專利名稱：：神經(jīng)氈蛋白片段與神經(jīng)氈蛋白抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供了單獨的或與抗神經(jīng)氈蛋白抗體復(fù)合的神經(jīng)氈蛋白l(Nrpl)和神經(jīng)氈蛋白2(Nrp2)片段的晶體結(jié)構(gòu)及其用途。本發(fā)明進一步提供了結(jié)合Nrpl和/或Nrp2的抗體及其使用方法。
背景技術(shù)：
：血管系統(tǒng)的發(fā)育是許多生理性和病理性過程的基本要求?；钴S生長中的組織諸如胚胎和腫瘤要求充足的血液供應(yīng)。它們通過生成促血管發(fā)生因子來滿足這一需要，所述促血管發(fā)生因子經(jīng)由一般稱為血管發(fā)生(angiogenesis)的過程促進新血管形成和維持。血管形成是復(fù)雜但有序的生物學(xué)事件，涉及所有或許多以下步驟a)自已有的內(nèi)皮細胞(EC)增殖出EC或自祖細胞分化出EC;b)EC遷移并接合以形成索樣結(jié)構(gòu)；c)血管索然后發(fā)生管發(fā)生(tubulogenesis)以形成具有中央內(nèi)腔的血管；d)已有的索或血管伸出芽以形成次生血管；e)初級血管叢發(fā)生進一步重塑(remodeling)和整形(resh即ing);及f)內(nèi)皮周細胞(peri-endothelialcell)被募集來包圍內(nèi)皮管，為血管提供維持和調(diào)節(jié)功能，此類細胞包括用于小毛細血管的周細胞、用于大血管的平滑肌細胞、和心臟中的心肌細胞。Hanahan，D.Science277:48-50(1997);Hogan，B丄禾口Kolodziej，P.A.NatureReviewsGenetics.3:513-23(2002);Lubarsky，B.和Krasnow，M.A.Cell.112:19-28(2003)?，F(xiàn)在完全確立了血管發(fā)生涉及多種病癥的發(fā)病機理。這些包括實體瘤和轉(zhuǎn)移、動脈粥樣硬化、晶狀體后纖維組織增生、血管瘤、慢性炎癥、眼內(nèi)新血管疾病諸如增殖性視網(wǎng)膜病變例如糖尿病性視網(wǎng)膜病、年齡相關(guān)黃斑變性(AMD)、新生血管性青光眼、移植角膜組織和其它組織的免疫排斥、類風濕性關(guān)節(jié)炎、和銀屑病。Folkman等，J.Biol.Chem.，267:10931-10934(1992);Klagsb進等，Annu.Rev.Physiol.53:217-239(1991);GarnerA.，〃Vasculardiseases〃，在GarnerA禾口KlintworthGK編的《PathobiologyofOcularDisease.ADy謹icApproach》第2版(MarcelDekker，NY，1994)中，pp1625-1710。在腫瘤生長的情況中，血管發(fā)生對于自增生至瘤形成的轉(zhuǎn)換，及為腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移提供營養(yǎng)似乎是至關(guān)重要的。Folkman等，Nature339:58(1989)。新血管形成(neovascularization)讓腫瘤細胞獲得了與正常細胞相比的生長優(yōu)勢和增殖自治。腫瘤通常開始于單個異常細胞，由于與可利用毛細管床的距離，該細胞只能增殖至幾立方毫米的尺寸，而且它能在較長的一段時間里保持"休眠"狀態(tài)而不進一步生長和傳播。有些腫瘤細胞然后轉(zhuǎn)向血管發(fā)生表型以激活內(nèi)皮細胞，所述內(nèi)皮細胞增殖并成熟成新的毛細血管。這些新形成的血管不僅讓原發(fā)性腫瘤繼續(xù)生長，而且讓轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞傳播并再建群(recolonization)。因而，在腫瘤切片中的微血管密度與乳腺癌及數(shù)種其它腫瘤的患者存活之間觀察到了相關(guān)性。Weidner等，N.Engl.J.Med324:1-6(1991);Horak等，Lancet340:1120-1124(1992);Macchiarini等，Lancet340:145-146(1992)。尚未完全了解控制血管發(fā)生轉(zhuǎn)換的精確機制，但是認為腫瘤塊的新血管形成源自眾多血管發(fā)生剌激物與抑制物的凈平衡(Folkman，NatMed1(1):27-31(1995))。血管發(fā)育的過程受到緊密調(diào)節(jié)。迄今為止，多種分子，多為由周圍細胞生成的分泌性因子，已顯示出調(diào)節(jié)EC分化、增殖、遷移和接合成索樣結(jié)構(gòu)。例如，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)已鑒定為涉及剌激血管發(fā)生和誘導(dǎo)血管通透性的關(guān)鍵因子。Ferrara等，Endocr.Rev.18:4-25(1997)。甚至單個VEGF等位基因的遺失導(dǎo)致胚胎致死的發(fā)現(xiàn)指向此因子在血管系統(tǒng)的發(fā)育和分化中所發(fā)揮的不可代替的作用。此外，VEGF已顯示為與腫瘤和眼內(nèi)病癥有關(guān)的新血管形成的關(guān)鍵介導(dǎo)物。Ferrara等，Endocr.Rev.見上文。VEGFmRNA在多數(shù)所檢查的人腫瘤中過表達。Berkman等，J.Clin.Invest.91:153-159(1993);Brown等，HumanPathol.26:86-91(1995);Brown等，CancerRes.53:4727-4735(1993);Mattern等，Brit.J.Cancer73:931-934(1996);Dvorak等，Am.J.Pathol.146:1029-1039(1995)。同樣，眼部液體中VEGF的濃度水平與糖尿病性和其它缺血相關(guān)視網(wǎng)膜病患者中的活潑血管增殖的存在高度相關(guān)。Aiello等，N.Engl.J.Med.331:1480-1487(1994)。此外，研究證明了VEGF在AMD患者脈絡(luò)膜新血管膜中的定位。Lopez等，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.37:855-868(1996)?？筕EGF中和性抗體在裸鼠中遏制多種人腫瘤細胞系的生長(Kim等，Nature362:841-844(1993);Warren等，J.Clin.Invest.95:1789-1797(1995);Borgstr6m等，CancerRes.56:4032-4039(1996);Melnyk等，CancerRes.56:921-924(1996))，而且在缺血性視網(wǎng)膜病癥模型中還抑制眼內(nèi)血管發(fā)生。Adamis等，Arch.Ophthalmol.114:66-71(1996)。因此，抗VEGF單克隆抗體或其它VEGF作用抑制劑是有希望用于治療腫瘤和多種眼內(nèi)新血管病癥的候選物。此類抗體記載于例如1998年1月14日公開的EP817，648和1998年10月15日公開的W098/45331和W098/45332?？筕EGF抗體之一，貝伐單抗(bevacizumab)已獲FDA批準與化療方案聯(lián)合用于治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌(CRC)和非小細胞肺癌(NSCLC)。而且，貝伐單抗正在許多進行中的治療各種癌癥適應(yīng)證的臨床試驗中進行研究。在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中，神經(jīng)元伸出纜樣軸突，所述軸突遷移長距離以到達它們的耙點。見綜述CarmelietandTessier-Lavigne(2005)Nature436:193-200。生長中的軸突的領(lǐng)先尖端是高度能動的感覺結(jié)構(gòu)，稱為生長錐。通過絲足伸展(filopodialextension)的伸展和收縮的動態(tài)循環(huán)，生長錐不斷感覺和評估其空間環(huán)境中的眾多提示，并精確選擇正確航跡來向其最終靶點延伸。在過去的十年里，在了解軸突導(dǎo)向機制方面取得了可觀的進展。見綜述Dickson(2002)Science298:1959-64。導(dǎo)向提示來自四種引誘物和驅(qū)除物；可以作用于近程(即細胞或基質(zhì)相關(guān)的)或遠程(即可擴散的)。迄今為止，已鑒定了四大族軸突導(dǎo)向分子netrins(神經(jīng)生長因子)、sem即horins(腦信號蛋白)、印hrins和slits。見綜述Huber等(2003)A匪RevNeurosci26:509_63。腦信號蛋白(Sema)，也稱作腦衰蛋白(coll即sin)，屬于一大族在系統(tǒng)發(fā)生上保守的分泌性和膜結(jié)合性蛋白質(zhì)。腦信號蛋白家族的成員能夠在神經(jīng)發(fā)育過程中介導(dǎo)驅(qū)除性和引誘性軸突導(dǎo)向事件。R即er(2000)Curr0pinNeurobiollO:88-94。迄今為止鑒定的超過三十種腦信號蛋白都享有大約500個氨基酸的保守N-末端Sema結(jié)構(gòu)域。腦信號蛋白成員根據(jù)它們的結(jié)構(gòu)相似性和物種起源歸入八個亞家族。關(guān)于腦信號蛋白統(tǒng)一命名法的更多詳情見Sem鄰horinNomenclatureCommittee(1999)Cell97:551-552。神經(jīng)氈蛋白(neuropilin，NRP)家族由兩種同源蛋白質(zhì)構(gòu)成，神經(jīng)氈蛋白-1(NRP1)和神經(jīng)氈蛋白-2(NRP2)。NRP1首先鑒定為在生長中的軸突的生長錐中表達的I6型130kDa跨膜糖蛋白。NRP2隨后通過表達克隆得到鑒定。FujisawaandKitsukawa(1998)CurrOpinNeurobiol8:587-592。發(fā)現(xiàn)NRP是腦信號蛋白的一個子集(即第3類腦信號蛋白)的受體。有人提出NRP與另一個腦信號蛋白受體家族(即神經(jīng)叢素(plexin))—起發(fā)揮非信號傳導(dǎo)性共同受體的功能。盡管最初描述為軸突導(dǎo)向的介導(dǎo)物，已發(fā)現(xiàn)NRP在血管發(fā)育中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。CarmelietandTessier-Lavigne(2005)。它被鑒定為在腫瘤和內(nèi)皮細胞上表達的同等型特異性VEGF受體，大大促進了對NRP在血管和腫瘤生物學(xué)中的作用的了解。Soker等(1998)Cell92:735-745;Klagsbrun等(2002)AdvExpMedBiol515:33-48。遺傳研究提供了有力的證據(jù)來證明Nrpl是血管形態(tài)發(fā)生所要求的。Nrpl功能的喪失導(dǎo)致血管重塑和分支缺陷，這種表型可以因Nrp2功能喪失而進一步增強。Kawasaki等(1999)Development126:4895-4902;Takashima等(2002)ProcNatlAcadSciUSA99:3657-3662。這些結(jié)果說明在發(fā)育早期Nrpl和Nrp2可能具有重疊的功能。然而，每一種Nrp的表達在發(fā)育晚期隔開，Nrpl主要在動脈中表達，而Nrp2主要在靜脈和淋巴管中表達。Yuan等(2002)Development129:4797-4806;Herzog等(2001)MechDev109:115-119。注意，僅僅Nrp2功能的喪失特異性的削弱淋巴發(fā)育。因為Nrpl在發(fā)育過程中在許多其它細胞類型中表達，所以通過生成EC特異性敲除(其導(dǎo)致與無效等位基因中所看到的類似的血管缺陷)得出了血管Nrpl的作用。Gu等(2003)DevCell5:45-57。有趣的是，此研究還顯示出Sema3A與NRP1結(jié)合不是血管發(fā)育所要求的。在另一項研究中，在Nrpl敲除胚胎的發(fā)育中的后腦的內(nèi)皮頂端細胞的導(dǎo)向中觀察到缺陷。Gerhardt等(2004)DevDyn231:503-509。盡管對NRP1在血管發(fā)育中的作用進行了廣泛研究，仍然不清楚NRP1是否是專門通過VEGF-VEGF受體2(VEGFR2)途徑(作為VEGF結(jié)合VEGFR2的增強劑并由此作為VEGFR2信號傳導(dǎo)的增強劑)或通過不依賴VEGFR2的信號傳導(dǎo)途徑或二者的組合來發(fā)揮其血管功能的。單克隆抗體可以使用重組DNA技術(shù)來制備。單克隆抗體得到了廣泛使用，特別是那些衍生自嚙齒類的單克隆抗體，然而非人抗體在人體中常常是抗原性的。本領(lǐng)域試圖通過構(gòu)建"嵌合"抗體來克服這個問題，在嵌合抗體中非人抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域與人恒定域偶聯(lián)(Cabilly等，美國專利No.4，816，567)。人恒定域的同種型可以選擇成適合嵌合抗體參與抗體依賴性細胞的細胞毒性(ADCC)和補體依賴性細胞毒性的。在試圖解決抗體的抗原結(jié)合功能和將人抗體中異源序列的使用最小化的另一項努力中，對多種抗原生成了人源化抗體，其中基本上少于整個人可變域被來自非人物種的相應(yīng)序列替代。例如，將嚙齒類殘基用于替代人抗體的相應(yīng)區(qū)段。在實踐中，人源化抗體通常是這樣的人抗體，其中一些互補決定區(qū)(CDR)殘基及可能的一些框架區(qū)(FR)殘基用嚙齒類抗體中類似位點的殘基替代。Jones等(1986)Nature321:522-525;Riechmann等(1988)Nature332:323-327;Verhoeyen等(1988)Science239:1534-1536。在對人施用治療性抗體之前，一般需要在非人哺乳動物中進行臨床前研究以評估抗體的療效和/或毒性。理想的是，進行這些研究的抗體能夠識別靶抗原并以高效力與靶抗原起作用，其中所述靶抗原對于宿主動物諸如小鼠或非人靈長類是內(nèi)源的。噬菌體展示技術(shù)提供了用于生成和選擇能與配體諸如抗原結(jié)合的新蛋白質(zhì)的有力工具。使用噬菌體展示技術(shù)，可以生成蛋白質(zhì)變體的大型文庫并快速分揀那些能以高親和力與靶抗原結(jié)合的序列。將編碼變異多肽的核酸與編碼病毒外殼蛋白諸如基因III蛋白或基因VIII蛋白的核酸序列融合。已經(jīng)開發(fā)了單價噬菌體展示系統(tǒng)，其中將編碼蛋白質(zhì)或多肽的核酸序列與編碼基因III蛋白一部分的核酸序列融合。(Bass，S.(1990)Proteins8:309;LowmanandWells(1991)Methods:ACompaniontoMethodsinEnzymology3:205)。在單價噬菌體展示系統(tǒng)中，基因融合物以低水平表達，而野生型基因III蛋白也表達，使得(病毒)顆粒的感染性得到保留。生成肽文庫和篩選那些文庫的方法已經(jīng)公開于許多專利(例如美國專利No.5，723，286、美國專利No.5，432，018、美國專利No.5，580，717、美國專利No.5，427，908和美國專利No.5，498，530)。證明肽在絲狀噬菌體表面上表達和功能性抗體片段在大腸桿菌周質(zhì)中表達對于開發(fā)噬菌體展示抗體文庫是重要的。(Smith等(1985)Science228:1315;SkerraandPluckthun(1988)Science240:1038)。已經(jīng)以多種方式制備了抗體或抗原結(jié)合多肽的文庫，包括通過插入隨機DNA序列來改變單一基因或者通過克隆一族相關(guān)基因。使用噬菌體展示來展示抗體或抗原結(jié)合片段的方法已經(jīng)記載于美國專利No.5，750，373、5，733，743、5，837，242、5，969，108、6，172，197、5，580，717和5，658，727。然后對文庫篩選具有期望特征的抗體或抗原結(jié)合蛋白的表達。噬菌體展示技術(shù)在制備具有期望特征的抗體方面相對于常規(guī)雜交瘤和重組方法具有數(shù)項優(yōu)勢。此技術(shù)容許以較少的時間、無需使用動物就開發(fā)出具有多樣序列的大型抗體文庫。雜交瘤的制備或人源化抗體的制備動則就需要數(shù)月制備。另外，由于不需要進行免疫，可以對有毒的或具有低抗原性的抗原生成噬菌體抗體文庫(Hogenboom(1988)Immunotechniques4:1-20)。噬菌體抗體文庫還可用于生成和鑒定新的治療性抗體。噬菌體展示文庫已經(jīng)用于自經(jīng)免疫的、未免疫的人、種系序列、或未接觸過抗原的B細胞Ig全集生成人抗體(Barbas和Burton(1996)TrendsBiotech14:230;Griffiths等(1994)EMB0J.13:3245;Vaughan等(1996)Nat.Biotech.14:309;WinterEP0368684B1)。已經(jīng)使用多種淋巴樣組織生成了未接觸過抗原的或非免疫的抗原結(jié)合文庫。這些文庫中的一些可以通過商業(yè)途徑購買，諸如那些由CambridgeAntibodyTechnology禾口Morphosys開發(fā)的文庫(Vaughan等(1996)NatureBiotech14:309;Kn即pik等(1999)J.Mol.Biol.296:57)。然而，這些文庫中的許多具有有限的多樣性。自噬菌體展示文庫中鑒定和分離高親和力抗體的能力在分離用于治療用途的新抗體中是重要的。自文庫中分離高親和力抗體依賴于文庫的容量、細菌細胞的生產(chǎn)效率、和文庫的多樣性。參見例如Kn即pik等(1999)J.Mol.Bio1.296:57。由于抗體或抗原結(jié)合蛋白的不正確折疊和終止密碼子的存在，文庫的容量會因低效生產(chǎn)而縮小。如果抗體或抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域沒有得到正確折疊，那么在細菌細胞中的表達會受到抑制?？梢酝ㄟ^突變可變/恒定界面的表面轉(zhuǎn)角中的殘基或選定的CDR殘基來提高表達。(Deng等(1994)J.Biol.Chem.269:9533;Ulrich等(1995)PNAS，92:11907-11911;Forsberg等(1997)J.Biol.Chem.272:12430)。在細菌細胞中生成噬菌體抗體文庫時，框架區(qū)的序列是提供正確折疊的一個因素。生成抗體或抗原結(jié)合蛋白的多樣性文庫對于分離高親和力抗體也是重要的。已經(jīng)使用多種方法生成了在有限CDR中具有多樣性的文庫。參見例如Tomlinson(2000)NatureBiotech.18:989-994。CDR3區(qū)是受關(guān)注的，部分因為常常發(fā)現(xiàn)它們參與抗原結(jié)合。重鏈上的CDR3區(qū)的長度、序列和結(jié)構(gòu)構(gòu)象變化極大。其他人也已經(jīng)通過在每個位置使用所有20種氨基酸來隨機化重鏈和輕鏈可變域CDR區(qū)而產(chǎn)生了多樣性。認為使用所有20種氨基酸會產(chǎn)生變異抗體序列的大量多樣性并增加鑒定到新抗體的機會。(Barbas(1994)PNAS91:3809;Yelton，DE(1995)J.Immunology155:1994;Jackson，J.R.(1995)J.Immunology154:3310;Hawkins，RE(1992)J.Mol.Biology226:889)。發(fā)明才既述本發(fā)明提供了單獨的或與選擇性阻斷腦信號蛋白或VEGF結(jié)合的抗體復(fù)合的神經(jīng)氈蛋白-1和神經(jīng)氈蛋白_2(Nrpl和Nrp2)片段的晶體結(jié)構(gòu)。Nrp采取出乎意料的結(jié)構(gòu)域排列，其中a2、bl、和b2結(jié)構(gòu)域形成一個緊密核心?？贵w表位的位置與體外實驗一起顯示了VEGF和腦信號蛋白不直接競爭Nrp結(jié)合?；谟蒩l結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的結(jié)晶Nrp二聚體，本發(fā)明另外為受體二聚化或配體結(jié)合提供了模型。基于這些結(jié)果，一方面，本發(fā)明提供了一種由Nrplb皿片段形成的晶體，其衍射x射線輻射以生成代表所述片段三維結(jié)構(gòu)的衍射圖樣，該衍射圖樣大致具有晶胞常數(shù)a=65.9A,6=66.7A,c=74.7A，及空間群P2^2丄。另一方面，本發(fā)明關(guān)注一種由Nrpla2blb2片段形成的晶體，其衍射x射線輻射以生成代表所述片段三維結(jié)構(gòu)的衍射圖樣，該衍射圖樣大致具有晶胞常數(shù)a=53.2A，6=68.2A，c=66.6A，及空間群P2丄。又一方面，本發(fā)明關(guān)注NrplM片段與抑制血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)結(jié)合Nrpl的抗NrplB抗體(YW107.4.87)的Fab片段之間形成的復(fù)合物的晶體，其中所述晶體其衍射x射線輻射以生成代表所述復(fù)合物三維結(jié)構(gòu)的衍射圖樣，該衍射圖樣大致具有晶胞常數(shù)a=213A,6=213A，c=45.3A,及空間群H3。又一方面，本發(fā)明關(guān)注一種由Nrp2blb2片段形成的晶體，其衍射x射線輻射以生成代表所述片段三維結(jié)構(gòu)的衍射圖樣，該衍射圖樣大致具有晶胞常數(shù)a=36.5A，6=70.5A，c=122A，及空間群P2A2丄。又一方面，本發(fā)明關(guān)注一種由Nrp2a2blb2片段形成的晶體，其衍射x射線輻射以生成代表所述片段三維結(jié)構(gòu)的衍射圖樣，該衍射圖樣大致具有晶胞常數(shù)a=50.lA，6=193A,c=66.2A,及空間群P2p另一方面，本發(fā)明關(guān)注Nrp2ala2blb2片段與抑制腦信號蛋白結(jié)合Nrp2的抗泛NrpA抗體(anti-panNrpAantibody)的Fab片段之間形成的復(fù)合物的晶體，其中所述晶體其衍射x射線輻射以生成代表所述復(fù)合物三維結(jié)構(gòu)的衍射圖樣，該衍射圖樣大致具有晶胞常數(shù)"=148A，6=106A,c=92.4A,及空間群C2。本發(fā)明還關(guān)注Nrp2ala2blb2片段與抑制腦信號蛋白結(jié)合Nrp2的抗泛NrpA抗體的Fab片段之間形成的復(fù)合物的晶體，其中所述晶體其衍射x射線輻射以生成代表所述復(fù)合物三維結(jié)構(gòu)的衍射圖樣，該衍射圖樣大致具有晶胞常數(shù)片段^=121A,6=121A,c=203A，及空間群P&21。另一方面，本發(fā)明關(guān)注一種抗泛NrpA抗體或其片段，包含圖7中所示輕鏈可變域序列和/或圖8中所示重鏈可變域序列。又一方面，本發(fā)明關(guān)注一種抗泛NrpAYW68.11抗體Fab片段，其包含圖9A中所示序列。又一方面，本發(fā)明關(guān)注一種抗泛NrpAYW68.11.26抗體Fab片段，其包含圖9B中所示序列。又一方面，本發(fā)明關(guān)注一種抗Nrp抗體，其與抗泛NrpA抗體競爭Nrp結(jié)合。在一個實施方案中，所述抗Nrp抗體基本上與抗泛NrpA抗體結(jié)合相同表位。在另一個實施方案中，所述抗Nrp抗體結(jié)合包含由Nrp2w氨基酸序列的氨基酸殘基Y39，Y45，P46，Q47，F(xiàn)72，N73P74,H75，F(xiàn)76，A133，和R138限定的界面至少一部分的表位。在又一個實施方案中，所述抗Nrp抗體結(jié)合Nrp1和Nrp2二者。在又一個實施方案中，所述抗Nrp抗體具有至少約O.10nM的對Nrpl和Nrp2二者的，或至少約0.15nM的對Nrpl和Nrp2二者的，或至少約0.20nM的對Nrpl和Nrp2二者的，或至少約0.25nM的對Nrpl和Nrp2二者的，或至少約0.30nM的對Nrpl和Nrp2二者的結(jié)合親和力。在另一個實施方案中，所述抗Nrp抗體阻斷Sema3結(jié)合Nrpl和Nrp2二者。在又一個實施方案中，所述抗Nrp抗體不阻斷VEGF結(jié)合Nrpl或Nrp2。在一個不同實施方案中，所述抗Nrp抗體在體外抑制腦信號蛋白生物學(xué)活性。在另一個實施方案中，所述抗Nrp抗體在體內(nèi)抑制腦信號蛋白生物學(xué)活性。另一方面，本發(fā)明關(guān)注一種制備腦信號蛋白拮抗劑的方法，包括設(shè)計結(jié)合包含由Nrp2ala2blb2氨基酸序列的氨基酸殘基Y39，Y45，P46，Q4了，F(xiàn)了2，N"P74，H了5，F(xiàn)了6，Al33和Rl38限定的界面至少一部分的位點的分子，合成所述化合物，并證實所述化合物阻斷腦信號蛋白結(jié)合Nrpl和Nrp2。在一個實施方案中，所述拮抗劑不干擾VEGF結(jié)合Nrp1或Nrp2，而且所述方法可包括證實所述拮抗劑不干擾VEGF結(jié)合Nrpl或Nrp2的額外步驟。在另一個實施方案中，所述方法進一步包括證實所述拮抗劑不干擾VEGF生物學(xué)活性的步驟。所述拮抗劑可以例如選自下組抗體，抗體片段，結(jié)合性多肽，肽，和非肽小分子，而且優(yōu)選是抗體或抗體片段，其中所述抗體片段包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、(scFv)2、dAb、線性抗體、單鏈抗體分子、微型抗體(minibody)、雙抗體、和由抗體片段形成的多特異性抗體。另一方面，本發(fā)明關(guān)注一種制備VEGF拮抗劑的方法，包括使用自Nrplbl片段與抗NrplB抗體(YW107.4.87)的Fab片段之間的復(fù)合物形成的晶體衍生的三維結(jié)構(gòu)來設(shè)計結(jié)合包含所述NrplB抗體結(jié)合的表位至少一部分的位點的分子，合成所述化合物，并證實所述化合物抑制VEGF結(jié)合Nrpl，其中所述晶體其衍射x射線輻射以生成代表所述復(fù)合物三維結(jié)構(gòu)的衍射圖樣，該衍射圖樣大致具有晶胞常數(shù)《=213A,6=213A，c—5.3A，及空間群H3。在一個實施方案中，所述拮抗劑不干擾腦信號蛋白結(jié)合Nrpl，而且所述方法可額外包括證實這一點的步驟。在另一個實施方案中，所述拮抗劑抑制VEGF生物學(xué)活性。10在又一個實施方案中，所述方法進一步包括證實所述拮抗劑抑制VEGF生物學(xué)活性的步驟。在又一個實施方案中，其中所述拮抗劑抑制血管重構(gòu)。在又一個實施方案中，所述拮抗劑選自下組抗體，抗體片段，結(jié)合性多肽，肽和非肽小分子，而且優(yōu)選是抗體或抗體片段，其中所述抗體片段可以是例如Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、(scFv)2、dAb、線性抗體、單鏈抗體分子、微型抗體、雙抗體、或由抗體片段形成的多特異性抗體。本發(fā)明進一步關(guān)注一種用于治療癌癥的方法，包括對有需要的哺乳動物受試者施用有效量的通過本發(fā)明上述方法制備的VEGF拮抗劑。所述癌癥可以例如選自下組乳腺癌，結(jié)腸直腸癌，非小細胞肺癌，非何杰金氏淋巴瘤(NHL)，腎癌，前列腺癌，肝癌，頭頸癌，黑素瘤，卵巢癌，間皮瘤，和多發(fā)性骨髓瘤。在另一個實施方案中，所述治療進一步包括第二治療劑，其中所述第二治療劑可以是但不限于選自下組的試劑抗血管發(fā)生劑，抗腫瘤組合物，化療劑和細胞毒劑，諸如別的VEGF拮抗劑。在又一個實施方案中，所述別的VEGF拮抗劑是抗hVEGF抗體或其片段。所述抗hVEGF抗體可以例如能夠與抗體A4.6.1結(jié)合相同的VEGF表位，而且具體是bevacizumab或ranibizumab。在其它實施方案中，所述第二治療劑是選自下組的受體酪氨酸激酶抑制劑vatalanib(PTK787)，erlotinib(TARCEVA),0SI-7904,ZD6474(ZACTIMA),ZD6126(ANG453)，ZD1839,sunitinib(SUTENT⑧)，semaxanib(SU5416)，AMG706，AG013736，Imatinib(GLEEVEC⑧)，MLN-518，CEP-701，PKC-412，L即atinib(GSK572016)，VELCADE，AZD2171，sorafenib(NEXAVAR),XL880，和CHIR-265。附圖簡述表1-數(shù)據(jù)收集和精化統(tǒng)計圖l-VEGF不阻斷Sema3A誘導(dǎo)的DRG神經(jīng)元生長錐塌陷。A)軸突生長錐的圖像。未處理的DRG具有大的、富含肌動蛋白的生長錐(箭頭)，其在添加Sema3A后顯著縮小。以50iig/ml添加抗Nrp抗體。B)對Sema3A誘導(dǎo)的生長錐塌陷的定量。塌陷的生長錐的百分比通過對塌陷的和未塌陷的生長錐計數(shù)來計算(N二4個外植體每種條件)。誤差條代表均值的標準誤差。圖2-神經(jīng)氈蛋白晶體結(jié)構(gòu)的匯總。A)Nrp胞外域由串聯(lián)的CUB(ala2)、串聯(lián)的凝血因子V/VIII(blb2)、和一個MAM(cl)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。此報告中所呈現(xiàn)的七種晶體結(jié)構(gòu)的卡通展示及下面列出的分辨極限。橙色球體指示a2結(jié)構(gòu)域中結(jié)合的鈣離子。B)人Nrpl和Nrp2的ala2blb2結(jié)構(gòu)域的序列比對。二級結(jié)構(gòu)元件指Nrp2-ala2blb2結(jié)構(gòu)(藍色，al;綠色，a2;黃色，bl;紅色，b2)，而且是依照spermadhesinCUB結(jié)構(gòu)域(Romero,A.等，NatStructBiol4,783-8(1997))和凝血因子VC2結(jié)構(gòu)域(Macedo-Ribeiro，S.等，Nature402,434-9(1999))所采用的規(guī)則命名的。以藍色和黃色框式的殘基分別描繪抗泛NrpA和抗NrplB的抗體表位。以橙色著重顯示的氨基酸指示a2中的Ca2+結(jié)合位點，而紅色殘基代表al結(jié)構(gòu)域中的推定Ca2+結(jié)合位點。綠色陰影的殘基著重顯示破壞Sema3A與Nrpl之間相互作用的氨基酸替代位置(Gu，C.等，JBiolChem277，18069-76(2002))。此比對是用EsPript(Gouet，P.等，NucleiAcidsRes31，3320_3(2003))生成的。圖3-神經(jīng)氈蛋白的整體結(jié)構(gòu)域體系結(jié)構(gòu)。A)與抗泛NrpA的Fab片段(淺橙色，重鏈；灰色，輕鏈)形成的復(fù)合物中Nrp2(藍色，al;綠色，a2;黃色，bl;紅色，b2)的結(jié)構(gòu)域組織。N-糖基化的殘基以品紅標示。B)Nrpl和Nrp2a2blb2結(jié)構(gòu)的條帶展示；橙色球體著重顯示了結(jié)合的鈣離子。C)來自基于a2blb2結(jié)構(gòu)域的兩種不同晶形的Nrp2/Fab復(fù)合物的重疊。注意al結(jié)構(gòu)域與a2blb2區(qū)相比的較差重疊。所有結(jié)構(gòu)圖都是用PyMol(http:〃www.pymol.org)生成的。圖4-神經(jīng)氈蛋白CUB結(jié)構(gòu)域的分子詳情。A)在a2blb2結(jié)構(gòu)中，a2結(jié)構(gòu)域包括結(jié)合的鈣離子(橙色)。Nrpal(見小圖C)和a2結(jié)構(gòu)域缺少在spermadhesin(Romero等，見上文)中發(fā)現(xiàn)的bl鏈。B)Nrpla2結(jié)構(gòu)域的鈣離子由三個帶負電荷的氨基酸、兩個主鏈羰基氧和水分子配位。這些相互作用在Nrp中是高度保守的(見圖S2-S3)。C)(左圖)氨基酸是依照埋藏在Nrp2/Fab界面處的溶劑可及表面百分比著色的(紅色，75-100%;橙色，50-74%;黃色，25-49%)?？狗篘rpA與Nrpl和Nrp2起交叉反應(yīng)，而且結(jié)構(gòu)性表位的十四個殘基中有十一個是相同的(黑色文本，相同；白色文本，不保守的；信號標示側(cè)鏈指向al蛋白質(zhì)核心的殘基)。以綠色描繪的殘基代表Nrpl與Sema3A"之間的相互作用所必需的氨基酸替代的位置。(右圖)這些氨基酸替代的Ca原子標示為綠色球體。紫色陰影的Ca原子代表推定的鈣結(jié)合位點。D)抗泛NrpVNrp2界面。Nrp2依照靜電勢顯示為分子表面(紅色，酸性；藍色，堿性)?？贵w接觸殘基以來自CDRH2、H3、和L3的芳香族殘基為主。圖5-NrpVEGF結(jié)合域和肝素結(jié)合域的特征。A)Nrpblb2晶體結(jié)構(gòu)(Nrpl，黃色(bl)和紅色(b2);Nrp2，灰色)的重疊。藍色(Nrpl)和綠色(Nrp2)殘基著重顯示b2而非bl的"剌突"中的構(gòu)象差異。B)以靜電勢對大鼠(PDB登錄號20RZ)(VancerKooi，C.W.，etal.，ProcNatlAcadSciUSA(2007))和人blb2晶體結(jié)構(gòu)的分子表面著色。黃色箭頭標示由bl結(jié)構(gòu)域中的"剌突"形成并代表大鼠結(jié)構(gòu)(VanderKooi等，見上文)中促吞噬肽(tuftsin)結(jié)合位點的酸性溝。綠色箭頭標示肝素結(jié)合片的大致位置。C)將十二種Nrp(圖S3)中blb2結(jié)構(gòu)域的相對序列保守性(綠色，100%;黃色，>75%)繪制到人Nrplblb2結(jié)構(gòu)的表面上。兩個高度保守的片以橙色描繪。以青色描繪的殘基標示那些在抗NrplB-Fab/bl復(fù)合物中接觸Fab的殘基。a2結(jié)構(gòu)域(小麥色)是使用來自Nrpl的blb2和a2blb2結(jié)構(gòu)域的重疊顯示的。D)抗NrplB-Fab/bl復(fù)合物的條帶展示(黃色，bl;橙色，重鏈；灰色，輕鏈)。E)抗Nrpl7bl界面。bl結(jié)構(gòu)域依照靜電勢卡通顯示為分子表面；黃色箭頭標示VEGF尾結(jié)合溝。只有CDRH3和Ll接觸bl。圖6-Nrp2結(jié)晶二聚體提示VEGF和腦信號蛋白結(jié)合的模型。A)Nrp2在Nrp2/Fab復(fù)合物的兩種晶形中都形成鞍形二聚體。此圖強調(diào)來自單斜晶形Fab復(fù)合物的Nrp2ala2blb2結(jié)構(gòu)域。標示了推定的VEGF尾結(jié)合位點、肝素結(jié)合位點、和腦信號蛋白結(jié)合位點。B)VEGF/Nrp和腦信號蛋白/Nrp復(fù)合物的潛在模型，其基于晶體結(jié)構(gòu)中Nrpal介導(dǎo)的二聚體。圖7-抗泛NrpA克隆YW68.11和YW68.11.26的輕鏈可變域序列比對。圖8-抗泛NrpA克隆YW68.11和YW68.11.26的重鏈可變域序列比對。圖9A-人抗泛NrpAIgGl抗體YW68.11的完整序列。圖9B-人抗泛NrpAIgGl抗體YW68.11.26的完整序列。12表SI-用于進行結(jié)晶和防凍的條件。圖Sl-抗Nrp抗體結(jié)合動力學(xué)分析?？狗篘rpA抗體的BIAcore動力學(xué)分析。于25t:在IgG固定化BIAcore傳感器芯片上注射500nM每種人NRP蛋白的傳感圖證明了結(jié)合特異性?？狗篘rpA結(jié)合Nrpl和Nrp2ala2blb2，但不結(jié)合Nrp2blb2結(jié)構(gòu)域。圖S2-NrpCUB結(jié)構(gòu)域包括保守的鈣結(jié)合位點。A)Nrpla2blb2結(jié)構(gòu)中鈣離子周圍的電子密度(最終2Fo-Fc圉在1.5q處定型)。b)Nrp2a2結(jié)構(gòu)域的鈣離子。c)描繪鈣結(jié)合位點的三個帶負電荷的氨基酸(橙色陰影)在來自Nrpl和Nrp2的CUB結(jié)構(gòu)域中是保守的。圖S3-神經(jīng)氈蛋白的序列比對。來自人、小鼠、大鼠、斑馬魚(BRARE)、蛙(XENLA)、和雞Nrpl和Nrp2的ala2blb2結(jié)構(gòu)域的全長序列比對。此圖是使用與圖2B相同的方案著色的，而且是用EsPript(GouetP.等，見上文)生成的。圖S4-Nrpl/促吞噬肽與bl/Fab結(jié)構(gòu)之間的比較。A)在nrpl-bl/抗NrplB_Fab復(fù)合物中，來自對稱相關(guān)分子的重鏈的C-端尾(紫色)占據(jù)促吞噬肽結(jié)合位點(Nrp2，分子表面以靜電勢標示；橙色，抗體重鏈；灰色，抗體輕鏈)。B)促吞噬肽(綠色)在與大鼠Nrplblb2形成的復(fù)合物(PDB登錄號20RZ)(VanderKooi，etal.，見上文)中的位置。C)小圖A中著重顯示的所述兩個結(jié)構(gòu)的重疊?？贵w和促吞噬肽如先前的小圖中那樣著色，其中人Nrplbl著黃色而大鼠Nrplblb2著青色。圖S5-Nrp2二聚體界面。A)在單斜晶形結(jié)構(gòu)中看到的Nrp2-ala2blb2/Fab二聚體條帶展示。B)Nrpl-bl/抗NrplB-Fab結(jié)構(gòu)重疊到Nrp2/Fab晶體結(jié)構(gòu)上。C)埋藏在a1/al界面處的氨基酸依照二聚化時埋藏的溶劑可及表面百分比著色(紅色，75-100%;橙色，50-74%;黃色，25-49%)。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及新的晶體結(jié)構(gòu)、用于調(diào)控NRP介導(dǎo)的生物學(xué)活性的方法、和用于鑒定能夠調(diào)控NRP介導(dǎo)的生物學(xué)活性的候選物的篩選測定法。定義"神經(jīng)氈蛋白/(neuropilin)"或NRP指神經(jīng)氈蛋白_1(NRP1)、神經(jīng)氈蛋白-2(NRP2)及其同等型(isoform)和變體全體，如Rossignol等(2000)Genomics70:211-222中所述。神經(jīng)氈蛋白是120-130kDa非酪氨酸激酶受體。有多種NRP-1和NRP-2剪接變體和可溶性同等型。神經(jīng)氈蛋白的基本結(jié)構(gòu)包含五個結(jié)構(gòu)域三個胞外結(jié)構(gòu)域(ala2、blb2和c)、一個跨膜結(jié)構(gòu)域、和一個胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。ala2結(jié)構(gòu)域與補體成分Clr和Cls(CUB)同源，其一般包含四個半胱氨酸殘基，形成兩個二硫鍵。blb2結(jié)構(gòu)域與凝血因子V和VIII同源。c結(jié)構(gòu)域的中央部分稱為MAM，因為它與跨膜肽酶(m印rin)、A5和受體酪氨酸磷酸酶P蛋白同源。ala2和blb2結(jié)構(gòu)域負責配體結(jié)合，而c結(jié)構(gòu)域?qū)τ谕投刍虍愋投刍侵陵P(guān)重要的。Gu等(2002)J.Biol.Chem.277:18069-76;HeandTessier-Lavigne(1997)Cell90:739-51。"神經(jīng)氈蛋白介導(dǎo)的生物學(xué)活性"一般指其中神經(jīng)氈蛋白-1和/或神經(jīng)氈蛋白_2發(fā)揮重大作用的生理性或病理性事件。此類活性的非限制性例子有胚胎神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育或神經(jīng)元再生、血管發(fā)生(包括血管造型)、腫瘤發(fā)生和腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的軸突導(dǎo)向。術(shù)語"抗體"以最廣義使用，明確覆蓋單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、及抗體片段，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性。術(shù)語"單克隆抗體"在用于本文時指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即構(gòu)成群體的各抗體個體是相同的，除了可以以極小量存在的可能的天然存在突變形式外。單克隆抗體是高度特異性的，針對單一抗原性位點。此外，與典型的包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的常規(guī)(多克隆)抗體制備物不同，每種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。修飾語"單克隆"指示抗體從基本上同質(zhì)的抗體群獲得的特征，不應(yīng)解釋為要求通過任何特定方法來生成抗體。例如，將依照本發(fā)明使用的單克隆抗體可通過最初由Kohler等(1975)Nature256:495記載的雜交瘤方法來制備，或者可通過重組DNA方法來制備(參見例如美國專利No.4，816，567)。"單克隆抗體"還可使用例如Clackson等(1991)Nature352:624-628和Marks等(1991)J.Mol.Biol.222:581-597中記載的技術(shù)從噬菌體抗體庫分離。單克隆抗體在本文中明確包括"嵌合"抗體(免疫球蛋白)以及此類抗體的片段，其中所述抗體重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性(美國專利No.4，816，567;Morrison等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851—6855)。非人(例如鼠)抗體的"人源化"形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。在極大程度上，人源化抗體指人免疫球蛋白(受體抗體)中的高變區(qū)殘基用具有期望特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類動物的高變區(qū)殘基替換的免疫球蛋白。在有些情況中，將人免疫球蛋白的Fv框架區(qū)(FR)殘基用相應(yīng)的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體中或在供體抗體中沒有找到的殘基。進行這些修飾是為了進一步改進抗體的性能。一般而言，人源化抗體將包含至少一個、通常兩個基本上整個如下的可變域，其中所有或基本上所有高變環(huán)對應(yīng)于非人免疫球蛋白的高變環(huán)，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗體任選還將包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。更多細節(jié)參見Jones等(1986)Nature321:522-525;Riechmann等(1988)Nature332:323-329;Presta(1992)Curr.Op.Struct.Biol.2:593—596。"物種依賴性抗體"指對來自第一哺乳動物物種的抗原的結(jié)合親和力強于對來自第二哺乳動物物種的所述抗原同系物的親和力的抗體。通常，物種依賴性抗體"特異性結(jié)合"人抗原(即結(jié)合親和力(Kd)數(shù)值不超過大約1X10—7M，優(yōu)選不超過大約1X10—8M，且最優(yōu)選不超過大約1X10—9M)，但是對來自第二非人哺乳動物物種的所述抗原同系物的結(jié)合親和力比對人抗原的結(jié)合親和力弱至少大約50倍、或至少大約500倍、或至少大約1000倍。物種依賴性抗體可以是上文所定義的各種類型抗體中的任一種，但是優(yōu)選人源化抗體或人抗體。在用于本文時，"抗體突變體"或"抗體變體"指物種依賴性抗體的氨基酸序列變體，其中物種依賴性抗體的一個或多個氨基酸殘基發(fā)生了修飾。此類突變體與物種依賴性抗體必然具有小于100%的序列同一性或相似性。在一個優(yōu)選的實施方案中，抗體突變體所具有的氨基酸序列與物種依賴性抗體的重鏈或輕鏈可變域的氨基酸序列具有至少75%、更優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少90%、最優(yōu)選至少95%的氨基酸序列同一性或相似性。關(guān)于此序列的同一性或相似性在本文中定義為在比對序列并在必要時引入缺口以實現(xiàn)最大百分比序列同一性后，候選序列中與物種依賴性抗體殘基相同(即相同殘基)或相似(即根據(jù)共同側(cè)鏈特性來自同一組的氨基酸殘基，見下文)的氨基酸殘基的百分比。N-末端、C-末端、或內(nèi)部的延伸、刪除、或插入可變域以外的抗體序列都不應(yīng)視為影響序列同一性或相似性。"分離的"抗體指已經(jīng)鑒定且自其天然環(huán)境的成分分開和/或回收的抗體。其天然環(huán)境的污染性成分指將會干擾該抗體的診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶、激素、和其它蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的溶質(zhì)。在優(yōu)選的實施方案中，將抗體純化至(1)根據(jù)Lowry法的測定，抗體重量超過95%，最優(yōu)選重量超過99%，(2)足以通過使用轉(zhuǎn)杯式測序儀獲得至少15個殘基的N-末端或內(nèi)部氨基酸序列的程度，或(3)根據(jù)還原性或非還原性條件下的SDS-PAGE及使用考馬斯藍或優(yōu)選的銀染色，達到同質(zhì)。既然抗體天然環(huán)境的至少一種成分不會存在，那么分離的抗體包括重組細胞內(nèi)的原位抗體。然而，分離的抗體通常將通過至少一個純化步驟來制備。在用于本文時，"抗體可變域"指抗體分子的輕鏈和重鏈中包含互補決定區(qū)(CDR;即CDR1、CDR2、和CDR3)和框架區(qū)(FR)氨基酸序列的那部分。VH指重鏈可變域。、指輕鏈可變域。依照本發(fā)明所使用的方法，歸為CDR和FR的氨基酸位置可以依照Kabat(SequencesofProteinsofImmunologicallnterest(NationalInstitutesofHealth,Bethesda，Md.，1987和1991))來限定。抗體或抗原結(jié)合片段的氨基酸編號方式也依照Kabat。在用于本文時，術(shù)語"互補決定區(qū)(CDR;即CDR1、CDR2、和CDR3)指抗體可變域中其存在是抗原結(jié)合所必需的氨基酸殘基。每個可變域通常具有三個CDR，鑒定為CDRl、CDR2和CDR3。每個互補決定區(qū)可以包含來自如Kabat定義的"互補決定區(qū)"的氨基酸殘基(即大約是輕鏈可變域的殘基24-34(Ll)、50-56(L2)和89-97(L3)及重鏈可變域的殘基31-35(HI)、50-65(H2)和95-102(H3);Kabat等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD.(1991))和/或來自"高變環(huán)"的殘基(即大約是輕鏈可變域的殘基26-32(LI)、50-52(L2)和91-96(L3)及重鏈可變域的殘基26-32(HI)、53-55(H2)和96-101(H3);ChothiaandLesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917)。在有些情況中，互補決定區(qū)可以包含來自Kabat定義的CDR和高變環(huán)二者的氨基酸。例如，抗體4D5重鏈的CDRH1包含氨基酸26-35。"框架區(qū)"(以下的FR)指可變域中CDR殘基以外的殘基。每個可變域通常具有四個FR，鑒定為FR1、FR2、FR3和FR4。如果CDR是依照Kabat定義的，那么輕鏈FR殘基位于大約輕鏈殘基1-23(LCFR1)、35-49(LCFR2)、57-88(LCFR3)、和98-107(LCFR4)，而重鏈FR殘基位于大約重鏈殘基1-30(HCFR1)、36-49(HCFR2)、66-94(HCFR3)、和103-113(HCFR4)。如果CDR包含來自高變環(huán)的氨基酸殘基，那么輕鏈FR殘基位于大約輕鏈殘基1-25(LCFR1)、33-49(LCFR2)、53-90(LCFR3)、和97-107(LCFR4)，而重鏈FR殘基位于大約重鏈殘基1-25(HCFR1)、33-52(HCFR2)、56-95(HCFR3)、禾口102-113(HCFR4)。在有些情況中;在CDR包含來自Kabat定義的CDR和高變環(huán)二者的氨基酸時，F(xiàn)R殘基將做相應(yīng)的調(diào)整。例如，當CDRH1包含氨基酸H26-H35時，重鏈FR1殘基位于1_25位，而FR2殘基位于36-49位。在用于本文時，"密碼子集"指用于編碼期望變異氨基酸的一套不同核苷酸三聯(lián)體序列。可以通過例如固相合成來合成一套寡核苷酸，其包括呈現(xiàn)密碼子集所提供的核苷酸三聯(lián)體的所有可能組合并編碼期望氨基酸組的序列。一種標準形式的密碼子命名是IUB代碼，其是本領(lǐng)域已知的且在本文中有記載。密碼子集通常以3個斜體大寫字母表示，例如NNK、NNS、XYZ、DVK等等。如此，"非隨機密碼子集"在用于本文時指編碼部分、優(yōu)選完全滿足本文所述氨基酸選擇標準的選定氨基酸的密碼子集。在某些位置具有選定核苷酸"簡并性"的寡核苷酸的合成是本領(lǐng)域眾所周知的，例如TRIM法(Kna卯ek等(1999)J.Mol.Biol.296:57-86);Garrard和Henner(1993)Gene128:103)。此類具有某些密碼子集的寡核苷酸集可以使用商品化核酸合成儀來合成(可購自例如AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity，CA)，或者可以通過商業(yè)途徑獲得(例如購自LifeTechnologies,Rockville，MD)。因此，一套具有特定密碼子集的合成寡核苷酸通常包括具有不同序列(在整個序列中由密碼子集所建立的差異)的多種寡核苷酸。寡核苷酸，在依照本發(fā)明使用時，具有容許與可變域核酸模板雜交的序列，而且還可以但非必須包含可用于例如克隆目的的限制酶位點。"Fv"片段是包含完整抗原識別和結(jié)合位點的抗體片段。此區(qū)由緊密結(jié)合(該結(jié)合的本質(zhì)可以是共價的，例如在scFv中)的一個重鏈可變域和一個輕鏈可變域的二聚體組成。正是在這種構(gòu)造中，每個可變域的三個CDR相互作用而在VH_、二聚體表面上確定了抗原結(jié)合位點。六個CDR或其子集共同賦予抗體以抗原結(jié)合特異性。然而，即使是單個可變域(或只包含對抗原特異性的三個CDR的半個Fv)也具有識別和結(jié)合抗原的能力，只是通常親和力低于完整結(jié)合位點。"Fab"片段包含輕鏈的可變域和恒定域及重鏈的可變域和第一恒定域(CHI)。F(ab')2抗體片段包含一對Fab片段，這對Fab片段一般通過它們之間的鉸鏈半胱氨酸在它們羧基末端附近共價連接。本領(lǐng)域還知道抗體片段的其它化學(xué)偶聯(lián)形式。"單鏈Fv"或"scFv"抗體片段包含抗體的VH和、結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于一條多肽鏈上。一般而言，F(xiàn)v多肽在VH與、結(jié)構(gòu)域之間還包含多肽接頭，使得scFv能夠形成結(jié)合抗原所需的結(jié)構(gòu)。關(guān)于scFv的綜述參見Pluckthun，在RosenburgandMoore編的《ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies》第113巻中，Springer-Verlag，NewYork,pp.269-315(1994)。術(shù)語"雙抗體"指具有兩個抗原結(jié)合位點的小型抗體片段，該片段在同一條多肽鏈(Vh及VJ中包含相連的重鏈可變域(VH)和輕鏈可變域(VJ。通過使用過短的接頭使得同一條鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域之間不能配對，迫使這些結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補結(jié)構(gòu)域配對，從而產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合位點。雙抗體更完整的記載于例如EP404，097;W093/11161;Hollinger等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448。表述"線性抗體"指Zapata等(1995)ProteinEng，8(10):1057-1062中所描述的抗體。簡言之，這些抗體包含一對串聯(lián)的Fd區(qū)段(VfQl-VfCHl)，該區(qū)段與互補的輕鏈多肽一起形成一對抗原結(jié)合區(qū)。線性抗體可以是雙特異性的，或者是單特異性的。在用于本文時，"文庫"或"庫"指眾多抗體或抗體片段序列(例如本發(fā)明的多肽)，或者編碼這些序列的核酸，這些序列在根據(jù)本發(fā)明方法導(dǎo)入這些序列的變異氨基酸組合方面是不同的。"噬菌體展示"是一種將變異多肽作為與外殼蛋白至少一部分的融合蛋白展示在噬菌體(例如絲狀噬菌體)顆粒表面上的技術(shù)。噬菌體展示的效用在于能夠?qū)﹄S機化蛋白質(zhì)變體的大型文庫快速且高效分選那些能以高親和力與靶抗原結(jié)合的序列的實情。肽和蛋白質(zhì)文庫在噬菌體上的展示已經(jīng)用于對數(shù)以百萬計的多肽篩選那些具有特異性結(jié)合特性的多肽。多價噬菌體展示法已經(jīng)用于展示小隨機肽和小蛋白，其通過與絲狀噬菌體的基因III或基因VIII融合來實現(xiàn)。WellsandLowman(1992)Curr.Opin.Struct.Biol.3:355-362，及其中引用的參考文獻。在單價噬菌體展示中，將蛋白質(zhì)或肽文庫與基因III或其一部分融合，并在存在野生型基因III蛋白時以低水平表達，使得噬菌體顆粒展示一個拷貝的融合蛋白或者不展示融合蛋白。親合效應(yīng)(avidityeffect)相對于多價噬菌體得到了降低，使得分選基于內(nèi)在的配體親和力，而且使用噬菌粒載體，這簡化了DNA操作丄owmanandWells(1991)Methods:AcompaniontoMethodsinEnzymology3:205-0216。"噬菌粒"是具有細菌復(fù)制起點(例如ColEl)和噬菌體基因間區(qū)拷貝的質(zhì)粒載體。噬菌?？衫萌魏我阎删w，包括絲狀噬菌體和A類噬菌體。質(zhì)粒一般也包含抗生素抗性的可選擇標志物。克隆入這些載體的DNA區(qū)段可以像質(zhì)粒一起而擴增。在給容納這些載體的細胞提供生成噬菌體顆粒所必需的所有基因時，質(zhì)粒的復(fù)制模式變成滾環(huán)復(fù)制，以生成質(zhì)粒DNA的一條鏈的拷貝，并包裝噬菌體顆粒。噬菌?？尚纬筛腥拘曰蚍歉腥拘允删w顆粒。此術(shù)語包括這樣的噬菌粒，它們包含與異源多肽基因連接成基因融合物的噬菌體外殼蛋白基因或其片段，使得異源多肽展示在噬菌體顆粒的表面上。術(shù)語"噬菌體載體"指包含異源基因且能夠復(fù)制的雙鏈復(fù)制型噬菌體。噬菌體載體具有容許噬菌體復(fù)制和噬菌體顆粒形成的噬菌體復(fù)制起點。噬菌體優(yōu)選是絲狀噬菌體，諸如M13、fl、fd、Pf3噬菌體或其衍生物，或者是A類噬菌體，諸如A、21、cp80、(p81、82、424、434等或其衍生物。在用于本文時，"溶劑可及位置"指源抗體或抗原結(jié)合片段重鏈和輕鏈可變區(qū)中根據(jù)抗體或抗原結(jié)合片段的結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)系綜(ensemble)和/或建模結(jié)構(gòu)確定為潛在觸及溶劑和/或接觸分子(諸如抗體特異性抗原)的氨基酸殘基位置。這些位置通常發(fā)現(xiàn)于CDR中和蛋白質(zhì)外部上。如本文所定義的抗體或抗原結(jié)合片段的溶劑可及位置可使用本領(lǐng)域已知的多種算法來確定。優(yōu)選的是，溶劑可及位置是使用來自抗體三維模型的坐標而確定的，優(yōu)選使用計算法程序，諸如InsightII程序(Accelrys，SanDiego，CA)。溶劑可及位置還可以使用本領(lǐng)域已知的算法來確定(例如LeeandRichards(1971)J.Mol.Biol.55，379和Connolly(1983)J.A卯l.Cryst.16,548)。溶劑可及位置的確定可使用適于蛋白質(zhì)建模的軟件和自抗體得到的三維結(jié)構(gòu)信息來進行?？捎糜谶@些目的的軟件包括SYBYLBiopolymerModule軟件(TriposAssociates)。一般和優(yōu)選的是，若算法(程序)要求用戶輸入大小參數(shù)，計算中所使用的探針的"大小"設(shè)為半徑大約1.4?；蚋?。另外，Pacios(1994)Comput.Chem.18(4):377-386記載了使用供個人計算機用的軟件確定溶劑可及區(qū)域和面積的方法。"血管發(fā)生因子"或"血管發(fā)生劑"指剌激血管發(fā)育，例如促進血管發(fā)生(angiogenesis)、內(nèi)皮細胞生長、血管穩(wěn)定性和/或血管生成(vasculogenesis)等的生長因子。例如，血管發(fā)生因子包括但不限于例如VEGF和VEGF家族的成員、P1GF、PDGF家族、成纖維細胞生長因子家族(FGF)、TIE配體(血管生成素)、印hrin、Del-l、酸性(aFGF)和堿性(bFGF)成纖維細胞生長因子、卵泡抑素(Follistatin)、粒細胞集落剌激因子(G-CSF)、肝17細胞生長因子(HGF)/散射因子(SF)、白介素-8(IL-8)、L印tin、Midkine、神經(jīng)氈蛋白、胎盤生長因子、血小板衍生內(nèi)皮細胞生長因子(PD-ECGF)、血小板衍生生長因子尤其是PDGF-BB或PDGFR-P、Pleiotrophin(PTN)、Progra皿lin、Proliferin、轉(zhuǎn)化生長因子-a(TGF_a)、轉(zhuǎn)化生長因子-P(TGF-l3)、腫瘤壞死因子-a(TNF-a)等。它還包括加速傷口愈合的因子，諸如生長激素、胰島素樣生長因子-I(IGF-I)、VIGF、表皮生長因子(EGF)、CTGF及其家族的成員、及TGF-a禾PTGF-P。參見例如KlagsbrunandD'Amore(1991)An皿.Rev.Physiol.53:217-39;StreitandDetmar(2003)Oncogene22:3172-3179;Ferrara禾口Alitalo(1999)NatureMedicine5(12):1359-1364;Tonini等(2003)Oncogene22:6549-6556(例如列舉已知血管發(fā)生因子的表1);Sato(2003)Int.J.Clin.Oncol.8:200-206。"抗血管發(fā)生劑"或"血管發(fā)生抑制劑"指或直接或間接抑制血管發(fā)生(angiogenesis)、血管生成(vasculogenesis)、或不想要的血管通透性的小分子量物質(zhì)、多核苷酸、多肽、分離的蛋白質(zhì)、重組蛋白、抗體、或其偶聯(lián)物或融合蛋白。應(yīng)當理解，抗血管發(fā)生劑包括那些結(jié)合并阻斷血管發(fā)生因子或其受體的血管發(fā)生活性的藥劑。例如，抗血管發(fā)生劑是上文定義的血管發(fā)生劑的抗體或其它拮抗劑，例如VEGF-A的抗體、VEGF-A受體(例如KDR受體或Flt-l受體)的抗體、抗PDGFR抑制劑諸如GleevecTM(ImatinibMesylate)。抗血管發(fā)生劑還包括天然血管發(fā)生抑制劑，例如血管他丁(angiostatin)、內(nèi)皮他丁(endostatin)等。參見例如KlagsbrunandD'Amore(1991)A匪.Rev.Physiol.53:217-39;StreitandDetmar(2003)Oncogene22:3172-3179(例如列舉惡性黑素瘤中抗血管發(fā)生療法的表3);Ferrara和Alitalo(1999)NatureMedicine5(12):1359-1364;Tonini等(2003)Oncogene22:6549-6556(例如列舉已知抗血管發(fā)生因子的表2);Sato(2003)Int.J.Clin.Oncol.8:200-206(例如列舉臨床試驗中所使用的抗血管發(fā)生劑的表1)。術(shù)語"VEGF"和"VEGF-A"在用于本文時指165個氨基酸的人血管內(nèi)皮細胞生長因子及相關(guān)的121個、189個和206個氨基酸的人血管內(nèi)皮細胞生長因子，如Leung等(1989)Science246:1306和Houck等(1991)Mol.Endocrin，5:1806所述，及其天然存在等位基因形式和加工形式。術(shù)語"VEGF"還指來自非人物種諸如小鼠、大鼠或靈長類動物的VEGF。有時，來自特定物種的VEGF表示如下，hVEGF表示人VEGF，mVEGF表示小鼠VEGF，等等。術(shù)語"VEGF"還用于指包含165個氨基酸的人血管內(nèi)皮細胞生長因子的氨基酸第8-109位或第1-109位的截短形式多肽。本申請中可能通過例如"VEGF(8-109)"、"VEGF(1-109)"或"VEGF165"來鑒別任何此類形式VEGF。"截短的"天然VEGF的氨基酸位置如天然VEGF序列中所示編號。例如，截短的天然VEGF中的第17位氨基酸(甲硫氨酸)也是天然VEGF中的第17位(甲硫氨酸)。截短的天然VEGF具有與天然VEGF相當?shù)膶DR和Flt-1受體的結(jié)合親和力。"VEGF抗體"指以足夠親和力和特異性結(jié)合VEGF的抗體。優(yōu)選的是，本發(fā)明的抗VEGF抗體可在靶向和干預(yù)其中涉及VEGF活性的疾病或疾患時用作治療劑。抗VEGF抗體通常不會結(jié)合其它VEGF同系物，諸如VEGF-B或VEGF-C，也不會結(jié)合其它生長因子，諸如P1GF、PDGF或bFGF。一種優(yōu)選的抗VEGF抗體是與雜交瘤ATCCHB10709所生成的單克隆抗VEGF抗體A4.6.1結(jié)合相同表位的單克隆抗體。更優(yōu)選的是，抗VEGF抗體是依照Presta等，CancerRes.57:4593-4599(1997)生成的重組人源化抗VEGF單克隆抗體，包括但不限于稱為貝伐單抗(bevacizumab;BV;AvastinTM)的抗體?？筕EGF抗體"貝伐單抗(Bevacizumab,BV)"，也稱為"rhuMAbVEGF"或"Avastin⑧，，,是依照Presta等，CancerRes.57:4593-4599(1997)生成的重組人源化抗VEGF單克隆抗體。它包含突變的人IgGl框架區(qū)和來自阻斷人VEGF結(jié)合其受體的鼠抗hVEGF單克隆抗體A4.6.1的抗原結(jié)合互補決定區(qū)。貝伐單抗大約93%的氨基酸序列，包括大部分框架區(qū)，衍生自人IgGl，而大約7X的序列衍生自小鼠抗體A4.6.1。貝伐單抗具有約149，000道爾頓的分子量且是糖基化的。"VEGF拮抗劑"指能夠中禾口、阻斷、抑制、消除、降低或干擾VEGF活性(包括但不限于其與一種或多種VEGF受體的結(jié)合)的分子。VEGF拮抗劑包括但不限于抗VEGF抗體及其抗原結(jié)合片段、特異性結(jié)合VEGF由此使其隔絕與一種或多種受體結(jié)合的受體分子及衍生物、抗VEGF受體抗體和VEGF受體拮抗劑諸如VEGFR酪氨酸激酶的小分子抑制劑。如本文中所使用的，術(shù)語"VEGF拮抗劑"明確包括結(jié)合神經(jīng)氈蛋白-1和/或神經(jīng)氈蛋白_2(Nrp-l和/或Nrp-2)且能夠中和、阻斷、抑制、消除、降低或干擾VEGF活性的分子，包括抗體、抗體片段、其它結(jié)合性多肽、肽、和非肽小分子，包括但不限于抗Nrpl和抗Nrp2抗體及與Nrpl和Nrp2起交叉反應(yīng)的抗體，前提是它們能夠中和、阻斷、抑制、消除、降低或干擾VEGF活性。如此，術(shù)語"VEGF活性"明確包括神經(jīng)氈蛋白介導(dǎo)的VEGF生物學(xué)活性(如上文所定義的)。"腦信號蛋白拮抗劑"指能夠中和、阻斷、抑制、消除、降低或干擾腦信號蛋白活性(包括但不限于其與一種或多種腦信號蛋白受體的結(jié)合)的分子。腦信號蛋白拮抗劑包括但不限于抗腦信號蛋白抗體及其抗原結(jié)合片段、特異性結(jié)合腦信號蛋白由此使其隔絕與一種或多種受體結(jié)合的受體分子及衍生物、抗腦信號蛋白受體抗體和腦信號蛋白受體拮抗劑諸如腦信號蛋白的小分子抑制劑。如本文中所使用的，術(shù)語"腦信號蛋白拮抗劑"明確包括結(jié)合神經(jīng)氈蛋白-1和/或神經(jīng)氈蛋白_2(Nrp-l和/或Nrp-2)且能夠中和、阻斷、抑制、消除、降低或干擾腦信號蛋白活性的分子，包括抗體、抗體片段、其它結(jié)合性多肽、肽、和非肽小分子，包括但不限于抗Nrpl和抗Nrp2抗體及與Nrpl和Nrp2起交叉反應(yīng)的抗體，前提是它們能夠中和、阻斷、抑制、消除、降低或干擾腦信號蛋白活性。如此，術(shù)語"腦信號蛋白活性"明確包括神經(jīng)氈蛋白介導(dǎo)的第3類腦信號蛋白生物學(xué)活性(如上文所定義的)。所述生物學(xué)活性包括例如胚胎神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和神經(jīng)元再生期間的神經(jīng)突生長抑制效應(yīng)。"治療"或"處理"指治療性處理和預(yù)防性或防范性措施二者。需要治療的受試者包括早就患有病癥的受試者以及要預(yù)防病癥的受試者。"病癥"指任何會受益于治療的疾患。例如，患有或需要預(yù)防異常血管發(fā)生(過度的、不當?shù)幕蚴Э氐难馨l(fā)生)或血管通透性的哺乳動物。這包括慢性和急性病癥或疾病，包括那些使哺乳動物傾向于所討論病癥的病理狀況。本文中待治療的病癥的非限制性例子包括惡性和良性腫瘤；非白血病和淋巴樣惡性腫瘤；神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)、星細胞、下丘腦和其它腺體、巨噬細胞、上皮、基質(zhì)和囊胚腔病癥；及炎性、血管發(fā)生性和免疫學(xué)病癥。異常血管發(fā)生發(fā)生于病情中的或引起病情的新血管生長過度、不足或不當(例如從醫(yī)學(xué)觀點看不良的血管發(fā)生位置、時間或啟動)時。過度的、不當?shù)幕蚴Э氐难馨l(fā)生發(fā)生干有促成病情惡化或引起病情的新血管生長時，諸如癌癥尤其是血管化實體瘤和轉(zhuǎn)移瘤(包括結(jié)腸癌、肺癌(尤其是小細胞肺癌、或前列腺癌)，由眼部新血管形成引起的疾病尤其是糖尿病性失明、視網(wǎng)膜病變、原發(fā)性糖尿病性視網(wǎng)膜病變(primarilydiabeticretinopathy)或年齡相關(guān)黃斑變性(AMD)，銀屑病、銀屑病關(guān)節(jié)炎、成血管細胞瘤諸如血管瘤；炎性腎病，諸如腎小球腎炎，尤其是膜增生性腎小球腎炎、溶血性尿毒綜合征(haemolyticuremicsyndrome)、糖尿病腎病或高血壓腎硬化；各種炎性疾病，諸如關(guān)節(jié)炎，尤其是類風濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、銀屑病、結(jié)節(jié)病、動脈硬化和移植后發(fā)生的疾病、子宮內(nèi)膜異位癥或慢性哮喘，及超過70種其它疾患。新血管可供應(yīng)患病組織，破壞正常組織，而且，在癌癥的情況中，新血管可容許腫瘤細胞逃入循環(huán)并停留在其它器官中(腫瘤轉(zhuǎn)移)。不足的血管發(fā)生發(fā)生于有不足血管生長促成病情惡化時，例如在諸如冠狀動脈疾病、中風和傷口愈合遲緩的疾病中。此外，潰瘍、中風和心臟病發(fā)作可源自沒有自然愈合通常所要求的血管發(fā)生。本發(fā)明設(shè)想了治療那些有風險發(fā)生上述疾病的患者。作為接受本發(fā)明抗體或其它分子的候選者的其他患者具有或者有風險發(fā)生維管組織(fibrovasculartissue)異常增殖、酒渣鼻(紅斑痤瘡)、獲得性免疫缺陷綜合征、動脈阻塞、特應(yīng)性角膜炎、細菌性潰瘍、貝切特氏病(Bechetsdisease)、血液傳播的腫瘤(bloodbornetumor)、頸動脈阻塞性疾病、脈絡(luò)膜新血管形成、慢性炎癥、慢性視網(wǎng)膜剝離、慢性葡萄膜炎、慢性玻璃體炎、接觸鏡佩戴過度、角膜移植物排斥、角膜新血管形成、角膜移植物新血管形成、克羅恩氏病(Crohn'sdisease)、伊爾斯病(Ealesdisease)、流行性角膜結(jié)膜炎、真菌性潰瘍、單純皰疹感染、帶狀皰疹感染、高粘滯綜合征、卡波西氏肉瘤(K即osi'ssarcoma)、白血病、脂質(zhì)變性、萊姆氏病(Lyme'sdisease)、邊緣角質(zhì)層分離(marginalkeratolysis)、莫倫潰瘍(Moorenulcer)、除麻風以外的分枝桿菌感染、近視、眼部新血管疾病、眼窩、奧-韋二氏綜合征(Osler-Webersyndrome)(奧斯勒-韋伯-朗迪(Osler-Weber-Rendu)病)、骨關(guān)節(jié)炎、佩吉特氏病(Pagetsdisease)、扁平部睫狀體炎(parsplanitis)、類天皰疫、phylecte皿losis、多動脈炎、激光后并發(fā)癥(post-lasercomplication)、原生動物感染、彈性假黃色瘤、翼狀胬肉(pterygium)、干燥性角膜炎、放射狀角膜切開術(shù)、視網(wǎng)膜新血管形成、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、晶狀體后纖維組織增生、類肉瘤/結(jié)節(jié)病(sarcoid)、鞏膜炎、鐮狀細胞貧血、斯耶格倫氏綜合征(Sogrenssyndrome)、實體瘤、斯塔力口特病(Stargartsdisease)、約_斯病(Steven'sJohnsondisease)、上緣角膜炎(superiorlimbickeratitis)、梅毒、全身性狼瘡、特里昂氏邊緣變性(Terrien'smarginaldegeneration)、弓形蟲病、外傷、尤因肉瘤(Ewingsarcoma)的腫瘤、成神經(jīng)細胞瘤的腫瘤、骨肉瘤的腫瘤、視網(wǎng)膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、潰瘍性結(jié)腸炎、靜脈阻塞、維生素A缺乏和韋格納結(jié)節(jié)病(Wegenerssarcoidosis)、與糖尿病有關(guān)的不良血管發(fā)生、寄生蟲病、異常傷口愈合，外傷、損傷或手術(shù)后肥大、毛發(fā)生長抑制、排卵和黃體形成抑制、子宮中胚胎發(fā)育抑制和植入抑制?？寡馨l(fā)生療法可用于以下各項的一般治療移植物排斥、肺部炎癥、腎病綜合征、先兆子癇、心包積液(諸如與心包炎有關(guān)的)和胸腔積液、特征為不良血管通透性的疾病和病癥，例如與腦瘤有關(guān)的水腫、與惡性腫瘤有關(guān)的腹水、梅格斯氏(Meigs)綜合征、肺部炎癥、腎病綜合征、心包積液、胸腔積液、與心血管疾病有關(guān)的通透性，諸如心肌梗死和中風后的疾患，諸如此類。依照本發(fā)明的其它血管發(fā)生依賴性疾病包括血管纖維瘤(傾向于出血的異常血管)、新生血管性青光眼(眼中的血管生長)、動靜脈畸形(動脈與靜脈之間的異常聯(lián)絡(luò))、不連接的骨折(不會愈合的骨折)、動脈粥樣硬化斑塊(動脈的硬化)、膿性肉芽腫(由血管構(gòu)成的普通皮膚損傷)、硬皮病(結(jié)締組織疾病的一種形式)、血管瘤(由血管構(gòu)成的腫瘤)、沙眼(第三世界失明的第一位原因)、血友病性關(guān)節(jié)、血管粘連和肥厚性瘢痕(異常瘢痕形成)。術(shù)語"癌癥"和"癌性"指或描述哺乳動物中特征通常為細胞生長不受調(diào)控的生理疾患。癌癥的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤、和白血病。此類癌癥的更具體例子包括鱗狀細胞癌、肺癌(包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺的腺癌、和肺的鱗癌)、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌(gastricorstomachcancer)(包括胃腸癌)、胰腺癌、成膠質(zhì)細胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌(livercancerorh印aticcarcinoma)、膀胱癌、肝肉瘤(h印atoma)、乳腺癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌(kidneyorrenalcancer)、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、及各種類型的頭和頸癌，以及B細胞淋巴瘤(包括低級/濾泡性非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴細胞性(SL)NHL、中級/濾泡性NHL、中級彌漫性NHL、高級成免疫細胞性NHL、高級成淋巴細胞性NHL、高級小無核裂細胞性NHL、貯積病(bulkydisease)NHL、套細胞淋巴瘤、AIDS相關(guān)淋巴瘤、和瓦爾登斯特倫氏(Waldenstrom)巨球蛋白血癥)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、急性成淋巴細胞性白血病(ALL)、毛細胞性白血病、慢性成髓細胞性白血病、和移植后淋巴增殖性病癥(PTLD)、以及與瘢痣病(phakomatoses)、水腫(諸如與腦瘤有關(guān)的)和梅格斯氏(Meigs)綜合征有關(guān)的異常血管增殖。術(shù)語"抗腫瘤組合物"指可用于治療癌癥的組合物，其包含至少一種活性治療劑，例如"抗癌劑"。治療劑(抗癌劑)的例子包括但不限于例如化療劑、生長抑制劑、細胞毒劑、放射療法中所使用的藥劑、抗血管發(fā)生劑、凋亡劑、抗微管蛋白劑、和其它用于治療癌癥的藥劑諸如抗HER-2抗體、抗CD20抗體、表皮生長因子受體(EGFR)拮抗劑(例如酪氨酸激酶抑制劑)、HER1/EGFR抑制劑(例如erlotinib(Tarceva)、血小板衍生生長因子抑制劑(例如GleevecTM(ImatinibMesylate))、C0X-2抑制劑(例如塞來考昔(celecoxib))、干擾素、細胞因子、能與ErbB2、ErbB3、ErbB4、PDGFR-P、BlyS、APRIL、BCMA或VEGF受體中的一種或多種靶物結(jié)合的拮抗劑(例如中和性抗體)、TRAIL/Apo2、及其它生物活性和有機化學(xué)劑等。本發(fā)明還包括它們的組合。術(shù)語"細胞毒劑"在用于本文時指抑制或阻止細胞功能和/或引起細胞破壞的物質(zhì)。該術(shù)語意圖包括放射性同位素(例如I131、I125、Y9°和Re186)、化療劑、和毒素諸如細菌、真菌、植物或動物起源的酶活毒素或其片段。"化療劑"指可用于治療癌癥的化學(xué)化合物?；焺┑睦影捎糜谥委煱┌Y的化學(xué)化合物?；焺┑睦影ㄍ榛瘎╊?alkylatingagents)，諸如塞替派(thiot印a)和CYTOXAN⑧環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide);磺酸烷基酯類(alkylsulfonates),諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan);氮丙啶類(aziridines)，諸如苯佐替派(benzod印a)、卡波酉昆(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和烏瑞替派(ured印a);乙撐亞胺類(ethylenimines)和甲基蜜胺類(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撐蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撐磷酰胺(triethylen印hosphor咖ide)、三乙撐硫代憐酉先胺(triethylenethiophosphor咖ide)和三羥甲蜜胺(trimethylolomelamine);番蒸枝內(nèi)酯類(acetogenins)(尤其是布拉他辛(bullatacin)禾口布拉他辛酮(bullataci麗e));喜樹堿(c卿tothecin)(包括合2成類似物托泊替康(topotecan));苔蘚抑素(bryostatin);callystatin;CC_1065(包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)和比折來新(bizelesin)合成類似物)；隱藻素類(cryptophycins)(特別是隱藻素l和隱藻素8);多拉司他汀(dolastatin);duocarmycin(包括合成類似物，KW-2189和CB1-TM1);艾榴塞洛素(eleutherobin);pancratistatin;sarcodictyin;海綿抑素(spongistatin);氮芥類(nitrogenmustards)，諸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、膽磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥(mechlorethamineoxidehydrochloride)、美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥膽甾醇(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracilmustard);亞石肖脈類(nitrosoureas)，i者如卡莫司汀(carmustine)、氣脈菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)禾P雷莫司汀(ranimustine);抗生素類，諸如烯二炔類抗生素(enediyne)(例如加利車霉素(calicheamicin)，尤其是加利車霉素Y11和加利車霉素"11(參見例如Agnew(1994)Chem.Intl.Ed.Engl.33:183-186);蒽環(huán)類抗生素(dynemicin)，包括dynemicinA;二膦酸鹽類(bisphosphonates)，諸如氯膦酸鹽(clodronate);埃斯波霉素(esperamicin);以及新制癌素(neocarzinostatin)發(fā)色團和相關(guān)色蛋白烯二炔類抗生素發(fā)色團)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、方文線菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮絲氨酸(azaserine)、博來霉素(bleomycin)、放線菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋紅霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放線菌素D(dactinomycin)、柔紅霉素(da皿orubicin)、地托比星(detorubicin)、6_二氮-5-氧-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN⑧多柔比星(doxorubicin)(包括嗎啉代多柔比星、氰基嗎啉代多柔比星、2_吡咯代多柔比星和脫氧多柔比星)、表柔比星(印irubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅霉素(marcellomycin)、絲裂霉素類(mitomycins)諸如絲裂霉素C、霉酚酸(mycophenolicacid)、諾拉霉素(nogalamycin)、撤攬霉素(olivomycin)、培洛霉素(p印lomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三,失阿毒素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、纟連黑菌素(streptonigrin)、纟連佐星(str印tozocin)、殺結(jié)核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、凈司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin);抗代謝物類，諸如甲氨蝶呤(methotrexate)和5_氟尿嘧啶(5-FU);葉酸類似物，諸如二甲葉酸(denopterin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、蝶羅呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate);嘌呤類似物，諸如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine);嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙脫氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine);雄激素類，諸如卡魯睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolonepropionate)、表硫雄醇(印itiostanol)、美雄烷(m印itiostane)、睪內(nèi)酉旨(testolactone);抗腎上腺類，諸如氨魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane);葉酸補充齊U，諸如亞葉酸(folinicacid);醋葡醛內(nèi)酯(aceglatone);醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide22glycoside);氨基乙酉先丙酸(aminolevulinicacid);恩尿嘧啶(eniluracil);安口丫啶(咖sacrine);bestrabucil;比生群(bisantrene);依達曲沙(edatraxate);地磷酉先月安(defosfamide);t也美可辛(demecolcine);t也口丫酉昆(diaziquone);elfornithine;依利醋銨(elliptiniumacetate);埃坡霉素(印othilone);依托格魯(etoglucid);硝酸鎵；羥脲(hydroxyurea);香燕多糖(lentinan);氯尼達明(lonidamine);美登木素生物減類(maytansinoids)，諸如美登素(maytansine)禾口安絲菌素(ansamitocin);米托月瓜月宗(mitoguazone);米托惠酉昆(mitoxantrone);莫呢達醇(mopidamol);二月安硝吖啶(nitracrine);噴司他丁(pentostatin);蛋氨氮芥(phe謹et);吡柔比星(pirarubicin);f各索惠酉昆(losoxantrone);鬼白酸(podophyllinicacid);2_乙基酰肼(ethylhydrazide);丙卡巴肼(procarbazine);PSK⑧多糖復(fù)合物(JHSNaturalProducts,Eugene,OR);雷佐生(razoxane);根霉素(rhizoxin);西佐卩南(sizofiran);螺方定錯(spirogermanium);細交纟連f包菌嗣酸(terumzonicacid);三亞月安酉昆(triaziquone);2，2'，2〃-三氯三乙胺；單端孢菌素類(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、桿孢菌素(roridin)A禾口蛇行菌素(anguidin));烏拉坦(urethan);長春地辛(vindesine);達卡巴嗪(dacarbazine);甘露莫司汀(ma皿omustine);二溴甘露酉享(mitobronitol);二溴衛(wèi)矛酉享(mitolactol);哌泊溴烷(pipobroman);gacytosine;阿糖胞苷(arabinoside)("Ara-C，，)；環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide);塞替派(thiot印a);類紫杉醇類(taxoids)，例如TAXDL⑧巾白利他塞(paclitaxel)(Bristol—MyersSquibbOncology,Princeton,N.J.)、ABRAXANE不含克列莫佛(Cremophor)、清蛋白改造納米顆粒劑型巾白利他塞(AmericanPharmaceuticalPartners,Schaumberg，Illinois)禾口TAXOTERE多西他塞(doxetaxel)(Rh6ne-PoulencRorer，Antony,France);苯丁酸氮芥(chlorambucil);GEMZAR吉西他濱(gemcitabine);6-硫鳥嘌呤(thioguanine);巰基嘌呤(mercaptopurine);甲氨蝶呤(methotrexate);鉬類似物，諸如順拍(cisplatin)禾口卡拍(carboplatin);長春石減(vinblastine);拍(platinum);依托泊苷(etoposide)(VP-16);異環(huán)磷酰胺(ifosfamide);米托蒽醌(mitoxantrone);長春新堿(vincristine);NAVELBINE⑧長春瑞濱(vinorelbine);會g滅瘤(no麗t皿e);替尼泊苷(teniposide);依達曲沙(edatrexate);道諾霉素(daunomycin);氨基蝶呤(aminopterin);希羅達(xeloda);伊本膦酸鹽(ibandronate);伊立替康(irinotecan)(Camptosar，CPT-11)(包括伊立替康及5_FU和亞葉酸的治療方案)；拓撲異構(gòu)酶抑制劑RFS2000;二氟甲基鳥氨酸(DMFO);類視黃酸類(retinoids)，諸如視黃酸(retinoicacid);卡培他濱(capecitabine);考布他汀(combretastatin);亞口十酸(leucovorin)(LV);奧沙利鉑(oxaliplatin)，包括奧沙利鉑治療方案(F0LF0X);PKC_a、Raf、H-Ras、EGFR(例如erlotinib(TarcevaTM))和VEGF-A的、降低細胞增殖的抑制劑；及任何上述物質(zhì)的藥劑學(xué)可接受的鹽、酸或衍生物。該定義還包括作用于調(diào)節(jié)或抑制激素對腫瘤作用的抗激素劑諸如抗雌激素類和選擇性雌激素受體調(diào)控物類(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(on即ristone)和FARESTON托瑞米芬(toremifene);抑制在腎上腺中調(diào)節(jié)雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制齊U，諸如例如4(5)-咪唑、氨魯米特(aminoglutethimide)、MEGASE⑧醋酸甲地孕酮(megestrolacetate)、AROMASIN依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、RIVISOR伏羅唑(vorozole)、FEMARA來曲唑(letrozole)和ARIMIDEX阿那曲唑(anastrozole);抗雄激素類，諸如氟他米特(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)、和戈舍瑞林(goserelin);以及曲沙他濱(troxacitabine)(1，3_二氧戊環(huán)核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，特別是抑，制涉及異常(abherant)細胞增殖的信號途經(jīng)中的基因表達的反義寡核苷酸，諸如例如PKC_a、Raf和H-Ras;核酶，諸如VEGF表達抑制劑(例如ANGIOZYME⑧核酸)和HER2表達抑制劑；疫苗，諸如基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN疫苗、LEUVECTIN疫苗和VAXID疫苗；PROLEUKINrIL-2;LURTOTECAN拓撲異構(gòu)酶1抑制劑；ABARELIXrmRH;長春瑞濱(Vinorelbine)和埃斯波霉素(Esperamicins)(見美國專利No.4，675，187);及任何上述物質(zhì)的藥劑學(xué)可接受的鹽、酸或衍生物。術(shù)語"前體藥物"在用于本申請時指與母藥(parentdrug)相比對腫瘤細胞的細胞毒性較小并能夠酶促活化或轉(zhuǎn)變?yōu)楦呋钚阅杆幮问降乃幱没钚晕镔|(zhì)的前體或衍生物形式。參見例如Wilman(1986)"ProdrugsinCancerChemother即y，，，BiochemicalSocietyTransactions,14，pp.375-382，615thMeetingBelfast和Stella等(1985)"Prodrugs:AChemicalApproachtoTargetedDrugDelivery，，，DirectedDrugDelivery,Borchardt等，編，pp.247-267，H咖anaPress。本發(fā)明的前體藥物包括但不限于含磷酸鹽/酯前體藥物、含硫代磷酸鹽/酯前體藥物、含硫酸鹽/酯前體藥物、含肽前體藥物、D-氨基酸修飾前體藥物、糖基化前體藥物、含內(nèi)酰胺前體藥物、含任選取代苯氧基乙酰胺的前體藥物或含任選取代苯乙酰胺的前體藥物、可轉(zhuǎn)化為更具活性而無細胞毒性的藥物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前體藥物?？裳苌鸀楸景l(fā)明使用的前體藥物形式的細胞毒性藥物的例子包括但不限于上文描述的那些化療劑。能用腦信號蛋白拮抗劑治療的疾病和疾患包括但不限于神經(jīng)病學(xué)疾病和要求神經(jīng)再生的或受益于神經(jīng)再生的疾病。"小分子"在本文中定義為具有低于約500道爾頓的分子量。"分離的"核酸分子指已經(jīng)鑒定且與抗體核酸的天然來源中通常與之關(guān)聯(lián)的至少一種污染性核酸分子分開的核酸分子。分離的核酸分子不同于在自然界中發(fā)現(xiàn)它時的形式或背景。分離的核酸分子因此與存在于天然細胞中時的核酸分子有區(qū)別。然而，分離的核酸分子包括通常表達該抗體的細胞中所包含的核酸分子，例如當所述核酸分子在所述細胞中的染色體定位不同于它在天然細胞中的染色體定位時。表述"控制序列"指在特定宿主生物體中表達可操作連接的編碼序列所必需的DNA序列。例如，適于原核生物的控制序列包括啟動子、任選的操縱基因序列、和核糖體結(jié)合位點。已知真核細胞利用啟動子、多腺苷酸化信號、和增強子。若一段核酸與另一段核酸序列處于功能性相互關(guān)系中，則它是"可操作連接的"。例如，若前序列(presequence)或分泌前導(dǎo)(secretoryleader)的DNA表達成參與多肽分泌的前蛋白質(zhì)(pr印rotein)，則它與該多肽的DNA可操作連接；若啟動子或增強子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則它與該序列可操作連接；或者，若核糖體結(jié)合位點的位置促進翻譯，則它與編碼序列可操作連接。一般而言，"可操作連接的"意味著相連的DNA序列是相鄰的，而且在分泌前導(dǎo)的情況中意味著相鄰且處于閱讀狀態(tài)。然而，增強子不必相鄰。連接可以通過在方便的限制性位點處的連接來實現(xiàn)。若沒有此類位點，則依照常規(guī)實踐使用合成的寡核苷酸銜接頭或接頭。在用于本文時，表述"細胞"、"細胞系"和"細胞培養(yǎng)物"可互換使用，而且所有此類名稱包括后代。如此，詞語"轉(zhuǎn)化子"和"(經(jīng))轉(zhuǎn)化細胞"包括原代受試細胞及由其衍生的培養(yǎng)物，不管傳代的次數(shù)。還應(yīng)理解，所有后代在DNA內(nèi)容上可能不是精確相同的，這是由于有意或無意的突變。包括與最初對轉(zhuǎn)化細胞所篩選的具有相同功能或生物學(xué)活性的突變后代。在意指不同的名稱時，上下文會有清楚表述。本發(fā)明的實施方式基于結(jié)構(gòu)域體系結(jié)構(gòu)和功能特性，通常將Nrp的胞外結(jié)構(gòu)域分出三個功能單元ala2，blb2，和c，分別代表它們主要的腦信號蛋白結(jié)合、VEGF結(jié)合、和二聚化區(qū)(Ellis，L.M.，MolCencerTher5，1099-107(2006))。雖然結(jié)構(gòu)_功能研究描繪了神經(jīng)超蛋白功能的總體結(jié)構(gòu)域要求，但是這些受體/配體復(fù)合物的分子細節(jié)仍然了解很少。至今，關(guān)于Nrp的結(jié)構(gòu)信息限于Nrpl的blb2結(jié)構(gòu)域(VanderKooi等，見上文；Lee，C.等，JBiolChem281，5702-10(2006))。與Tuftsin(—種與VEGF165的C末端同源的四肽)復(fù)合的Nrplblb2的晶體結(jié)構(gòu)提供了關(guān)于Nrp與其結(jié)合配偶VEGF的相互作用的第一手結(jié)構(gòu)信息(VanderKooi，etal.，見上文；vonWronski，M.A.，etal.，J.BiolChem281，5702-10(2006))。本發(fā)明提供了與能在體外阻斷Sema3結(jié)合Nrpl和Nrp2二者的抗體的Fab片段復(fù)合的Nrp2ala2blb2的晶體結(jié)構(gòu)。還比較和對比了這兩種Nrp同等型(isoforms)的a2blb2和blb2片段的結(jié)構(gòu)。另外，還提供和評估了與最近描述的在體內(nèi)特異性抑制VEGF165結(jié)合Nrpl的噬菌體衍生抗體的Fab片段組合的Nrpl的bl結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)(Liang，W.C.，JMolBiol366,815-29(2007);Pan，Q.等，CancerCell11，53-67(2007))?？傊@些結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)了Nrp胞外結(jié)構(gòu)域一大部分的詳細畫面，并為VEGF和腦信號蛋白結(jié)合提出了模型?；趦煞N不同晶形中存在的Nrp2二聚體，對Nrp二聚化和配體結(jié)合提出了新的機制。在下文實施例中提供了結(jié)晶學(xué)研究的詳情。在本文中和在實施例1中描述了用于生成抗NRP抗體的一般方法?？筃RP抗體的生成本發(fā)明包括抗NRP抗體的生成和使用。產(chǎn)生抗體的示例性方法在以下章節(jié)中有更詳細的描述。用衍生自哺乳動物物種的NRP(例如NRP1和/或NRP2)抗原選出抗NRP抗體?？乖瓋?yōu)選是人NRP(hNRP)。然而，來自其它物種的NRP，諸如小鼠NRP(mNRP)，也可用作靶抗原。來自各種哺乳動物物種的NRP抗原可分離自天然來源。在其它實施方案中，抗原是重組生產(chǎn)的或者是利用本領(lǐng)域已知的其它合成方法而制備的。所選的抗體通常將具有足夠強的針對NRP抗原的結(jié)合親和力。例如，所述抗體結(jié)合hNRP的Kd值可不超過約5nM，優(yōu)選不超過約2nM，而更優(yōu)選不超過約500pM。例如，抗體親和力可由基于表面等離振子共振的測定法(如實施例所述的BIAcore測定法)；酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA);和競爭測定法(如RIA的)來測定。而且，所述抗體可進行其它生物學(xué)活性測定法，如，用以評估其作為治療劑的有效性。此類測定法是本領(lǐng)域已知的，而且依賴于靶抗原并意圖用于抗體。實例包括HUVEC抑制測定法(如下文實施例所述的)；腫瘤細胞生長抑制測定法(如例如W089/06692所述的)；抗體依賴性細胞的細胞毒性(ADCC)和補體介導(dǎo)的細胞毒性(CDC)測定法(美國專利5，500，362);和激動劑活性或造血作用測定法(參見W095/27062)。為了篩選能結(jié)合感興趣的抗原上的特定表位的抗體，可進行常規(guī)的交叉阻斷測試，如Antibodis，ALaboratoryMa皿al，ColdSpringHarborLaboratory,EdHarlow禾口DavidLane(1988)所述的。另外，可進行表位作圖，如Champe等(1995)J.Biol.Chem.270:1388-1394所述的，來確定抗體是否結(jié)合感興趣的表位。從合成的抗體噬菌體文庫中產(chǎn)生抗NRP抗體在一個優(yōu)選的實施方案中，利用獨特的噬菌體展示法來選擇抗NRP抗體。該方法包括產(chǎn)生基于單個框架模板的合成抗體噬菌體文庫，設(shè)計可變域內(nèi)的足夠的多樣性，展示具有多樣化可變域的多肽，選擇對靶NRP抗原具有高親和力的候選抗體，和分離所選的抗體。噬菌體展示方法的詳情可在例如2003年12月11日公開的W003/102157中找到。在一個方面，抗體文庫可通過在抗體可變域的至少一個CDR中突變?nèi)軇┛杉暗暮?或高度多變的位置來產(chǎn)生。一些或全部CDR可用本文提供的方法來突變。在一些實施方案中，優(yōu)選突變CDRH1、CDRH2和CDRH3中的位置以形成單個文庫或突變CDRL3和CDRH3中的位置以形成單個文庫或突變CDRL3和CDRH1、CDRH2和CDRH3中的位置以形成單個文庫，由此產(chǎn)生多樣的抗體文庫。例如，可產(chǎn)生這樣的抗體可變域文庫，其在CDRH1、CDRH2和CDRH3中溶劑可及的和/或高度多變的位置上有突變。產(chǎn)生的另一種文庫在CDRL1、CDRL2和CDRL3中有突變。這些文庫也可互相結(jié)合使用以產(chǎn)生具有期望親和力的結(jié)合物。例如，在一或多輪選擇對靶抗原結(jié)合的重鏈文庫后，在其它輪次的選擇中可將輕鏈文庫替換入重鏈結(jié)合物群中以提高結(jié)合物的親和力。文庫優(yōu)選通過用重鏈序列可變區(qū)CDRH3區(qū)中的變異氨基酸替代原始氨基酸來產(chǎn)生。所得文庫可包含多種抗體序列，其中序列多樣性主要位于重鏈序列的CDRH3區(qū)中。在一個方面，文庫在人源化抗體4D5序列、或人源化抗體4D5序列的框架氨基酸序列的背景中產(chǎn)生。所述文庫優(yōu)選通過用DVK密碼子集編碼的氨基酸至少替代重鏈殘基95-100a來產(chǎn)生，其中DVK密碼子集用于編碼這些位置中每個位置的變異氨基酸集?？捎糜诋a(chǎn)生這些替代的寡核苷酸集的例子包括序列(DVK)7。在一些實施方案中，文庫通過用DVK和NNK兩個密碼子集編碼的氨基酸替代殘基95-100a來產(chǎn)生?？捎糜诋a(chǎn)生這些替代的寡核苷酸集的例子包括序列(DVK)6(NNK)。在另一個實施方案中，文庫通過用DVK和NNK兩個密碼子集編碼的氨基酸替代殘基95-100a來產(chǎn)生?？捎糜诋a(chǎn)生這些替代的寡核苷酸集的例子包括序列(DVK)5(NNK)?？捎糜诋a(chǎn)生這些替代的寡核苷酸集的另一個例子包括序列(NNK)e。根據(jù)本文所述標準，本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定合適寡核苷酸序列的其它例子。在另一個實施方案中，利用不同的CDRH3設(shè)計來分離高親和力結(jié)合物和分離針對各種表位的結(jié)合物。該文庫中產(chǎn)生的CDRH3的長度范圍是11至13個氨基酸，盡管也可產(chǎn)生不同于此的長度。通過用NNK、DVK和NVK密碼子集也可拓展H3多樣性，以及在N和/或c-末端處的更有限的多樣性。CDRH1和CDRH2中也可產(chǎn)生多樣性。CDR-H1和H2多樣性的設(shè)計遵循目標為模擬所述帶有如下修飾的天然抗體全集的策略，所述修飾使多樣性較前述設(shè)計更緊密地與天然多樣性相匹配。對于CDRH3中的多樣性，可分開構(gòu)建多個文庫，它們具有不同長度的H3，然后組合起來以選擇針對靶抗原的結(jié)合物。合并多個文庫并用前述和本文下述的固體支持物選擇和溶液分選法來選擇。可采用多種選擇策略。例如，一種變化涉及在結(jié)合至固相的靶物上選擇，然后分選可能在融合多肽上存在的標簽(如抗gD標簽)，然后再一次在結(jié)合至固相的靶物上分選?；蛘?，文庫可首先在結(jié)合至固相表面的靶物上選擇，然后用靶抗原濃度逐漸減低的溶液相結(jié)合來分選所洗脫的結(jié)合物。利用不同分選方法的組合來最低限度地只選擇高度表達的序列并選擇許多不同的高親和力克隆。針對靶NRP抗原的高親和力結(jié)合物可由文庫分離。Hl/H2區(qū)中的有限多樣性可降低簡并性約l(^至10s倍并允許為更多高親和力結(jié)合物提供更大的H3多樣性。利用在CDRH3中具有不同類型多樣性的文庫(如利用DVK或NVT)可分離能與靶抗原的不同表位結(jié)合的結(jié)合物。對于如上所述合并的文庫中分離的結(jié)合物，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)親和力可通過提供輕鏈中的有限多樣性來進一步提高。在該實施方案中，輕鏈多樣性如下產(chǎn)生，在CDRL1中氨基酸第28位由RDT編碼；氨基酸第29位由RKT編碼；氨基酸第30位由RVW編碼；氨基酸第31位由A麗編碼；氨基酸第32位由THT編碼；任選的，氨基酸第33位由CTG編碼；在CDRL2中氨基酸第50位由KBG編碼；氨基酸第53位由AVC編碼；任選地，氨基酸第55位由GMA編碼；在CDRL3中氨基酸第91位由TMT或SRT或這兩者編碼；氨基酸第92位由DMC編碼；氨基酸第93位由RVT編碼；氨基酸第94位由NHT編碼；和氨基酸第96位由TWT或YKG或這兩者編碼。在另一個實施方案中，產(chǎn)生在CDRH1、CDRH2和CDRH3區(qū)中具有多樣性的一個或多個文庫。在該實施方案中，用各種長度的H3區(qū)并主要用密碼子集XYZ和NNK或NNS來產(chǎn)生CDRH3中的多樣性。用各寡核苷酸形成文庫并合并，或者合并寡核苷酸來形成文庫子集。該實施方案的文庫可針對結(jié)合至固相的靶物進行分選。分離自多次分選的克隆可利用ELISA測定法來篩選特異性和親和力。對于特異性，所述克隆可以針對期望靶抗原以及其它非靶抗原進行篩選。然后，在溶液結(jié)合競爭ELISA測定法或點競爭測定法中對那些針對靶NRP1抗原的結(jié)合物篩選那些結(jié)合物。可以用如上所述制備的XYZ密碼子集由所述文庫分離高親和力結(jié)合物。可方便地在細胞培養(yǎng)中以高產(chǎn)率將這些結(jié)合物制備成抗體或抗原結(jié)合片段。在一些實施方案中，可能希望產(chǎn)生在CDRH3區(qū)長度方面具有更大多樣性的文庫。例如，可能希望產(chǎn)生CDRH3區(qū)的長度范圍為約7至19個氨基酸的文庫。由這些實施方案中的文庫分離的高親和力結(jié)合物可方便地在細菌和真核細胞培養(yǎng)中以高產(chǎn)率產(chǎn)生。可設(shè)計載體以方便地去除如下序列如gD標簽、病毒外殼蛋白成分序列，和/或增加恒定區(qū)序列來高產(chǎn)率地產(chǎn)生全長抗體或抗原結(jié)合片段?？梢詫DRH3中有突變的文庫與包含不同型式的其它CDR(例如CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1和/或CDRH2)的文庫組合。因此，例如，在一個實施方案中，將CDRH3文庫與CDRL3文庫組合，所述CDRL3文庫用預(yù)先確定的密碼子集在第28、29、3Q、31、和/或32位有變異氨基酸的人源化4D5抗體序列的背景中產(chǎn)生。在另一個實施方案中，將CDRH3有突變的文庫與包含變異CDRH1和/或CDRH2重鏈可變域的文庫組合。在一個實施方案中，CDRH1文庫用第28、30、31、32和33位有變異氨基酸的人源化抗體4D5序列產(chǎn)生。CDRH2文庫可用預(yù)先確定的密碼子集用第50、52、53、54、56和58位有變異氨基酸的人源化抗體4D5序列產(chǎn)生?？筃RP抗體突變體可進一步修飾噬菌體文庫產(chǎn)生的抗NRP抗體以產(chǎn)生抗體突變體，所述突變體具有比親本抗體改善了的物理、化學(xué)和/或生物學(xué)性質(zhì)。當所用的測定法是生物學(xué)活性測定法時，優(yōu)選抗體突變體在所選測定法中的生物學(xué)活性比親本抗體在該測定法中的生物學(xué)活性好至少約10倍，優(yōu)選好至少約20倍，更優(yōu)選好至少約50倍，有時好至少約100倍或200倍。例如，優(yōu)選抗NRP1抗體突變體針對NRP的結(jié)合親和力比親本抗NRP抗體的結(jié)合親和力強至少約10倍，優(yōu)選強至少約20倍，更優(yōu)選強至少約50倍，有時強至少約100倍或200倍。為了產(chǎn)生抗體突變體，將一處或多處氨基酸改變(如替代)導(dǎo)入親本抗體的一個或多個高變區(qū)?；蛘?另外，可將框架區(qū)殘基的一處或多處改變(如替代)導(dǎo)入親本抗體，這些改變導(dǎo)致抗體突變體針對來自第二哺乳動物物種的抗原的結(jié)合親和力有所改善。要修飾的框架區(qū)殘基的實例包括那些直接非共價結(jié)合抗原的(Amit等(1986)Science233:747-753);相互作用于/影響CDR構(gòu)象的(Chothia等(1987)J.Mol.Biol.196:901-917);和/或參與VfVH界面的(EP239400B1)的殘基。在某些實施方案中，一個或多個這類框架區(qū)殘基的修飾導(dǎo)致抗體針對來自第二哺乳動物物種的抗原的結(jié)合親和力有所增強。例如，在本發(fā)明的該實施方案中，可改變約l個至約5個框架殘基。有時，這可足以產(chǎn)生適用于臨床前試驗中的抗體突變體，甚至其中沒有高變區(qū)殘基被改變。可是通常，所述抗體突變體將包含別的高變區(qū)改變。改變的高變區(qū)殘基可以是隨機改變的，尤其是在其中親本抗體的起始結(jié)合親和力使得這類隨機產(chǎn)生的抗體突變體可方便地被篩選出來。可用于生成此類抗體突變體的一種方法稱作"丙氨酸掃描誘變"(CunninghamandWells(1989)Science244:1081-1085)。這里，一個或多個高變區(qū)殘基用丙氨酸或多丙氨酸殘基替代，以影響氨基酸與來自第二哺乳動物物種的抗原的相互作用。然后通過在或?qū)μ娲稽c引入更多或其它突變，推敲那些對替代展現(xiàn)出功能敏感性的高變區(qū)殘基。如此，雖然引入氨基酸序列變異的位點是預(yù)先決定的，但是突變本身的性質(zhì)不需要預(yù)先決定。如本文所述對如此生成的丙氨酸突變體篩選它們的生物學(xué)活性。通常，從保守替代諸如下文顯示在標題"優(yōu)選替代"下的那些開始。如果此類替代導(dǎo)致生物學(xué)活性(例如結(jié)合親和力)的改變，那么可以引入下表中稱為"例示替代"的更實質(zhì)性改變，或如下文中關(guān)于氨基酸種類的進一步描述，并篩選產(chǎn)物。優(yōu)選替代原始殘基例示替代優(yōu)選替代Ala(A)val;leu;ileval<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>對抗體生物學(xué)特性的甚至更實質(zhì)性修飾通過選擇在保持以下方面的效果上顯著不同的替代來完成(a)替代區(qū)域的多肽主鏈的結(jié)構(gòu)，例如作為折疊片或螺旋構(gòu)象，(b)靶位點處分子的電荷或疏水性，或(c)側(cè)鏈的體積。基于共同的側(cè)鏈特性，將天然存在殘基如下分組(1)疏水性的:正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile;(2)中性、親水性的cys、ser、thr、asn、gln;(3)酸性的asp、glu;(4)堿性的his、lys、arg;(5)影響鏈取向的殘基gly、pro;及(6)芳香族的trp、tyr、phe。非保守替代將需要用這些類別之一的一個成員替換另一個類別的。在另一個實施方案中，利用噬菌體展示(見上)，對為修飾而選擇的位點進行親和力成熟。編碼氨基酸序列突變體的核酸分子由本領(lǐng)域已知的多種方法制備。這些方法包括但不限于，寡核苷酸介導(dǎo)的(或定點)誘變、PCR誘變、和盒式誘變早先制備的突變或非突變型式的親本抗體。制備突變體的優(yōu)選方法是定點誘變(參見例如Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:488)。在某些實施方案中，抗體突變體僅有單個高變區(qū)殘基被替代。在其它實施方案中，有親本抗體的兩個或更多個高變區(qū)殘基被替代，如約2個至約10個高變區(qū)被替代。通常，生物學(xué)特性得到改善的抗體突變體所具有的氨基酸序列與親本抗體重鏈或輕鏈可變域的氨基酸序列有至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少90%，和最優(yōu)選至少95%的氨基酸序列同一性或相似性。關(guān)于此序列的同一性或相似性在本文中定義為在比對序列并在必要時引入缺口以實現(xiàn)最大百分比序列同一性后，候選序列中與親本抗體殘基相同(即相同殘基)或相似(即根據(jù)共同側(cè)鏈特性來自同一組的氨基酸殘基，見上文)的氨基酸殘基的百分比。N-末端、C-末端、或內(nèi)部的延伸、刪除、或插入可變域以外的抗體序列都不應(yīng)視為影響序列同一性或相似性。產(chǎn)生抗體突變體后，測定該分子相對于親本抗體的生物學(xué)活性。如上所示，這可包括測定抗體的結(jié)合親和力和/或其它生物學(xué)活性。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，制備一組抗體突變體并篩選針對抗原(諸如NRP1或其片段)的結(jié)合親和力。任選將該初始篩選中選出的一個或多個抗體突變體進行一種或多種其它生物學(xué)活性測定法以確證結(jié)合親和力增強的抗體突變體是真正有用的，例如可用于臨床前研究。這樣選出的抗體突變體可進一步修飾，修飾時常取決于抗體的預(yù)期用途。此類修飾可包括進一步改變氨基酸序列，融合異源多肽和/或共價修飾，諸如下文所詳述的那些。對于氨基酸序列改變，示例性的修飾上文有詳述。例如，也可替代任何不涉及保持抗體突變體正確構(gòu)象的半胱氨酸殘基，一般替代為絲氨酸，用以改善所述分子的氧化穩(wěn)定性并防止異常交聯(lián)。相反地，可向抗體中加入半胱氨酸鍵以改善其穩(wěn)定性(特別是在抗體是抗體片段，諸如Fv片段時)。另一類氨基酸突變體具有改變的糖基化模式。這可通過刪除抗體中發(fā)現(xiàn)的一個或多個碳水化合物模塊和/或添加不存在于抗體中的一個或多個糖基化位點來實現(xiàn)?？贵w糖基化通常是N-連接的或O-連接的。N-連接的指碳水化合物模塊附著于天冬酰胺殘基側(cè)鏈。三肽序列天冬酰胺-x-絲氨酸和天冬酰胺-x-蘇氨酸，其中X是除了脯氨酸之外的任何氨基酸，是碳水化合物模塊酶促附著于天冬酰胺側(cè)鏈的識別序列。因此，多30肽中存在這些三肽序列之任一產(chǎn)生潛在的糖基化位點。O-連接的糖基化指糖類N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、或木糖之一附著于羥基氨基酸(最常見的是絲氨酸或蘇氨酸，盡管也可用5_羥脯氨酸或5-羥賴氨酸)。在抗體上增加糖基化位點可通過改變氨基酸序列使之包含一個或多個上述的三肽序列來方便地實現(xiàn)(用于N-連接的糖基化位點)。也可在原始抗體序列中通過添加、或替代一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基來產(chǎn)生改變(用于0-連接的糖基化位點)。載體、宿主細胞和重組方法本發(fā)明的抗NRP抗體可使用易于得到的技術(shù)和材料而重組生產(chǎn)。為了重組生產(chǎn)抗NRP抗體，分離編碼抗體的核酸，并插入可復(fù)制載體，用于進一步克隆(DNA擴增)或表達。編碼抗體的DNA易于使用常規(guī)規(guī)程分離或合成(例如通過使用能夠與編碼抗體重鏈和輕鏈的DNA特異性結(jié)合的寡核苷酸探針)?？梢垣@得許多載體。載體構(gòu)件通常包括但不限于下列一種或多種信號序列、復(fù)制起點、一種或多種標志基因、增強子元件、啟動子、和轉(zhuǎn)錄終止序列。(i)信號序列構(gòu)件本發(fā)明的抗體不僅可以直接重組生產(chǎn)，而且可以作為與異源多肽的融合多肽，所述異源多肽優(yōu)選是成熟蛋白質(zhì)或多肽的N-末端處的信號序列或具有特異性切割位點的其它多肽。所選擇的異源信號序列優(yōu)選是受到宿主細胞識別并加工(即受到信號肽酶切割)的。對于不識別和加工天然抗體信號序列的原核宿主細胞，所述信號序列用例如選自堿性磷酸酶、青霉素酶、lpp或熱穩(wěn)定腸毒素II前導(dǎo)序列的原核信號序列取代。為了酵母分泌，天然信號序列可以用例如酵母轉(zhuǎn)化酶前導(dǎo)序列、a因子前導(dǎo)序列(包括糖酵母屬和克魯維氏酵母屬a因子前導(dǎo)序列)、酸性磷酸酶前導(dǎo)序列、白色假絲酵母葡萄糖淀粉酶前導(dǎo)序列、或W090/13646中記載的信號取代。在哺乳動物細胞表達中，可以利用哺乳動物信號序列以及病毒分泌前導(dǎo)序列，例如單純皰疹gD信號。將此類前體區(qū)(precursorregion)的DNA以符合讀碼框的方式與編碼抗體的DNA連接。(ii)復(fù)制起點構(gòu)件表達和克隆載體都包含能夠使載體在一種或多種所選擇的宿主細胞中復(fù)制的核酸序列。通常，在克隆載體中，這種序列是能夠使載體不依賴于宿主染色體DNA而復(fù)制的序列，包括復(fù)制起點或自主復(fù)制序列。眾所周知多種細菌、酵母和病毒的此類序列。來自質(zhì)粒pBR322的復(fù)制起點適合于大多數(shù)革蘭氏陰性細菌，2ii質(zhì)粒起點適合于酵母，而各種病毒起點(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用于哺乳動物細胞中的克隆載體。通常，哺乳動物表達載體不需要復(fù)制起點構(gòu)件(SV40起點的使用通常可能只是因為它包含早期啟動子)。(iii)選擇基因構(gòu)件表達和克隆載體可包含選擇基因，也稱為選擇標志。典型的選擇基因編碼如下蛋白質(zhì)(a)賦予對抗生素或其它毒素的抗性，例如氨芐青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四環(huán)素；(b)補足營養(yǎng)缺陷型的缺陷；或(c)提供不能由復(fù)合培養(yǎng)基獲得的必需營養(yǎng)物，例如用于芽孢桿菌的編碼D-丙氨酸消旋酶的基因。選擇方案的一個例子利用藥物來阻滯宿主細胞的生長。用異源基因成功轉(zhuǎn)化的那些細胞生成賦予藥物抗性的蛋白質(zhì)，因而幸免于選擇方案。此類顯性選擇的例子使用藥物新霉素、霉酚酸和潮霉素。適于哺乳動物細胞的選擇標志的另一個例子是那些能夠鑒定有能力攝取抗體核酸的細胞的選擇標志，諸如DHFR、胸苷激酶、金屬硫蛋白-I和-II優(yōu)選靈長類金屬硫蛋白基因、腺苷脫氨酶、鳥氨酸脫羧酶等。例如，首先通過將所有轉(zhuǎn)化子在含有甲氨蝶呤(Mtx)，DHFR的一種競爭性拮抗劑的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)來鑒定經(jīng)DHFR選擇基因轉(zhuǎn)化的細胞。在采用野生型DHFR時，適宜的宿主細胞是DHFR活性缺陷的中國倉鼠卵巢(CH0)細胞系?；蛘?，可以通過細胞在含有針對選擇標志的選擇劑諸如氨基糖苷抗生素例如卡那霉素、新霉素或G418的培養(yǎng)基中的生長來選擇經(jīng)編碼抗體、野生型DHFR蛋白質(zhì)、和另一種選擇標志諸如氨基糖苷3'-磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)的DNA序列轉(zhuǎn)化或共轉(zhuǎn)化的宿主細胞(特別是包含內(nèi)源DHFR的野生型宿主)。參閱美國專利No.4，965，199。適用于酵母的選擇基因是存在于酵母質(zhì)粒YRp7中的trpl基因(Stinchcomb等(1979)Nature282:39)。trpl基因為缺乏在色氨酸中生長能力的酵母突變株，例如ATCCNo.44076或PEP4-1提供了選擇標志。Jones(1977)Genetics85:12。酵母宿主細胞基因組中存在trpl損傷隨之提供了用于通過在缺乏色氨酸時的生長來檢測轉(zhuǎn)化的有效環(huán)境。類似的，用攜帶Leu2基因的已知質(zhì)粒補足Leu2缺陷型酵母菌株(ATCC20，622或38，626)。此外，衍生自1.6ym環(huán)狀質(zhì)粒pKDl的載體可用于轉(zhuǎn)化克魯維氏酵母屬酵母?；蛘撸瑘髮?dǎo)了用于在乳酸克魯維氏酵母中大規(guī)模生產(chǎn)重組小牛凝乳酶的表達系統(tǒng)。VandenBerg(1990)Bio/Technology8:135。還披露了用于由克魯維氏酵母屬的工業(yè)用菌株分泌成熟重組人血清清蛋白的穩(wěn)定多拷貝表達載體。Fleer等(1991)Bio/Technology9:968-975。(iv)啟動子構(gòu)件表達和克隆載體通常包含受到宿主生物體識別的啟動子，而且它與抗體核酸可操作連接。適用于原核宿主的啟動子包括phoA啟動子、13-內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動子系統(tǒng)、堿性磷酸酶、色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)、和雜合啟動子諸如tac啟動子。然而，其它已知的細菌啟動子也是合適的。用于細菌系統(tǒng)的啟動子還將包含與編碼抗體的DNA可操作連接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。已知真核細胞的啟動子序列。事實上，所有真核基因都具有富含AT區(qū)，它位于起始轉(zhuǎn)錄的位點上游大約25至30個堿基處。在許多基因的轉(zhuǎn)錄起點上游70至80個堿基處找到的另一種序列是CNCAAT區(qū)，其中N可以是任何核苷酸。在大多數(shù)真核基因的3'端是AATAAA序列，它可能是向編碼序列的3'端添加聚腺苷酸尾的信號。所有這些序列合適的插入真核表達載體。適用于酵母宿主的啟動序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的啟動子，諸如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖_6-磷酸異構(gòu)酶、3_磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶和葡糖激酶。作為具有通過生長條件控制轉(zhuǎn)錄的額外優(yōu)點的誘導(dǎo)型啟動子的其它酵母啟動子是醇脫氫酶2、異細胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝有關(guān)的降解酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、及負責麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動子區(qū)。適用于酵母表達的載體和啟動子進一步記載于EP73,657。酵母增強子也可以有利的與酵母啟動子一起使用。在哺乳動物宿主細胞中由載體轉(zhuǎn)錄抗體受到例如從病毒諸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(諸如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽類肉瘤病毒、巨細胞病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙肝病毒和最優(yōu)選的猿猴病毒40(SV40)基因組，從異源哺乳動物啟動子例如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子，及此熱休克啟動子獲得的啟動子的控制，倘若此類啟動子與宿主細胞系統(tǒng)相容的話。方便的以SV40限制性片段的形式獲得SV40病毒的早期和晚期啟動子，該片段還包含SV40病毒復(fù)制起點。方便的以HindIIIE限制性片段的形式獲得人巨細胞病毒的立即早期啟動子。美國專利No.4，419，446中披露了使用牛乳頭瘤病毒作為載體在哺乳動物宿主中表達DNA的系統(tǒng)。美國專利No.4，601，978中記載了該系統(tǒng)的一種改良。關(guān)于在小鼠細胞中在來自單純皰疹病毒的胸苷激酶啟動子的控制下表達人P-干擾素cDNA還可參閱Reyes等(1982)Nature297:598-601。或者，可以使用勞氏肉瘤病毒長末端重復(fù)序列作為啟動子。(v)增強子元件構(gòu)件常常通過將增強子序列插入載體來提高高等真核細胞對編碼本發(fā)明抗體的DNA的轉(zhuǎn)錄?，F(xiàn)在知道來自哺乳動物基因(球蛋白、彈性蛋白酶、清蛋白、甲胎蛋白和胰島素)的許多增強子序列。然而，通常使用來自真核細胞病毒的增強子。例子包括SV40復(fù)制起點晚期一側(cè)的增強子(bp100-270)、巨細胞病毒早期啟動子增強子、多瘤病毒復(fù)制起點晚期一側(cè)的增強子、和腺病毒增強子。關(guān)于激活真核啟動子的增強元件還可參閱Yaniv(1982)Nature297:17-18?？梢詫⒃鰪娮蛹艚拥捷d體中，位于抗體編碼序列的5'或3'位置，但是優(yōu)選位于啟動子的5'位點。(vi)轉(zhuǎn)錄終止構(gòu)件用于真核宿主細胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人或來自其它多細胞生物體的有核細胞)的表達載體還將包含終止轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定mRNA所必需的序列。此類序列通?？梢詮恼婧嘶虿《綝NA或cDNA非翻譯區(qū)的5'端和偶爾的3'端獲得。這些區(qū)域包含在編碼抗體的mRNA的非翻譯部分中轉(zhuǎn)錄成聚腺苷酸化片段的核苷酸區(qū)段。一種有用的轉(zhuǎn)錄終止構(gòu)件是牛生長激素聚腺苷酸化區(qū)。參閱W094/11026及其中披露的表達載體。(vii)宿主細胞的選擇和轉(zhuǎn)化適于克隆或表達本文載體中的DNA的宿主細胞是上文描述的原核生物、酵母或高等真核細胞。適于此目的的原核生物包括真細菌，諸如革蘭氏陰性生物體或革蘭氏陽性生物體，例如腸桿菌科，諸如埃希氏菌屬(Escherichia)例如大腸埃希氏菌(E.coli)、腸桿菌屬(Enterobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、變形菌屬(Proteus)、沙門氏菌屬(Salmonella)例如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimuri咖)、沙雷氏菌屬(Serratia)例如粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescans)、志賀氏菌屬(Shigella)、以及芽孢桿菌屬(Bacilli)諸如枯草芽孢桿菌(B.subtilis)和地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日公開的DD266，710中披露的地衣芽孢桿菌41P)、假單胞菌屬(Pseudomonas)諸如銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)、和鏈霉菌屬(Str印tomyces)。一種優(yōu)選的大腸桿菌克隆宿主是大腸桿菌294(ATCC31,446)，盡管其它菌株諸如大腸桿菌B、大腸桿菌X1776(ATCC31,537)和大腸桿菌W3110(ATCC27，325)也是合適的。這些例子是例示性的，而不是限制性的。在原核生物以外，真核微生物諸如絲狀真菌或酵母也是編碼抗體的載體的合適克隆或表達宿主。釀酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)或常用的面包酵母是最常用的低等真核宿主微生物。然而，通?？色@得許多其它屬、種和菌株且可用于本發(fā)明，諸如粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomycespombe);克魯維酵母屬(Kluyveromyces)宿主，諸如例如乳酸克魯維酵母(K.lactis)、脆壁克魯維酵母(K.fragilis)(ATCC12,424)、保加利亞克魯維酵母(K.bulgaricus)(ATCC16，045)、威克克魯維酵母(K.wickeramii)(ATCC24，178)、K.waltii(ATCC56,500)、果蠅克魯維酵母(K.drosophilarum)(ATCC36，906)、耐熱克魯維酵母(K.thermotolerans)和馬克思克魯維酵母(K.marxia皿s);亞羅酵母屬(Yarrowia)(EP402,226);巴斯德畢赤酵母(Pichi即astoris)(EP183,070);假絲酵母屬(Candida);瑞氏木霉(Trichodermareesia)(EP244,234);粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa);許旺酵母屬(Schwanniomyces)，諸如許旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis);和絲狀真菌，諸如例如脈孢菌屬(Neurospora)、青霉屬(Penicillium)、彎頸霉屬(Tolypocladium)、和曲霉屬(Aspergillus)宿主諸如構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。適于表達糖基化抗體的宿主細胞衍生自多細胞生物體。無脊椎動物細胞的例子包括植物和昆蟲細胞。已經(jīng)鑒定了許多桿狀病毒株和變體及相應(yīng)的允許昆蟲宿主細胞，它們來自諸如草地夜蛾Spodopterafrugiperda(毛蟲)、埃及伊蚊Aedesaegypti(蛟子)、白紋伊岐Aedesalbopictus(岐子)、黑月復(fù)果蟲雖Drosophilamelanogaster(果蟲雖)禾口家香Bombyxmori等宿主。公眾可獲得多種病毒株用于轉(zhuǎn)染，例如苜蓿尺蠖Autogr即hacalifornicaNPV的L-l變體和家蠶BombyxmoriNPV的Bm_5株，而且此類病毒可依照本發(fā)明用作本文中的病毒，特別是用于轉(zhuǎn)染草地夜蛾細胞。還可利用棉、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛、番茄和煙草的植物細胞培養(yǎng)物作為宿主。然而，脊椎動物細胞得到最多關(guān)注，而且培養(yǎng)(組織培養(yǎng))中脊椎動物細胞的繁殖已經(jīng)成為常規(guī)流程。有用哺乳動物宿主細胞系的例子是用SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CV1系(C0S-7，ATCCCRL1651);人胚腎系(293或為了在懸浮培養(yǎng)中生長而亞克隆的293細胞，Graham等(1977)J.GenVirol.36:59);幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCCCCL10);中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CH0，Urlaub等(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216));小鼠塞托利(Sertoli)細胞(TM4，Mather(1980)Biol.R印rod.23:243-251);猴腎細胞(CV1，ATCCCCL70);非洲綠猴腎細胞(VER0-76，ATCCCRL-1587);人宮頸癌細胞(HELA，ATCCCCL2);犬腎細胞(MDCK，ATCCCCL34);牛鼠(buffalorat)肝細胞(BRL3A，ATCCCRL1442);人肺細胞(W138，ATCCCCL75);人肝細胞(H印G2，HB8065);小鼠乳瘤(匪T060562，ATCCCCL51);TRI細胞(Mather等(1982)AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68;MRC5細胞；FS4細胞；和人肝瘤系(H印G2)。用上文所述用于生產(chǎn)抗體的表達或克隆載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，并在為了誘導(dǎo)啟動子、選擇轉(zhuǎn)化子或擴增編碼期望序列的基因而適當更改的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。(viii)培養(yǎng)宿主細胞可以在多種培養(yǎng)基中培養(yǎng)用于生產(chǎn)本發(fā)明抗體的宿主細胞。商品化培養(yǎng)基諸如34Ham氏F10(Sigma)、極限必需培養(yǎng)基(MEM，Sigma)、RPMI_1640(Sigma)、和Dulbecco氏改良的Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM，Sigma)適于培養(yǎng)宿主細胞。另外，可以使用下列文獻中記載的任何培養(yǎng)基作為宿主細胞的培養(yǎng)基:Ham等(1979)，Meth.Enz.58:44;Barnes等(1980)，Anal.Biochem.102:255;美國專利No.4，767，704;4，657，866;4，927，762;4，560，655;或5，122，469;W090/03430;WO87/00195;或美國專利復(fù)審30，985。任何這些培養(yǎng)基可以根據(jù)需要補充激素和/或其它生長因子(諸如胰島素、運鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(諸如氯化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽)、緩沖劑(諸如HEPES)、核苷酸(諸如腺苷和胸苷)、抗生素(諸如GENTAMYCINTM藥物)、痕量元素(定義為通常以微摩爾范圍的終濃度存在的無機化合物)、和葡萄糖或等效能源。還可以以本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的適宜濃度包含任何其它必需補充物。培養(yǎng)條件，諸如溫度、PH等，就是先前為表達而選擇用于宿主細胞的，這對于普通技術(shù)人員而言是顯而易見的。(ix)抗體純化在使用重組技術(shù)時，可以在細胞內(nèi)、在周質(zhì)空間中生成抗體，或者直接分泌到培養(yǎng)基中。如果在細胞內(nèi)生成抗體，那么作為第一步，通過例如離心或超濾除去宿主細胞或裂解片段的微粒碎片。Carter等(1992)Bio/Technology10:163-167記載了用于分離分泌到大腸桿菌周質(zhì)空間的抗體的流程。簡單的說，在存在乙酸鈉(pH3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)時使細胞糊融化約30分鐘?？赏ㄟ^離心除去細胞碎片。如果將抗體分泌到培養(yǎng)基中，那么通常首先使用商品化蛋白質(zhì)濃縮濾器，例如Amicon或MilliporePellicon超濾單元濃縮來自此類表達系統(tǒng)的上清液。在任何上述步驟中，可以包括蛋白酶抑制劑諸如PMSF來抑制蛋白水解，而且可以包括抗生素來防止外來污染物的生長?？梢允褂美缌u磷灰石層析、凝膠電泳、透析和親和層析來純化由細胞制備的抗體組合物，優(yōu)選的純化技術(shù)是親和層析。蛋白A作為親和配體的適宜性取決于抗體中存在的任何免疫球蛋白Fc區(qū)的種類和同種型。蛋白A可用于純化基于人Yl、Y2或Y4重鏈的抗體(Lindmark等(1983)J.Immunol.Meth.62:1-13)。蛋白G推薦用于所有小鼠同種型和人Y3(Guss等(1986)EMB0J.5:1567-1575)。親和配體所附著的基質(zhì)最常用的是瓊脂糖，但是可以使用其它基質(zhì)。物理穩(wěn)定的基質(zhì)諸如可控孔徑玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯容許獲得比瓊脂糖所能獲得的更快的流速和更短的加工時間。若抗體包含CH3結(jié)構(gòu)域，則可使用BakerbondABX樹脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)進行純化。根據(jù)待回收的抗體，也可使用其它蛋白質(zhì)純化技術(shù)，諸如離子交換柱上的分級、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的層析、肝素SEPHAROSETM上的層析、陰離子或陽離子交換樹脂(諸如聚天冬氨酸柱)上的層析、層析聚焦、SDS-PAGE、和硫酸銨沉淀。在任何預(yù)備性純化步驟后，包含目的抗體和污染物的混合物可進行低pH疏水相互作用層析，使用PH大約2.5-4.5之間的洗脫緩沖液，優(yōu)選在低鹽濃度進行(例如大約0-0.25M鹽)。藥用配制劑抗體的治療用配制劑可通過將具有期望純度的抗體與任選的生理學(xué)可接受的載f本、貝武形齊U或禾急定齊[J(Remington'sPharmaceuticalSciences,16thedition，Osol，A.Ed.，1980)混合，以凍干劑型或水溶液的形式制備供貯存?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑在所采用的劑量和濃度對接受者是無毒的，包括緩沖劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基芐基銨；氯化己烷雙胺；苯扎氯銨、苯索氯銨；酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3_戊醇；和間甲酚)；低分子量(少于約10個殘基)多肽；蛋白質(zhì)，諸如血清清蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA;糖類，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽反荷離子，諸如鈉；金屬復(fù)合物(例如Zn-蛋白質(zhì)復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑，諸如TWEEN、PLUR0NICS或聚乙二醇(PEG)。本文中的配制劑還可含有所治療具體適應(yīng)癥所必需的超過一種活性化合物，優(yōu)選那些活性互補且彼此沒有不利影響的。例如，可能希望進一步提供免疫抑制劑。合適的是，此類分子以對于預(yù)定目的有效的量組合存在。活性成分還可包載于例如通過凝聚技術(shù)或通過界面聚合制備的微膠囊中(例如分別是羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)、在膠狀藥物投遞系統(tǒng)中(例如脂質(zhì)體、清蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和納米膠囊)、或在粗滴乳狀液中。此類技術(shù)披露于例如Remington'sPharmaceuticalSciences,16thedition,Osol，A.Ed.，1980。用于體內(nèi)施用的配制劑必須是無菌的。這可容易的通過使用無菌濾膜過濾來實現(xiàn)?？芍苽涑掷m(xù)釋放制劑。持續(xù)釋放制劑的合適例子包括含有抗體的固體疏水性聚合物半透性基質(zhì)，該基質(zhì)是定型產(chǎn)品的形式，例如薄膜或微膠囊。持續(xù)釋放基質(zhì)的例子包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基_甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國專利No.3，773，919)、L-谷氨酸與L-谷氨酸y乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物諸如LUPR0NDEP0T(由乳酸_乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林構(gòu)成的可注射微球體)及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。雖然諸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸等聚合物能夠釋放分子達100天以上，但是某些水凝膠釋放蛋白質(zhì)的時間較短。當膠囊化抗體在體內(nèi)長時間維持時，它們可能由于暴露于37t:的潮濕環(huán)境而變性或聚集，導(dǎo)致生物學(xué)活性損失和免疫原性可能改變?？梢愿鶕?jù)相關(guān)機制來設(shè)計合理的穩(wěn)定化策略。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚集機制是經(jīng)由硫_二硫化物互換的分子間S-S鍵形成，那么可通過修飾巰基殘基、由酸性溶液凍干、控制濕度、采用適宜添加劑和開發(fā)特定聚合物基質(zhì)組合物來實現(xiàn)穩(wěn)定。治療用途設(shè)想了本發(fā)明的抗體可用于治療哺乳動物。例如，在一個實施方案中，給非人哺乳動物施用抗體用以獲得臨床前數(shù)據(jù)。示例性的要治療的非人哺乳動物包括非人靈長類動物、犬、貓、嚙齒類動物和其它臨床前研究所用的哺乳動物。這類哺乳動物可以是用抗體治療的疾病的已確立的動物模型，或者可用于研究目的抗體的毒性。在這些實施方案的每一個中，可以在哺乳動物中進行劑量放大研究。例如，當抗體是抗NRP1抗體時，將它施用給實體瘤模型的宿主嚙齒類動物。另外/或者，抗體用于治療人，例如患有能由施用抗體而受益的疾病或病癥的患者。本發(fā)明涵蓋抗血管發(fā)生癌癥療法，一種新的癌癥治療策略，其目標在于抑制提供營養(yǎng)以支持腫瘤生長所需的腫瘤血管發(fā)育。因為血管發(fā)生涉及原發(fā)性腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，所以本發(fā)明提供的抗血管發(fā)生治療能夠在原發(fā)性位置處抑制腫瘤的瘤生長，以及在繼發(fā)性位置處防止腫瘤轉(zhuǎn)移，因而容許其它治療劑攻擊腫瘤。本文中要治療的癌癥的實例包括但不限于癌、淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤、和白血病。此類癌癥的更具體例子包括鱗狀細胞癌、肺癌(包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺的腺癌、和肺的鱗癌)、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌(gastricorstomachcancer)(包括胃腸癌)、胰腺癌、成膠質(zhì)細胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌(livercancerorh印aticcarcinoma)、膀胱癌、肝肉瘤(h印atoma)、乳腺癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌(kidneyorrenalcancer)、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、及各種類型的頭和頸癌，以及B細胞淋巴瘤(包括低級/濾泡性非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴細胞性(SL)NHL、中級/濾泡性NHL、中級彌漫性NHL、高級成免疫細胞性NHL、高級成淋巴細胞性NHL、高級小無核裂細胞性NHL、貯積病(bulkydisease)NHL、套細胞淋巴瘤、AIDS相關(guān)淋巴瘤、和瓦爾登斯特倫氏(Waldenstrom)巨球蛋白血癥)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、急性成淋巴細胞性白血病(ALL)、毛細胞性白血病、慢性成髓細胞性白血病、和移植后淋巴增殖性病癥(PTLD)、以及與瘢痣病(phakomatoses)、水腫(諸如與腦瘤有關(guān)的)和梅格斯氏(Meigs)綜合征有關(guān)的異常血管增殖。更具體地，本發(fā)明抗體能治療的癌癥包括乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、直腸癌、非小細胞肺癌、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、腎細胞癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、軟組織肉瘤、卡波西氏肉瘤、類癌(carcinoidcarcinoma)、頭和頸癌、黑素瘤、卵巢癌、間皮瘤、和多發(fā)性骨髓瘤。設(shè)想了在用于治療各種疾病諸如腫瘤時，本發(fā)明的抗體可以與其它適用于相同或相似疾病的治療劑組合在一起。在用于治療癌癥時，本發(fā)明的抗體可以與常規(guī)癌癥療法(諸如手術(shù)、放療、化療或其組合)組合使用。在某些方面，可用于與本發(fā)明抗體一起構(gòu)成組合癌癥療法的其它治療劑包括其他抗血管發(fā)生劑。許多抗血管發(fā)生劑已得到鑒定并且是本領(lǐng)域已知的，包括Carmeliet和Jain(2000)所列的那些。在一個方面，本發(fā)明的抗體與VEGF拮抗劑或VEGF受體拮抗劑(諸如抗VEGF抗體、VEGF變體、可溶性VEGF受體片段、能阻斷VEGF或VEGFR的適體、中和性抗VEGFR抗體、VEGFR酪氨酸激酶的抑制劑及其任何組合)組合使用。或者/另外，兩種或更多種抗NRPl抗體可共施用給患者。在一個更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的抗NRP1A或抗NRPB抗體與抗VEGF抗體組合使用以產(chǎn)生疊加或協(xié)同效應(yīng)。優(yōu)選的抗VEGF抗體包括那些與抗hVEGF抗體A4.6.1結(jié)合相同表位的抗體。更優(yōu)選的是，抗VEGF抗體是bevacizumab(貝伐單抗)或ranibizumab(蘭尼單抗)。在一些其它方面，可用于與本發(fā)明抗體一起構(gòu)成組合腫瘤療法的其它治療劑包括涉及腫瘤生長的其它因子(諸如EGFR、ErbB2(也稱為Her2)、ErbB3、ErbB4、或TNF)的拮抗劑。優(yōu)選的是，本發(fā)明的抗NRP1抗體可以與靶向一種或多種酪氨酸激酶受體(諸如VEGF受體、FGF受體、EGF受體和PDGF受體)的小分子受體酪氨酸激酶抑制劑(RTKI)組合使用。許多治療性小分子RTKI是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于vatalanib(PTK787)、erlotinib(TARCEVA)、0SI_7904、ZD6474(ZACTIMA)、ZD6126(ANG453)、ZD1839、sunitinib(SUTENT)、semaxanib(SU5416)、AMG706、AG013736、Imatinib(GLEEVEC)、MLN-518、CEP-701、PKC-412、L即atinib(GSK572016)、VKLCADE⑧、AZD2171、sorafenib(NEXAVAR⑧)、XL880、和CHIR-265。本發(fā)明的抗NRP抗體，單獨的或與第二治療劑(諸如抗VEGF抗體)組合的，都可進一步與一種或多種化療劑組合使用。多種化療劑可用于與本發(fā)明一起構(gòu)成組合治療方法。所設(shè)想的示例性的和非限制性的化療劑列表在本文"定義"小節(jié)中有提供。當抗NRP抗體與第二治療劑共施用時，可首先施用第二治療劑，然后施用抗NRP抗體。然而，也設(shè)想了同時施用或首先施用抗NRP抗體。第二治療劑的合適劑量就是當前所用的那些，而且可以由于該藥劑與抗NRP抗體的組合(協(xié)同)作用而降低。為了預(yù)防或治療疾病，抗體的合適劑量將取決于要治療的疾病的類型、疾病的嚴重性和進程、是為了預(yù)防還是為了治療目的而施用抗體的、以前的療法、患者的臨床史和對抗體的應(yīng)答、和主治醫(yī)師的判斷。合適的是，抗體在一次或在一系列治療中施用于患者。根據(jù)疾病類型和嚴重性，例如，約1yg/kg至50mg/kg(例如0.1-20mg/kg)抗體是向患者施用的初始候選劑量，無論是一次或多次分開給藥，或者通過連續(xù)輸注。根據(jù)上述因素，典型的每日劑量的范圍可以是約1Pg/kg至約100mg/kg或更多。對于持續(xù)數(shù)天或更長時間的重復(fù)給藥，根據(jù)狀況，治療持續(xù)到發(fā)生疾病癥狀所希望的消退。然而，可以用其它劑量方案。在一個優(yōu)選的方面，本發(fā)明的抗體每兩至三周施用一次，劑量范圍為約5mg/kg至約15mg/kg。更優(yōu)選的是，這類劑量給藥方案與化療方案組合使用，作為治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌的一線療法。在一些方面，化療方案包括傳統(tǒng)的高劑量間歇性給藥。在一些其它方面，用更小且更頻繁的劑量施用化療劑而無預(yù)定的中斷("節(jié)奏性化療")。本發(fā)明療法過程可容易地用常規(guī)技術(shù)和測定法來監(jiān)測?？贵w組合物將以與優(yōu)良醫(yī)學(xué)實踐一致的方式配成劑型、確定劑量(dosed)、和施用。本文考慮的因素包括所治療的特定疾病、所治療的特定哺乳動物、患者個體的臨床狀況、病癥成因、藥劑投遞位置、施用方法、施用計劃、和醫(yī)學(xué)從業(yè)人員已知的其它因素。要施用的抗體的"治療有效量"將根據(jù)這類考量而決定，而且是預(yù)防、改善、或治療疾病或病癥所必需的最小量?？贵w不必是但任選與一種或多種當前用于預(yù)防或治療所討論病癥的藥劑配制成劑型。這類其它藥劑的有效量取決于存在于配方中的抗體量、病癥或治療法的類型、和以上討論的其它因素。這些通常是以與上文所用相同劑量和施用路徑使用，或是迄今所用劑量的大約1_99%。一般而言，疾病或病癥的改善或治療包括減輕一種或多種癥狀或與疾病或病癥相關(guān)的醫(yī)學(xué)問題。對于癌癥，藥物的治療有效量可實現(xiàn)以下一項或它們的任意組合減少癌細胞數(shù)；縮小腫瘤尺寸；抑制(即降低到某種程度和/或停止)癌細胞浸潤入周圍組織；抑制腫瘤轉(zhuǎn)移；以某種程度抑制腫瘤生長；和/或以某種程度減輕一種或多種與癌癥相關(guān)的癥狀。到藥物可防止已有癌細胞生長和/或殺死已有癌細胞的程度，它可以是細胞抑制性的和/或細胞毒性的。在一些實施方案中，本發(fā)明的組合物可用于防止受試者或哺乳動物中疾病或病癥的發(fā)作或復(fù)發(fā)。非治療用途本發(fā)明的抗體可用作親和純化試劑。在這種方法中，使用本領(lǐng)域眾所周知的方法將抗體固定在固相上，諸如S印hadex樹脂或濾紙。使固定化抗體接觸含有待純化抗原的樣品，然后用合適的溶劑清洗支持物，這將基本上除去樣品中固定化抗體所結(jié)合的待純化抗原以外的所有物質(zhì)。最后，用另一種合適的將從抗體上釋放抗原的溶劑清洗支持物，諸如甘氨酸緩沖液pH5.0。本發(fā)明的抗體還可用于診斷性測定法，例如用于檢測目的抗原在特定細胞、組織或血清中的表達。就診斷性應(yīng)用而言，通常用可檢測模塊標記抗體?？衫迷S多標記物，一般可分成以下幾類(a)放射性同位素，諸如35S、"C、mi、3H和1311。例如，可使用CurrentProtocolsinImmunology,Volumes1and2，Coligen等，Ed.，Wiley_Interscience，NewYork,NewYork,Pubs.1991中描述的技術(shù)用放射性同位素標記抗體，并可使用閃爍計數(shù)來測量放射性。(b)熒光標記物，諸如可利用稀士螯合物(銪螯合物)或熒光素及其衍生物、若丹明及其衍生物、丹酰、麗絲胺、藻紅蛋白和德克薩斯紅。例如，可使用CurrentProtocolsinImmunology,見上文中披露的技術(shù)使熒光標記物與抗體偶聯(lián)。可使用熒光計對熒光進行定(c)可利用各種酶-底物標記物且美國專利No.4，275，149中提供了有關(guān)它們中的一些的綜述。酶一般催化可使用多種技術(shù)測量的顯色底物的化學(xué)改變。例如，酶可以催化可通過分光光度法測量的底物的顏色改變?；蛘撸缚梢愿淖兊孜锏臒晒饣蚧瘜W(xué)發(fā)光。上文描述了用于對熒光改變進行定量的技術(shù)?；瘜W(xué)發(fā)光底物通過化學(xué)反應(yīng)變成電子激發(fā)態(tài)，然后可發(fā)射可測量(例如使用化學(xué)發(fā)光計)或給熒光受體提供能量的光。酶標記物的例子包括螢光素酶(例如螢火蟲螢光素酶和細菌螢光素酶；美國專利No.4，737，456)、螢光素、2，3-二氫酞嗪二酮類、蘋果酸脫氫酶、尿素酶、過氧化物酶諸如辣根過氧化物酶(HRP0)、堿性磷酸酶、P-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖_6-磷酸脫氫酶)、雜環(huán)氧化酶(諸如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶)、乳過氧化物酶、微過氧化物酶等。用于使酶與抗體偶聯(lián)的技術(shù)描述于0'Sullivan等(1981)MethodsforthePreparationofEnzyme—AntibodyConjugatesforuseinEnzymeImmunoassay,MethodsinEnzym.，J丄angone禾口H.VanV皿akisEd.，AcademicPress,NewYork,73:147-166。酶-底物組合的例子包括例如(i)辣根過氧化物酶(HRP0)，其以過氧化氫為底物，其中過氧化氫氧化染料前體(例如鄰苯二胺(0PD)或3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽(TMB));(ii)堿性磷酸酶(AP)與作為顯色底物的對硝基苯基磷酸酯；禾口(iii)|3-D-半乳糖苷酶(13-D-Gal)與顯色底物(例如對硝基苯基-13-D-半乳糖苷)或熒光底物4-甲基傘形基_13-D-半乳糖苷。本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用許多其它酶-底物組合。有關(guān)它們的一般性綜述參見美國專利No.4，275，149和4，318，980。有時，將標記物與抗體間接偶聯(lián)。熟練技術(shù)人員了解實現(xiàn)這一目的的多種技術(shù)。例如，可將抗體與生物素偶聯(lián)，而且可以將上述三大類標記物中的任一種與親合素偶聯(lián)，或反之亦然。生物素選擇性結(jié)合親合素，由此標記物可與抗體以這種間接方式偶聯(lián)?；蛘?，為了實現(xiàn)標記物與抗體的間接偶聯(lián)，將抗體與小型半抗原(例如地高辛)偶聯(lián)，并將上述不同類型的標記物之一與抗半抗原抗體(例如抗地高辛抗體)偶聯(lián)。由此，可實現(xiàn)標記物與抗體的間接偶聯(lián)。在本發(fā)明的另一個實施方案中，抗體無需標記，而且可使用結(jié)合該抗體的經(jīng)標記抗體檢測其存在。本發(fā)明的抗體可用于任何已知測定方法，諸如競爭性結(jié)合測定法、直接和間接夾心式測定法、及免疫沉淀測定法。Zola，MonoclonalAntibodies:AMa皿alofTechniques,pp.147-158，CRCPress,Inc.，1987。競爭性結(jié)合測定法依賴于經(jīng)標記標準品與測試樣品分析物競爭結(jié)合有限量的抗體的能力。測試樣品中的抗原量與結(jié)合至抗體的標準品量成反比。為了便于測定得到結(jié)合的標準品的量，一般在競爭之前或之后使抗體不溶解，從而可以方便的將結(jié)合至抗體的標準品和分析物與仍然未結(jié)合的標準品和分析物分離。三明治/夾心式測定法涉及使用兩種抗體，它們都能夠結(jié)合待檢測蛋白質(zhì)的不同免疫原性部分或表位。在三明治/夾心式測定法中，測試樣品分析物得到固定在固體支持物上的第一抗體的結(jié)合，此后第二抗體結(jié)合至分析物，如此形成不溶性三元復(fù)合物。參見例如美國專利No.4，376，110。第二抗體自身可以是用可檢測模塊標記的(直接夾心測定法)，或者可以使用經(jīng)可檢測模塊標記的抗免疫球蛋白抗體來測量(間接夾心測定法)。例如，一種類型的夾心測定法是ELISA測定法，其中的可檢測模塊是酶。對于免疫組織化學(xué)，例如，腫瘤樣品可以是新鮮的或冷凍的，或者可以包埋在石蠟中并用防腐劑諸如福爾馬林固定?？贵w還可用于體內(nèi)診斷性測定法。一般而言，用放射性核素(諸如min、"Tc、"d^H、"P或355)或染料標記抗體，從而可使用免疫閃爍描記法(immunoscintiography)來定位月中瘤。在一個實施方案中，檢測生物學(xué)樣品(例如組織、血液、血清、脊髓液)或所制備生物學(xué)樣品中的NRP1的方法可包括使本發(fā)明抗體接觸該樣品并觀察結(jié)合至樣品中NRP1的抗NRP1抗體或測定結(jié)合至樣品中NRP1的抗NRP1抗體的量的步驟。在另一個實施方案中，檢測受試者(例如人、小鼠、兔、大鼠等)中的NRP1的方法包括對受試者施用本發(fā)明的抗體并觀察結(jié)合至受試者中NRP1的抗NRP1抗體或測定結(jié)合至受試者中NRP1的抗NRP1抗體的量的步驟。診斷試劑盒為方便起見，可以在試劑盒中提供本發(fā)明的抗體，即以預(yù)定量包裝的試劑組合及實施診斷測定法的說明書。若抗體是用酶標記的，則試劑盒將包括酶所需要的底物和輔因子(例如提供可檢測生色團或熒光團的底物前體)。另外，可以包括其它添加劑，諸如穩(wěn)定劑、緩沖劑(例如封閉緩沖液或裂解緩沖液)等等。各種試劑的相對量可以廣泛變化，以提供實質(zhì)性優(yōu)化測定法靈敏度的、試劑在溶液中的濃度。具體而言，可以以包含賦形劑的干粉形式提供試劑，通常是凍干的，它們在溶解后提供具有適宜濃度的試劑溶液。制品在本發(fā)明的另一個實施方案中提供了包含可用于治療上文所述病癥的物質(zhì)的制品。所述制品包括容器和標簽。合適的容器包括例如藥瓶、藥管、注射器和試管。所述容器可以用多種材料制成，諸如玻璃或塑料。所述容器裝有有效治療所述疾患的組合物，可以具有無菌存取口(例如所述容器可以是帶有皮下注射針可剌穿的塞子的靜脈內(nèi)溶液袋或藥40瓶)。所述組合物中的活性藥劑是抗體。容器上或與容器相連的標簽指明該組合物用于治療所選疾患。所述制品可進一步包括第二容器，其中裝有藥劑學(xué)可接受的緩沖液，諸如磷酸鹽緩沖鹽水、林格氏(Ringer)溶液和右旋糖溶液。它可進一步包括從商業(yè)和用戶立場出發(fā)需要的其它物質(zhì)，包括其它緩沖液、稀釋齊U、濾器、針頭、注射器和帶有使用說明書的包裝插頁。以下實施例僅僅意圖例示本發(fā)明的實施，而非作為限制提供的。本文中所引用的所有專利和科學(xué)文獻的公開內(nèi)容完整收錄作為參考。實施例實施例1:抗NrplB和抗泛NrpA抗體的構(gòu)建和功能Liang等，JMolBiol366，815-29(2007)和Pan等，CancerCell11，53-67(2007)報告了開發(fā)選擇性阻斷腦信號蛋白或VEGF結(jié)合Nrpl的噬菌體衍生抗體的一種策略。這些單克隆抗體被設(shè)計成用于區(qū)分Nrpl介導(dǎo)的各種應(yīng)答和用于在鼠腫瘤模型中評估它們作為治療劑的潛力的工具。簡言之，設(shè)計了一種人合成抗體噬菌體文庫，其是在單一共有支架上用VH/VL多樣性建立的。此抗體文庫的設(shè)計和選擇的詳情記載于Liang等，見上文，而且還可見于2003年12月11日公布的WO03/102157，通過述及將其完整公開內(nèi)容收入本文。自此文庫生成了針對人和鼠NRP1的功能阻斷性抗體。定位于NRP1blb2結(jié)構(gòu)域的抗體能阻斷VEGF與NRP1的結(jié)合，及VEGF誘導(dǎo)的HUVEC細胞遷移。所鑒定的抗體包括以0.2nM的親和力結(jié)合Nrpl的VEGF阻斷性抗體(克隆YW107.4.87;抗NrplB)(Liang等，見上文;Pan等，見上文)。雖然此抗體阻斷VEGF與Nrpl之間的相互作用，但是它不拮抗Sema3A功能。在體內(nèi)，抗NrplB不僅降低小鼠視網(wǎng)膜中的血管重構(gòu)，而且還與抗VEGF的作用相加以減緩腫瘤生長(Liang等，見上文和Pan等，見上文)。遵循相同的辦法，使用在單一共有框架上建立的人合成抗體噬菌體文庫，開發(fā)了一種分別以0.21和0.15nM的親和力與Nrpl和Nrp2二者起交叉反應(yīng)的抗體(克隆YW68.11.26，抗泛NrpA)(圖S1)。YW68.1L26和相關(guān)YW68.11的輕鏈和重鏈可變域序列分別顯示于圖7和8?？狗篘rpAIgG1抗體Yff68.n和Yff68.1L26的Fab片段的氨基酸序列分別顯示于圖9A和9B。與抗NrplB形成對比，抗泛NrpA不影響VEGF165或VEGF-C的結(jié)合(數(shù)據(jù)未顯示)。對這兩種抗體抑制Sema3A介導(dǎo)的軸突生長錐(來自鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG))塌陷的能力的評估(圖1)。添加Sema3A導(dǎo)致伴DRG生長錐的肌動蛋白前行(actinprocesses)的收回(retraction);此作用受到抗泛NrpA的完全拮抗，但不受抗NrplB拮抗。實施例2:神經(jīng)氈蛋白/抗體復(fù)合物的結(jié)構(gòu)研究材料和方法功能測定法和抗體結(jié)合親和力塌陷測定法和抗Nrp抗體結(jié)合親和力的測定如先前所述那樣實施(He，Z和Tessier-Lavigne，M.，Cell90,739-51(1997);Liang等，見上文和Pan等，見上文)。用于進行結(jié)晶學(xué)研究的蛋白質(zhì)的表達和純化將Nrpl-bl、Nrpl-blb2、和Nrp2_blb2(結(jié)構(gòu)域邊界見表SI)克隆入pET15b(Novagen)并在大腸桿菌中表達，于37°C(Nrpl-bl和_blb2)或16°C(Nrp2_blb2)溫育。所有神經(jīng)氈蛋白b型片段以可溶性蛋白質(zhì)的形式表達，不需要再折疊方案。在裂解細胞后，使用鑷_氨三乙酸(Ni-NTA)樹脂在50mMTris(pH8.0)、300-500mMNaCl、和20mM咪唑中純化蛋白質(zhì)，并在相同的緩沖劑加250mM咪唑中洗脫。用凝血酶切除hise標簽，并使用在25mMTris(pH8.0)禾P150mMNaCl中平衡的Superdex-75柱通過凝膠過濾層析進一步純化樣品。生成重組桿狀病毒以便于自Hi5細胞分泌Nrpl-a2blb2、Nrp2_a2blb2、Nrp2-ala2blb2、和全長Nrp2_ECD(表SI)。將Nrp2_ala2blb2和全長Nrp2_ECD與Nrp2天然分泌信號和C末端His6標簽一起亞克隆入pENTR/D-TOPO(Invitrogen)并重組入pDEST8(Invitrogen)以生成病毒桿粒(bacmid)。將Nrpl-a2blb2和Nrp2-a2blb2亞克隆入pAcGP67B(Clonetech)。感染后，收集培養(yǎng)物培養(yǎng)液并補充50mMTris(pH8.0)、5mMCaCl2、和ImMNiCl2;如關(guān)于細菌表達的神經(jīng)氈蛋白構(gòu)建體所述那樣用Ni-NTA和凝膠過濾層析純化蛋白質(zhì)。將抗NrplB(YW107.4.87)和抗泛NrpA(YTO8.11.26)的Fab片段在大腸桿菌中表達，在PBS中平衡的蛋白G柱上捕捉，并用0.58%乙酸洗脫。通過離子交換層析(SP-s印harose)在20mMMES(pH5.5)中進一步純化蛋白質(zhì)級分，并用0至250mMNaCl的梯度洗脫。Fab/Nrp復(fù)合物通常以1:1的摩爾比混和，并且使用在25mMTris-HCl(pH7.5)和200mMNaCl中平衡的Superdex-200柱進一步純化。為了結(jié)晶，如表SI中詳述地那樣濃縮所有未結(jié)合的神經(jīng)氈蛋白和Nrp/Fab復(fù)合物樣品。結(jié)晶、結(jié)構(gòu)測定、和精化所有晶體都是通過蒸氣擴散法于1『C通過混和等體積的蛋白質(zhì)加孔溶液得到的(細節(jié)見表S1)。為了防凍，一般將晶體轉(zhuǎn)移至母液加20%甘油或乙二醇的溶液(表SI)。將Nrpl-bl/Fab復(fù)合物晶體轉(zhuǎn)移至10mMH印es(pH7.2)、25%PEG1，500、和10%乙二醇；讓其對10mMH印es(pH7.2)、25%PEG1，500、和20%乙二醇脫水過夜；并在液氮中閃凍。在AdvancedLightSource(beam-lines5.0.1或5.0.2)或StanfordSynchrotronRadiationLaboratory(beam-lines9-2或11-1)處收集數(shù)據(jù)集。使用來自HKL套{牛的Denzo禾口Scal印ack(0twinowski，Z禾口Minor,W.，MethodsinEnzymology276，307-326(1997))加工數(shù)據(jù)。晶胞參數(shù)和數(shù)據(jù)統(tǒng)計總結(jié)于表1。所有晶體結(jié)構(gòu)都使用Phaser(McCoy等，ActaCrystallogrDBiolCrystallogr61，458-64(2005))通過分子置換來解析。使用Nrpl_b1晶體結(jié)構(gòu)(pdb登錄號1KEX)(Lee，etal.，Structure11，99-108(2003))作為每個凝血因子結(jié)構(gòu)域的搜索模型解析了Nrpl-blb2結(jié)構(gòu)。用Nrpl-blb2結(jié)構(gòu)的精化座標充當Nrp2-blb2結(jié)構(gòu)的搜索探針。使用Nrp2-blb2結(jié)構(gòu)和含有來自B20-4/VEGF復(fù)合物(pdb登錄號2FJH)的可變域(VH/、)或恒定域(CH1/"的Fab片段解析了Nrp2ala2blb2/抗泛NrpA_Fab復(fù)合物的單斜晶形。使用來自MASP-2的N末端CUB結(jié)構(gòu)域通過分子置換鑒定了a2結(jié)構(gòu)域；al結(jié)構(gòu)域不能通過分子置換來定位，在電子密度內(nèi)手工放置。使用上文所述Nrpl-bl晶體結(jié)構(gòu)和B20-4Fab片段解析了Nrpl-bl/Fab復(fù)合物。使用來自Nrp2-ala2blb2/Fab復(fù)合物的blb2結(jié)構(gòu)和a2CUB結(jié)構(gòu)域的精化座標解析了所有剩余結(jié)構(gòu)。原子模型使用Coot(Emsley，P.和Cowtan，K.Coot，ActaCrystallogrDBiolCrystallogr60，2126-32(2004))來構(gòu)建，并使用42Refmac(Murshudov，etal.，ActaCrystallographicaD53，240-255(1997))來精化。Nrpl、Nrp2、和神經(jīng)氈蛋白/Fab復(fù)合物的結(jié)晶使用兩種不同策略來為結(jié)構(gòu)研究生成蛋白質(zhì)。只包括b型結(jié)構(gòu)域的較小神經(jīng)氈蛋白片段在大腸桿菌中表達，而較大Nrp構(gòu)建體需要作為自桿狀病毒感染的昆蟲細胞分泌的蛋白質(zhì)生成。關(guān)于七種結(jié)構(gòu)的概況呈現(xiàn)于圖2。簡言之，Nrpl和Nrp2的VEGF結(jié)合部分(blb2)的晶體分別衍射至1.8和1.95A的最大分辨率。Nrpl和Nrp2的a2blb2結(jié)構(gòu)域的晶體分別精化至2.0和2.3A，而與VEGF阻斷性Fab，抗NrplB形成的復(fù)合物中Nrpl的bl結(jié)構(gòu)域衍射至2.2A分辨率。最后，Nrp2ala2blb2結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)是在與腦信號蛋白阻斷性Fab，抗泛NrpA形成的復(fù)合物中解析的；鑒定了此復(fù)合物的衍射至2.75和3.1A的兩種晶形。所有結(jié)構(gòu)通過分子置換來解析，并以具有好的立體化學(xué)的低于20/25X的最終R工^/R游離(R耐k/RfJ值來報告(表D。Nrpla2blb2結(jié)構(gòu)在a2結(jié)構(gòu)域的對邊上具有兩個N-連接的糖基化位點(圖3B)。Nrp2/Fab復(fù)合物的單斜晶形也顯示a2結(jié)構(gòu)域內(nèi)的兩個糖基化位點(圖3A);然而，這些糖模塊在Nrp2-a2blb2結(jié)構(gòu)的電子密度中沒有很好地被限定，因此沒有建模(圖3B)。神經(jīng)氈蛋白胞外域的總體結(jié)構(gòu)域體系結(jié)構(gòu)神經(jīng)氈蛋白胞外區(qū)常常分成三個單元，分別稱作主要腦信號蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(ala2)、VEGF結(jié)合結(jié)構(gòu)域(blb2)、二聚化結(jié)構(gòu)域(c)(Ellis，L.M.，MolCancerTher5，1099-107(2006))。事實上，最近的大鼠Nrplblb2晶體結(jié)構(gòu)(VanderKooi，C.W.，etal.，ProcNatlAcadSciUSA104，6152-6157(2007))鑒定了bl與b2結(jié)構(gòu)域之間的大界面，及埋藏在結(jié)構(gòu)域之間的殘基在序列方面是保守的，此blb2結(jié)構(gòu)域排列被公認是Nrp家族的一般特征。在此，已經(jīng)自多種結(jié)晶條件(表S1)解析了包括a2、bl、和b2結(jié)構(gòu)域的Nrp的四種晶體結(jié)構(gòu)(圖2，3)。兩種模型包括結(jié)合至Fab片段的al結(jié)構(gòu)域，而另兩種模型包括a2結(jié)構(gòu)域中的鈣離子。不管這些差異，三個結(jié)構(gòu)域(即a2，bl，和b2)在所有晶體結(jié)構(gòu)中共享相同的排列，而且緊密包圍在假3-折疊軸(pseudo3-foldaxis)周圍(圖3)。Nrpl和Nrp2a2blb2結(jié)構(gòu)非常相似而且在317個Ca原子上以1.2A的r.m.s.d.(均方根差)重疊。bl與b2之間的界面在兩種神經(jīng)氈蛋白間是保守的，埋藏約1200-1500人2的溶劑可及表面。有趣的是，a2結(jié)構(gòu)域與blb2之間的界面在所有結(jié)構(gòu)中也是保守的，而且埋藏超過2000入2的溶劑可及面積，指示所有三個結(jié)構(gòu)域形成剛性結(jié)構(gòu)單元(圖3)。相反，al與a2blb2之間的結(jié)構(gòu)域排列在Nrp2/抗泛NrpA_Fab復(fù)合物的兩種晶形間沒有得到保留。在重疊受體的a2blb2核心時，al結(jié)構(gòu)域相對于彼此移位約7A。al與a2blb2之間的界面是小的(約800人2埋藏表面積)且不是保守的。強相互作用的缺乏鑒定了al結(jié)構(gòu)域的柔性，提示它能在溶液中或在受體結(jié)合時相對于Nrp的剩余部分發(fā)生構(gòu)象變化(圖3C)。NrpCUB結(jié)構(gòu)域包括鈣結(jié)合位點和腦信號蛋白結(jié)合位點Nrpl和Nrp2的al和a2結(jié)構(gòu)域是CUB結(jié)構(gòu)域(Ellis，L.M，MolCencerTher5，1099-107(2006))。在CUB結(jié)構(gòu)域原型，spe麗dhesin(Romero,A.，etal.，NatStructBiol4,783-8(1997)中，折疊結(jié)構(gòu)(fold)包含兩個5鏈P-片層，其形成P-三明治。鏈132、134、139、136禾PP7形成一個P_片層，而另一個片層含有鏈P1、P3、P10、P5和;然而，鏈13l和P2在來自數(shù)個補體家族蛋白質(zhì)的CUB結(jié)構(gòu)域中頻繁缺失(Feinberg，4H.等，EMBOJ22,2348-59(2003);Gregory，LA.等，JBiolChem278,32157-64(2003);Gregory,L.A.等，JBolChem279，29391-7(2004))。與這些蛋白質(zhì)相似，Nrp的al和a2結(jié)構(gòu)域缺少P1鏈(圖4)?？傮w而言，CUB結(jié)構(gòu)域展現(xiàn)高度的相似性。例如，Nrpa2結(jié)構(gòu)域在結(jié)構(gòu)上與Nrpla2結(jié)構(gòu)域(r.m.s.d.為0.9A)、Nrp2al結(jié)構(gòu)域(r.m.s.d.為0.9A)、和來自spermadhesin(Romero,A.等，見上文)的CUB結(jié)構(gòu)域(r.m.s.d.為1.4A)相似。來自補體家族蛋白質(zhì)Cls和MASP-236'37的CUB結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)在三明治的一端含有鈣結(jié)合位點。Nrpl和Nrp2a2blb2結(jié)構(gòu)在結(jié)構(gòu)域a2內(nèi)的此位置也含有結(jié)合的離子(圖3B，4A)。在Nrpl結(jié)構(gòu)中，在電子密度中清楚觀察到所述離子(圖S2)，即使在結(jié)晶過程中沒有包括二價離子(表S1)。在Nrpl，鈣離子由三個帶負電荷的側(cè)鏈(Glu^、Asp，、和Asp25°)、兩個羰基氧(Ala252和lie253)、和水分子配位(圖4B)。類似地，在Nrp2中，鈣配位涉及三個帶負電荷的氨基酸(Glu197、Asp^、和Asp252;見圖S2);這三個殘基在來自十二種關(guān)系較遠的物種的a2結(jié)構(gòu)域中是絕對保守的(圖S3)。Nrp的al和a2結(jié)構(gòu)域間的序列比對(圖S2)顯示了此帶電荷殘基三聯(lián)體在Nrp的al結(jié)構(gòu)域內(nèi)也是嚴格保守的。然而，在Nrp2/抗NrpA_Fab復(fù)合物中，沒有關(guān)于al結(jié)構(gòu)域中結(jié)合的離子的指示。促成限定推定alCa2+結(jié)合位點的殘基的環(huán)較為無序，提示Ca2+在穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域的折疊結(jié)構(gòu)中發(fā)揮作用。基于高度的序列保守性，有可能的是鈣結(jié)合代表NrpCUB結(jié)構(gòu)域的共享特征。神經(jīng)氈蛋白發(fā)揮第3類腦信號蛋白家族選定成員的共同受體的功能。N-端含有簽名"Sema"結(jié)構(gòu)域，即一種7片P-螺旋槳(Antipenko，A.，etal.，Neuron39，589-98(2003))，它是結(jié)合神經(jīng)氈蛋白ala2結(jié)構(gòu)域所需要的。抗泛NrpA阻斷Sema3結(jié)合Nrpl和Nrp2二者(圖1)，但是不影響VEGF結(jié)合(數(shù)據(jù)未顯示)。在Nrp2/抗泛NrpA_Fab復(fù)合物結(jié)構(gòu)(圖4C)中，F(xiàn)ab片段只在埋藏約1400入2溶劑可及表面的三明治P8-5-10-3面上接觸Nrp2的al結(jié)構(gòu)域。受到此抗體識別的界面在Nrpl與Nrp2之間是很保守的，14個有超過25%的它們可及表面埋藏在界面中的Nrp2殘基中有11個在兩種受體之間是相同的(圖4C)。在Nrpl與Nrp2之間保守的表位的識別解釋了該抗體以亞納摩爾范圍內(nèi)的親和力結(jié)合兩種受體的能力(圖Sl)。在抗體側(cè)，來自CDRL3、H2和H3的11個側(cè)鏈接觸Nrp2，其中7個在性質(zhì)上是芳香族的(圖4D)。先前的研究使用定點誘變概述了Nrpl的腦信號蛋白結(jié)合位點(Gu，C.等，JBiolChem277,18069-76(2002)?；趕permadhesin模型，選擇al結(jié)構(gòu)域表面上的推定溶劑暴露殘基進行氨基酸替代。使用此辦法，鑒定了許多突變，它們破壞Sema3A與Nrpl之間的相互作用(Gu等，見上文)，而且在定位到Nprlal模型上時，定位在aiP-三明治的一個極處的環(huán)上(圖4C)。所述結(jié)構(gòu)域另一端處的替代對Sema3A結(jié)合沒有影響(Gu等，見上文)。破壞Sema3A結(jié)合的突變在受到Sema3A阻斷性Fab識別的表位附近(圖4C)，強烈提示sema結(jié)構(gòu)域結(jié)合Nrp2al結(jié)構(gòu)域內(nèi)三明治的環(huán)和8-5_10_3面。腦信號蛋白結(jié)合位點的位置也在al結(jié)構(gòu)域的推定鈣結(jié)合位點附近(圖4C)，提示鈣結(jié)合可能在配體與受體的相互作用中發(fā)揮作用。Nrp型b結(jié)構(gòu)域含有肝素結(jié)合位點和VEGF結(jié)合位點來自人神經(jīng)氈蛋白blb2結(jié)構(gòu)的b結(jié)構(gòu)域(圖5A和VanderKoo等，見上文，Lee等，見上文)與來自凝血因子V和VIII(F5/8)的磷脂結(jié)合(C2型)模塊(Macedo-Ribeiro44等，Nature402,434-9(1999);Pratt，K.P.，etal.，Nature402,439-42(1999))及與細菌唾液酸酶的半乳糖結(jié)合域(Gaskell，A.等，Structure3,1197-205(1995))共享顯著同源性。總之，這些結(jié)構(gòu)域限定盤菌素(discoidin)折疊結(jié)構(gòu)，其在拓撲學(xué)上歸類為由八個核心P_鏈構(gòu)成的變形果凍巻13_桶(jelly-rollP-barrel)。該結(jié)構(gòu)域的一個極含有三個延伸的"剌突"或環(huán)，其通常構(gòu)成盤菌素家族成員的配體結(jié)合位點(Macedo-Ribeiro等，見上文；Pratt等，見上文；Gaskell等，見上文)。Nrpl和Nrp2的blb2片段共享50%序列同一性，而且在307個Ca原子上以2.3A的r.m.s.d.重疊(圖5A)。雖然Nrpl和Nrp2的bl結(jié)構(gòu)域幾乎不能區(qū)分(r.m.s.d=0.6A)，但是b2結(jié)構(gòu)域重疊不太好(r.m.s.d.=2.7A)，差異主要源自"剌突"的不同構(gòu)象(圖5A)。因為這些剌突常常限定盤菌素家族內(nèi)的結(jié)合位點(VanderKooi等，見上文；Lee等，見上文；Macedo-Ribeiro等，見上文；Pratt等，見上文；Gaskell等，見上文)，Nrpl與Nrp2之間的不相似性可能代表Nrp識別不同結(jié)合配偶的一種方式。盡管Nrpl和Nrp2的b2結(jié)構(gòu)域之間有差異，但是b結(jié)構(gòu)域被壓緊并形成剛性支架(圖5)。結(jié)構(gòu)域間連接處形成深裂，其大致垂直于兩個b結(jié)構(gòu)域的長軸(圖5)。由bl的134:P5環(huán)和b2的135:P6環(huán)創(chuàng)建的此裂由許多帶正電荷的殘基圍繞，基于在大鼠Nrpl上進行的誘變實驗(VanderKoo等，見上文)，這代表了Nrp的肝素結(jié)合位點。兩種人Nrp的結(jié)構(gòu)中也都存在正電片(圖5B)。VEGF165的C-端結(jié)構(gòu)域(也稱作VEGF55)(Fairbrother等，Structure6,637-48(1998))也含有肝素結(jié)合位點。因為肝素將blb2對VEGF服的親和力提高多達100倍(Mamluk，R.等，JBiolChem277,24818-25(2002);Fuh，G.等，JBiolChem275，26690-5(2000))，可行的是，Nrp利用肝素來募集VEGF165至此區(qū)域。在此肝素介導(dǎo)的、VEGF^的外顯子7之間的相互作用之外，由外顯子8編碼的VEGFC-端尾(CDKPRRe。。H)能直接結(jié)合Nrp。在與促吞噬肽(VanderKooi等，見上文)(即VEGF尾的一種四肽模擬物(TKPRc固)(vonWronski，M.A.等，JBiolChem281,5702-10(2006)))形成的復(fù)合物中的大鼠Nrpl-blb2晶體結(jié)構(gòu)中，C-端精氨酸緊密擠入由來自bl結(jié)構(gòu)域保守"剌突"的殘基創(chuàng)建的酸性溝中。在我們的數(shù)種結(jié)構(gòu)中，包括所有三種Fab復(fù)合物，來自對稱相關(guān)分子的C-端殘基(組氨酸)占據(jù)促吞噬肽的同一酸性袋(圖S4)。為了進一步細化涉及VEGF結(jié)合的潛在殘基，檢查了blb2表面上Nrp殘基的表面保守性(圖5C)。兩個連續(xù)片在十二種Nrpl和Nrp2蛋白質(zhì)中是保守的(圖S3)。這些位點之一直接定位至促吞噬肽結(jié)合位點，而第二個位點包括肝素結(jié)合片邊緣上的殘基，提示Nrp與VEGF之間的相互作用涉及另外的面積。在Nrpl-bl/抗NrplB_Fab復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)(圖5D)中，F(xiàn)ab接觸位于兩個推定VEGF結(jié)合位點之間且與促吞噬肽結(jié)合裂部分交疊的表位。此VEGF阻斷性抗體的表位是不常見的，只涉及來自CDRLI和H3的殘基。平均而言，F(xiàn)ab/抗原界面埋藏1680入2的溶劑暴露表面(LoConte等，JMolBiol285，2177-98(1999))，然而在Nrpl-bl/Fab界面處僅遮蔽了900A^雖然所述界面較小，但是抗NrplB以0.2nM的親和力緊密結(jié)合Nrpl(Liang等，見上文；Pan等，見上文)。VEGF和Sema3A不競爭Nrp結(jié)合在本發(fā)明的Nrp/Fab晶體結(jié)構(gòu)中，阻斷VEGF和腦信號蛋白結(jié)合的結(jié)合表位相距65A且位于Nrp的對邊上(圖S5)。數(shù)項研究報告了VEGF和腦信號蛋白競爭細胞表面結(jié)合且此競爭涉及bl結(jié)構(gòu)域上部分交疊的結(jié)合位點(Gu等，見上文；Miao，H.Q.等，JCellBiol146,2177-98(1999);Narazaki，M.和Tosato，G.，Blood107，3892-901(2006))。由于VEGF165和第3類腦信號蛋白的羧基尾都富含堿性殘基，提示這些尾可能競爭由b1結(jié)構(gòu)域中的"剌突"創(chuàng)建的負電溝(VanderKooi等，見上文；Lee等，見上文)。最近的blb2/促吞噬肽晶體結(jié)構(gòu)鑒定了VEGF^尾可能占據(jù)此結(jié)合位點。我們先前已經(jīng)顯示了抗NrplB不拮抗Sema3A介導(dǎo)的來自背根神經(jīng)節(jié)(DRG)的軸突的塌陷(Liang等，見上文；Pan等，見上文)，提示Sema3的C-端尾不結(jié)合同一條溝。先前的競爭實驗(Gu等，見上文；Miao等，見上文；Narazaki等，見上文)采用在蛋白質(zhì)的C端含有異源標簽(諸如堿性磷酸酶)的VEGF和腦信號蛋白。有可能的是，所觀察到的競爭是來自所述標簽的立體沖突的結(jié)果，而非VEGF與Sema3尾之間的直接競爭。我們檢查了VEGF165拮抗Sema3介導(dǎo)的來自DRG的軸突生長的塌陷的能力。即使在100mM的濃度，VEGF165也不影響Sema3A引起肌動蛋白前行的收回的能力(圖1)。這些數(shù)據(jù)證明了Sema3不與VEGF競爭對bl結(jié)構(gòu)域的結(jié)合，而且腦信號蛋白的所述尾接觸此結(jié)構(gòu)域內(nèi)的不同位點。神經(jīng)氈蛋白二聚化的模型Nrpl和Nrp2能形成同型或異型多聚體，即使沒有配體也行(Takahashi，L.等，Cell99,59-69(1999);Chen，H.等，Neuron21,1283-90(1998);Giger，R.J.等，Neuron21,1079-92(1998);Takahashi等，NatNeurosci1，487-93(1998))，而且雖然神經(jīng)超蛋白復(fù)合物的精確化學(xué)計量尚未確立，但是廣泛推定Nrp在配體結(jié)合后形成同二聚體。當前數(shù)據(jù)顯示c結(jié)構(gòu)域是必需的，但是不足以進行Nrp寡聚化，因為缺少此結(jié)構(gòu)域的截短突變體展示相對于全長ECD降低的多聚化(Takahashi等，Cell99,59-69(1999);Chen等，見上文;Giger等，見上文;Nakamura等，Neuron21，1093-100(1998))。包括ala2和blb2結(jié)構(gòu)域的神經(jīng)氈蛋白構(gòu)建體對有些VEGF同等型具有比只跨越blb2結(jié)構(gòu)域的構(gòu)建體高的親和力(Mamluk，R.等，J.Biol.Chem.277，24818-25(2002);Karpanen，T.等，F(xiàn)ASEBJ20，1462-72(2006);Giger，R.J.等，Neuron25，29-41(2000))，即使ala2結(jié)構(gòu)域不結(jié)合VEGF。因此，可行的是，ala2結(jié)構(gòu)域直接促成Nrp二聚化，并如此通過穩(wěn)定2:2復(fù)合物而增強Nrp與VEGF二聚體之間的相互作用。有趣的是，來自兩種不同晶形的Nrp2-ala2blb2晶體結(jié)構(gòu)(表l)含有由al介導(dǎo)的保守的、結(jié)晶界面。在此二聚體中，al結(jié)構(gòu)域以沿著P7和PS鏈的大致反平行排列方式而排列。該界面埋藏約1200人2的溶劑可及表面積，而且受疏水相互作用控制(圖S5)。有趣的是，已經(jīng)對其它CUB結(jié)構(gòu)域家族成員觀察到相似的二聚體(Romero等，見上文)。然而，通過多角度光散射對三種Nrp2構(gòu)建體(a2blb2，ala2blb2和ala2blb2c)分子量的檢查揭示了所有三種Nrp2構(gòu)建體在溶液中是單體的(數(shù)據(jù)未顯示)。這些數(shù)據(jù)暗示Nrp在溶液中的同二聚化是非常弱的，即使存在MAM結(jié)構(gòu)域也如此，而且受體二聚化可能只在配體結(jié)合時發(fā)生。結(jié)晶Nrp2二聚體的取向提示VEGF結(jié)合的模型。al界面創(chuàng)建鞍形二聚體，寬度約70A(圖6)，大得足以容納尺寸約35X60A的VEGF1Q9二聚體。重要的是，在所述鞍的內(nèi)表面找到了促吞噬肽結(jié)合位點和肝素結(jié)合片。肝素能穩(wěn)定Nrp肝素結(jié)合位點與VEGF之間的相互作用，并進一步促進VEGF尾與bl的"剌突"的結(jié)合。此排列還會能夠容納經(jīng)由VEGF受體結(jié)合域的VEGFR結(jié)合以進行下游信號傳導(dǎo)。因此，雖然al結(jié)構(gòu)域不直接涉及VEGF，但是它們能增強Nrp的VEGF結(jié)合，因為它們促進Nrp二聚化。此二聚化能進一步容納Sema3結(jié)合(圖6)。在Sema3A晶體結(jié)構(gòu)(Antipenko，A.等，Neuron39,589-98(2003))中，兩個"sema"結(jié)構(gòu)域在界面處壓緊在一起。在Nrp結(jié)合時，Sema3A的sema結(jié)構(gòu)域解離以容許與ala2上主要結(jié)合位點的相互作用(Antipenko，etal.，見上文)。在本文所呈現(xiàn)的al介導(dǎo)的Nrp二聚體模型中，兩個推定Sema3A結(jié)合位點位于對邊上，而且遠得足以容納兩個結(jié)合的Sema3分子的大P-螺旋槳(圖6和S5)。本發(fā)明的結(jié)構(gòu)分析提供了NrpECD的VEGF結(jié)合部分(blb2)和腦信號蛋白結(jié)合部分(ala2)二者的第一手詳細圖像?？贵w復(fù)合物(圖3-5)及先前的突變研究(Gu等，見上文；VanderKooi等，見上文)描繪了Nrp上供腦信號蛋白的Sema結(jié)構(gòu)域和VEGF的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合的位點。這些結(jié)構(gòu)為未來的誘變實驗提供了基礎(chǔ)，而且提供了策略來闡明Nrp在與其配體和信號傳導(dǎo)受體VEGF、VEGFR、腦信號蛋白、和叢蛋白形成的復(fù)合物中的結(jié)構(gòu)。另外，本發(fā)明提供的晶體結(jié)構(gòu)和其它信息能夠設(shè)計VEGF和/或腦信號蛋白的拮抗劑和激動劑，而且能在篩選測定法中用于鑒定此類拮抗劑或激動劑。雖然在上文描述中參照某些實施方案例示了本發(fā)明，但是本發(fā)明不限于此。實際上，根據(jù)上面的描述，在本文所顯示和描述之外，本發(fā)明的多種修飾對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的，而且在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。通過述及將整篇說明書中引用的所有參考文獻及其中引用的參考文獻完整收入本文。權(quán)利要求一種由Nrp1b1b2片段形成的晶體，其衍射x射線輻射以生成代表所述片段三維結(jié)構(gòu)的衍射圖樣，該衍射圖樣大致具有晶胞常數(shù)a＝65.9b＝66.7c＝74.7及空間群P212121。F2007800537931C00011.tif,F2007800537931C00012.tif,F2007800537931C00013.tif2.—種由Nrpl^^片段形成的晶體，其衍射x射線輻射以生成代表所述片段三維結(jié)構(gòu)的衍射圖樣，該衍射圖樣大致具有晶胞常數(shù)a=53.2A,b=68.2A,c=66.6A，及空間群P2"3.Nrplbl片段與抑制血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)結(jié)合Nrpl的抗NrplB抗體(YW107.4.87)的Fab片段之間形成的復(fù)合物的晶體，其中所述晶體衍射x射線輻射以生成代表所述復(fù)合物三維結(jié)構(gòu)的衍射圖樣，該衍射圖樣大致具有晶胞常數(shù)3=213A,b=213A，c=45.3A，及空間群H3。4.一種由Nrp2blb2片段形成的晶體，其衍射x射線輻射以生成代表所述片段三維結(jié)構(gòu)的衍射圖樣，該衍射圖樣大致具有晶胞常數(shù)a二36.5A，b=70.5A，c=122A，及空間群5.—種由Nrp2^^片段形成的晶體，其衍射x射線輻射以生成代表所述片段三維結(jié)構(gòu)的衍射圖樣，該衍射圖樣大致具有晶胞常數(shù)a=50.1A，b=193A，c=66.2A，及空間群P2106.Nrp2ala2blb2片段與抑制腦信號蛋白結(jié)合Nrp2的抗泛NrpA抗體的Fab片段之間形成的復(fù)合物的晶體，其中所述晶體其衍射x射線輻射以生成代表所述復(fù)合物三維結(jié)構(gòu)的衍射圖樣，該衍射圖樣大致具有晶胞常數(shù)a=148A,b=106A,c=92.4A，及空間群C2。7.Nrp2ala2blb2片段與抑制腦信號蛋白結(jié)合Nrp2的抗泛NrpA抗體的Fab片段之間形成的復(fù)合物的晶體，其中所述晶體其衍射x射線輻射以生成代表所述復(fù)合物三維結(jié)構(gòu)的衍射圖樣，該衍射圖樣大致具有晶胞常數(shù)a=121A，b=121A,c=203A，及空間群P3221。8.—種抗泛NrpA抗體，其包含圖7中所示輕鏈可變域序列和/或圖8中所示重鏈可變域序列，或其片段。9.一種抗泛NrpAYff68.n抗體Fab片段，其包含圖9A中所示序列。10.—種抗泛NrpAYff68.u.26抗體Fab片段，其包含圖9B中所示序列。11.一種抗Nrp抗體，其與抗泛NrpA抗體競爭結(jié)合Nrp。12.權(quán)利要求11的抗Nrp抗體，其基本上與抗泛NrpA抗體結(jié)合相同表位。13.權(quán)利要求11的抗Nrp抗體，其結(jié)合包含由Nrp2ala2blb2氨基酸序列的氨基酸殘基Y39、Y45、P46、Q47、F72、N73、P74、H75、F76、A133和R138限定的界面至少一部分的表位。14.權(quán)利要求11的抗Nrp抗體，其結(jié)合Nrpl和Nrp2二者。15.權(quán)利要求14的抗Nrp抗體，其具有至少約0.10nM的對Nrpl和Nrp2二者的結(jié)合親和力。16.權(quán)利要求14的抗Nrp抗體，其具有至少約0.15nM的對Nrpl和Nrp2二者的結(jié)合親和力。17.權(quán)利要求14的抗Nrp抗體，其具有至少約0.20nM的對Nrpl和Nrp2二者的結(jié)合親和力。18.權(quán)利要求14的抗Nrp抗體，其具有至少約0.25nM的對Nrpl和Nrp2二者的結(jié)合親和力。19.權(quán)利要求14的抗Nrp抗體，其具有至少約0.30nM的對Nrpl和Nrp2二者的結(jié)合親和力。20.權(quán)利要求14的抗Nrp抗體，其阻斷Sema3結(jié)合Nrpl和Nrp2二者。21.權(quán)利要求20的抗Nrp抗體，其不阻斷VEGF結(jié)合Nrpl或Nrp2。22.權(quán)利要求20或權(quán)利要求21的抗Nrp抗體，其在體外抑制腦信號蛋白生物學(xué)活性。23.權(quán)利要求20或權(quán)利要求2的抗Nrp抗體，其在體內(nèi)抑制腦信號蛋白生物學(xué)活性。24.—種制備腦信號蛋白拮抗劑的方法，包括設(shè)計結(jié)合包含由Nrp2aW2氨基酸序列的氨基酸殘基Y39、Y45、P46、Q47、F72、N73、P74、H75、F76、A133和R138限定的界面至少一部分的位點的分子，合成所述化合物，并證實所述化合物阻斷腦信號蛋白結(jié)合Nrpl和Nrp2。25.權(quán)利要求24的方法，其中所述拮抗劑不干擾VEGF結(jié)合Nrpl或Nrp2。26.權(quán)利要求25的方法，進一步包括證實所述拮抗劑不干擾VEGF結(jié)合Nrpl或Nrp2的步驟。27.權(quán)利要求25的方法，進一步包括證實所述拮抗劑不干擾VEGF生物學(xué)活性的步驟。28.權(quán)利要求24的方法，其中所述拮抗劑選自抗體，抗體片段，結(jié)合性多肽，肽和非肽小分子。29.權(quán)利要求28的方法，其中所述拮抗劑是抗體或抗體片段。30.權(quán)利要求29的方法，其中所述抗體片段選自Fab，F(xiàn)ab'，F(xiàn)(ab')2，scFv，(scFv)2，dAb，線性抗體，單鏈抗體分子，微型抗體，雙抗體和由抗體片段形成的多特異性抗體。31.—種制備VEGF拮抗劑的方法，包括使用自Nrplbl片段與抗NrplB抗體(YW107.4.87)的Fab片段之間的復(fù)合物形成的晶體衍生的三維結(jié)構(gòu)來設(shè)計結(jié)合包含所述NrplB抗體結(jié)合的表位至少一部分的位點的分子，合成所述化合物，并證實所述化合物抑制VEGF結(jié)合Nrpl，其中所述晶體衍射x射線輻射以生成代表所述復(fù)合物三維結(jié)構(gòu)的衍射圖樣，該衍射圖樣大致具有晶胞常數(shù)a二213A，b=213A，c=45.3A，及空間群H3。32.權(quán)利要求31的方法，其中所述拮抗劑不干擾腦信號蛋白結(jié)合Nrpl。33.權(quán)利要求32的方法，進一步包括證實所述拮抗劑不干擾腦信號蛋白結(jié)合Nrpl的步驟。34.權(quán)利要求31的方法，其中所述拮抗劑抑制VEGF生物學(xué)活性。35.權(quán)利要求34的方法，進一步包括證實所述拮抗劑抑制VEGF生物學(xué)活性的步驟。36.權(quán)利要求35的方法，其中所述拮抗劑抑制血管重構(gòu)。37.權(quán)利要求35的方法，其中所述拮抗劑選自下組抗體，抗體片段，結(jié)合性多肽，肽和非肽小分子。38.權(quán)利要求37的方法，其中所述拮抗劑是抗體或抗體片段。39.權(quán)利要求38的方法，其中所述抗體片段選自Fab，F(xiàn)ab'，F(xiàn)(ab')2，scFv，(scFv)2，dAb，線性抗體，單鏈抗體分子，微型抗體，雙抗體和自抗體片段形成的多特異性抗體。40.—種用于治療癌癥的方法，包括對有需要的哺乳動物受試者施用有效量的通過權(quán)利要求31的方法制備的VEGF拮抗劑。41.權(quán)利要求40的方法，其中所述癌癥選自下組乳腺癌，結(jié)腸直腸癌，非小細胞肺癌，非何杰金氏淋巴瘤(NHL)，腎癌，前列腺癌，肝癌，頭頸癌，黑素瘤，卵巢癌，間皮瘤和多發(fā)性骨髓瘤。42.權(quán)利要求41的方法，其中所述治療進一步包括第二治療劑。43.權(quán)利要求42的方法，其中所述第二治療劑選自下組抗血管發(fā)生劑，抗腫瘤組合物，化療劑和細胞毒劑。44.權(quán)利要求43的方法，其中所述抗血管發(fā)生劑是別的VEGF拮抗劑。45.權(quán)利要求44的方法，其中所述別的VEGF拮抗劑是抗hVEGF抗體或其片段。46.權(quán)利要求45的方法，其中所述抗hVEGF抗體能夠與抗體A4.6.1結(jié)合相同的VEGF表位。47.權(quán)利要求45的方法，其中所述抗hVEGF抗體是bevaciz麗b或ranibiz麗b。48.權(quán)利要求42的方法，其中所述第二治療劑是選自下組的受體酪氨酸激酶抑制劑vatalanib(PTK787)，erlotinib(TARCEVA),0SI-7904,ZD6474(ZACTIMA),ZD6126(ANG453)，ZD1839,sunitinib(SUTENT),semaxanib(SU5416)，AMG706,AG013736，Imatinib(GLEEVEC⑧)，MLN-518，CEP-701，PKC-412，L即atinib(GSK572016)，VELCADE'AZD2171，sorafenib(NEXAVAR),XL880和CHIR_265。全文摘要本發(fā)明提供了單獨的或與抗神經(jīng)氈蛋白抗體復(fù)合的神經(jīng)氈蛋白1(Nrp1)和神經(jīng)氈蛋白2(Nrp2)片段的晶體結(jié)構(gòu)，及其使用方法。本發(fā)明進一步提供了抗Nrp抗體及其治療應(yīng)用的方法。文檔編號C07K14/71GK101743253SQ200780053793公開日2010年6月16日申請日期2007年5月17日優(yōu)先權(quán)日2007年5月17日發(fā)明者克里斯琴·威斯曼,吳雁,布倫特·A·阿普爾頓申請人:健泰科生物技術(shù)公司