定流動(dòng)相流速為1.4ml/min，同時(shí)開啟主機(jī)電機(jī)， 調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為820rpm，十幾分鐘后，管柱內(nèi)溶劑系統(tǒng)達(dá)成動(dòng)態(tài)平衡，管柱出 口處只有流動(dòng)相流出。通過進(jìn)樣器注入樣品，設(shè)定波長為254nm，在進(jìn)樣 后約260分鐘出現(xiàn)扁蒴藤素峰，收集該流分，濃縮后得到純扁蒴藤素27mg， 純度大于98.5%，相對進(jìn)樣前收率為3.375%，相對于藥材0.378%。
實(shí)施例5
精確稱取二氯甲烷粗提干燥物1.9克，用石油醚乙醇水(溶劑體 積比12: 10: 1.1)溶劑系統(tǒng)的上相溶解樣品，開啟恒溫循環(huán)器，設(shè)置溫度為22攝氏度，以該溶劑系統(tǒng)上相為固定相，下相為流動(dòng)相，用雙泵等 比例同時(shí)泵入流動(dòng)相(下相)和固定相(上相)，當(dāng)溶劑從管路出口流出
時(shí)，停止泵入固定相，設(shè)定流動(dòng)相流速為lml/min，同時(shí)開啟主機(jī)電機(jī)， 調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為800rpm，十幾分鐘后，管柱內(nèi)溶劑系統(tǒng)達(dá)成動(dòng)態(tài)平衡，管柱出 口處只有流動(dòng)相流出。通過進(jìn)樣器注入樣品，設(shè)定波長為254nm，在進(jìn)樣 后約430分鐘出現(xiàn)扁蒴藤素峰，收集該流分，濃縮后得到純扁蒴藤素 189mg，純度大于99%，相對進(jìn)樣前收率為9.947%，相對于藥材1.114%。
實(shí)施例6
精確稱取二氯甲烷粗提干燥物2克，用石油醚乙醇水(溶劑體積
比ll: 9: 1.1)溶劑系統(tǒng)的上相溶解樣品，開啟恒溫循環(huán)器，設(shè)置溫度為
27攝氏度，以該溶劑系統(tǒng)上相為固定相，下相為流動(dòng)相，用雙泵等比例同
時(shí)泵入流動(dòng)相(下相)和固定相(上相)，當(dāng)溶劑從管路出口流出時(shí)，停
止泵入固定相，設(shè)定流動(dòng)相流速為2.2ml/min，同時(shí)開啟主機(jī)電機(jī)，調(diào)節(jié) 轉(zhuǎn)速為870rpm，十幾分鐘后，管柱內(nèi)溶劑系統(tǒng)達(dá)成動(dòng)態(tài)平衡，管柱出口處 只有流動(dòng)相流出。通過進(jìn)樣器注入樣品，設(shè)定波長為254nm，在進(jìn)樣后約 215分鐘出現(xiàn)扁蒴藤素峰，收集該流分，濃縮后得到純扁蒴藤素205mg， 純度大于99,5%，相對進(jìn)樣前收率為10.25%，相對于藥材1.148%。
權(quán)利要求
1. 高速逆流色譜法制備高純度扁蒴藤素的方法，包括制備構(gòu)成固定相和流動(dòng)相的溶劑體系；設(shè)置恒溫循環(huán)器的溫度；調(diào)節(jié)流動(dòng)相流速；調(diào)節(jié)主機(jī)轉(zhuǎn)速；其特征在于，所述溶劑體系由石油醚、乙醇和水組成，三種組分的體積比為9～129～101～1.1，該溶劑體系的上相為固定相，下相為流動(dòng)相。
2. 如權(quán)利要求1所述的制備高純度扁蒴藤素的方法，其特征在于，所 述恒溫循環(huán)器的溫度為22 27'C 。
3. 如權(quán)利要求2所述的制備高純度扁蒴藤素的方法，其特征在于，所 述恒溫循環(huán)器的溫度為25'C 。
4. 如權(quán)利要求1所述的制備高純度扁蒴藤素的方法，其特征在于，所 述流動(dòng)相的流速為1.0 2.2ml/min。
5. 如權(quán)利要求4所述的制備高純度扁蒴藤素的方法，其特征在于，所 述流動(dòng)相的流速為1. 6ml/min 。
6.如權(quán)利要求1所述的制備高純度扁蒴藤素的方法，其特征在于，所 述主機(jī)轉(zhuǎn)速為800 880rpm。
7. 如權(quán)利要求6所述的制備高純度扁蒴藤素的方法，其特征在于，所 述主機(jī)轉(zhuǎn)速為840rpm。
8. 如權(quán)利要求1所述的制備高純度扁蒴藤素的方法，其特征在于，所述璿劑體系的三種組分的體積比為10: 10: 1。
9. 如權(quán)利要求1所述的制備高純度扁蒴藤素的方法，其特征在于，所述溶劑體系的三種組分的體積比為10: 9: 1。
10. 如權(quán)利要求I所述的制備高純度扁蒴藤素的方法，其特征在于，所 述溶劑體系的三種組分的體積比為ll: 9: 1.1。
全文摘要
本發(fā)明公開一種高速逆流色譜法制備高純度扁蒴藤素的方法，包括制備構(gòu)成固定相和流動(dòng)相的溶劑體系；調(diào)節(jié)流動(dòng)相流速；調(diào)節(jié)主機(jī)轉(zhuǎn)速；其特征在于，所述溶劑體系由石油醚、乙醇和水組成，三種組分的體積比為9～12∶9～10∶1～1.1，該溶劑體系的上相為固定相，下相為流動(dòng)相。該方法分離條件溫和，分離效率高，且分離時(shí)間短，能得到高純度的扁蒴藤素。
文檔編號(hào)C07J75/00GK101519420SQ20081003390
公開日2009年9月2日 申請日期2008年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月26日
發(fā)明者翔 倪, 楊培明, 歐陽丹薇, 肖婕妤, 許海燕, 佳 陳 申請人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院