專利名稱：植物根部特異表達(dá)Bt-cry6A晶體蛋白在根結(jié)線蟲防治中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物病蟲防治技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種由根部特異啟動子DNA-^ promoter驅(qū)動的Bt_cry6A基因植物表達(dá)載體及其在根結(jié)線蟲防治和研究中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
根結(jié)線蟲是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上危害最為嚴(yán)重的植物寄生線蟲之一，其適應(yīng)性強、傳播途徑多樣、寄主范圍包括單子葉與雙子葉草本或木本植物等2000多種植物。近年來，隨著對線蟲侵染方式，植物自身抗病防御體系研究的不斷深入，以及分子生物學(xué)理論和生物工程技術(shù)的不斷發(fā)展，抗線蟲基因的分子遺傳操作技術(shù)已趨向成熟，為利用植物自身防御體系及線蟲自身生理生化特點，通過基因工程手段，建立一個具有高效、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的線蟲綜合控防策略成為可能(Atkinson HJ, Urwin PE, McPherson MJ. Engineering plantsfor nematode resistance. Annual Review of Phytopathology,2003. 41 (I):615-639.；Williamson VMj Hussey RS. Nematode pathogenesis and resistance in plants.Plant Cell，1996,8 :1735-1745 ;Williamson VM. Plant nematode resistance genes.Current Opinion in Plant Biology，1999，2:327-331 ;Wi11iamson VMj GleasonCA. Plant-nematode interactions.Current Opinion in Plant Biology，2003，6 :327-333)。
在過去的植物基因工程研究中，人們常使用組成型啟動子表達(dá)外源基因，在這類啟動子的控制下，外源基因在轉(zhuǎn)基因植物所有的細(xì)胞以及整個發(fā)育階段都表達(dá)。然而外源基因在受體植物體內(nèi)持續(xù)、高效地表達(dá)，可能會改變植物的某些性狀，從而對植物生長發(fā)育產(chǎn)生不利影響，嚴(yán)重地會導(dǎo)致植株死亡；另外，這種持續(xù)的組成型表達(dá)，從植物能量消耗角度來講也是一種浪費，還可能帶來食品安全性問題。嚴(yán)格地講，組織特異性的啟動子更適用于生產(chǎn)外源蛋白，因為這些蛋白可以集中表達(dá)在植物的某些部位從而更便于產(chǎn)物的加收。此外，根是植物生長發(fā)育的重要器官，也是根結(jié)線蟲侵染植物的主要途徑，研究根特異性啟動子對根結(jié)線蟲的防治具有重要意義。所以從植物生長發(fā)育和經(jīng)濟(jì)有效的角度以及抗病性的研究方面考慮，根組織特異性啟動子也具有研究和應(yīng)用價值。關(guān)翠平分離鑒定TYLCCNVY10分子上DNAP Cl基因啟動子(GeneBank登錄號A3J19675)，組織化學(xué)檢測表明，該啟動子能夠驅(qū)動gus基因在轉(zhuǎn)基因植株的根部及韌皮部細(xì)胞特異性表達(dá)，是花椰菜花葉病毒(CMV) 355 啟動子活性的 10 16% (Cuiping Guan, Xueping Zhou, Phloemspecific promoter from a satellite associated with a DNAvirus， Virus Research115(2006) 150-157)。產(chǎn)芽孢的蘇蕓金桿菌是一種能夠殺死昆蟲的土壤微生物，這種微生物分泌兩種蛋白，一種是外毒素，另一種是內(nèi)毒素。外毒素是由vip3a基因編碼，在營養(yǎng)生長期從菌體中分泌出來，研究表明P -外毒素對線蟲有效(Devidas and Rehberger, 1992)(Devidas P. and Rehberger L.A. The effects of exotoxin (Thuringiensin) fromBacillus thuringiensis on Meloidogyne incognita and Caenorhabditis elegans.Plant and Soil. 1992，145 (I) : 115-120.)。第二類毒素為 S -內(nèi)毒素，是由 cry 基因族編碼，在孢子產(chǎn)生時以包涵體的形式產(chǎn)生的。cry5B編碼的蛋白對秀麗線蟲具有毒性，且線蟲的中腸受到了破壞，對于雄蟲、二齡幼蟲和不育的突變體具有致命的效果；秀麗線蟲的突變體對cry5B產(chǎn)生了抗性，對cry6A敏感，這一點表明線蟲與蛋白的結(jié)合區(qū)域具有一定的特異性(Marroquin L. D. , Elyassnia D. , Griffitts J. S. , FeitelsonJ.S.and Aroian R. V. Bacillus thuringiensis(Bt) toxin susceptibility andisolation of resistance mutants in the nematode Caenorhabditis elegans.Genetics. 2000, 155 (4) : 1693-1699)。Marroquin研究表明了這種蛋白在根中的表達(dá)對線蟲具有有效的防治作用(Marroquin L. D. , Elyassnia D. , Griffitts J. S. , FeitelsonJ.S. and Aroian R. V. Bacillus thuringiensis(Bt) toxin susceptibility and isolationof resistance mutants in the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 2000, 155:1693-1699)。目前，利用Bt防治植物寄生線蟲的研究很少，尤其是在根部表達(dá)Bt殺蟲基因，迄今沒有這方面的報道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明根據(jù)上述領(lǐng)域存在的空白和根結(jié)線蟲防治的需要，提供一種由根部特異啟動子DNAP驅(qū)動Bt-cry6A基因超表達(dá)的植物表達(dá)載體及該載體用于防治根結(jié)線蟲的方法。用于在植物根部特異表達(dá)Bt_cry6`A基因的重組表達(dá)載體pBP_bt06，骨架載體為pBI121,啟動子為DNA 0 promotor,外源基因為序列為SEQ ID No. 4所示的優(yōu)化Bt_cry6A基因。轉(zhuǎn)入有上述重組表達(dá)載體的菌株。所述菌株指轉(zhuǎn)入有pBP_bt06的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105。一種研究蘇云芽孢桿菌基因功能的新方法，其特征在于，將上述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌中，然后轉(zhuǎn)化植物，通過觀察轉(zhuǎn)基因植株，確定此基因?qū)ΩY(jié)線蟲的防治效果。一種獲得抗根結(jié)線蟲的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟(I)構(gòu)建含有蘇云金芽孢桿菌的Bt_cry6A基因的根部特異性重組表達(dá)載體，(2)將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到宿主植物中，篩選能夠表達(dá)Bt_cry6A蛋白的陽性轉(zhuǎn)化子。所述重組載體是pBP_bt06。所述將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到番茄中，篩選能夠表達(dá)Bt-Cry6A蛋白的陽性轉(zhuǎn)化子，包括如下步驟(I)準(zhǔn)備植物轉(zhuǎn)化外植體，(2)制備農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液，(3)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液侵染外植體，然后共培養(yǎng)，
(4)對共培養(yǎng)的外植體進(jìn)行選擇培養(yǎng)以分化愈傷組織，(5)生根培養(yǎng)分化的愈傷組織獲得轉(zhuǎn)基因植株。所述準(zhǔn)備植物轉(zhuǎn)化外植體包括外植體預(yù)培養(yǎng)，指將取自番茄幼苗的外植體放置在MS+50 u g/ u I乙酰丁香酮的固體培養(yǎng)基上，光照預(yù)培養(yǎng)2天，所述共培養(yǎng)指采用MS+100ii g/ii I乙酰丁香酮固體培養(yǎng)基，避光培養(yǎng)2天。所述選擇培養(yǎng)指采用MS+2mg/L 6BA+0. 2mg/L IAA+300mg/L羧芐青霉素+50 y g/ml卡那霉素+IOii g/ml玉米素,26_28°C,光照培養(yǎng)16h,所述生根培養(yǎng)指長到2 3厘米的分化良好的愈傷組織轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基MS+0. 25mg/LIAA+25 u g/ml 卡那霉素 +200 u g/ml 頭孢霉素上。
所述制備農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液指采用1/2濃度的液體MS + 200 u g/ U I的乙酰丁香酮為
懸浮劑懸浮菌體。本發(fā)明提供優(yōu)化的Bt_Cry6A核苷酸序列。為使Bt_Cry6A基因其更適合于在植物中表達(dá)，本發(fā)明對表達(dá)Bt_Cry6A晶體蛋白Seq ID No2的初始核苷酸序列Seq ID No3的密碼子進(jìn)行優(yōu)化并合成。合成后的核苷酸序列Seq ID No. 4。本發(fā)明提供一種由根部特異啟動子驅(qū)動Bt基因超表達(dá)的植物載體，其特點就是在骨架載體中插入有特異性啟動子和BT基因，關(guān)于骨架載體，本領(lǐng)域技術(shù)人員可能選出很多用于超表達(dá)載體構(gòu)建的常規(guī)骨架載體，構(gòu)建方法也是替換掉原有的組成型啟動子，插入Bt_cry6A 基因。本發(fā)明優(yōu)選骨架載體為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的表達(dá)載體，農(nóng)桿菌能夠攜帶目的基因轉(zhuǎn)移到多種生物體內(nèi)，除了自然界的植物之外，還包括酵母、絲狀真菌以及人的細(xì)胞等。與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)化方法相比，AMT技術(shù)轉(zhuǎn)化效率高且遺傳穩(wěn)定性好的優(yōu)點，因此，構(gòu)建成農(nóng)桿菌介導(dǎo)的超表達(dá)載體有利于使作用片段轉(zhuǎn)入到較多種類的宿主中使其表達(dá)目的基因，用于毒殺根結(jié)線蟲。本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，以pBI121為骨架載體，以DNA-P promotor基因中的如Seq ID No.1所示的全長及Bt_cry6A基因中的如Seq ID No. 4所示的全長構(gòu)建了超表達(dá)載體 pBP_bt06。本發(fā)明還提供了將構(gòu)建的超表達(dá)載體pBP-bt06轉(zhuǎn)入到番茄中獲得轉(zhuǎn)基因番茄的優(yōu)選具體實施方式
，經(jīng)驗證獲得了根部特異性表達(dá)Bt-cry6A蛋白的轉(zhuǎn)基因植株。經(jīng)鑒定該轉(zhuǎn)基因植株的Bt-cry6A蛋白基因只在根部表達(dá)，在植物地上部分并不表達(dá)。 本發(fā)明的實施例中，將構(gòu)建的超表達(dá)載體pBP-bt06轉(zhuǎn)入到番茄中，獲得了可用于根部特異性表達(dá)Bt-cry6A蛋白的轉(zhuǎn)基因植株。經(jīng)鑒定在特異基因只在根部表達(dá)，在植物地上部分并不表達(dá)。番茄是受根結(jié)線蟲危害最嚴(yán)重的蔬菜作物之一，也是植物分子生物學(xué)與生物技術(shù)研究的模式作物，具有較好的基因組信息研究、突變體材料；侵害番茄的根結(jié)線蟲有7種以上，其中主要是南方根結(jié)線蟲。與煙草和擬南芥相比，以番茄為受體材料，對線蟲的抗性研究更具有實際意義。本發(fā)明將Bt-cry6A基因轉(zhuǎn)入番茄中，對轉(zhuǎn)基因番茄植株接種南方根結(jié)線蟲，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株的根結(jié)和卵塊數(shù)量顯著降低。為番茄提供了可靠有效的線蟲防治策略。本發(fā)明將空載體以相同方法轉(zhuǎn)入番茄中作為參照，將2齡幼蟲接種到T1代植株，45天后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)本發(fā)明的表達(dá)Bt-cry6A基因植株的根結(jié)和卵塊數(shù)量顯著低于對照組植株，并且轉(zhuǎn)空載體植株的根結(jié)和卵塊數(shù)量與非轉(zhuǎn)基因植物無差別。充分說明Bt-cry6A基因可抑制線蟲的發(fā)育與寄生，表明此發(fā)明在根結(jié)線蟲的防治中具有重要的應(yīng)用價值。
圖1.載體pBI121結(jié)構(gòu)2 目的基因DNAP promoter結(jié)構(gòu)3 載體pBP121結(jié)構(gòu)4 目的基因Bt_cry6A結(jié)構(gòu)示意5.載體pBP_bt06構(gòu)建流程6.酶切鑒定重組載體pBP_bt067. T0代轉(zhuǎn)基因番茄植株靶標(biāo)基因在葉片和根尖的PCR檢測圖8.轉(zhuǎn)基因Ttl代植株的Southern雜交檢測圖9. T0代轉(zhuǎn)基因番茄植株RT-PCR檢測圖10.轉(zhuǎn)基因番茄的根部接種線蟲45天后的根部照片A :轉(zhuǎn)基因植株的根部；B :轉(zhuǎn)空載體植株的根部；C :對照植株的根部
具體實施例方式以下通過試驗及數(shù)據(jù)具體說明本發(fā)明的實施和其取得的有益效果。生物材料南方根結(jié)線蟲(Meloidogyne incognita),本實驗室保存。根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株 EHA105,本實驗室保存。植物材料番爺(SolanumIycopersicum),品種 Moneymaker (在 MAGDALENAROSSI, FIONA L. G0GGIN, STEPHEN B. MILLIGAN, ISG0UHI KAL0SHIAN, DIANE E. ULLMAN, ANDVALERIE M. WILLIAMSON. The nematode resistance gene Mi of tomato confersresistance against the potato aphid. Proc. Natl. Acad. Sc1. USA:95(1998):9750 -9754.中記載)，本實驗保存。骨架載體pBI121為已知載體(見Rugang Chen, Hanxia Li, Liying Zhang, JunhongZhang, Jinghua Xiao, Zhibiao Ye. CaMi, a root—knot nematode resistance gene fromhot pepper(Capsium annuum L.) confers nematode resistance in tomato. Plant CellRep (2007) 26:895 - 905),由本實驗室保存。特異啟動子DNA-P promotor 基因(Cuiping Guan, Xueping Zhou, Phloemspecific promoter from a satellite associated with a DNA virus, Virus Research115(2006) :150 - 157)，由浙江大學(xué)周雪平教授惠贈。蘇云芽孢桿菌目的基因Bt_cry6A由本實驗合成。申請人:聲明，以上生物材料均在申請人實驗室有保存，可向公眾發(fā)放用于驗證試驗。主要儀器和試劑儀器冷凍離心機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱、 冰箱、電子天平、高壓滅菌鍋、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、水浴鍋、移液器、勻漿器、離心管、槍頭、燒杯和PH計等。試劑柱式DNA小量抽提試劑盒和柱式DNA膠回收試劑盒、Taq DNA聚合酶、DNAMarker2Kplus和克隆所用的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞等均購自全式金生物公司；TA克隆試劑盒、限制性內(nèi)切酶Hindlll、BamH1、Xba I和Sac I等均購自Takara生物公司。MS培養(yǎng)基粉末購自SIGMA公司。TAE 緩沖液(5 0X ):Tris 堿 242g，冰醋酸 57.1ml,0. 5mol/L EDTA (pH8. 0) 100ml。LB 培養(yǎng)基酵母粉 5g/L，蛋白胨 10g/L，NaCl 10g/L。MS+AS 卡那霉素溶于水中，配制濃度為10mg/ml,儲存于_20°C ；氨芐青霉素溶于水中，配制濃度為10mg/ml，儲存于_20°C ；利福平溶于甲醇中，配制濃度為10mg/ml，儲存于_20°C，使用時稀釋為34iig/ml ；頭孢霉素溶于水中，200mg/ml,儲存于_20°C,使用時稀釋為400 ii g/ml。乙酰丁香酮(AS) :100禮，用無水乙醇溶解，放置于_20°C。實施例1 :構(gòu)建根部特異啟動子DNA- ^驅(qū)動的植物表達(dá)載體pBP-121載體pBP-121的構(gòu)建，主要以常規(guī)載體pB1-121為骨架(圖1 )，對其T-DNA區(qū)加以改造，用限制性內(nèi)切酶Hindlll、BamH I將的35S啟動子片段雙酶切切掉，回收載體大片段(約14kb);同時，用同樣的內(nèi)切酶酶切帶有目的基因DNA P promotor的T載體，回收目的基因片段(SEQ ID No.1)。而DNAP promotor片段(圖2)的粘性末端和pB1-121線狀載體的粘性末端恰好匹配，連接后構(gòu)建植物表達(dá)載體PBP-121 (圖3)。酶切鑒定陽性克隆后測序確認(rèn)。實施例2 :構(gòu)建根部特異啟動子DNA-P驅(qū)動Bt-cry6A基因的超表達(dá)植物載體一pBP_bt06載體PBP_bt06的構(gòu)建，主要以構(gòu)建的含根部特異啟動子的載體pBP-121為骨架，對其T-DNA區(qū)加以改造，用限制性內(nèi)切酶Xba I和Sac I將啟動子下段的GusA基因切掉，電泳回收載體大片段(約13kb);而線狀載體和外源合成基因核苷酸序列如SEQ ID No. 4的粘性末端恰好匹配，連接后構(gòu)建植物表達(dá)載體pBP-bt06。酶切鑒定陽性克隆后測序確認(rèn)，外源合成基因核苷酸序列如SEQ ID No. 4。構(gòu)建流程示意圖見圖5。構(gòu)建過程中得到的載體均轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a菌株，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，并用Xbal/SacI雙酶切檢測其正確性(圖
6)。經(jīng)檢測載體構(gòu)建成功，用于后續(xù)實驗。實施例3.獲得抗線蟲轉(zhuǎn)基因植株本實驗以根癌農(nóng)桿菌為介導(dǎo),把裝載有Bt_cry6A基因的pBP_bt06轉(zhuǎn)化到番爺中。通過優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件，提供了成功將pBP-bt06轉(zhuǎn)化到番茄中，并獲得轉(zhuǎn)基因植株的方法。3.1根癌農(nóng)桿菌的培養(yǎng)1.將根癌農(nóng)桿菌劃線接種在LB培養(yǎng)基上，28 °C恒溫培養(yǎng)2_3天；2.挑取單個菌落接種于基本培養(yǎng)基中，28°C，200rpm振蕩培養(yǎng)24h ;3.在離心管中收集菌體，加入液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基，使0D600調(diào)節(jié)至0. 20左右，28°C，200rpm振蕩培養(yǎng)6h，0D600升高到0. 4左右時即可停止。
3. 2農(nóng)桿菌感受態(tài)制作(I)挑取農(nóng)桿菌EHA106單菌落，接種于20ml液體LB培養(yǎng)基中(含有50mg/L的利福平)，28 0C，200rpm 培養(yǎng) 48h ；(2)轉(zhuǎn)接500 u I搖培的EHA106至50ml液體LB (含有50mg/L的利福平)培養(yǎng)基中，28 °C，200rpm培養(yǎng)至0D600值為0. 6左右；(3)將菌液冰浴 30min, 4°C, 5000rpm 離心 IOmin,棄上清；(4)用50ml預(yù)冷的10%的甘油懸浮菌體,4°C, 5000rpm,離心IOmin,棄上清,收集菌體；(5)用25ml預(yù)冷的10%的甘油懸浮菌體,4°C, 5000rpm,離心IOmin,棄上清,收集菌體；(6)用IOml預(yù)冷的10%的甘油懸浮菌體,4°C, 5000rpm,離心IOmin,棄上清,收集菌體；(7)用l_2ml預(yù)冷的10%的甘油懸浮菌體，分裝50 U I/管，液氮中速凍后_80°C保存。3. 3電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌1.冰上融化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞50 ii I;2.將I ill pBP-bt06和pBP-121質(zhì)粒分別加入到50 U I農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈混勻，在離心管中混勻后轉(zhuǎn)移到電擊杯中，冰浴30s-60s ；3.將電擊杯放在適當(dāng)?shù)奈恢?，按住電擊按鈕進(jìn)行電擊；4.加500 ill不含任何抗生素的LB液體培養(yǎng)基，28 °C，220rpm,振蕩培養(yǎng)3h，活化菌體；5.用滅菌槍頭將菌液混勻，吸取100 U I均勻涂于LB固體培養(yǎng)基(卡那50mg/L和利福平50mg/L)上，28°C培養(yǎng)48h。6.提取農(nóng)桿菌質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定或通過菌液PCR進(jìn)行檢測。3. 4侵染菌液的制備1.取轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌劃線接種于LB固體培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)48h，至單菌落出現(xiàn)；2.挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，28°C，220rpm，振蕩培養(yǎng)，0D600達(dá)到0. 6左右時終止；3. 5000rpm離心IOmin,棄上清,沉淀物即為收集的菌體；4.將菌體用1/2濃度的液體MS培養(yǎng)基洗滌兩遍。5.為提高農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化效率，加懸浮液懸浮菌體，懸浮液為1/2濃度的液體MS加A 200 u g/ u I的乙酰丁香酮(AS),懸浮后立即用于侵染。
3. 5番茄轉(zhuǎn)化外植體的準(zhǔn)備1.番爺種子用無菌水浸泡洗漆兩遍。2.用70%的乙醇浸泡番茄種子2min。3.棄去乙醇，加無菌水洗滌兩次。4.棄去無菌水，用20%的次氯酸鈉消毒15min。輕搖容器，加大種子與溶液的接觸。5.棄去次氯酸鈉，用無菌水漂洗5-6次后吸干多余水分。6.將種子移入裝有MS培養(yǎng)基的三角瓶中，每瓶20 30粒，均勻擺放。
7. 26-28°C避光培養(yǎng)出芽后光照培養(yǎng)6_7天至子葉張開角度120度。3. 6番茄轉(zhuǎn)化外植體的預(yù)培養(yǎng)將待切番茄幼苗放在牛皮上，用鑷子夾住幼苗胚軸部分，使兩片子葉重疊、平鋪于培養(yǎng)皿底部，將子葉頂端切去，然后在靠近葉柄部位切一刀，切下方形子葉塊；胚軸截為小段。放置在MS+50 ii g/ill AS培養(yǎng)基上，光照，預(yù)培養(yǎng)2天。3.7番茄外植體轉(zhuǎn)化共培養(yǎng)1.將預(yù)培養(yǎng)2d的子葉和胚軸從培養(yǎng)皿中移出，放入盛有農(nóng)桿菌菌液的錐形瓶中，輕輕搖蕩，侵染lOmin，控制侵染時間，以免時間較長農(nóng)桿菌過量，污染外植體，同時時間長外植體容易褐化，時間短則侵染效率低。2.取出后用液體MS沖洗后置無菌濾紙上吸干，轉(zhuǎn)入MS+lOOiig/iUAS共培養(yǎng)基平皿。3.避光，共培養(yǎng)2天。3.8番茄轉(zhuǎn)化外植體選擇分化將共培養(yǎng)結(jié)束的外植體轉(zhuǎn)到篩選培養(yǎng)基上(MS+2mg/L 6BA+0. 2mg/L IAA+300mg/L羧節(jié)青霉素+50 V- g/ml卡那霉素+10 V- g/ml玉米素),26-28°C, 16h光照培養(yǎng),分化綠色愈傷組織。3. 9番茄轉(zhuǎn)化繼代每2 周繼代一次，棄去愈傷生長不良者，將苗移入新的培養(yǎng)基中。待小苗長到2-3cm，再轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上(MS+0. 25mg/LIAA+25 u g/ml卡那霉素+200 y g/ml頭孢霉素)。待小苗長出4-5條根，并有大量側(cè)根生出時進(jìn)行煉苗，待根系發(fā)達(dá)后移栽到滅菌的土中。待苗長到四片葉時，取根和葉片進(jìn)行鑒定。3. 10植物基因組DNA提取1.在50ml離心管中加入20ml提取緩沖液I，60°C水浴預(yù)熱。2.分別取番茄新鮮葉片和根尖，在研缽中加液氮磨成粉狀后至于1. 5ml離心管中，立即加入預(yù)熱的提取緩沖液I，劇烈搖動混勻，60°C水浴保溫30-60分鐘(時間長，DNA產(chǎn)量高)，不時搖動。3.加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液，顛倒混勻(需帶手套，防止損傷皮膚)，室溫下靜置5-10分鐘，使水相和有機(jī)相分層(必要時可重新混勻)。4.室溫下5000rpm離心5分鐘。5.仔細(xì)移取上清液至另一 50ml離心管，加入I倍體積異丙醇，混勻，室溫下放置片刻即出現(xiàn)絮狀DNA沉淀。6.在1.5ml印pendorf中加入Iml TE。用鉤狀玻璃棒撈出DNA絮團(tuán)，在干凈吸水紙上吸干，轉(zhuǎn)入含TE的離心管中，DNA很快溶解于TE。7.如DNA不形成絮狀沉淀，則可用5000rpm離心5分鐘，再將沉淀移入TE管中。這樣收集的沉淀，往往難溶解于TE，可在60°C水浴放置15分鐘以上，以幫助溶解。8.將DNA溶液3000rpm離心5分鐘，上清液倒入干凈的5ml離心管。9.加入 5 U I RNaseAdO U g/u I), 37 °C 10 分鐘，除去 RNA (RNA 對 DNA 的操作、分
析一般無影響，可省略該步驟)。10.加入1/10體積的3mol/LNaAc及2X體積的冰乙醇混勻，_20°C放置20分鐘左右，DNA形成絮狀沉淀。11.用玻棒撈出DNA沉淀，70%乙醇漂洗，再在干凈吸水紙上吸干。12.將 DNA 重溶解于 Iml TE, -20 貯存。13.取2 ill DNA樣品在0. 7%Agarose膠上電泳，檢測DNA的分子大小。同時取15 ill稀釋20倍，測定0D260/0D280，檢測DNA含量及質(zhì)量。3. 11轉(zhuǎn)基因番茄植株的PCR檢測以具有卡那抗性的轉(zhuǎn)基因番茄植株新鮮葉片和根尖提取的DNA分別作PCR擴(kuò)增模板。利用下列特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根尖DNA能擴(kuò)增出特異條帶的植株即初步鑒定為陽性植株，由于是根部特異表達(dá)，因此葉片部分無特異條帶。擴(kuò)增引物序列如下檢測Bt_cry6A基因的特異引物BT6F1 TCTAGAATGATTATCGATBT6R1 GGATCCTTAGTTGTTGTAPCR反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.用于在植物根部特異表達(dá)Bt-cry6A基因的重組表達(dá)載體pBP_bt06，骨架載體為pBI121,啟動子為DNA β promotor,外源基因為序列為SEQ ID No. 4所示的優(yōu)化Bt_cry6A基因。
2.轉(zhuǎn)入有權(quán)利要求1所述重組表達(dá)載體的菌株。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菌株，指轉(zhuǎn)入有pBP-bt06的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens) EHA 105。
4.一種研究蘇云芽孢桿菌基因功能的新方法，其特征在于，將權(quán)利要求1所述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌中，然后轉(zhuǎn)化植物，通過觀察轉(zhuǎn)基因植株，確定此基因?qū)ΩY(jié)線蟲的防治效果。
5.一種獲得抗根結(jié)線蟲的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟 (I)構(gòu)建含有蘇云金芽孢桿菌的Bt-cry6A基因的根部特異性重組表達(dá)載體， (2 )將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到宿主植物中，篩選能夠表達(dá)Bt-cry6A蛋白的陽性轉(zhuǎn)化子， 所述重組載體是pBP-bt06。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，所述將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到番茄中，篩選能夠表達(dá)Bt-06蛋白的陽性轉(zhuǎn)化子，包括如下步驟 (1)準(zhǔn)備植物轉(zhuǎn)化外植體， (2)制備農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液,所述農(nóng)桿菌指轉(zhuǎn)入有pBP-bt06的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens) EHA105, (3)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液侵染外植體，然后共培養(yǎng)， (4)對共培養(yǎng)的外植體進(jìn)行選擇培養(yǎng)以分化愈傷組織， (5)生根培養(yǎng)分化的愈傷組織獲得轉(zhuǎn)基因植株。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法， 所述準(zhǔn)備植物轉(zhuǎn)化外植體包括外植體預(yù)培養(yǎng)，指將取自番茄幼苗的外植體放置在MS+50 μ g/ μ I乙酰丁香酮的固體培養(yǎng)基上，光照預(yù)培養(yǎng)2天， 所述共培養(yǎng)指采用MS+ΙΟΟμ g/μ I乙酰丁香酮的固體培養(yǎng)基，避光培養(yǎng)2天， 所述選擇培養(yǎng)指采用MS+2mg/L 6BA+0. 2mg/L IAA+300mg/L羧芐青霉素+50 μ g/ml卡那霉素+10 μ g/ml玉米素的培養(yǎng)基，26-28°C，光照培養(yǎng)16h， 所述生根培養(yǎng)指長到2 3厘米的分化良好的愈傷組織轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基MS+0. 25mg/LIAA+25 μ g/ml卡那霉素+200 μ g/ml頭孢霉素上。
8.根據(jù)權(quán)利要求5 7任一所述的方法，所述制備農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液指采用1/2濃度的液體MS + 200 μ g/ μ I乙酰丁香酮為懸浮劑懸浮菌體。
全文摘要
本發(fā)明“植物根部特異表達(dá)Bt-cry6A晶體蛋白在根結(jié)線蟲防治中的應(yīng)用”涉及植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)，本發(fā)明提供用于在植物的根中特異表達(dá)Bt-cry6A基因的重組表達(dá)載體pBP-bt06，以及將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化番茄的轉(zhuǎn)基因方法。本發(fā)明合成的基因是對密碼子進(jìn)行優(yōu)化的。將優(yōu)化后的編碼Bt-Cry6A晶體蛋白的人工基因轉(zhuǎn)入番茄品種。實驗結(jié)果表明，本發(fā)明成功獲得了在根部特異表達(dá)Bt-cry6A基因的轉(zhuǎn)基因番茄。
文檔編號C12R1/01GK103045637SQ201210470439
公開日2013年4月17日 申請日期2012年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月18日
發(fā)明者陳國華, 梅眉, 王殿東, 田雪亮, 茆振川, 楊宇紅, 謝丙炎 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所