專利名稱：殺蟲蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種殺蟲蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途，特別是涉及一種改造的PIC6-0U殺蟲蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途。
背景技術(shù)：
植物蟲害是導(dǎo)致農(nóng)作物損失的主要因素，給農(nóng)民造成重大的經(jīng)濟損失，甚至影響到當?shù)厝丝诘纳鏍顩r。為了防治植物蟲害，人們通常使用廣譜化學殺蟲劑和生物殺蟲制齊U，但二者在實際應(yīng)用中都具有局限性化學殺蟲劑會帶來環(huán)境污染的問題，并導(dǎo)致抗藥性 昆蟲的出現(xiàn)；而生物殺蟲制劑在環(huán)境中容易降解，在生產(chǎn)上需要重復(fù)施用，大大增加了生產(chǎn)成本。為了解決化學殺蟲劑和生物殺蟲制劑在實際應(yīng)用中的局限性，科學家們經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)將編碼殺蟲蛋白的抗蟲基因轉(zhuǎn)入植物中，可獲得一些抗蟲轉(zhuǎn)基因植物以防治植物蟲害。PIC6殺蟲蛋白是眾多殺蟲蛋白中的一種，是由蘇云金芽孢桿菌產(chǎn)生的伴胞結(jié)晶蛋白。PIC6蛋白被昆蟲攝入進入中腸，毒蛋白原毒素被溶解在昆蟲中腸的堿性PH環(huán)境下。蛋白N-和C-末端被堿性蛋白酶消化，將原毒素轉(zhuǎn)變成活性片段；活性片段和昆蟲中腸上皮細胞膜上表面上受體結(jié)合，插入腸膜，導(dǎo)致細胞膜出現(xiàn)穿孔病灶，破壞細胞膜內(nèi)外的滲透壓變化及PH平衡等，擾亂昆蟲的消化過程，最終導(dǎo)致其死亡。每年因植物蟲害造成的糧食損失巨大，例如小菜蛾、玉米螟、棉鈴蟲、東方黏蟲或二化螟等。目前未發(fā)現(xiàn)PIC6殺蟲蛋白在植物中的表達水平和毒力的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種殺蟲蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途，所述PIC6-0U殺蟲蛋白在植物中(尤其為玉米)具有較高的表達量和毒力。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種殺蟲蛋白質(zhì)，包括(a)如SEQ ID NO:2所示的第1_650位氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；或(b)如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；或(C)在(a)或(b)中的氨基酸序列經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸且具有殺蟲活性的由(a)或(b)衍生的蛋白質(zhì)；或(d)與(a)或(b)中的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。進一步地，所述殺蟲蛋白質(zhì)為與SEQ ID NO: 2的第1_650位具有至少95%序列同一性的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)或與SEQ ID N0:2具有至少95%序列同一性的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。更進一步地，所述殺蟲蛋白質(zhì)為與SEQ ID NO: 2的第1-650位具有至少99%序列同一性的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)或與SEQ ID N0:2具有至少99%序列同一性的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種殺蟲基因，包括Ca)編碼權(quán)利要求1-3任一項所述殺蟲蛋白質(zhì)的核苷酸序列；或(b)在嚴格條件下與(a)限定的核苷酸序列雜交且編碼具有殺蟲活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列；或(c)具有SEQ ID NO:1的第1-1950位所示的核苷酸序列；或(d)具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。所述嚴格條件可為在6 X SSC (檸檬酸鈉)、0· 5%SDS (十二烷基硫酸鈉)溶液中，在65°C下雜交，然后用2XSSC、0. 1%SDS和I X SSC,O. 1%SDS各洗膜I次。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種表達盒，包含在有效連接的調(diào)控序列調(diào)控 下的所述殺蟲基因。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種包含所述殺蟲基因或所述表達盒的重組載體。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種包含所述殺蟲基因或所述表達盒的轉(zhuǎn)基因宿主生物，包括植物細胞、動物細胞、細菌、酵母、桿狀病毒、線蟲或藻類。進一步地，所述植物為玉米、大豆、棉花、水稻、小麥、高粱、牧草或甘蔗。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生殺蟲蛋白質(zhì)的方法，包括獲得所述轉(zhuǎn)基因宿主生物的細胞；在允許產(chǎn)生殺蟲蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)基因宿主生物的細胞；回收所述殺蟲蛋白質(zhì)。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種用于增加昆蟲靶范圍的方法，包括將所述殺蟲蛋白質(zhì)或所述表達盒編碼的殺蟲蛋白質(zhì)在植物中與至少一種不同于所述殺蟲蛋白質(zhì)或所述表達盒編碼的殺蟲蛋白質(zhì)的第二種殺蟲核苷酸一起表達。進一步地，所述第二種殺蟲核苷酸可以編碼Cry類殺蟲蛋白質(zhì)、Vip類殺蟲蛋白質(zhì)、蛋白酶抑制劑、凝集素、α-淀粉酶或過氧化物酶?？蛇x擇地，所述第二種殺蟲核苷酸為抑制目標昆蟲害蟲中重要基因的dsRNA。在本發(fā)明中，PIC6-01t殺蟲蛋白在一種轉(zhuǎn)基因植物中的表達可以伴隨著一個或多個Cry類殺蟲蛋白質(zhì)和/或Vip類殺蟲蛋白質(zhì)的表達。這種超過一種的殺蟲毒素在同一株轉(zhuǎn)基因植物中共同表達可以通過遺傳工程使植物包含并表達所需的基因來實現(xiàn)。另外，一種植物(第I親本)可以通過遺傳工程操作表達PIC6-0U殺蟲蛋白質(zhì)，第二種植物(第2親本)可以通過遺傳工程操作表達Cry類殺蟲蛋白質(zhì)和/或Vip類殺蟲蛋白質(zhì)。通過第I親本和第2親本雜交獲得表達引入第I親本和第2親本的所有基因的后代植物。RNA干擾(RNA interference，RNAi)是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA(double-stranded RNA, dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。因此可以使用RNAi技術(shù)特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生抗蟲植物的方法，包括將所述殺蟲基因或所述表達盒或所述重組載體導(dǎo)入植物。優(yōu)選地，所述植物為玉米、大豆、棉花、水稻、小麥、高粱、牧草或甘蔗。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種用于保護植物免受由昆蟲害蟲引起的損傷的方法，包括將所述的殺蟲基因或所述的表達盒或所述的重組載體導(dǎo)入植物，使導(dǎo)入后的植物產(chǎn)生足夠保護其免受昆蟲害蟲侵害量的殺蟲蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，所述植物為玉米、大豆、棉花、水稻、小麥、高粱、牧草或甘蔗。將所述的殺蟲基因或所述的表達盒或所述的重組載體導(dǎo)入植物，在本發(fā)明中為將外源DNA導(dǎo)入植物細胞，常規(guī)轉(zhuǎn)化方法包括但不限于，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、微量發(fā)射轟擊、直接將DNA攝入原生質(zhì)體、電穿孔或晶須硅介導(dǎo)的DNA導(dǎo)入。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種控制昆蟲害蟲的方法，包括使昆蟲害蟲與抑制量的所述殺蟲蛋白質(zhì)或由所述殺蟲基因編碼的昆蟲抑制性蛋白接觸。
優(yōu)選地，所述昆蟲害蟲是鱗翅目昆蟲害蟲。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種由包含所述殺蟲基因的核苷酸序列編碼的雜合殺蟲蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，所述雜合殺蟲蛋白質(zhì)是由如SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列編碼的。本發(fā)明中所述的植物、植物組織或植物細胞的基因組，是指植物、植物組織或植物細胞內(nèi)的任何遺傳物質(zhì)，且包括細胞核和質(zhì)體和線粒體基因組。本發(fā)明中所述的多核苷酸和/或核苷酸形成完整“基因”，在所需宿主細胞中編碼蛋白質(zhì)或多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易認識到，可以將本發(fā)明的多核苷酸和/或核苷酸置于目的宿主中的調(diào)控序列控制下。本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，DNA典型的以雙鏈形式存在。在這種排列中，一條鏈與另一條鏈互補，反之亦然。由于DNA在植物中復(fù)制產(chǎn)生了 DNA的其它互補鏈。這樣，本發(fā)明包括對序列表中示例的多核苷酸及其互補鏈的使用。本領(lǐng)域常使用的“編碼鏈”指與反義鏈結(jié)合的鏈。為了在體內(nèi)表達蛋白質(zhì)，典型將DNA的一條鏈轉(zhuǎn)錄為一條mRNA的互補鏈，它作為模板翻譯出蛋白質(zhì)。mRNA實際上是從DNA的“反義”鏈轉(zhuǎn)錄的。“有義”或“編碼”鏈有一系列密碼子(密碼子是三個核苷酸，一次讀三個可以產(chǎn)生特定氨基酸)，其可作為開放閱讀框(ORF)閱讀來形成目的蛋白質(zhì)或肽。本發(fā)明還包括與示例的DNA有相當功能的RNA和PNA (肽核酸)。本發(fā)明中核酸分子或其片段在嚴格條件下與本發(fā)明殺蟲基因雜交。任何常規(guī)的核酸雜交或擴增方法都可以用于鑒定本發(fā)明殺蟲基因的存在。核酸分子或其片段在一定情況下能夠與其他核酸分子進行特異性雜交。本發(fā)明中，如果兩個核酸分子能形成反平行的雙鏈核酸結(jié)構(gòu)，就可以說這兩個核酸分子彼此間能夠進行特異性雜交。如果兩個核酸分子顯示出完全的互補性，則稱其中一個核酸分子是另一個核酸分子的“互補物”。本發(fā)明中，當一個核酸分子的每一個核苷酸都與另一個核酸分子的對應(yīng)核苷酸互補時，則稱這兩個核酸分子顯示出“完全互補性”。如果兩個核酸分子能夠以足夠的穩(wěn)定性相互雜交從而使它們在至少常規(guī)的“低度嚴格”條件下退火且彼此結(jié)合，則稱這兩個核酸分子為“最低程度互補”。類似地，如果兩個核酸分子能夠以足夠的穩(wěn)定性相互雜交從而使它們在常規(guī)的“高度嚴格”條件下退火且彼此結(jié)合，則稱這兩個核酸分子具有“互補性”。從完全互補性中偏離是可以允許的，只要這種偏離不完全阻止兩個分子形成雙鏈結(jié)構(gòu)。為了使一個核酸分子能夠作為引物或探針，僅需保證其在序列上具有充分的互補性，以使得在所采用的特定溶劑和鹽濃度下能形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。本發(fā)明中，基本同源的序列是一段核酸分子，該核酸分子在高度嚴格條件下能夠和相匹配的另一段核酸分子的互補鏈發(fā)生特異性雜交。促進DNA雜交的適合的嚴格條件，例如，大約在45°C條件下用6. OX氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)處理，然后在50°C條件下用
2.OXSSC洗滌，這些條件對本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。例如，在洗滌步驟中的鹽濃度可以選自低度嚴格條件的約2.0父55(、501到高度嚴格條件的約0.2\55(、501。此外，洗滌步驟中的溫度條件可以從低度嚴格條件的室溫約22°C，升高到高度嚴格條件的約65 °C。溫度條件和鹽濃度可以都發(fā)生改變，也可以其中一個保持不變而另一個變量發(fā)生改變。優(yōu)選地，本發(fā)明所述嚴格條件可為在6XSSC、0. 5%SDS溶液中，在65°C下與SEQ ID NO:1發(fā)生特異性雜交，然后用2XSSC、0. 1%SDS和I X SSC,O. 1%SDS各洗膜I次。因此，具有抗蟲活性并在嚴格條件下與本發(fā)明序列I雜交的序列包括在本發(fā)明中。這些序列與本發(fā)明序列至少大約40%-50%同源，大約60%、65%或70%同源，甚至至少大約 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更大的序列同源性。
本發(fā)明中所述的基因和蛋白質(zhì)不但包括特定的示例序列，還包括保存了所述特定示例的蛋白質(zhì)的殺蟲活性特征的部分和/片段(包括與全長蛋白質(zhì)相比在內(nèi)和/或末端缺失)、變體、突變體、取代物(有替代氨基酸的蛋白質(zhì))、嵌合體和融合蛋白。所述“變體”或“變異”是指編碼同一蛋白或編碼有殺蟲活性的等價蛋白的核苷酸序列。所述“等價蛋白”是指與權(quán)利要求的蛋白具有相同或基本相同的抗鱗翅目昆蟲害蟲的生物活性的蛋白。本發(fā)明中所述的DNA分子或蛋白序列的“片段”或“截短”是指涉及的原始DNA或蛋白序列(核苷酸或氨基酸)的一部分或其人工改造形式(例如適合植物表達的序列)，包括臨近片段和與全長分子相比內(nèi)部和/或末端的缺失，前述序列的長度可存在變化，但長度足以確保(編碼)蛋白質(zhì)為昆蟲毒素。在一些情況下(特別是植物中的表達)，使用編碼截短蛋白質(zhì)的截短基因可能是有利的。優(yōu)選的截短基因一般編碼全長蛋白質(zhì)的40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98 或99%。由于遺傳密碼子的豐余性，多種不同的DNA序列可以編碼相同的氨基酸序列。產(chǎn)生這些編碼相同或基本相同的蛋白的可替代DNA序列正在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)水平內(nèi)。這些不同的DNA序列包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。所述“基本上相同的”序列是指有氨基酸取代、缺失、添加或插入但實質(zhì)上不影響殺蟲活性的序列，亦包括保留殺蟲活性的片段。本發(fā)明中氨基酸序列的取代、缺失或添加是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，優(yōu)選這種氨基酸變化為小的特性改變，即不顯著影響蛋白的折疊和/或活性的保守氨基酸取代；小的缺失，通常約1-30個氨基酸的缺失；小的氨基或羧基端延伸，例如氨基端延伸一個甲硫氨酸殘基；小的連接肽，例如約20-25個殘基長。保守取代的實例是在下列氨基酸組內(nèi)發(fā)生的取代堿性氨基酸(如精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(如谷氨酰胺、天冬酰胺)、疏水性氨基酸(如亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳香氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)，以及小分子氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變特定活性的那些氨基酸取代在本領(lǐng)域內(nèi)是眾所周知的，并且已由，例如，N. Neurath和R. L. Hill在1979年紐約學術(shù)出版社(Academic Press)出版的《Protein》中進行了描述。最常見的互換有 Ala/Ser，Val/Ile, Asp/Glu, Thu/Ser, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe,Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu 和 Asp/Gly,以及它們相反的互換。
對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言顯而易見地，這種取代可以在對分子功能起重要作用的區(qū)域之外發(fā)生，而且仍產(chǎn)生活性多肽。對于由本發(fā)明的多肽，其活性必需的并因此選擇不被取代的氨基酸殘基，可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，如定點誘變或丙氨酸掃描誘變進行鑒定(如參見，Cunningham 和 Wells, 1989, Science 244 1081-1085)。后一技術(shù)是在分子中每一個帶正電荷的殘基處引入突變，檢測所得突變分子的抗蟲活性，從而確定對該分子活性而言重要的氨基酸殘基。底物-酶相互作用位點也可以通過其三維結(jié)構(gòu)的分析來測定，這種三維結(jié)構(gòu)可由核磁共振分析、結(jié)晶學或光親和標記等技術(shù)測定(參見，如de Vos等，1992，Science 255 :306_312 ;Smith 等，1992，J. Mol. Biol 224:899-904 ;Wlodaver 等，1992，F(xiàn)EBS Letters 309 :59_64)。因此，與序列2所示的氨基酸序列具有一定同源性的氨基酸序列也包括在本發(fā)明中。這些序列與本發(fā)明序列類似性/相同性典型的大于60%，優(yōu)選的大于75%，更優(yōu)選的大于80%，甚至更優(yōu)選的大于90%，并且可以大于95%。也可以根據(jù)更特定的相同性和/或類似性范圍定義本發(fā)明的優(yōu)選的多核苷酸和蛋白質(zhì)。例如與本發(fā)明示例的序列有49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、 71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的相同性和 / 或類似性。本發(fā)明中所述調(diào)控序列包括但不限于啟動子、轉(zhuǎn)運肽、終止子，增強子，前導(dǎo)序列，內(nèi)含子以及其它可操作地連接到所述殺蟲基因的調(diào)節(jié)序列。所述啟動子為植物中可表達的啟動子，所述的“植物中可表達的啟動子”是指確保與其連接的編碼序列在植物細胞內(nèi)進行表達的啟動子。植物中可表達的啟動子可為組成型啟動子。指導(dǎo)植物內(nèi)組成型表達的啟動子的示例包括但不限于，來源于花椰菜花葉病毒的35S啟動子、ubi啟動子、水稻G0S2基因的啟動子等。備選地，植物中可表達的啟動子可為組織特異的啟動子，即該啟動子在植物的一些組織內(nèi)如在綠色組織中指導(dǎo)編碼序列的表達水平高于植物的其他組織(可通過常規(guī)RNA試驗進行測定)，如PEP羧化酶啟動子。備選地，植物中可表達的啟動子可為創(chuàng)傷誘導(dǎo)啟動子。創(chuàng)傷誘導(dǎo)啟動子或指導(dǎo)創(chuàng)傷誘導(dǎo)的表達模式的啟動子是指當植物經(jīng)受機械或由昆蟲啃食引起的創(chuàng)傷時，啟動子調(diào)控下的編碼序列的表達較正常生長條件下有顯著提高。創(chuàng)傷誘導(dǎo)啟動子的示例包括但不限于，馬鈴薯和西紅柿的蛋白酶抑制基因(pin I和pin II)和玉米蛋白酶抑制基因(MPI)的啟動子。所述轉(zhuǎn)運肽(又稱分泌信號序列或?qū)蛐蛄?是指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物到特定的細胞器或細胞區(qū)室，對受體蛋白質(zhì)來說，所述轉(zhuǎn)運肽可以是異源的，例如，利用編碼葉綠體轉(zhuǎn)運肽序列靶向葉綠體，或者利用‘KDEL’保留序列靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，或者利用大麥植物凝集素基因的CTPP靶向液泡。所述前導(dǎo)序列包含但不限于，小RNA病毒前導(dǎo)序列，如EMCV前導(dǎo)序列(腦心肌炎病毒5’非編碼區(qū))；馬鈴薯Y病毒組前導(dǎo)序列，如MDMV (玉米矮縮花葉病毒)前導(dǎo)序列；人類免疫球蛋白質(zhì)重鏈結(jié)合蛋白質(zhì)(BiP);苜蓿花葉病毒的外殼蛋白質(zhì)mRNA的不翻譯前導(dǎo)序列(AMV RNA4);煙草花葉病毒(TMV)前導(dǎo)序列。所述增強子包含但不限于，花椰菜花葉病毒(CaMV)增強子、玄參花葉病毒(FMV)增強子、康乃馨風化環(huán)病毒(CERV)增強子、木薯脈花葉病毒(CsVMV)增強子、紫茉莉花葉病毒(MMV)增強子、夜香樹黃化曲葉病毒(CmYLCV)增強子、木爾坦棉花曲葉病毒(CLCuMV)、鴨跖草黃斑駁病毒(CoYMV)和花生褪綠線條花葉病毒(PCLSV)增強子。對于單子葉植物應(yīng)用而言，所述內(nèi)含子包含但不限于，玉米hsp70內(nèi)含子、玉米泛素內(nèi)含子、Adh內(nèi)含子1、蔗糖合酶內(nèi)含子或水稻Actl內(nèi)含子。對于雙子葉植物應(yīng)用而言，所述內(nèi)含子包含但不限于，CAT-1內(nèi)含子、pKANNIBAL內(nèi)含子、PIV2內(nèi)含子和“超級泛素”內(nèi)含子。所述終止子可以為在植物中起作用的適合多聚腺苷酸化信號序列，包括但不限于，來源于農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂堿合成酶(NOS)基因的多聚腺苷酸化信號序列、來源于蛋白酶抑制劑II (pin II)基因的多聚腺苷酸化信號序列、來源于豌豆ssRUBISCO E9基因的多聚腺苷酸化信號序列和來源于α -微管蛋白(a -tubulin)基因的多聚腺苷酸化信號序列。
本發(fā)明中所述“有效連接”表示核酸序列的聯(lián)結(jié)，所述聯(lián)結(jié)使得一條序列可提供對相連序列來說需要的功能。在本發(fā)明中所述“有效連接”可以為將啟動子與感興趣的序列相連，使得該感興趣的序列的轉(zhuǎn)錄受到該啟動子控制和調(diào)控。當感興趣的序列編碼蛋白并且想要獲得該蛋白的表達時“有效連接”表示啟動子與所述序列相連，相連的方式使得得到的轉(zhuǎn)錄物高效翻譯。如果啟動子與編碼序列的連接是轉(zhuǎn)錄物融合并且想要實現(xiàn)編碼的蛋白的表達時，制造這樣的連接，使得得到的轉(zhuǎn)錄物中第一翻譯起始密碼子是編碼序列的起始密碼子。備選地，如果啟動子與編碼序列的連接是翻譯融合并且想要實現(xiàn)編碼的蛋白的表達時，制造這樣的連接，使得5’非翻譯序列中含有的第一翻譯起始密碼子與啟動子相連結(jié)，并且連接方式使得得到的翻譯產(chǎn)物與編碼想要的蛋白的翻譯開放讀碼框的關(guān)系是符合讀碼框的。可以“有效連接”的核酸序列包括但不限于提供基因表達功能的序列(即基因表達元件，例如啟動子、5’非翻譯區(qū)域、內(nèi)含子、蛋白編碼區(qū)域、3’非翻譯區(qū)域、聚腺苷化位點和/或轉(zhuǎn)錄終止子)、提供DNA轉(zhuǎn)移和/或整合功能的序列(即T-DNA邊界序列、位點特異性重組酶識別位點、整合酶識別位點)、提供選擇性功能的序列(即抗生素抗性標記物、生物合成基因)、提供可計分標記物功能的序列、體外或體內(nèi)協(xié)助序列操作的序列(即多接頭序列、位點特異性重組序列)和提供復(fù)制功能的序列(即細菌的復(fù)制起點、自主復(fù)制序列、著絲粒序列)。本發(fā)明中所述的“殺蟲”是指對農(nóng)作物害蟲是有毒的。更具體地，目標昆蟲是害蟲，例如，但不限于，大部分鱗翅目害蟲，如玉米螟、二化螟、棉鈴蟲、小菜蛾或東方黏蟲等。本發(fā)明中所述的“雜合蛋白質(zhì)”為人工制造的殺蟲毒素，其包含與來源于不同毒素氨基酸區(qū)域或片段連接的一種毒素的氨基酸區(qū)域或片段，包括但不限于，連接來源于SEQID N0:2的PIC6 C-末端區(qū)域和來源于SEQ ID NO: 5第661至699位的N-末端區(qū)域，產(chǎn)生了具有SEQ ID N0:4中所述氨基酸序列的雜合蛋白質(zhì)。本發(fā)明中，所述殺蟲蛋白質(zhì)為PIC6-0U氨基酸序列，如序列表中SEQ ID N0:2所示。所述殺蟲基因為PIC6-0U核苷酸序列，如序列表中SEQ ID N0:1所示。所述殺蟲基因為用于植物，特別是玉米轉(zhuǎn)化的DNA序列，除了包含由PIC6-0U核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)的編碼區(qū)外，也可包含其他元件，例如編碼轉(zhuǎn)運肽的編碼區(qū)、編碼選擇性標記的蛋白質(zhì)或賦予除草劑抗性的蛋白質(zhì)的編碼區(qū)。本發(fā)明中PIC6-0U殺蟲蛋白質(zhì)對大多數(shù)鱗翅目害蟲具有毒性。本發(fā)明中的植物，特別是玉米，在其基因組中含有外源DNA，所述外源DNA包含PIC6-0U核苷酸序列，通過表達抑制量的該蛋白而保護其免受害蟲的威脅。抑制量是指致死的或亞致死的劑量。同時，植物在形態(tài)上應(yīng)是正常的，且可在常規(guī)方法下培養(yǎng)以用于產(chǎn)物的消耗和/或生成。此外，該植物可基本消除對化學或生物殺蟲劑的需要(所述化學或生物殺蟲劑為針對由PIC6-0U核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)所靶向的昆蟲的殺蟲劑)。植物材料中殺蟲晶體蛋白(ICP)的表達水平可通過本領(lǐng)域內(nèi)所描述的多種方法進行檢測，例如通過應(yīng)用特異引物對組織內(nèi)產(chǎn)生的編碼殺蟲蛋白質(zhì)的mRNA進行定量，或直接特異性檢測產(chǎn)生的殺蟲蛋白質(zhì)的量?？梢詰?yīng)用不同的試驗測定植物中ICP的殺蟲效果。本發(fā)明中目標昆蟲主要為鱗翅目害蟲，更具體地為亞洲玉米螟、東方黏蟲或二化螟等。此外，包含本發(fā)明殺蟲蛋白質(zhì)(PIC6-0U氨基酸序列)的表達盒在植物中還可以 與至少一種編碼除草劑抗性基因的蛋白質(zhì)一起表達，所述除草劑抗性基因包括但不限于，草胺膦抗性基因(如bar基因、pat基因)、苯敵草抗性基因(如pmph基因)、草甘膦抗性基因(如EPSPS基因)、溴苯腈(bromoxynil)抗性基因、磺酰脲抗性基因、對除草劑茅草枯的抗性基因、對氨腈的抗性基因或谷氨酰胺合成酶抑制劑(如PPT)的抗性基因，從而獲得既具有高殺蟲活性、又具有除草劑抗性的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明提供了一種殺蟲蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途，具有以下優(yōu)點1、毒力強。本發(fā)明殺蟲蛋白質(zhì)PIC6-0U的殺蟲毒力強，尤其是針對危害玉米的鱗翅目害蟲。2、表達量高。本發(fā)明殺蟲基因PIC6-0U采用玉米的偏好密碼子，完全符合玉米基因的特性，使得本發(fā)明殺蟲基因特別適合在單子葉植物中表達，尤其是玉米，其表達量高且穩(wěn)定性好。3、殺蟲譜廣。本發(fā)明殺蟲蛋白質(zhì)PIC6-0U蛋白不僅對亞洲玉米螟表現(xiàn)出較高的抗性，而且首次報道了本發(fā)明殺蟲蛋白質(zhì)PIC6-0U蛋白對東方黏蟲和二化螟也具有較高的活性，因此在植物上應(yīng)用前景廣闊。下面通過附圖和實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步的詳細描述。


圖1為本發(fā)明殺蟲蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途的含有PIC6-0U核苷酸序列的重組克隆載體DBNOl-T構(gòu)建流程圖；圖2為本發(fā)明殺蟲蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途的含有PIC6-0U核苷酸序列的重組表達載體DBN100086t構(gòu)建流程圖；圖3為本發(fā)明殺蟲蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途的含有天然序列的重組表達載體DBN100086N構(gòu)建流程圖；圖4為本發(fā)明殺蟲蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途的轉(zhuǎn)基因玉米植株的PIC6殺蟲蛋白質(zhì)的mRNA相對含量圖；圖5為本發(fā)明殺蟲蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途的轉(zhuǎn)基因玉米植株接種亞洲玉米螟的抗蟲效果圖；圖6為本發(fā)明殺蟲蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途的轉(zhuǎn)基因玉米植株接種二化螟的抗蟲效果圖7為本發(fā)明殺蟲蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途的轉(zhuǎn)基因玉米植株接種東方黏蟲的抗蟲效果圖。
具體實施例方式下面通過具體實施例進一步說明本發(fā)明殺蟲蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途的技術(shù)方案。第一實施例、PIC6-0U基因序列的獲得和合成1、獲得PIC6-0U基因序列PIC6-0U殺蟲蛋白質(zhì)的氨基酸序列(660個氨基酸)，如序列表中SEQ ID N0:2所示；依據(jù)玉米偏好性密碼子獲得編碼相應(yīng)于所述PIC6-0U殺蟲蛋白質(zhì)的氨基酸序 列(660個氨基酸)的核苷酸序列(1983個核苷酸)，如序列表中SEQ ID N0:1所示。玉米的密碼子使用偏好性可參考 http://www. kazusa. or. jp/codon/cg1-bin/showcodon.cgi species=38112402、合成上述PIC6-01t核苷酸序列所述PIC6-01t核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO:1所示)由南京金斯瑞生物科技公司合成；合成的所述PIC6-0U核苷酸序列(SEQ ID NO:1)的5’端還連接有SpeI酶切位點，所述PIC6-0U核苷酸序列(SEQ ID NO:1)的3，端還連接有SwaI酶切位點。同時，合成Pice-Olt取代核苷酸序列(如序列表中SEQ ID N0:6所示)，其為所述PIC6-01t氨基酸序列(如序列表中SEQ ID NO: 2所示)中第659位Lys替換為Glu ;合成的所述PIC6-0U取代核苷酸序列(SEQ ID N0:6)的5’端還連接有SpeI酶切位點，所述PIC6-0U取代核苷酸序列(SEQ ID N0:6)的3’端還連接有SwaI酶切位點。同時，合成PIC6_01t缺失核苷酸序列(如序列表中SEQ ID N0:7所示)，其為所述PIC6-0U氨基酸序列(如序列表中SEQ ID NO: 2所示)中缺失第651-660位的氨基酸；合成的所述PIC6-0U缺失核苷酸序列(SEQ ID NO: 7)的5’端還連接有SpeI酶切位點，所述PIC6-0U缺失核苷酸序列(SEQ ID N0:7)的3’端還連接有SwaI酶切位點。同時，合成優(yōu)化的PIC6_Ib雜合殺蟲蛋白質(zhì)的核苷酸序列(如序列表中SEQ IDNO: 3所示)，其為所述PIC6氨基酸序列(如序列表中SEQ ID NO: 2所示)后再連接上一段CrylIb基因的氨基酸序列，所得到的PIC6-1b氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0:4所示。所述CrylIb基因的氨基酸序列選自Li，H.等人于2010年登記的序列號為ADK38579.1的天然Cryllb6基因的氨基酸序列第661至699位,天然Cryllb6基因的氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0:5所示。合成的所述PIC6-1b核苷酸序列(SEQ ID N0:3)的5’端還連接有SpeI酶切位點，所述PIC6-1b核苷酸序列(SEQ ID NO: 3)的3’端還連接有SwaI酶切位點。第二實施例、重組表達載體的構(gòu)建及重組表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌1、構(gòu)建含有PIC6-0U核苷酸序列的重組克隆載體DBN01-T將合成的PIC6_01t核苷酸序列連入克隆載體pGEM-T (Promega, Madison, USA,CAT :A3600)上，操作步驟按Promega公司產(chǎn)品pGEM_T載體說明書進行，得到重組克隆載體DBN01-T，其構(gòu)建流程如圖1所示(其中，Amp表示氨芐青霉素抗性基因；fl表示噬菌體fl的復(fù)制起點；LacZ為LacZ起始密碼子；SP6為SP6 RNA聚合酶啟動子；T7為Τ7 RNA聚合酶啟動子；PIC6-01t為PIC6-0U核苷酸序列(SEQ ID NO:1) ；MCS為多克隆位點)。然后將重組克隆載體DBNOl-T用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌Tl感受態(tài)細胞(Transgen, Beijing, China ；Cat. No :Q)501),其熱激條件為50μ I 大腸桿菌 Tl 感受態(tài)細胞、10 μ I質(zhì)粒DNA (重組克隆載體DBN01-T)，42°C水浴30秒；37°C水浴I小時(IOOrpm轉(zhuǎn)速下?lián)u床搖動)，在表面涂有X-gal (5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷)的氨芐青霉素(100毫克/升)的LB平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，瓊脂15g/L，用NaOH調(diào)pH至7. 5)上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，氨芐青霉素100mg/L，用NaOH調(diào)pH至7. 5)中于溫度37°C條件下培養(yǎng)過夜。堿法提取其質(zhì)粒將菌液在12000rpm轉(zhuǎn)速下離心Imin,去上清液,沉淀菌體用100 μ I 冰預(yù)冷的溶液 I (25mM Tris-HCl, IOmM EDTA (乙二胺四乙酸)，50mM 葡萄糖，ρΗ8· 0)懸?。患尤?50 μ I新配制的溶液II (0. 2Μ NaOH, 1% SDS (十二烷基硫酸鈉))，將管子顛倒
4次，混合，置冰上3-5min ;加入150 μ I冰冷的溶液ΙΙΙ(4Μ醋酸鉀，2Μ醋酸)，立即充分混勻，冰上放置5-10min ;于溫度4°C、轉(zhuǎn)速12000rpm條件下離心5min，在上清液中加入2倍 體積無水乙醇，混勻后室溫放置5min ;于溫度4°C、轉(zhuǎn)速12000rpm條件下離心5min,棄上清液，沉淀用質(zhì)量濃度為70%的乙醇洗滌后晾干；加入30μ I含Rnase (20 μ g/ml)的TE(10mMTris-HCl, ImM EDTA, ΡΗ8. 0)溶解沉淀；于溫度37°C下水浴30min，消化RNA ;于溫度_20°C保存?zhèn)溆?。提取的質(zhì)粒經(jīng)SpeI和SwaI酶切鑒定后，對陽性克隆進行測序驗證，結(jié)果表明重組克隆載體DBN01-T中插入的所述PIC6-0U核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，即PIC6-0U核苷酸序列正確插入。按照上述構(gòu)建重組克隆載體DBN01-T的方法，將合成的所述PIC6_01t取代核苷酸序列連入克隆載體pGEM-Τ上，得到重組克隆載體DBN02-T，其中，miPIC6_01t為PIC6_01t取代核苷酸序列(SEQ ID N0:6)。酶切和測序驗證重組克隆載體DBN02-T中所述PIC6-01t取代核苷酸序列正確插入。按照上述構(gòu)建重組克隆載體DBN01-T的方法，將合成的所述PIC6_01t缺失核苷酸序列連入克隆載體pGEM-T上，得到重組克隆載體DBN03-T，其中，mdPIC6_01t為PIC6_01t缺失核苷酸序列(SEQ ID N0:7)。酶切和測序驗證重組克隆載體DBN03-T中所述PIC6-01t缺失核苷酸序列正確插入。按照上述構(gòu)建重組克隆載體DBN01-T的方法，將合成的所述PIC6_Ib核苷酸序列連入克隆載體pGEM-T上，得到重組克隆載體DBN04-T，其中，PIC6_Ib為雜合殺蟲蛋白質(zhì)PIC6-1b的核苷酸序列(SEQ ID N0:3)。酶切和測序驗證重組克隆載體DBN04-T中所述PIC6-1L·核苷酸序列正確插入。2、構(gòu)建含有PIC6-0U核苷酸序列的重組表達載體DBN100086t用限制性內(nèi)切酶SpeI和SwaI分別酶切重組克隆載體DBN01-T和表達載體DBNBC-01 (載體骨架pCAMBIA2301 (CAMBIA機構(gòu)可以提供))，將切下的PIC6_01t核苷酸序列片段插到表達載體DBNBC-01的SpeI和SwaI位點之間，利用常規(guī)的酶切方法構(gòu)建載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，表達載體DBNBC-01中的SpeI和SwaI酶切位點也是利用常規(guī)的酶切方法引入的，構(gòu)建成重組表達載體DBN100086t，其構(gòu)建流程如圖2所示(Kan :卡那霉素基因；RB :右邊界；Ub1:玉米Ubiquitin (泛素)基因啟動子(SEQ ID N0:8) ；PIC6-01t PIC6-01t核苷酸序列(SEQ ID NO:1) ;Nos :胭脂堿合成酶的終止子(SEQ ID N0:9)；PM1:磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因(SEQ ID N0:10) ;LB :左邊界)。將重組表達載體DBN100086t用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌Tl感受態(tài)細胞，其熱激條件為50μ I大腸桿菌Tl感受態(tài)細胞、10 μ I質(zhì)粒DNA (重組表達載體DBN100086t)，42°C水浴30秒；37°C水浴I小時(IOOrpm轉(zhuǎn)速下?lián)u床搖動)；然后在含50mg/L卡那霉素(Kanamycin)的LB固體平板(胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L, NaCl 10g/L,瓊脂15g/L,用NaOH調(diào)pH至7. 5)上于溫度37°C條件下培養(yǎng)12小時，挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，卡那霉素50mg/L，用NaOH調(diào)pH至7. 5)中于溫度37°C條件下培養(yǎng)過夜。堿法提取其質(zhì)粒。將提取的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶SpeI和SwaI酶切后鑒定，并將陽性克隆進行測序鑒定，結(jié)果表明重組表達載體DBN100086t在SpeI和SwaI位點間的核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，即 PIC6_01t核苷酸序列。按照上述構(gòu)建重組表達載體DBN100086t的方法，將SpeI和SwaI酶切重組克隆載體DBN02-T切下的所述PIC6-0U取代核苷酸序列插入表達載體DBNBC-01，得到重組表達載體DBN100086t-1。酶切和測序驗證重組表達載體DBN100086t_i在SpeI和SwaI位點間即為所述PIC6-0U取代核苷酸序列。按照上述構(gòu)建重組表達載體DBN100086t的方法，將SpeI和SwaI酶切重組克隆載體DBN03-T切下的所述PIC6-0U缺失核苷酸序列插入表達載體DBNBC-01，得到重組表達載體DBN100086t-d。酶切和測序驗證重組表達載體DBN100086t_d在SpeI和SwaI位點間即為所述PIC6-0U缺失核苷酸序列。按照上述構(gòu)建重組表達載體DBN100086t的方法，將SpeI和SwaI酶切重組克隆載體DBN04-T切下的所述PIC6-1b核苷酸序列插入表達載體DBNBC-Ol，得到重組表達載體DBN100086t-h。酶切和測序驗證重組表達載體DBN100086t_h在SpeI和SwaI位點間即為所述PIC6-1b添加核苷酸序列。3、構(gòu)建含有天然序列的重組表達載體DBN100086N (正對照)按照本發(fā)明第二實施例中I所述的構(gòu)建含有PIC6-01核苷酸序列的重組克隆載體DBNOl-T的方法，利用天然序列(SEQ ID NO: 11)構(gòu)建含有天然序列的重組克隆載體DBNOlR-T0對陽性克隆進行測序驗證，結(jié)果表明重組克隆載體DBNOlR-T中插入的天然序列為序列表中SEQ ID NO: 11所示的核苷酸序列，即天然序列正確插入。按照本發(fā)明第二實施例中2所述的構(gòu)建含有PIC6-01核苷酸序列的重組表達載體DBN100086t的方法，利用天然序列構(gòu)建含有天然序列的重組表達載體DBN100086N，其構(gòu)建流程如圖3所示(載體骨架pCAMBIA2301 (CAMBIA機構(gòu)可以提供)；Kan :卡那霉素基因；RB :右邊界；Ub1:玉米Ubiquitin (泛素)基因啟動子(SEQ ID N0:8);mN :天然序列(SEQ IDNO: 11) ；Nos :胭脂堿合成酶的終止子(SEQ ID NO:9) ；PM1:磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因(SEQ IDNO: 10) ；LB :左邊界)。對陽性克隆進行測序驗證，結(jié)果表明重組表達載體DBN100086N中插入的天然序列為序列表中SEQ ID NO: 11所示的核苷酸序列，即天然序列正確插入。4、重組表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌對己經(jīng)構(gòu)建正確的重組表達載體DBN100086t、DBN100086t_1、DBN100086t_d、DBN100086t-h和DBN100086N (天然序列)用液氮法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌LBA4404 (Invitrgen,Chicago, USA ；Cat. No : 18313-015)中，其轉(zhuǎn)化條件為:100 μ L 農(nóng)桿菌 LBA4404、3 μ L 質(zhì)粒DNA (重組表達載體)；置于液氮中10分鐘，37°C溫水浴10分鐘；將轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌LBA4404接種于LB試管中于溫度28°C、轉(zhuǎn)速為200rpm條件下培養(yǎng)2小時，涂于含50mg/L的利福平(Rifampicin)和100mg/L的卡那霉素(Kanamycin)的LB平板上直至長出陽性單克隆，挑取單克隆培養(yǎng)并提取其質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶StyI和BglII酶切DBN100086、DBN100086-1、DBN100086_t和DBN100086_a后進行酶切驗證，用限制性內(nèi)切酶StyI和BglI酶切DBN100086N (天然序列)后進行酶切驗證，結(jié)果表明重組表達載體DBN100086t、DBN100086t-1、DBN100086t-d、DBN100086t-h 和 DBN100086N (天然序列)結(jié)構(gòu)完全正確。第三實施例、轉(zhuǎn)入Pice-Olt核苷酸序列的玉米植株的獲得及驗證1、獲得轉(zhuǎn)入PIC6-0U核苷酸序列的玉米植株
按照常規(guī)采用的農(nóng)桿菌侵染法，將無菌培養(yǎng)的玉米品種綜31 (Z31)的幼胚與第二實施例中4所述的農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，以將第二實施例中2和3構(gòu)建的重組表達載體DBN100086t、DBN100086t_1、DBN100086t_d、DBN100086t_h 和 DBN100086N (天然序列)中的T-DNA (包括玉米Ubiquitin基因的啟動子序列、PIC6-0U核苷酸序列、PIC6-0U取代核苷酸序列、PIC6-0U缺失核苷酸序列、PIC6-1L·核苷酸序列、天然序列、PMI基因和Nos終止子序列)轉(zhuǎn)入到玉米染色體組中，獲得了轉(zhuǎn)入PIC6-0U核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入PIC6-0U取代核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入PIC6-0U缺失核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入PIC6-1L·核苷酸序列的玉米植株和轉(zhuǎn)入天然序列的玉米植株(正對照)；同時以野生型玉米植株作為負對照。對于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化，簡要地，從玉米中分離未成熟的幼胚，用農(nóng)桿菌懸浮液接觸幼胚，其中農(nóng)桿菌能夠?qū)IC6-0U核苷酸序列傳遞至幼胚之一的至少一個細胞(步驟1:侵染步驟)。在此步驟中，幼胚優(yōu)選地浸入農(nóng)桿菌懸浮液(OD66tl=O. 4-0. 6，侵染培養(yǎng)基(MS鹽4. 3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、鹿糖68. 5g/L、葡萄糖36g/L、乙酰丁香酮(AS)40mg/L、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D) lmg/L, pH5. 3))中以啟動接種。幼胚與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)一段時期(3天)(步驟2:共培養(yǎng)步驟)。優(yōu)選地，幼胚在侵染步驟后在固體培養(yǎng)基(MS鹽
4.3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、鹿糖20g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁香酮(AS) 100mg/L、2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D) lmg/L、瓊脂8g/L，pH5. 8)上培養(yǎng)。在此共培養(yǎng)階段后，可以有一個選擇性的“恢復(fù)”步驟。在“恢復(fù)”步驟中，恢復(fù)培養(yǎng)基(MS鹽4. 3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、鹿糖30g/L、2, 4-二氯苯氧乙酸(2，4_D)lmg/L、瓊脂8g/L,pH5. 8)中至少存在一種己知抑制農(nóng)桿菌生長的抗生素(頭孢霉素)，不添加植物轉(zhuǎn)化體的選擇劑(步驟3 :恢復(fù)步驟)。優(yōu)選地，幼胚在有抗生素但沒有選擇劑的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以消除農(nóng)桿菌并為侵染細胞提供恢復(fù)期。接著，接種的幼胚在含選擇劑(甘露糖)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)并選擇生長著的轉(zhuǎn)化愈傷組織(步驟4 :選擇步驟)。優(yōu)選地，幼胚在有選擇劑的篩選固體培養(yǎng)基(MS鹽4. 3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖5g/L、甘露糖12. 5g/L、2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4_D)lmg/L、瓊脂8g/L，pH5. 8)上培養(yǎng)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化的細胞選擇性生長。然后，愈傷組織再生成植物(步驟5 :再生步驟)，優(yōu)選地，在含選擇劑的培養(yǎng)基上生長的愈傷組織在固體培養(yǎng)基(MS分化培養(yǎng)基和MS生根培養(yǎng)基)上培養(yǎng)以再生植物。篩選得到的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到所述MS分化培養(yǎng)基(MS鹽4. 3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、6-芐基腺嘌呤2mg/L、甘露糖5g/L、瓊脂8g/L，pH5. 8)上，25°C下培養(yǎng)分化。分化出來的小苗轉(zhuǎn)移到所述MS生根培養(yǎng)基(MS鹽2. 15g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、吲哚-3-乙酸lmg/L、瓊脂8g/L，pH5. 8)上，25°C下培養(yǎng)至約IOcm高，移至溫室培養(yǎng)至結(jié)實。在溫室中，每天于28°C下培養(yǎng)16小時，再于20°C下培養(yǎng)8小時。2、用TaqMan驗證轉(zhuǎn)入PIC6_01t核苷酸序列的玉米植株分別取轉(zhuǎn)入PIC6-0U核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入PIC6-0U取代核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入PIC6-0U缺失核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入PIC6-1b核苷酸序列的玉米植株和轉(zhuǎn)入天然序列的玉米植株的葉片約IOOmg作為樣品,用Qiagen的DNeasy Plant MaxiKit提取其基因組DNA，通過Taqman探針熒光定量PCR方法檢測PIC6基因的拷貝數(shù)。同時以野生型玉米植株作為負對照，按照上述方法進行檢測分析。實驗設(shè)3次重復(fù)，取平均值。檢測PIC6基因拷貝數(shù)的具體方法如下步驟11、分別取轉(zhuǎn)入PIC6-0U核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入PIC6-0U取代核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入PIC6-0U缺失核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入PIC6-1b核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入天然序列的玉米植株和野生型玉米植株的葉片各lOOmg，分別在研缽中用液氮研成勻漿，每個樣品取3個重復(fù)；步驟12、使用Qiagen的DNeasy Plant Mini Kit提取上述樣品的基因組DNA,具體方法參考其產(chǎn)品說明書；步驟13、用NanoDrop 2000 (Thermo Scientific)測定上述樣品的基因組DNA濃度；步驟14、調(diào)整上述樣品的基因組DNA濃度至同一濃度值，所述濃度值的范圍為80_100ng/μ I ；步驟15、采用Taqman探針熒光定量PCR方法鑒定樣品的拷貝數(shù)，以經(jīng)過鑒定已知拷貝數(shù)的樣品作為標準品，以野生型玉米植株的樣品作為對照，每個樣品3個重復(fù)，取其平均值；熒光定量PCR引物和探針序列分別是以下引物和探針用來檢測PIC6-0U核苷酸序列、PIC6-0U取代核苷酸序列、PIC6-0U缺失核苷酸序列和PIC6-1b核苷酸序列引物I (CFl) :ACCAGGACAAGCACCAGAGC 如序列表中 SEQ ID NO: 12 所示；引物2 (CRl) CTTCAGGCTGTCGGTGCTG 如序列表中 SEQ ID NO: 13 所示；探針I(yè) (CPl) AGCAGCAACGCCAAGGTGGACAAG 如序列表中 SEQ ID NO: 14 所示；以下引物和探針用來檢測天然序列引物3 (CF2) CAAACAGGTATTGGTATTGCGG 如序列表中 SEQ ID NO: 15 所示；引物4 (CR2) CCCTTAGGCCATAGCTCACCT 如序列表中 SEQ ID NO: 16 所示；探針2 (CP2) CTTGGTACCCTAGGCGTTCCTTTTGCAG 如序列表中 SEQ ID NO: 17 所示；PCR反應(yīng)體系為
權(quán)利要求
1.一種殺蟲蛋白質(zhì)，其特征在于，包括(a)如SEQID NO:2所示的第1-650位氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；或(b)如SEQID NO:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；或(c)在(a)或(b)中的氨基酸序列經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸且具有殺蟲活性的由(a)或(b)衍生的蛋白質(zhì)；或(d)與(a)或(b)中的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述殺蟲蛋白質(zhì)，其特征在于，所述殺蟲蛋白質(zhì)為與SEQID N0:2的第1-650位具有至少95%序列同一性的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)或與SEQ ID N0:2具有至少95%序列同一性的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述殺蟲蛋白質(zhì)，其特征在于，所述殺蟲蛋白質(zhì)為與SEQID N0:2的第1-650位具有至少99%序列同一性的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)或與SEQ ID N0:2具有至少99%序列同一性的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。
4.一種殺蟲基因，其特征在于，包括Ca)編碼權(quán)利要求1-3任一項所述殺蟲蛋白質(zhì)的核苷酸序列；或(b)在嚴格條件下與(a)限定的核苷酸序列雜交且編碼具有殺蟲活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列；或(c)具有SEQID NO:1的第1-1950位所示的核苷酸序列；或Cd)具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
5.一種表達盒，其特征在于，包含在有效連接的調(diào)控序列調(diào)控下的權(quán)利要求4所述殺蟲基因。
6.一種包含權(quán)利要求4所述殺蟲基因或權(quán)利要求5所述表達盒的重組載體。
7.一種包含權(quán)利要求4所述殺蟲基因或權(quán)利要求5所述表達盒的轉(zhuǎn)基因宿主生物，其特征在于，包括植物細胞、動物細胞、細菌、酵母、桿狀病毒、線蟲或藻類。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述轉(zhuǎn)基因宿主生物，其特征在于，所述植物為玉米、大豆、棉花、水稻、小麥、高粱、牧草或甘蔗。
9.一種產(chǎn)生殺蟲蛋白質(zhì)的方法，其特征在于，包括獲得權(quán)利要求7或8所述轉(zhuǎn)基因宿主生物的細胞；在允許產(chǎn)生殺蟲蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)基因宿主生物的細胞；回收所述殺蟲蛋白質(zhì)。
10.一種用于增加昆蟲靶范圍的方法，其特征在于，包括將權(quán)利要求1-3任一項所述殺蟲蛋白質(zhì)或權(quán)利要求5所述表達盒編碼的殺蟲蛋白質(zhì)在植物中與至少一種不同于權(quán)利要求1-3任一項所述殺蟲蛋白質(zhì)或權(quán)利要求5所述表達盒編碼的殺蟲蛋白質(zhì)的第二種殺蟲核苷酸一起表達。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述用于增加昆蟲靶范圍的方法，其特征在于，所述第二種殺蟲核苷酸可以編碼Cry類殺蟲蛋白質(zhì)、Vip類殺蟲蛋白質(zhì)、蛋白酶抑制劑、凝集素、α _淀粉酶或過氧化物酶。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述用于增加昆蟲靶范圍的方法，其特征在于，所述第二種殺蟲核苷酸為抑制目標昆蟲害蟲中重要基因的dsRNA。
13.—種產(chǎn)生抗蟲植物的方法，其特征在于，包括將權(quán)利要求4所述殺蟲基因或權(quán)利要求5所述表達盒或權(quán)利要求6所述重組載體導(dǎo)入植物。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述產(chǎn)生抗蟲植物的方法，其特征在于，所述植物為玉米、大豆、棉花、水稻、小麥、高粱、牧草或甘蔗。
15.一種用于保護植物免受由昆蟲害蟲引起的損傷的方法，其特征在于，包括將權(quán)利要求4所述殺蟲基因或權(quán)利要求5所述表達盒或權(quán)利要求6所述重組載體導(dǎo)入植物，使導(dǎo)入后的植物產(chǎn)生足夠保護其免受昆蟲害蟲侵害量的殺蟲蛋白質(zhì)。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述用于保護植物免受由昆蟲害蟲引起的損傷的方法，其特征在于，所述植物為玉米、大豆、棉花、水稻、小麥、高粱、牧草或甘蔗。
17.—種控制昆蟲害蟲的方法,其特征在于,包括使昆蟲害蟲與抑制量的權(quán)利要求1-3任一項所述殺蟲蛋白質(zhì)或由權(quán)利要求4所述殺蟲基因編碼的昆蟲抑制性蛋白質(zhì)接觸。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述控制昆蟲害蟲的方法，其特征在于，所述昆蟲害蟲是鱗翅目昆蟲害蟲。
19.一種由包含權(quán)利要求4所述殺蟲基因的核苷酸序列編碼的雜合殺蟲蛋白質(zhì)。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述雜合殺蟲蛋白質(zhì)，其特征在于，所述雜合殺蟲蛋白質(zhì)是由如SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列編碼的。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種殺蟲蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途，殺蟲蛋白質(zhì)包括(a)如SEQ ID NO:2所示的第1-650位氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；或(b)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；或(c)在(a)或(b)中的氨基酸序列經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸且具有殺蟲活性的由(a)或(b)衍生的蛋白質(zhì)；或(d)與(a)或(b)中的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。本發(fā)明殺蟲蛋白質(zhì)不僅表達量高且穩(wěn)定性好，對昆蟲害蟲的毒力強。
文檔編號C12N1/21GK102993281SQ20121047023
公開日2013年3月27日 申請日期2012年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月19日
發(fā)明者程鵬, 張愛紅, 李勝兵, 張云珠, 韓玉, 楊進孝, 黃金存, 張成偉, 葉云, 李運亭 申請人:北京大北農(nóng)科技集團股份有限公司, 北京大北農(nóng)科技集團股份有限公司生物技術(shù)中心