專利名稱：一種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物純化試劑盒及純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域核酸純化技術(shù)在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用，具體涉及一種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物純化試劑盒及純化方法。
背景技術(shù)：
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)物純化是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行核酸PCR擴(kuò)增、核酸酶切反應(yīng)或測序反應(yīng)后常需進(jìn)行一項(xiàng)工作。PCR產(chǎn)物中一般都含有過量的引物、Taq-DNA酶、dNTP及核苷酸等，有時(shí)還有一些引物二聚體，這些成分將直接影響后續(xù)的質(zhì)粒連接、酶切、PCR測序反應(yīng)等實(shí)驗(yàn)過程，因此必須去除這些雜質(zhì)。目前核酸的純化試劑盒和純化方法很多，市場上大多數(shù)的PCR產(chǎn)物純化試劑盒均是采用吸附法的原理，即結(jié)合一洗滌一洗脫，然后回收獲得純化產(chǎn)物。然而，已有的一些PCR產(chǎn)物純化試劑盒和純化方法亦存在諸多的問題，例如一些純化方法往往因需時(shí)較長或回收率太低而影響下一步的操作。一些PCR產(chǎn)物 純化試劑盒因價(jià)格高昂而令多數(shù)實(shí)驗(yàn)室難以承受，一些試劑盒雖然價(jià)格低廉但過濾膜易破損且回收效率不夠穩(wěn)定或所用的異丙醇、酚和氯仿等試劑對人體有一定的危害。因此，開發(fā)一些成本低、實(shí)用強(qiáng)、回收效率高而穩(wěn)定、操作簡單方便的PCR產(chǎn)物純化試劑盒及純化方法是很有必要的。目前很多商品化的純化試劑盒中所用的DNA結(jié)合溶液基本配方都是由異硫氰酸胍(Guanidine isothiocyanate)和乙醇組成，因此,在純化過程溶液濃度的改變會影響溶液的PH值，進(jìn)而影響純化效率的穩(wěn)定性，降低核酸的回收率。本發(fā)明通過反復(fù)試驗(yàn)，改變DNA結(jié)合溶液的配方，在原有的異硫氰酸胍和無水乙醇配比基礎(chǔ)上增加了磷酸氫二鈉(Na2HPO4)和磷酸二氫鈉(NaH2PO4)并通過科學(xué)配比。過濾柱采用silica膜,異硫氰酸胍對蛋白有強(qiáng)的變性作用，它提供DNA結(jié)合到膜上的條件；而無水乙醇同樣具有促進(jìn)DNA結(jié)合的作用，并且提高溶液體系體積，延長膜的吸附反應(yīng)時(shí)間；磷酸鹽組成的緩沖系統(tǒng)，可保證PH值維持在5. O左右的弱酸性。從而使PCR產(chǎn)物純化保持高而穩(wěn)定的DNA回收率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物純化試劑盒及純化方法。本發(fā)明的基本原理是(I)結(jié)合；利用silica膜在高鹽環(huán)境下吸附DNA在低鹽濃度下釋放DNA的特性，并且在一定濃度和pH條件下對不同片段長度DNA結(jié)合能力的不同，結(jié)合PCR產(chǎn)物的的特點(diǎn)，發(fā)明了一種新型的DNA結(jié)合溶液；這種DNA結(jié)合溶液中的異硫氰酸胍(Guanidine isothiocyanate)對蛋白有強(qiáng)的變性作用，并且提供DNA結(jié)合到膜上的條件；而無水乙醇同樣具有促進(jìn)DNA結(jié)合的作用，并且提高溶液體系體積，延長膜的吸附反應(yīng)時(shí)間；磷酸鹽組成的緩沖系統(tǒng)，可保證PH值維持在5. O左右的弱酸性。(2)洗滌；silica膜上吸附留下的除了目的DNA外，還有高鹽濃度的溶液，需要洗滌干凈，三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris/HCl)、乙二胺四乙酸(EDTA)、氯化鈉(NaCl)和無水乙醇(Ethanol)按一定配比混合后可有效去除高鹽溶液。(3)洗脫；經(jīng)過洗滌的silica膜，含有乙醇，會對后續(xù)的實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生影響，Tris/HCl和EDTA按一定配比混合后通過高速離心可有效去除殘留的乙醇。最后，小于50bp的片度和變性的蛋白及引物二聚體等雜質(zhì)均被透過silica膜被除去。本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是—種新的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物純化試劑盒，由下述組成(1)帶silica膜PCR過濾管，(2) I. 5ml 離心管，(3) 2ml 離心管，(4) DNABinding Buffer (DNA 結(jié)合溶液)，(5)WashingBuffer (洗漆液)，(6) Eluent Buffer (洗脫液)。所述PCR產(chǎn)物純化試劑盒中DNABinding Buffer (DNA結(jié)合溶液)配方為1000mlDNABinding Buffer 中包含 4· 5M 異硫氰酸狐(Guanidine isothiocyanate), 200ml 無水乙醇(Ethanol)，O. 05M磷酸氫二鈉(Na2HPO4), O. 05M磷酸二氫鈉(NaH2PO4)15室溫密閉貯存。所述PCR產(chǎn)物純化試劑盒中Washing Buffer (洗漆液)配方為1000ml WashingBuffer中包含IOOmM氯化鈉(NaCl)，IOmM乙二胺四乙酸(EDTA)，50mM三羥甲基氨基甲 烷-鹽酸(Tris-HCl，pH7. 5)。使用時(shí)與無水乙醇(Ethanol)按I :1. 5混合均勻，室溫密閉貯存。所述PCR產(chǎn)物純化試劑盒中Eluent Buffer (洗脫液)配方為1000ml EluentBuffer中包含10禮三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(1'1^/!1(1)，11111乙二胺四乙酸化0丁八，pH8. O)。室溫密閉貯存。本發(fā)明還公開了使用PCR產(chǎn)物純化試劑盒的純化方法，其操作步驟是a.在待純化樣品溶液中，加入3倍體積的DNA Binding Buffer (若DNA BindingBuffer不足100μ I,加至100 μ I),混勻后,轉(zhuǎn)移到帶silica膜的過濾管中，將過濾管置于2ml離心管中，12000rpm離心Imin，棄濾液；b.將過濾管置于 2ml 離心管中，加 700 μ I Washing Buffer, 12000rpm 離心 lmin，
棄濾液；c.(可選步驟)將過濾管置于離心管中，將過濾管置于2ml離心管，加400 μ IWashingBuffer, 12000rpm 離心 lmin,棄濾液；d.將過濾管置于潔凈的I. 5ml離心管中，在過濾管膜中央加30-40 μ I EluentBuffer,室溫靜置 2_3min。12000rpm 離心 lmin 洗脫 DNA。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明適合從PCR、酶切反應(yīng)和測序反應(yīng)等的反應(yīng)液中純化回收DNA，回收率為80-90%。小于50bp的片度和變性的蛋白及引物二聚體等透過膜被除去。本發(fā)明提供的PCR產(chǎn)物純化試劑盒及純化方法成本低、實(shí)用強(qiáng)、回收效率高而穩(wěn)定、操作簡單方便。很適合各科研院所實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化使用。本發(fā)明完全可實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)轉(zhuǎn)化并量產(chǎn)銷售，具有廣泛的市場前景和應(yīng)用經(jīng)濟(jì)價(jià)值。


圖I.帶silica膜的過濾管。圖2. PCR產(chǎn)物純化流程圖。圖3. PCR產(chǎn)物純化前后比較(M DL2000Plus Marker ;泳道I.中華絨螯蟹熱激蛋白90基因PCR產(chǎn)物純化前；泳道2.中華絨螯蟹熱激蛋白90基因PCR產(chǎn)物純化后；泳道
3.中華絨螯蟹錨蛋白基因PCR產(chǎn)物純化前；泳道4.中華絨螯蟹錨蛋白基因PCR產(chǎn)物純化后)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I本發(fā)明實(shí)施例I提供一種利用本發(fā)明進(jìn)行PCR反應(yīng)溶液純化的方法，下面進(jìn)行詳細(xì)說明1.在待純化的45 μ I中華絨螯蟹熱激蛋白90基因的PCR擴(kuò)增反應(yīng)溶液中，加入135 μ I DNABinding Buffer，混勻后，轉(zhuǎn)移到帶silica膜的過濾管中(圖1)，將過濾管置于2ml離心管中，12000rpm離心lmin，棄濾液；2.將過濾管置于2ml離心管中，加700 μ IWashing Buffer, 12000rpm離心lmin,棄濾液；3.將過濾管置于離心管中，將過濾管置于2ml離心管,加400 μ I Washing Buffer, 12000rpm離心lmin,棄濾液；4.將過濾管置于潔凈的I. 5ml離心管中，在過濾管膜中央加35 μ I Eluent Buffer,室溫靜置3min ; 12000rpm離心lmin洗脫DNA (圖2)。I. 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測和使用Biophotometer (Eppendorf,Germany)進(jìn)行DNA濃度與純度檢測，結(jié)果顯示回收效率達(dá)90%且純化效果非常好，沒有其他雜質(zhì)殘留(見圖3泳道2)。實(shí)施例2 本發(fā)明實(shí)施例2提供一種利用本發(fā)明進(jìn)行cDNA酶切反應(yīng)溶液純化的方法，下面進(jìn)行詳細(xì)說明a.在待純化的45 μ I中華絨螯蟹錨蛋白的PCR擴(kuò)增反應(yīng)溶液中，加入135 μ IDNABinding Buffer,混勻后,轉(zhuǎn)移到帶silica膜的過濾管中，將過濾管置于2ml離心管中，12000rpm離心lmin,棄濾液；b.將過濾管置于2ml離心管中,加700 μ I Washing Buffer,12000rpm離心lmin，棄濾液；c.將過濾管置于離心管中，將過濾管置于2ml離心管，力口400 μ I WashingBuffer, 12000rpm離心lmin,棄濾液；d.將過濾管置于潔凈的I. 5ml離心管中，在過濾管膜中央加40 μ I Eluent Buffer,室溫靜置2min。12000rpm離心lmin洗脫cDNA。I. 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測和使用Biophotometer (Eppendorf,Germany)進(jìn)行DNA濃度與純度檢測，結(jié)果顯示回收效率達(dá)85%且純化效果非常好，沒有其他雜質(zhì)殘留(圖3泳道4)。以上對本發(fā)明實(shí)施例所提供的一種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物純化試劑盒及純化方法進(jìn)行了詳細(xì)介紹，本文中應(yīng)用了具體個(gè)例對本發(fā)明的原理及實(shí)施方式進(jìn)行了闡述，以上實(shí)施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想；同時(shí)，對于本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員，依據(jù)本發(fā)明的思想，在具體實(shí)施方式
及應(yīng)用范圍上均會有改變之處，綜上所述，本說明書內(nèi)容不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。
權(quán)利要求
1.一種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物純化試劑盒，其特征在于包括帶silica膜PCR過濾管、I.5 ml離心管、2 ml離心管、DNA結(jié)合溶液、洗滌液和洗脫液； 其中，DNA結(jié)合溶液配方為1000 ml DNA結(jié)合溶液中包含4. 5M異硫氰酸胍，200 ml無水乙醇，O. 05M磷酸氫二鈉，O. 05M磷酸二氫鈉。
2.根據(jù)權(quán)利要求I中所述的一種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物純化試劑盒，其特征是所述洗滌液配方為1000 ml洗滌液中包含IOOmM氯化鈉，IOmM乙二胺四乙酸，50mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、PH7. 5。
3.根據(jù)權(quán)利要求I中所述的一種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物純化試劑盒，其特征是所述洗脫液配方為1000 ml洗脫液中包含IOmM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸，ImM乙二胺四乙酸、pH8. O0
4.權(quán)利要求I中所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物純化試劑盒的使用方法，其特征是步驟如下 a.在待純化樣品溶液中，加入3倍體積的DNA結(jié)合溶液，若DNA結(jié)合溶液不足100μ ，加至100 μ I,混勻后,轉(zhuǎn)移到帶silica膜的過濾管中,將過濾管置于2 ml離心管中，12000 rpm離心I min,棄濾液； b.將過濾管置于2ml離心管中，加700 μ I洗漆液，12000 rpm離心I min,棄濾液； d.將過濾管置于潔凈的I. 5 ml離心管中，在過濾管膜中央加30-40 μ I洗脫液，室溫靜置 2-3 min ； 12000 rpm 離心 I min 洗脫 DNA。
5.權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于步驟d前還有步驟c.將過濾管置于離心管中，將過濾管置于2 ml離心管，加400 μ I洗滌液，12000 rpm離心I min，棄濾液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物純化試劑盒及純化方法。所述PCR產(chǎn)物純化試劑盒包括(1)PCR過濾管，(2)1.5ml離心管，(3)2ml離心管，(4)DNA結(jié)合溶液，(5)洗滌液，(6)洗脫液。所述純化方法操作步驟a.將待純化樣品溶液與3倍體積的DNA結(jié)合溶液混勻后，轉(zhuǎn)移到帶2ml離心管的過濾管中，離心，棄濾液；b.加洗滌液到帶2ml離心管的過濾管中，離心，棄濾液；c.將過濾管置于潔凈的1.5ml離心管中，在過濾管膜中央加30-40μl洗脫液，室溫靜置2-3min，離心，洗脫DNA。本發(fā)明提供的試劑盒及純化方法成本低、實(shí)用強(qiáng)、回收效率高且穩(wěn)定、操作簡單方便。
文檔編號C12N15/10GK102925429SQ20121047032
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月19日
發(fā)明者徐士霞, 劉繼來, 李鵬 申請人:南京師范大學(xué)