專利名稱：用于治療過(guò)敏的屬于歐蓍草(Parietaria judaica)脂質(zhì)轉(zhuǎn)移家族的低變應(yīng)原的嵌合蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于預(yù)防和治療過(guò)敏，尤其是花粉過(guò)敏，更尤其是由脂質(zhì)轉(zhuǎn)移家族的變應(yīng)原引起的過(guò)敏，更為具體的是在墻草屬(Parietaria)的花粉中發(fā)現(xiàn)的變應(yīng)原。
背景技術(shù)：
I型過(guò)敏在工業(yè)化國(guó)家中是重要的健康問(wèn)題。這一類型的過(guò)敏是由于對(duì)空氣中載有的抗原形成了 IgE抗體而導(dǎo)致。這些IgE抗體與肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞相互作用，釋放出生物介體例如組胺，并在約20%的人群中導(dǎo)致過(guò)敏性鼻炎，結(jié)膜炎和支氣管哮喘[(I)Miyamoto,T. (1992)。Increased prevalence of pollen allergy in Japan.1n Advancesin Allergology and Clinical Immunology. P. Godard,J. Bousquet,and F. B. Michel,eds.(Cornforth, UK The Parthenon Publishing Group), pp.343-347]。特異性免疫療法(SIT)是一種對(duì)由特定抗原引發(fā)的過(guò)敏性反應(yīng)的有效治療方法，它基本上是由通過(guò)定期給藥來(lái)調(diào)節(jié)患者體內(nèi)的免疫應(yīng)答，增加產(chǎn)生過(guò)敏的蛋白質(zhì)(變應(yīng)原提取物)的濃度組成。以高劑量注射的變應(yīng)原會(huì)誘導(dǎo)由抗原-遞呈細(xì)胞合成大量的IL-12，例如樹(shù)枝狀細(xì)胞，這種細(xì)胞優(yōu)先促進(jìn)T細(xì)胞的發(fā)育，而這些T細(xì)胞是與ThI或ThO協(xié)同的處女型細(xì)胞(nTH)。這使得從與Τη2細(xì)胞相關(guān)的過(guò)敏應(yīng)答類型的免疫應(yīng)答向ΤΗ1/ΤΗ0型的應(yīng)答偏離，從而導(dǎo)致生成高水平的 IFN-Y [ (2) Akdis, C. A. and Blaser, K. (2000) Mechanisms ofallergen-specific immunotherapy. Allergy 55,522-530]。在產(chǎn)生免疫抑制因子細(xì)胞因子IL-10和TGF-β的調(diào) 節(jié)T細(xì)胞(TkI)的影響之下，通過(guò)誘導(dǎo)ΤΗ2記憶細(xì)胞的耐受(無(wú)反應(yīng)性或克隆缺失)而使免疫偏離得以加強(qiáng)[(3)Akdis7C. A. ,Joss,A. ,Akdis7M. ,and Blaser,K. (2001)oMechanism of IL-10 induced cell inactivation in allergic inflammationand normal response to allergens.1nt. Arch Allergy Immunol. 124 ; 180-182] 0TH2細(xì)胞的活化和增殖的減少伴隨B細(xì)胞導(dǎo)致的IL-4以及IgE的減少。TH2細(xì)胞的活性和浸潤(rùn)進(jìn)鼻和支氣管粘液的減少引起IL-5合成的減少，從而減少了嗜伊紅粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，這導(dǎo)致了炎性介體如MBP和ECP蛋白的釋放的更大的減少。優(yōu)勢(shì)表型抗原ThO的T細(xì)胞的新的特異性克隆產(chǎn)生了 ThI和Th2型細(xì)胞因子的混合物，其促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生大量的特異性IgG抗原抗體。另一方面，高水平的IL-10誘導(dǎo)了大量特異性IgG4抗原抗體的合成。這兩種類型的特異性抗體可用作封閉抗體來(lái)提供IgE抗體與它們的受體在肥大細(xì)胞中的交叉，從而抑制組胺的脫粒和釋放[⑷Moverate，R. (2003)。Immunological mechanisms of specific immunotherapywith pollen vaccines !implications for diagnostics and the development ofimproved vaccination strategies. Expert Rev. Vacc. 2, 85-97 ； (5)ffachholz, P. A.,Soni, N. K. , Till, S. , and Durham, S. R. (2003).1nhibition of allergen-1gE bindingto B cells by IgG antibodies after grass pollen immunotherapy. J. Allergy Clin.1mmunol. 112 ;915_922]。它們還通過(guò)含抗原的細(xì)胞來(lái)阻止IgE-介導(dǎo)的抗原的聚積,而這抑制了對(duì)抗原的免疫反應(yīng)。從天然源分離出的變態(tài)反應(yīng)原提取物為蛋白質(zhì)和其他分子的復(fù)雜混合物。它們的組成，進(jìn)而變應(yīng)原性取決于使用的材料，并隨環(huán)境條件，花粉的成熟狀態(tài)以及真菌類中螨類等的生長(zhǎng)條件。一些提取物中甚至可含有濃度不足的主要變應(yīng)原，且甚至可被一些對(duì)患者不過(guò)敏的不期望的成分污染，或者兩種情況。目前的免疫療法完全使用全變態(tài)反應(yīng)原提取物，而這導(dǎo)致了許多問(wèn)題，如-由于疫苗與效應(yīng)物分子的IgE的反應(yīng)所致的嚴(yán)重的不良反應(yīng)。-免疫療法后在疫苗中出現(xiàn)對(duì)其他變應(yīng)原的新的致敏作用。-難以標(biāo)準(zhǔn)化變態(tài)反應(yīng)原提取物。所有的這些意味著免疫療法不是期望的安全有效的治療方法。對(duì)過(guò)敏的發(fā)病機(jī)理以及特異性免疫療法的機(jī)理的更好的認(rèn)識(shí)使得能夠更進(jìn)一步地解決上述提及的問(wèn)題。對(duì)IgE-介導(dǎo)的抗原在特異性變態(tài)反應(yīng)原應(yīng)答Th2中的影響的認(rèn)識(shí)增加了人們對(duì)產(chǎn)生不結(jié)合到IgE上的變應(yīng)原的嘗試。目前的特異性療法的主要目標(biāo)是對(duì)變態(tài)反應(yīng)原進(jìn)行改性，旨在使IgE表位失活，從而減少甚至消除對(duì)IgE的結(jié)合以及隨之引起的不良反應(yīng)[(6)Valenta, R. and Linhart, B. (2005)。Molecular design of allergy vaccines. Curr.Opin.1mmunol. 17,1-10]。這樣,改性的變態(tài)反應(yīng)原將通過(guò)吞曬/胞飲作用-介導(dǎo)的抗原收集機(jī)制而被引向T細(xì)胞，從而防止了 IgE交叉和IgE-依賴的抗原的遞呈。這誘導(dǎo)了通過(guò)T細(xì)胞的ThO或ThI細(xì)胞因子的產(chǎn)生的平衡，通過(guò)B細(xì)胞的IgE的產(chǎn)生減少而IgG的產(chǎn)生增加了 ；所有的這些將導(dǎo)致在無(wú)過(guò)敏性反應(yīng)的危險(xiǎn)之下誘導(dǎo)出Th2型T細(xì)胞耐受性。在獲得變態(tài)反應(yīng)原和變態(tài)反應(yīng)原衍生物的重組方法中的進(jìn)展使得研發(fā)新的用于治療過(guò)敏的疫苗的能力大大增加。 由于可能對(duì)IgE表位的重要氨基酸進(jìn)行突變或缺失，以及對(duì)其進(jìn)行分級(jí)分離和低聚作用，獲得低變應(yīng)原疫苗是可能的。這些分子具有較低的結(jié)合至IgE的能力但保持了它們對(duì)T細(xì)胞的反應(yīng)性，可以較大劑量使用，能夠用較少次數(shù)注射獲得更快更安全的免疫療法。此外，重組的變應(yīng)原可在發(fā)酵罐中使用微生物表達(dá)體系來(lái)大規(guī)模生產(chǎn)，且其純化比它們的天然等同物更為有效和廉價(jià)。低變應(yīng)原的衍生物在免疫療法中的使用先前已用 Bet V I 的三聚體片段[(7) Niederberger, V.，Horak, F.，Vrtala, S.，Spitzauer,
S., Krauth, Μ. T. , Valent, P. , Reisinger, J. , Pelzmann, Μ. , Hayek, B. , Kronqvist, Μ.,Gafvelin, G. , GiOilkind, H. , Purohit, A. , Suck, R. , Fiebig, H. , Cromwell, 0. , Pauli,G. , van Hage-Hamsten, Μ. , and Valenta, R. (2004)。 Vaccination with geneticallyengineered allergens prevents progression of allergic disease. Proc. Natl.Acad. Sc1.U. S. A. 101，14677-14682]、蜂毒蛋白(Api m 1,2,3)的多變應(yīng)原的雜合體[(8)Schmid-Grendelmeier, P. , Karamloo, F. , Miiller, U. , Housley—Marcovic, Z. , Soldatova,L. , Zumkehr, J. , Kemeny, D. Μ. , Kiindig, Τ. , Reimers, A. , von Beust, B. R. , Salagianni, Μ.,Akdis, Μ. , Kussebi, F. ,Spangfort,Μ. D. ,Blaser, K. , and Akdis, C. Α. (2005). Preventionof allergy by a recombinant mult1-allergen vaccine with reduced IgE binding andpreserved T cell epitopes. Eur. J.1mmunol. 35, 3268-3276]和以消除其三級(jí)結(jié)構(gòu)的Par j2和Parj I的突變?nèi)诤象w進(jìn)行了描述。一些作者提到，變應(yīng)原疫苗不應(yīng)用低變應(yīng)原制備，這是由于對(duì)IgE的結(jié)合可助于專門(mén)的抗原遞呈細(xì)胞的變應(yīng)原的捕獲和遞呈，如表達(dá)具有高親和力和低親和力的IgE的表面受體的樹(shù)突狀細(xì)胞和活化的B淋巴細(xì)胞。該方法當(dāng)在免疫療法中使用舌下途徑時(shí)具有特別的意義。高親和性受體的交叉也可導(dǎo)致T細(xì)胞對(duì)變應(yīng)原應(yīng)答的減少[(9)Allam，J.P.，Novak, N.，F(xiàn)uchs, C.，Asen，S.，Berge，S.，Appel, T.，et al. (2003)Characterizationof dendritic cells from human oral mucosa a new Langerhans! cell type withhigh constitutive Fe ε RI expression. J.Allergy Clin.1mmunol. 112，141-8. (10)von Bubnoff, D.，Matz, H.，F(xiàn)rahnert，C.，Rao, M. L.，Hanau, D.，de la Salle, H.，Bieber, T. (2003)Fe ε RI induces the triptophan degradation pathway involved inregulating T cell responses. J.1mmunol. 169，1810-1816]。許多研究者仍在不引入缺失時(shí)制備這種類型的疫苗[(Il)Batard, T.，Didierlaurent，A.，Chabre, H.，Mothes, N.，Bussieres, L ， Bohle, B. ， et al. (2005)Characterization of wild-type recombinantBet V la as a candidate vaccine against birch pollen allergy.1nt. Arch. AllergyImmunol. 136，239-249. (12) Jutel, M.，Jaeger, L.，Suck，R.，Meyer, H.，F(xiàn)iebig，H.，Cromwell,0. (2005)Allergen-specific immunotherapy with recombinant grass pollenallergens. J. Allergy Clin.1mmunol. 116, 608-13. (13) Niederberger，V.，Horak, F.，Vrtala, S.，Spitzauer, S .，Krauth, M. T.，Valent, P.，et al. (2004) Vaccination withgenetically engineered allergens prevents progression of allergic disease.Proc. Natl. Acad. Sc1.U. S. A. 101，14677-82. (14) Cromwell，0.，F(xiàn)iebig, H.，Suck，R.，Kahlert，H. ，Nandy，A. ，Kettner，J. ，et al. (2006)Strategies for recombinant allergenvaccines and fruitful results from first clinical studies.1mmunol. Allergy Clin.N. Am. 26，261-81]。墻草屬(Parietaria)是蕁麻目蕁麻科家族的雙子葉雜草屬，。墻草屬中的很多種廣泛和大量的分布在地中海海岸[(15) Colombo，P.，Duro, G.，Costa, Μ. A.，Izzo，V.，Mirisola，M.，Locorotondo，G.，Cocchiara，R.，and Geraci, D. (1998)。An update onallergens. Parietaria pollen allergens. Allergy 53，917-921]。最常見(jiàn)的種為歐蓄草(P. judaica)和藥用墻草(P. officinalis)，但其他的種 P. lusitanica、P. mauritanica 和P. cretica可在于一些地區(qū)有一些存在。然而，地中海區(qū)域并不是唯一可發(fā)現(xiàn)墻草屬花粉的地方，因?yàn)橛羞@種花粉存在于英格蘭南部，奧地利，中歐和東歐的溫帶區(qū)域，澳大利亞和加利福尼亞的描述[(16) Colombo，P.，Bonura, A.，Costa, Μ.，Izzo, V.，Passantino，R.，Licorotondo， G. ， Amoroso， S. ， and Gerasi, D. (2003)。 The allergens of Parietaria.1nt. Arch. Allergy Immunol. 130，173-179 ; (17)Carreira，J. and Polo，F(xiàn). (1995). Theallergens of Olea europaea and Parietaria spp.and their relevance in theMediterranean Area. Allergy Clin.1mmunol. News 7, 79-84].墻草屬的一個(gè)顯著特征是持續(xù)長(zhǎng)達(dá)數(shù)月的授粉期，從而導(dǎo)致在對(duì)墻草屬過(guò)敏的患者中出現(xiàn)幾乎常年性的癥狀，這些癥狀范圍為從較輕的鼻結(jié)膜炎到嚴(yán)重的哮喘。應(yīng)當(dāng)注意的是，由于在墻草屬的不同種之間表現(xiàn)出顯著的交叉反應(yīng)性，正常的對(duì)墻草屬的輕微的單特異性致敏作用包括對(duì)該屬中各種不同種的致敏作用。
已有對(duì)兩種最常見(jiàn)的種歐蓍草(P. judaica)和藥用墻草(P. off icinalis)的變應(yīng)原餾分純化和表征的各種論文。這些餾分的分子量在IO-HkDa的范圍，并實(shí)際上涉及它們的提取物的全部變應(yīng)原力。The allergens of Parietaria.1nt. Arch. AllergyImmunol. 130，173-179 ； (18) Ayuso，R.，Carreira，J.，Lombardero, M.，Duffort，0.，Peris,A. ,Basomba,A. ,and Polo,F. (1993).1solation by mAb based affinity chromatographyof two Par j isoallergens. Comparison of their physicochemical, immunochemicaland allergenic properties. Mol.1mmunol. 30，1347-1354 ； (19)Polo，F(xiàn).，Ayuso, R.，andCarreira,J. (1990). HPLC purification of the main allergen of Parietaria judaicapollen. Mol.1mmunol. 27，151-157 ； (20) Polo，F(xiàn).，Ayuso, R.，and Carreira，J. (1991).Studies on the relationship between structure and IgE—binding ability ofParietaria judaica allergen1. Mol.1mmunol. 28，169-175].重組 DNA 技術(shù)的發(fā)展使得能夠?qū)Σ輰倩ǚ圩儜?yīng)原的分子表征得以完成歐蓍草花粉的兩種主要變應(yīng)原Parj I和Parj 2 已被克隆和測(cè)序[(21) Duro, G.，Colombo，P.，Costa, Μ. A.，Izzo, V.，Porcasi，R.，DiFiore, R.，Locorotondo，G.，Mirisola，M. G.，Cocchiara，R.，and Geraci, D. (1996).cDNA cloning， sequence analysis and allergological characterization of Par j2.0101，a new major allergen of the Parietaria judaica pollen. FEBS Lett. 399,295-298 ； (22)Costa,M. A. , Colombo,P. ,Izzo,V. , Kennedy,H.，Venturella，S. ,Cocchiara,R.，Mistrello，G.，F(xiàn)alagiani，P.，and Geraci, D. (1994). cDNA cloning expression andprimary structure of Par j I， a major allergen of Parietaria judaica pollen.FEBS Lett. 341，182-186 ； (23)Amoresano，A.，Pucci, P.，Duro, G.，Colombo，P.，Costa,M. A.，Izzo, V.，La`mbda，D.，and Geraci，D. (2003). Assignment of disulphide bridgesin Par j 2.0101，a major allergen of Parietaria judaica pollen.Biol. Chem. 384,1165-1172]。兩種變應(yīng)原均屬于非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白(ns-LTP)家族，并在它們的末端區(qū)域具有信號(hào)肽，加工后產(chǎn)生分子量分別為14，726和11，344Da的蛋白質(zhì)并具有約45%的相同殘基。已描述了在兩種抗原中可能的可能位于結(jié)構(gòu)相關(guān)區(qū)域內(nèi)的IgE-結(jié)合線性表位[(24) Asturias，J. A.，Gomez-Bayon, N.，Eseverri, J. L.，and Martinez, A. (2003). Par j
Iand Par j 2，the major allergens from Parietaria judaica pollen, have similarimmunoglobulin E epitopes. Clinical and Experimental Allergy 33，518-524]。這些區(qū)域是為能獲得最佳低變應(yīng)原分子來(lái)治療對(duì)歐蓍草花粉過(guò)敏而被作用的靶。ns-LTP因能夠離體完成膜間交換和/或傳遞極性脂質(zhì)而著稱。[(25)van Ree,R. (2002). Clinical importance of non-specific lipid transfer proteins as foodallergens. Biochem. Soc. Trans 30，910-913]。在植物中已表征了兩個(gè)主要的家族，它們是分子量約為9kDa的LTPl和分子量約為7kDa的LTP2。屬于LTP家族的變應(yīng)原已在除食物外的植物中被鑒定，在這些植物中對(duì)它們已進(jìn)行了廣泛的研究。因此，來(lái)自巴西橡膠樹(shù)(hevea brasiliensis)乳膠的Hev b 12為9. 3kDa的堿性蛋白質(zhì)，其顯不出與薔薇科果實(shí)中的變應(yīng)原 LTP 約 65% 的序列同一性[(26) Beezhold, D. H.，Hickey，V. L，Kostyal，D. A. , and et al. (2003). Lipid transfer protein from Hevea brasiliensis (Hev b12), a cross-reactive latex protein. Ann Allergy Asthma Immunol 439-445]。此夕卜，一些花粉變應(yīng)原被描述為L(zhǎng)TP，例如北艾蒿(Artemisia vulgaris)的Art v 3[(27)Diaz-Perales,A. ,Lombardero,M. ,Sanchez-Monge,R. , and et al. (2000). Lipid-transferproteins as potential plant panallergens cross-reactivity among proteins ofArtemisia pollen, Castanea nut and Rosaceae fruits, with different IgE—bindingcapacities. Clin Exp Allergy 1403-1410]以及油撤攬(Olea europaea)的Ole e 7[(28)Tejera, M. L. , Villalba, Μ. , Batanero, Ε. , and Rodriguez, R. (1999).1dentification,isolation, and characterization of Ole e7, a new allergen of olive tree pollen.J.Allergy Clin. Tmmunol. 797-802 ； (29)Rodriguez, R. , Villalba, Μ. , Batanero, Ε.,and et al. (2002)。Allergenic diversity of the olive pollen. Allergy 6-16],其為9-10kDa且與食物的變應(yīng)原的LTP具有30-55%的序列同一性。歐蓍草的主要變應(yīng)原ParjI和Parj 2，一方面相互之間具有約45%的序列同一性的，另一方面具有比LTP家族中的正常值高的分子量，分別為 14. 7 和 11. 3kDa[ (16) Colombo, P.，Bonura, A.，Costa, Μ.，Izzo,V. , Passantino, R. ,Licorotondo, G. , Amoroso, S. , and Gerasi,D. (2003). The allergensof Parietaria.1nt. Arch. Allergy Immunol. 130，173-179]。然而，盡管兩變應(yīng)原具有與LTP類似的結(jié)構(gòu)，它們卻在共有的序列區(qū)域具有與食物L(fēng)TP的中等水平的同一性(在ParjI和桃LTP之間為28% ) οW02005/085278公開(kāi)了含歐蓍草的兩種主要變態(tài)反應(yīng)原的融合蛋白的構(gòu)建物，其中融合蛋白的三維結(jié)構(gòu)通過(guò)取代每種抗原的一級(jí)序列中的一些半胱氨酸殘基(更具體的是涉及形成二硫鍵中的半胱氨酸)被破壞，從而使變應(yīng)原的序列維持在幾乎相同的長(zhǎng)度。根據(jù)后來(lái)的實(shí)驗(yàn)，這將得到比天然變應(yīng)原的變應(yīng)原性低1000倍的蛋白質(zhì)。

本發(fā)明的發(fā)明者們已發(fā)現(xiàn)，不僅通過(guò)破壞變態(tài)反應(yīng)原的三維結(jié)構(gòu)，而且通過(guò)使一些IgE-結(jié)合位點(diǎn)(已知為B表位)發(fā)生缺失可驚人的大大減少變應(yīng)原性，最令人吃驚的是，這不會(huì)導(dǎo)致免疫原性的降低。本發(fā)明首次公開(kāi)了通過(guò)將含少量IgE-結(jié)合表位的歐蓍草的兩種變應(yīng)原的片段(Parj I和Parj 2)結(jié)合獲得的不同的嵌合蛋白質(zhì)，以及獲得它們的不同的方法和中間體。不僅本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)被打斷，而且一些B表位被缺失。根據(jù)本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)可稱為低變應(yīng)原的嵌合蛋白質(zhì)，其變應(yīng)原性降低了 99. 99%，這是由于它們具有更低的結(jié)合IgE抗體的能力，這一結(jié)論基于i)離體的ELISA，使用對(duì)歐蓍草過(guò)敏的患者的血清混合物進(jìn)行ELISA抑制和免疫檢測(cè)測(cè)試；ii)在對(duì)歐蓍草過(guò)敏的患者體內(nèi)進(jìn)行皮膚反應(yīng)性的活體內(nèi)測(cè)試；以及iii)使用對(duì)歐蓍草過(guò)敏的患者的單一血清進(jìn)行離體EAST抑制測(cè)試。根據(jù)本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)在另一方面保持了它們的免疫原的能力，這通過(guò)對(duì)13名對(duì)歐蓍草過(guò)敏的患者的外周血單核細(xì)胞(CMSP)的淋巴細(xì)胞增殖測(cè)試得以證實(shí)。變應(yīng)原提取物為蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)分子的復(fù)雜混合物。用于檢測(cè)對(duì)提取物中的組份特異的IgE水平的技術(shù)，其使用的增多使得能夠證實(shí)過(guò)敏患者通常對(duì)多種組份產(chǎn)生反應(yīng)。僅對(duì)單一變態(tài)反應(yīng)原反應(yīng)的過(guò)敏患者的例子非常稀少。由于變應(yīng)原提取物在免疫療法中存在顯著的問(wèn)題，一種解決方法是盡可能地將多種治療性能組合在單個(gè)分子中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人成功地將兩種變應(yīng)原結(jié)合在一個(gè)分子中，這不僅從工業(yè)化生產(chǎn)和治療上受益，并且在不改變免疫原性之下還顯示出明顯降低的變應(yīng)原性。
出于這些原因，本發(fā)明涉及嵌合蛋白質(zhì)(后面稱作Q1，Q2，和Q3)，其由變應(yīng)原ParjI和Parj 2的片段組成，由于它們失去了一些IgE-結(jié)合B表位，因而它們的過(guò)敏應(yīng)答性被降低，但未失去免疫原的能力。這樣，所得的嵌合多肽就具有比兩個(gè)單獨(dú)的蛋白質(zhì)的總和低的分子量。本發(fā)明還涉及包含對(duì)前述嵌合多肽進(jìn)行編碼的DNA的核苷酸序列，表達(dá)體系包含具有表達(dá)和控制所需的序列的所述序列，以及由所述表達(dá)體系轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞。本發(fā)明還涉及該嵌合多肽的臨床應(yīng)用，用于治療過(guò)敏的特異性免疫療法，以及含有該嵌合多肽的可能的組合物，及其不同的施用方法。允許用于免疫治療的本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)的低變應(yīng)原的性能已經(jīng)被廣泛證實(shí)。由發(fā)明者們進(jìn)行的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，嵌合體Q2在不識(shí)別對(duì)歐蓍草過(guò)敏的患者血清中的IgE，這在圖10和11中示出。如圖12所示，Q2具有的IgE結(jié)合能力低于兩種天然蛋白質(zhì)混合物 10，000 倍。這一低變應(yīng)原性數(shù)據(jù)限制在通過(guò)在30名患者的皮膚點(diǎn)刺測(cè)試的活體實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。嵌合體Ql的變應(yīng)原性比由兩種分離的天然蛋白質(zhì)獲得的變應(yīng)原性低3. 5倍(圖13)。在另一方面，由Parj I和Parj 2片段形成的Q2，其不含有任何描述的B表位，變應(yīng)原性比兩種分離的天然蛋白質(zhì)獲得的變應(yīng)原性低的112倍。嵌合體Q2的低變 應(yīng)原性(IgE-結(jié)合能力)通過(guò)測(cè)量該分子與30名對(duì)歐蓍草過(guò)敏的患者的血清的反應(yīng)性而得以確證。這種在變應(yīng)原性上的降低出乎意料地伴隨著嵌合體Q2的免疫原能力的保持，這與單個(gè)天然蛋白質(zhì)的總和的免疫原能力沒(méi)有區(qū)別(圖16)。免疫原性的保持將使得該嵌合體用作完全提取物的替代品，但其安全性卻高的多(較低的變應(yīng)原性)。菌株的保藏根據(jù)國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏的布達(dá)佩斯條約，對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的微生物的菌株保藏于巴倫西亞大學(xué)(University of Valencia) (Universidad de Valencia,Edificio de Investigacion,Campus de Burjasot,46100 BURJASOT,Valencia)的西班牙典型培養(yǎng)物保藏中心(CECT)，并具有以下參考大腸桿菌(Escherichiacoli)，CECT 7141，，保藏于 2006 年 3 月 7 日。


圖1是Ql的構(gòu)建圖。圖2示出了 Ql的氨基酸和核苷酸序列。對(duì)應(yīng)于載體pQE-32的親和性尾部的殘基用下劃線表示。通過(guò)EcoRI (EF)部分引入的殘基用陰影表示。半胱氨酸殘基用雙下劃線表
/Jn ο圖3示出了 Parj I和Parj 2的IgE表位(方框)和T表位(下劃線)的對(duì)比,指出了位于粗方框內(nèi)的Q2缺失的表位。對(duì)相同的殘基()和類似的殘基(.)進(jìn)行了標(biāo)記。圖4是Q2的構(gòu)建圖。圖5示出了 Q2的氨基酸和核苷酸序列。對(duì)應(yīng)于載體pQE-32的親和性尾部的殘基用下劃線表示。通過(guò)EcoRI (EF)PstI (LQ)和EcorRV(DI)部分引入的殘基用陰影表示。半胱氨酸殘基用雙下劃線表示。
圖6示出了 Parj I和Parj 2的IgE表位(方框)和T表位(下劃線)的對(duì)比，表明了位于雙線方框內(nèi)的Q3缺失的表位。對(duì)相同的殘基()和類似的殘基(.)進(jìn)行了標(biāo)記。圖7是Q3的構(gòu)建圖。圖8示出了 Q3的氨基酸和核苷酸序列。對(duì)應(yīng)于載體pQE-32的親和性尾部的殘基用下劃線表示。通過(guò) EcoRI (EF)PstI (LQ)和 EcorRV(DI)，BglII (RS)，以及 KpnI (GT)部分引入的殘基用陰影表示。半胱氨酸殘基用雙下劃線表示。圖9示出了在電泳后用考馬斯藍(lán)對(duì)聚酰胺凝膠進(jìn)行染色的結(jié)果。Ql (帶I)，Q2 (帶2)，Q3 (帶 3)。圖10示出了對(duì)純化的蛋白質(zhì)nParj 1-nParj 2，Ql, Q2，和Q3的圓二色性分析結(jié)
果O圖11示出了用對(duì)歐蓍草過(guò)敏的患者的血清混合物的IgE抗體進(jìn)行的免疫檢測(cè)，包括nParj 1-nParj 2 (泳 道 I), rParj I (泳道 2), rParj 2 (泳道 3), Ql (泳道 4), Q2 (泳道5)，Q3 (泳道6)。圖12示出了使用15種對(duì)歐蓍草過(guò)敏的患者的血清(稀釋1/10)進(jìn)行的IgE抗體對(duì)Ql，Q2，和Q3的結(jié)合。示出了三次實(shí)驗(yàn)的值和它們的偏差。圖13示出了 ELISA抑制測(cè)試結(jié)果，用固相中的歐蓍草提取物以及nPar j1-Par j2，Q1，Q2，和Q3作為抑制劑，用對(duì)歐蓍草過(guò)敏的患者的血清混合物。每個(gè)值均對(duì)應(yīng)于三次實(shí)驗(yàn)的平均值，標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%。圖14示出了用歐蓍草提取物，nPar j1-Par j 2以及Ql (50 μ g/ml)，和Q3(250yg/ml)進(jìn)行的皮膚測(cè)試結(jié)果。示出的數(shù)值是斑點(diǎn)的面積，單位為mm2。圖15示出了用歐蓍草提取物，nPar j1-Par j 2以及Ql (50 μ g/ml)，和Q3(250 μ g/ml)進(jìn)行的特異性IgE的確定。圖16示出了用于研究在對(duì)歐蓍草過(guò)敏的患者中的T淋巴細(xì)胞增殖的的最佳濃度的確定。刺激指數(shù)(IE)。圖17示出了用歐蓍草提取物和0，5 μ g/ml三種嵌合蛋白質(zhì)以及Par j I和Par j2的天然的和重組的形式獲得的T淋巴細(xì)胞的增殖。顯示的數(shù)值是刺激指數(shù)(％)的數(shù)值。無(wú)顯著性差異(ns)。
具體實(shí)施例方式根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種具有低變應(yīng)原性的嵌合蛋白質(zhì)或肽，其通過(guò)缺失任何B表位或IgE-結(jié)合表位或通過(guò)合成出無(wú)任何B表位或IgE-結(jié)合表位得到而得到。缺失優(yōu)選針對(duì)Parj I和Parj 2的28-53處的B表位進(jìn)行。這里使用的術(shù)語(yǔ)“低變應(yīng)原性”及其類似變體為相對(duì)的術(shù)語(yǔ)，涉及與野生型免疫原的相同能力相比，本發(fā)明的蛋白質(zhì)或肽的活體內(nèi)和離體刺激過(guò)敏應(yīng)答的能力的降低。優(yōu)選的嵌合蛋白質(zhì)包含示于SEQ ID No. :2，4或6中的氨基酸序列，最優(yōu)選的嵌合蛋白質(zhì)包含示于SEQ ID No. :4中的氨基酸序列。嵌合蛋白質(zhì)可選地或可額外包含與示于SEQ ID No. :2，4或6中的氨基酸序列同源的序列。優(yōu)選的同源的序列與示于SEQ ID No. :2，4或6中的氨基酸序列，最優(yōu)選為與示于SEQ ID No. :4中的氨基酸序列具有至少為70%，更優(yōu)選為至少80%，更優(yōu)選為至少90%，最優(yōu)選為100%的同源性。另一種優(yōu)選的實(shí)施方式包括與不于SEQ ID No. :2,4或6中的氨基酸序列中具有至少為70%,優(yōu)選為至少80%,更優(yōu)選為至少90%,最優(yōu)選為100%的同源性的氨基酸序列的嵌合蛋白質(zhì)或肽。嵌合蛋白質(zhì)也可包含有助于其純化的肽序列。這種肽是本技術(shù)領(lǐng)域公知的，例如
聚組氨酸尾。構(gòu)成嵌合蛋白質(zhì)的片段可由合格培訓(xùn)的人員按照已知的方案通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增合成。所述片段，在被合適的限制性酶消化后，可通過(guò)連接至表達(dá)載體而進(jìn)行整合。該表達(dá)載體(如商用載體PQE32)可具有將嵌合蛋白質(zhì)與輔助純化的序列如位于末端氨基酸端的一系列組氨酸進(jìn)行融合的能力。在構(gòu)建嵌合蛋白質(zhì)期間，由不同的限制性酶識(shí)別的序列形成的接頭將不同的DNA片段結(jié)合在一起，而在天然變態(tài)反應(yīng)原的原始序列中不存在的殘基將出現(xiàn)在最終的嵌合分子中。這些不干涉正確讀取蛋白質(zhì)的新的殘基在圖2，5，和8中的序列中被標(biāo)記，并在相關(guān)的實(shí)施例中進(jìn)行了適當(dāng)?shù)拿枋?。類似地，嵌合體在氨基端的區(qū)域具有14個(gè)原始序列未出現(xiàn)的殘基，它們對(duì)應(yīng)于富含組氨酸的區(qū)域，其允許通過(guò)與結(jié)合至固體支持物的二價(jià)金屬相互作用而可實(shí)現(xiàn)快速純化。根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供了對(duì)本發(fā)明的蛋白質(zhì)或肽進(jìn)行編碼的多核苷酸。優(yōu)選地，多核苷酸含有示于SEQ ID No. : 1，3或5中的核苷酸序列，最優(yōu)選地，多核苷酸含有示于SEQ ID No. :3中的核苷酸序列。多核苷酸可可選地或附加地包含與示于SEQ ID No. :1，3或5中的多核苷酸序列同源的序列。優(yōu)選的同源的序列具`有的與示于SEQ ID No. :1，3或5中的氨基酸序列至少為70 %，更優(yōu)選為至少80 %，更優(yōu)選為至少90 %，最優(yōu)選為95 %的同源性。另一種優(yōu)選的實(shí)施方式包括與不于SEQ ID No. :1，3或5中的核苷酸序列具有至少為70 %，優(yōu)選為至少80 %，更優(yōu)選為至少90 %，最優(yōu)選為100 %的同源性的核苷酸序列的多核苷酸。多核苷酸可進(jìn)一步包含一對(duì)信號(hào)肽進(jìn)行編碼的序列。信號(hào)肽為一種引發(fā)蛋白質(zhì)跨內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜傳輸?shù)陌被嵝蛄小＿m合的信號(hào)肽為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。本發(fā)明還包括由本發(fā)明的多核苷酸序列編碼的肽。根據(jù)本發(fā)明的其他方面，提供了一種表達(dá)系統(tǒng)，其包含本發(fā)明的多核苷酸序列，以及被所述表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，其能夠表達(dá)本發(fā)明的蛋白質(zhì)或肽。本發(fā)明還包括制備本發(fā)明的肽或蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括以下步驟(i)制備能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)對(duì)本發(fā)明的蛋白質(zhì)或肽進(jìn)行編碼的核苷酸序列的可復(fù)制的表達(dá)系統(tǒng)；(ii)用所述表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；(iii)在允許表達(dá)所述蛋白質(zhì)或肽的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；以及(iv)任選地，回收所述的蛋白質(zhì)或肽。本發(fā)明還包括能夠產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白質(zhì)或肽的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，例如在它們的奶中或蛋中廣生。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了本發(fā)明的蛋白質(zhì)或肽在治療免疫疾病，特別是超敏性疾病如過(guò)敏中的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)方面，提供了本發(fā)明的蛋白質(zhì)或肽在制備治療免疫疾病，特別是超敏性疾病如過(guò)敏的藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選的藥物為疫苗。優(yōu)選地，超敏性疾病為對(duì)墻草屬花粉的過(guò)敏，更優(yōu)選的是對(duì)歐蓍草花粉的過(guò)敏。這里使用的術(shù)語(yǔ)治療以及其變體如“治療”或“治療的”是指可使人類或非人類動(dòng)物受益的療法。治療可以是針對(duì)現(xiàn)存癥狀的，或可以是預(yù)防疾病的(預(yù)防性治療)。治療可包括治愈，緩和或預(yù)防疾病的效果。優(yōu)選地，治療為預(yù)防治療。根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)方面，提供了一種藥物組合物，其包含有效量的本發(fā)明的蛋白質(zhì)或肽以及藥學(xué)上可接受的賦形劑。優(yōu)選的藥物組合物為疫苗組合物。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供了一種治療免疫疾病，特別是超敏性疾病如過(guò)敏的方法，所述方法包括向有需要的研究對(duì)象施用有效量的本發(fā)明的蛋白質(zhì)或肽。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了本發(fā)明的蛋白質(zhì)或肽在治療免疫疾病，特別是超敏性疾病如過(guò)敏中的應(yīng)用。對(duì)個(gè)體患者的合適的施用和劑量形式的選擇對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。本發(fā)明覆蓋了本發(fā)明的嵌合體，優(yōu)選為嵌合體Q2，或尤其衍生的合成的肽在哺乳動(dòng)物中進(jìn)行脫敏治療中的應(yīng)用。脫敏的方法涉及通過(guò)腸胃外途徑(皮下的，靜脈內(nèi)的，或肌肉的)，或口腔，鼻或直腸途 徑重復(fù)施用所述的變態(tài)反應(yīng)原。這些(多)肽可單獨(dú)施用或與其他稀釋劑組合，所依據(jù)的是當(dāng)前的法規(guī)和蓋倫制劑使用規(guī)程。在發(fā)明中描述的嵌合體蛋白Q2和Q3是低變應(yīng)原的因?yàn)樗鼈儗?duì)歐蓍草過(guò)敏的患者的血清的反應(yīng)性比全提取物或組合的天然蛋白質(zhì)低，如圖10，11，12和14所示，且這種低變應(yīng)原性在活體內(nèi)的皮膚測(cè)試中也有發(fā)現(xiàn)(圖13)。嵌合分子Ql和Q2也具有與組合的天然蛋白質(zhì)類似的免疫原能力(圖16)。這兩種特性(低變應(yīng)原性和免疫原性)使得嵌合體Q2成為對(duì)歐蓍草花粉過(guò)敏進(jìn)行預(yù)防和治愈的優(yōu)異的候選對(duì)象，這些過(guò)敏表現(xiàn)為如鼻炎，結(jié)膜炎，哮喘，蕁麻疹，血管性水腫，濕疹，皮炎，或者甚至為過(guò)敏性休克。對(duì)本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)的免疫學(xué)特性的描述將在后面給出。圖10示出的免疫檢測(cè)，表明在患過(guò)敏癥的患者中，嵌合體Q2和Q3(泳道5和泳道6)具有比兩種天然蛋白質(zhì)(泳道I)，分離的重組蛋白質(zhì)(泳道2和泳道3)或顯示為兩種完全且含有所有B表位的蛋白質(zhì)的重組融合嵌合體(帶4)大大降低的IgE-接合能力。應(yīng)當(dāng)指明的是，包括在殘基29和52之間的B表位(嵌合體Q2)缺失貢獻(xiàn)變應(yīng)原性的降低。當(dāng)對(duì)15種不同血清與嵌合蛋白質(zhì)的反應(yīng)性進(jìn)行調(diào)查時(shí)獲得了類似的結(jié)果(圖11)。嵌合蛋白質(zhì)Q2和Q3具有比Ql中觀察到的在兩種完整變態(tài)反應(yīng)原(Parj1-Parj 2)的結(jié)合性低得多的反應(yīng)性。該變應(yīng)原性的降低通過(guò)ELISA抑制采用來(lái)自對(duì)歐蓍草過(guò)敏患者的血清混合物來(lái)進(jìn)行定量(圖12)。需要比兩種天然蛋白質(zhì)混合物多10，000倍的蛋白質(zhì)Q2來(lái)達(dá)到60%提取物的抑制。因此，可以推斷，其比天然蛋白質(zhì)的變應(yīng)原性低10，000倍，且比嵌合蛋白質(zhì)Ql的變應(yīng)原性低約20倍。對(duì)嵌合體Q2的低變應(yīng)原性的更為直接的測(cè)量可通過(guò)直接對(duì)30名對(duì)歐蓍草花粉過(guò)敏的患者的皮膚反應(yīng)性測(cè)量來(lái)獲得。圖13中給出的數(shù)據(jù)表明，嵌合體Q2在皮膚反應(yīng)性上有顯著降低。對(duì)各分布的描述進(jìn)行的比較表明，嵌合體Q2具有的平均斑點(diǎn)大小比兩種天然蛋白質(zhì)中觀察到的小112倍，這意味著致敏性活性降低了超過(guò)99%。IgE與嵌合蛋白質(zhì)Q2的低結(jié)合能力也通過(guò)進(jìn)一步的30名對(duì)歐蓍草花粉過(guò)敏患者的單血清的EAST測(cè)量得以證實(shí)(圖14)。在所有的患者中，與天然蛋白質(zhì)的混合物相比，嵌合體Q2中的IgE-結(jié)合均大大降低。這種在IgE-結(jié)合能力上的大大降低以及因此由于B表位缺失而誘發(fā)不良反應(yīng)的能力卻伴隨著免疫原能力的維持。蛋白質(zhì)Q2表現(xiàn)出的淋巴增殖指數(shù)與天然提取物以及兩種純天然蛋白質(zhì)組合的混合物引起的淋巴增殖指數(shù)類似，這在圖16中示出。所有的這些都顯示出用片段Parj I和Parj 2構(gòu)建的嵌合蛋白質(zhì)Q2含有更少的IgE表位,但仍保持了足夠以激發(fā)保護(hù)性免疫應(yīng)答的T表位。通過(guò)以下與本發(fā)明的制備和其性質(zhì)展示的實(shí)驗(yàn)階段相關(guān)的實(shí)施例，將對(duì)本發(fā)明有更好的理解。這些實(shí)施例僅為示例性的，并不對(duì)本發(fā)明構(gòu)成限制。實(shí)施例1 :Q1, Q2,和Q3融合體的構(gòu)津嵌合蛋白質(zhì)是通過(guò)聚合酶的鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)(PCR)，使用含有對(duì)Parj 1.0103和Parj 2. 0101編碼的序列的質(zhì)粒作為基質(zhì)以及在每個(gè)例子中的具體引發(fā)劑構(gòu)建的，其中 Parj1. 0103 和 Parj 2. 0101 描述于 Gonzcilez-Rioja 等人的 “Expression andpurification of the recombinant allergens Par j land Par j 2，，XXIII CongresoEAACI,Abstracts Book(2004)，181-182中。引發(fā)劑各種不同限制性內(nèi)切核酸酶(下劃線)的切斷位點(diǎn)的雜交區(qū)，以及一些錨定核苷酸組成。PCR-引起的擴(kuò)增反應(yīng)在50 μ I的反應(yīng)體積內(nèi)具有以下組分?jǐn)U增緩沖液χ10，5μ I ;200μΜ的dNTPs ；100皮摩爾的各種引發(fā)寡核苷酸2. 5單位的聚合酶Taq(Pfx DNA聚合酶，Invitrogen) ；lng DNA基質(zhì)和使體積達(dá)到50 μ I的無(wú)菌蒸懼水.擴(kuò)增反應(yīng)在RoboCycler熱循環(huán)儀(Stratagene)中進(jìn)行,反應(yīng)進(jìn)行具體條件將在每個(gè)情 況中在下面描述。將反應(yīng)產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠(2%)中進(jìn)行電泳，用Geneclean(BiolOl)按廠商描述的方法從凝膠中分離出目的帶。分離出的片段用合適的限制性酶進(jìn)行消化，并連接到用相同的酶消化過(guò)的pBluescript載體上。連接混合物被用于對(duì)大腸桿菌DH5a的感受態(tài)細(xì)胞(來(lái)自Invitrogen, Paisley, UK)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。使所得菌落進(jìn)行生長(zhǎng)以分離出它們的質(zhì)粒DNA，其用適合的酶來(lái)消化以釋放出目的片段。選擇陽(yáng)性克隆對(duì)之進(jìn)行測(cè)序。插入到pBluescript中的DNA的測(cè)序是通過(guò)使用突光二脫氧核苷酸的改進(jìn) Sanger，s法[(30)Hanahan, D. (1983). Studies on transformation of Escherichiacoli with plasmids. J. Mol. Biol. 166, 557-580],在熱循環(huán)儀中用 PRISM Ready ReactionDiDeoxy Termination Cycle Sequencing Kit (Perkin Elmer)按廠商說(shuō)明進(jìn)行的。A)嵌合蛋白質(zhì)Ql在此例中，兩種蛋白質(zhì)(Parj I和Par j 2)的完全序列被融合，以獲得具有去穩(wěn)定的三級(jí)結(jié)構(gòu)但保持了其完整的連續(xù)IgE表位的蛋白質(zhì)。為了獲得稱為Ql的構(gòu)建物，使用克隆進(jìn)載體KS-Bluescript中的Parj I^PParj 2的cDNA作為基質(zhì)。為了融合兩個(gè)序列，需要具有接頭，在EcoRI靶的情況，為在Parj I序列的C-末端和在Parj 2序列的N-末端，來(lái)完成片段的隨后連接。所述靶被添加到相應(yīng)的合成寡核苷酸(F1R1和F1F2)，并整合到PCR過(guò)程中擴(kuò)增的片段中。使用的合成寡核苷酸
片段1:F1F1，CG GGATCC TGCAAGAAACCTGCGG(BamHI)和 FlRl，CG GAATTCGGCTTTTTCCGGTGCGG (EcoRI)。條件94 °C，4min (I 次循環(huán))；94 °C，30s_53 °C，30s_72 °C，90s (5 次循環(huán))；94V，30s-60°C，30s_72°C，90s (35 次循環(huán))-JTC，IOmin (I 次循環(huán))。片段2 :F1F2， CG GAATTC GAGGAGGCTTGCGGGA(EcoRI)和 F1R2， CG AAGCTTCTAATAGTAACCTCTGA(HindIII)。條件94°C,4min(l 次循環(huán));94°C，30s_51 °C，30s_72°C，90s (5 次循環(huán))；94V，30s-59°C，30s_72°C，90s (35 次循環(huán))；72V, IOmin (I 次循環(huán))。產(chǎn)生了分別對(duì)應(yīng)于Parj I和Par j 2的兩種PCR產(chǎn)物。對(duì)它們中的第一種(ParjI)，合成的寡核苷酸FlFl和FlRl分別用于N和C末端，獲得了大約420個(gè)堿基對(duì)(pb)的大小。經(jīng)擴(kuò)增的片段克隆在pKS-Bluescript載體中，且證實(shí)了它的序列。對(duì)與Parj 2相對(duì)應(yīng)的第二種片段，采用相同的程序，分別使用寡核苷酸F1F2和F1R3作為N和C末端。這種情況下，獲得了大約為300 pb的片段，將其克隆在pKS-Bluescript載體中，且證實(shí)了它的序列。通過(guò)EcoRI祀經(jīng)連接將該第二個(gè)片段接合到第一個(gè)片段上，Parj I在N-末端，Parj2在C-末端，所得片段隨后亞克隆在商用表達(dá)載體pQE-32 (Qiagen)中，該pQE_32在N-末端含有額外的相當(dāng)于親和尾的13個(gè)氨基酸序列(圖2)。所述序列編碼具有256個(gè)氨基酸且表觀分子量為28070Da的多肽。A)嵌合蛋白質(zhì) Q2當(dāng)獲得該嵌合體時(shí)，兩種蛋白質(zhì)的片段都被結(jié)合但不包括任何描述的連續(xù)的IgE表位[(18) Asturias, J. A, Gomez-Bayon, N. , Eseverri, J. L.，and Martinez, A. (2003). Parj I and Par j 2,the major allergens from Parietaria judaica pollen,have similarimmunoglobulin E epitopes. Clinical and Experimental Allergy 33, 518-524].設(shè)計(jì)出了包括以下片段的一些合成寡核苷酸Parj 1(殘基1-28和53-139的片段)和Parj 2(殘基1-28和53-103的片段)(圖3和圖4)。這樣，就消除了含IgE表位的序列部分。四種片段(每種變態(tài)反應(yīng)原各兩種)被擴(kuò)增用于該構(gòu)建物，且克隆在pKSBluescript載體中的Parj I和Parj 2的cDNA被用作基質(zhì)。新的蛋白質(zhì)的構(gòu)建機(jī)制是使用限制性酶(在此種情況為PstI，EcoRi和EcoRV)來(lái)進(jìn)行不同擴(kuò)增片段的連續(xù)接合。使用的合成寡核苷酸片段1:F1F1，CG GGATCC TGCAAGAAACCTGCGG(BamHI)和 F2R1，CG CTGCAGCCCCTTTGACGGCTCTT (PstI)。條件min (I 次循環(huán))；94V，30s_54°C，30s_72°C，90s (35 次循環(huán))；72°C，10min(l 次循環(huán))。片段2 :F2F2， CG CTGCAG ATCCAGACCGCCATGAA(PstI)和 F2R2， CG GAATTCGGCTTTTTCCGGTGCGGG(EcoRI)。片段3 :F2F3， CG GAATTC GAGGAGGCTTGCGGGAA(EcoRI)和 F2R3， CG GATATCCTCCTTCGACGGCTCCTT(EcoRV)。片段4 :F2F4，CG GATATC ATAGTGCGCGCCACGAA(EcoRV)和 F1R2，CG AAGCTTCTAATAGTAACCTCTGA (HindiII)。三種片段的條件是94 °C，4min (I 次循環(huán))；94 V，30s-54°C,30s-72°C,90s(5 次循環(huán))；94 °C, 30s-62 °C, 30s-72 °C , 90s (35 次循環(huán))；72°C,IOmin (I次循環(huán))。這些中的的第一個(gè)，其對(duì)應(yīng)于Parj I (片段I)，合成寡核苷酸FlFl和F2R1被分別用作N和C末端，獲得了大約為90個(gè)堿基對(duì)大小的片段并克隆在pKS-Bluescript載體中。對(duì)與Parj I相對(duì)應(yīng)的第二個(gè)片段，采用相同的步驟分別使用寡核苷酸F2F2和F2F2作為N和C末端。在這種情況下，獲得了大約為260pb的片段并克隆在pKS-Bluescript載體中。該最后一個(gè)片段由PstI攜帶的靶的接頭通過(guò)連接而結(jié)合到第一個(gè)片段上，且它的序列得到了證實(shí)。就由Parj 2(片段3和4)擴(kuò)增出的兩種片段而言，采用片段I和2中描述的程序。分別用于N和C末端的寡核苷酸F2F3/F2R3和F2F4/F1R4被用于它們的擴(kuò)增，片段3和4的PCR產(chǎn)物的大小約為90和150pb。片段4由EcoRV攜帶的靶的接頭通過(guò)連接而結(jié)合到片段3上，且它的序列得到了驗(yàn)證。在最后一步中，產(chǎn)生的兩個(gè)新片段(各自用于一種變態(tài)反應(yīng)原)由EcoRI攜帶的革巴的接頭通過(guò)連接而結(jié)合到一起，Parj I在N-末端而Parj 2在C-末端。所述片段隨后亞克隆在商業(yè)表達(dá)載體PQE-32中，該pQE-32在N-末端含有對(duì)應(yīng)于親和尾的額外13個(gè)氨基酸的序列(圖5)。所述序列對(duì)具有212個(gè)氨基酸且表觀分子量為23336Da的多肽進(jìn)行編碼。B)嵌合蛋白質(zhì)Q3最后的這個(gè)構(gòu)建物除了在這種情況以及試圖消除任何可能存在的IgE表位之外，基本上與Q2相同，存在于序列Parj I (殘基71-80)和Parj I (殘基72-81)(圖6和圖7)中的另外的額外的8個(gè)氨基酸序列被消除。使用的合成寡核苷酸片段1:F1F1，CG G GATCC TGCAAGAAACCTGCGG(BamHI)和 F3R1，CG AGATCTGACCTCGCTGACGAG(BglII)。片段2 :F3F2，CG AGATCT AGCAAGCTCCCGCCC (BglII)和 F3R2，CG GGTACCGGGGACCTCGGCGAC (KpnI)。2 種片段的條件是94 °C，4min (I 次循環(huán))；94 °C，30s_54 °C，30s-72°C，90s(5 次循環(huán));94°C，30s_63°C，30 s_72°C，90s (35 次循環(huán));72°C，IOmin (I 次
循環(huán))。片段3 F3F3, CG GGTACC CTCCCGCCCATCACC (Kpn I)和 F3R3，TTTAAAAAGGCCGTAATATCC。條件94°C，4min (I 次循環(huán));94°C，30s_56°C，30s_72°C，90s (35次循環(huán))；72°C，10min(l次循環(huán))。在本例中，構(gòu)建物Q2-pQE-32被用作基質(zhì)，對(duì)片段1，2和3分別獲得了大小約150，370和290pb的產(chǎn)物。使用的寡核苷酸是，對(duì)片段I為F3F1和F3R1，對(duì)片段2為F3F2和F3R2，以及對(duì)片段3為F3F3和F3R3。再次重復(fù)先前所述的序列連接步驟。使用的新的限制性酶是BglII和ΚρηΙ。在第三種即最后一種片段中，由于它很小只有66pb，因此決定對(duì)載體PQE-32-Q2序列的一部分進(jìn)行擴(kuò)增以獲得較大的片段，從而能夠更方便地進(jìn)行后續(xù)的純化過(guò)程。在各步驟中，通過(guò)PCR獲得的片段克隆在載體pKS-Bluescript中并且驗(yàn)證了它的序列。通過(guò)脯氨酸(P)在第一種片段產(chǎn)生了對(duì)應(yīng)于第一個(gè)谷酰胺氨基酸(Q)的自發(fā)突變。最后，所得片段在商業(yè)表達(dá)載體pQE-32中進(jìn)行亞克隆，該pQE-32在N-末端含有額外的對(duì)應(yīng)于親和尾的13個(gè)氨基酸的序列(圖8)所述序列對(duì)具有200個(gè)氨基酸且表觀分子量為21938Da的多肽進(jìn)行編碼。實(shí)施例2 :嵌合蛋白質(zhì)Ql, Q2,和Q3的表汰和純化從LB平板(分別補(bǔ)充了 100和25 μ g/ml的氨比西林和卡那霉素)上分離菌落開(kāi)始，產(chǎn)生了 50ml的相同培養(yǎng)基的預(yù)接種體，并在攪拌下(260rpm)于37°C隔夜培養(yǎng)。用所述預(yù)接種體對(duì)I升到相同培養(yǎng)基進(jìn)行接種，從O. 2的光學(xué)密度^OOnm)開(kāi)始?；旌衔镌?7°C下攪拌培養(yǎng)I小時(shí)30分鐘，然后用IPTG(lmM的終濃度)在相同的培養(yǎng)條件下對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)3小時(shí)。在Q2的情況下，細(xì)胞在4°C，10，OOOrpm的條件下離心15分鐘，再重新懸浮于50ml的裂解緩沖液(磷酸鹽20mM，pH 7. 4 ;50mM咪唑；0· 5Μ NaCl)中。37°C攪拌下用溶菌酶(終濃度O. lmg/ml)處理重新懸浮的物質(zhì)30分鐘。然后進(jìn)行超聲處理(20秒5脈沖)，并將混合物在4°C, 15000rpm下離心15分鐘。上清液通過(guò)O. 45 μ m (Mi I lex HV, Millipore)過(guò)濾，并注入(2. 5ml/min)適用于 AKTA Prime system(GE-Healthcare)的 5ml H1-Trap 整合HP柱(GE-Healthcare)。該柱用鎳進(jìn)行螯合，并事先用10體積的裂解緩沖液進(jìn)行了平衡。用15體積的裂解緩沖液洗滌柱后，用洗脫緩沖液(磷酸鹽20mM pH7. 4 ；0. 5M咪唑)對(duì)結(jié)合到柱上的蛋白質(zhì)洗脫至100%。洗脫物經(jīng)過(guò)5mlH1-Trap脫鹽柱(GE-Healthcare)以除去鹽并改變20mM pH 7磷酸鹽緩沖液樣品。將蛋白質(zhì)保存在_40°C。在Ql和Q3的情況下，需要額外的純化步驟。在細(xì)胞的誘導(dǎo)之后，將之在4°C，10，OOOrpm下離心15分鐘，并重新懸浮于補(bǔ)充了尿素的50ml的裂解緩沖液中，并采用在前面段落中描述的步驟。在第二步純化步驟中，將獲得的洗脫物注入(lml/min)事先用PBS平衡了的H1-Load 16/60 Superdex-200柱(GE-Healthcare);在前面段落中描述的緩沖液中進(jìn)行蛋白質(zhì)的洗脫。將蛋白質(zhì)保存在_40°C。在含SDS的聚酰胺凝膠(SDS-PAGE)中進(jìn)行電泳?；旧习凑誏aemmli描述的方法[(31)Laemmli,U. K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assemblyof the head of bacteriophage T4. Nature 277，680-685]，采用 MIN1-PROTEAN 電泳裝置(Bio-Rad)進(jìn)行。測(cè)量為10x10cm的且具有12. 5%的聚丙烯酰胺濃度的凝膠，在tris-甘氨酸緩沖液中，進(jìn)行200伏特電流45分鐘的電泳。用作參照物的蛋白質(zhì)是用于低分子量的來(lái)自Bio-Rad的試劑盒的參照物。分子量的計(jì)算和凝膠的光密度分析使用圖像分析儀(Diversity, BioRad)進(jìn)行。`雜化蛋白質(zhì)Ql表達(dá)為32kDa的His-標(biāo)簽的融合蛋白質(zhì)(圖9)，其產(chǎn)生了終濃度2mg/L的細(xì)菌培養(yǎng)物。Q2和Q3蛋白質(zhì)表達(dá)為28kDa的His-標(biāo)簽的融合蛋白質(zhì)，終產(chǎn)量分別為5mg/L和7mg/L的細(xì)菌培養(yǎng)物(圖9)。實(shí)施例3 純化的雜化分子的圓二色性分析用配備了 20°C恒溫槽的Jasco PTC-423S溫度控制器的Jasco J-810旋光分光計(jì)記錄pH 7. O和20°C時(shí)的Far-UV (190-250nm) CD圖譜。在0. 2cm槽中的20mM磷酸鈉緩沖液中的蛋白質(zhì)的濃度為0. 035mg/ml，累計(jì)進(jìn)行40次掃描。所有的圖譜均減去適當(dāng)?shù)谋尘?，并轉(zhuǎn)化為平均殘基橢圓率。用天然墻草屬變態(tài)反應(yīng)原混合物(Parj I和Par j 2)和雜化蛋白質(zhì)通過(guò)⑶圖譜分析二級(jí)結(jié)構(gòu)元素(圖10)。它們當(dāng)中的雜化蛋白質(zhì)的圖譜幾乎完全相同，但與天然的變態(tài)反應(yīng)原的CD圖譜完全不同。NPA圖譜在208nm出現(xiàn)最小值，在222nm出現(xiàn)清晰的肩峰，并在190nm出現(xiàn)最大值，而雜化蛋白質(zhì)的圖譜向幾乎達(dá)到完全非折疊狀態(tài)的無(wú)規(guī)卷曲構(gòu)象移動(dòng)。實(shí)施例4 :免疫學(xué)試驗(yàn)，以顯示嵌合蛋白質(zhì)對(duì)對(duì)歐蓍草過(guò)敏的患者的血清混合物具有低的IgE-固定反應(yīng)活性⑷免疫檢測(cè)對(duì)融合體1，2和3的IgE-接合活性的首次評(píng)價(jià)是通過(guò)免疫轉(zhuǎn)移法采用對(duì)歐蓍草過(guò)敏的患者的血清混合物進(jìn)行的。蛋白質(zhì)提取物和純化的蛋白質(zhì)被載入聚丙烯酰胺凝膠后，按照 Towbin 等人的方法進(jìn)行電轉(zhuǎn)移[(32)Towbin, H. , Staehelin,1. , and Gordon,J. (1979). Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels tonitrocellulose sheets !Procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sc1.USA 76，4350-4354]。為此，由SDS-PAGE分離的蛋白質(zhì)被電刺穿到PVDF Hybond-P膜(GE-Healthcare)。膜在環(huán)境溫度下阻斷I小時(shí)后，立即將它們用第一抗體在4°C隔夜溫育，并且在用相同洗滌緩沖液洗滌數(shù)次后，將膜在環(huán)境溫度下用過(guò)氧化物酶偶聯(lián)第二抗體溫育I小時(shí)。米用ECL化學(xué)發(fā)光法(GE-Healthcare),按照廠商描述,將膜暴露于膠片(Hyperfilm. ECL, GE-Healthcare),檢測(cè)到了帶。免疫檢測(cè)試驗(yàn)顯示在三種融合體之間不同的IgE-接合能力；僅在Ql的情況下出現(xiàn)對(duì)IgE抗體的識(shí)別(圖11)。在Q2的情況下，對(duì)IgE抗體的識(shí)別出現(xiàn)急劇的下降，而在Q3的情況下，對(duì)IgE抗體的識(shí)別為O。B)直接 ELISAIgE對(duì)三種融合體的反應(yīng)性用ELISA法用來(lái)自對(duì)歐蓍草過(guò)敏的患者的單個(gè)血清分析。在環(huán)境溫度下用在PBS緩沖液(磷酸鹽IOmM pH 7. 2 ；137mM NaCl 2. 7mM KCl)中的每杯I μ g歐蓍草提取蛋白質(zhì)或O.1 μ g純蛋白質(zhì)隔夜溫育聚苯乙烯盤(pán)(Greiner)。它們用200 μ I/杯的補(bǔ)充了 1% BSA-0. 05% Tween 20的PBS進(jìn)行封閉，并且保存在37°C I小時(shí)。加入100 μ I/杯的來(lái)自過(guò)敏患者的血清(稀釋1/10)，并在37°C溫育90分鐘。經(jīng)3次用200 μ I/杯的PBS-T (PBS+0. 05% Tween 20)洗滌后，加入100 μ I/杯的對(duì)偶聯(lián)過(guò)氧化物酶的人類IgE免疫球蛋白(Dako)的抗血清(稀釋1: 1000)，并在37°C溫育90分鐘。經(jīng)3次用PBS-T洗漆后,加入 按廠商說(shuō)明配制的200 μ I/杯的鄰苯二胺(Sigma-Fast TabletSets, Sigma)溶液，并將盤(pán)保存在黑暗中30分鐘。用50 μ I/杯的3Μ H2S04終止反應(yīng)，并在ELISA Easy Reader EAR-400AT (SLT-Lab Instruments)酶表儀中測(cè)量 492nm 處的吸收。僅在Ql的情況中顯示出對(duì)IgE的反應(yīng)性，而在Q2和Q3兩種情況下均顯示基本上沒(méi)有對(duì)IgE抗體的識(shí)別(圖12)。OELISA 抑制對(duì)于ELISA抑制實(shí)驗(yàn)，將對(duì)歐蓍草過(guò)敏的患者的血清混合物在抑制蛋白質(zhì)的給定濃度下(l-1000ng/ml)在4°C隔夜預(yù)溫育。后面的進(jìn)行步驟與ELISA直接測(cè)試中描述的相同。在用歐蓍草過(guò)敏的患者的血清混合物進(jìn)行的ELISA抑制實(shí)驗(yàn)中，Ql表現(xiàn)出的對(duì)歐蓍草花粉的IgE-結(jié)合活性的抑制程度約為50%，這比nParj1-Parj 2的抑制程度(92% )低一些，從而有必要加入多500倍的蛋白質(zhì)(圖13)。嵌合體Q2和Q3達(dá)到約為60%的最大抑制程度，但要達(dá)到相同程度的抑制，它們需要的蛋白質(zhì)濃度比nParj1-Parj 2需要的要高出10，000倍，這說(shuō)明了這些嵌合體的變應(yīng)原性降低了約99. 99%。實(shí)施例5 :顯示嵌合蛋白質(zhì)Ql，Q2，和Q3的低皮膚反應(yīng)性的活體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行活體內(nèi)皮膚反應(yīng)(點(diǎn)刺)實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)嵌合體1，2和3的低變應(yīng)原性，只在確定候選低變應(yīng)原分子，以能夠研發(fā)滿意的針對(duì)對(duì)歐蓍草花粉過(guò)敏的免疫療法。使用歐蓍草提取物,在大腸桿菌中表達(dá)的nParj1-Parj 2, rParj I和rParj 2,以及嵌合體1，2和3進(jìn)行皮膚試驗(yàn)。純化的蛋白質(zhì)在含有O. 5%苯酚和50%甘油的鹽水中稀釋。在天然Parj，Parj 2，Ql的情況下使用的濃度為O. 5，5，和50 μ g/ml ;而在Q2或Q3的情況下使用的濃度為5，50和250 μ g/ml。分別使用O. 9% NaCl和鹽酸組胺(10mg/ml)作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照。在實(shí)驗(yàn)中，將每種待檢測(cè)的變態(tài)反應(yīng)原液滴沉積在前臂的手掌區(qū)，然后用柳葉刀通過(guò)液滴穿刺。每個(gè)測(cè)試進(jìn)行兩次，分別沿濃度增加和減小的相反方向進(jìn)行。15分鐘后，用尖端細(xì)的黑色記號(hào)筆勾畫(huà)出斑點(diǎn)的輪廓。將低變應(yīng)原的膠帶置于斑點(diǎn)上，并輕微按壓使墨水痕跡印到帶上；并將之轉(zhuǎn)移到斑點(diǎn)記錄板上。斑點(diǎn)面積通過(guò)用Summasketch數(shù)字化圖形輸入板掃描記錄以及計(jì)算機(jī)輔助的設(shè)計(jì)程序(Autocad V. 11)而測(cè)定。所得的結(jié)果通過(guò)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析將結(jié)果描繪在方塊圖中并用Wilcoxon檢驗(yàn)相關(guān)變量進(jìn)行說(shuō)明(圖14)。這些圖解表明對(duì)應(yīng)皮膚反應(yīng)的值的分布(以斑點(diǎn)面積_2測(cè)定)與關(guān)于提取物(平均值為65. 25mm2-置信區(qū)間95% :54. 98-75. 53)和nParj1-Parj 2 (平均值為106. 80mm2-置信區(qū)間95% :91. 90-121. 70)的三種嵌合體的情況顯著不同(P < O. 001)。嵌合體2和3的值幾乎為O :Q2 (平均值為O. 95mm2-置信區(qū)間95% :0_2. 89)以及Q3 (平均值為 O. 15mm2-置信區(qū)間 95% 0-0. 47)。實(shí)施例6 :顯示嵌合蛋白質(zhì)Ql，Q2，和Q3低的IgE抗體結(jié)合能力的實(shí)驗(yàn)作為對(duì)活體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的補(bǔ)充，使用EAST-直接法通過(guò)確定特異的IgE來(lái)再次進(jìn)行離體實(shí)驗(yàn)。根據(jù)Ceska 等人的方法[(33) Ceska, M. and Lundkvist, U. (1972). A new andsimple radioimmunoassay method for the determination of IgE.1mmunochemistry 9，1021-1030]，通過(guò)將天然的和重組的蛋白質(zhì)(50yg/ml)以及歐蓍草提取物(2mg/ml)偶聯(lián)至用溴化氰活化過(guò)的盤(pán)來(lái)確定特異的IgE。隨后加入50 μ I患者的血清，并在環(huán)境溫度下溫育I小時(shí)。洗滌后，將盤(pán)在37°C下用接合到堿性磷酸酯酶上的人抗IgE抗體溫育30分鐘，然后按照廠商(Hycor Biomedical Inc.)用提供的IgE特異性Hytec試劑盒EIA進(jìn)行定量。獲得的結(jié)果再次驗(yàn)證了在活體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果；在三種嵌合體中，Ql保持了它相對(duì)于nParj1-Parj 2的免疫能力，而Q2和Q3在所述能力上產(chǎn)生了顯著下降(P < 0. 001)(圖 15)。實(shí)施例7 :誘導(dǎo)的淋巴增殖實(shí)驗(yàn)，以顯示嵌合蛋白質(zhì)Ql，Q2和Q3的免疫能力在免疫療法中使用低變應(yīng)原分子的一個(gè)基本要求是保持它的抗原性(T表位)。因此，為驗(yàn)證除了不結(jié)合IgE抗體外，我們的蛋白質(zhì)是否保持抗原性，在由在實(shí)驗(yàn)中使用的各種蛋白質(zhì)刺激的單核外周血細(xì)胞(CMSP)上進(jìn)行了淋巴增殖試驗(yàn)。試驗(yàn)通過(guò)比色法進(jìn)行，其原理是用活細(xì)胞的線粒體脫氫酶對(duì)四唑鹽WST-1進(jìn)行消化而形成通過(guò)比色法測(cè)量的甲臜化合物。通過(guò)重力梯度離心使用淋巴細(xì)胞分離溶液(Lymphoprep, Nycomed)對(duì)來(lái)自13名對(duì)歐蓍草過(guò)敏的患者的CMSP進(jìn)行分離。然后將CMSP以1x106活細(xì)胞/ml重新懸浮于培養(yǎng)基中(無(wú)血清的培養(yǎng)基AM V，Gibco)，并用0. 25%的PBS中的臺(tái)盼藍(lán)(Sigma ChemicalCo.)測(cè)定它們的生存力。制備出的生存力大于90%的CMSP按照廠商的描述(細(xì)胞增殖試劑WST-1, Roche Diagnostics)被立即用于離體增殖測(cè)試。它們被沉積在平底的微盤(pán)(Nunclon,NUNC)中，200 μ I最終體積的培養(yǎng)基中有2xl05CMSP，并在37°C和5% CO2濕潤(rùn)的空氣中用純化至終濃度為O. 0005-0. 005-0. 05-0. 5-5 μ g/ml的歐蓍草提取物和各種蛋白質(zhì)進(jìn)行測(cè)量，取三次測(cè)量值。在所有的情況下均包括了未受刺激的培養(yǎng)物的三組對(duì)照。3天后，將20μ I的細(xì)胞增殖試劑WST-1加入到所有的杯中，并溫育4小時(shí)。由新陳代謝活躍的細(xì)胞產(chǎn)生的甲臜化合物通過(guò)在450nm的吸收進(jìn)行定量。用于實(shí)驗(yàn)中的重組蛋白質(zhì)為三種嵌合體以及在大腸桿菌中表達(dá)的rParj I和rParj 2。在第一步中，對(duì)免疫性蛋白質(zhì)進(jìn)行掃描以確定用于后面實(shí)驗(yàn)部分的最佳濃度。在所有情況下均發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)出最大增殖(IE% )的蛋白質(zhì)濃度為O. 5 μ g/ml (圖16)。用13名對(duì)歐蓍草過(guò)敏的患者進(jìn)行的增殖結(jié)果通過(guò)方塊圖統(tǒng)計(jì)分析以及用于兩組成對(duì)樣品的非參數(shù)檢驗(yàn)來(lái)確定。統(tǒng)計(jì)分析表明，用作對(duì)照的歐蓍草提取物具有與nParj1-Parj 2 (P = O. 142)相差不大的抗原刺激能力，并且Ql和Q2表現(xiàn)出的數(shù)值分布與提取物(分別為 P = O. 152 和 P = O. 294)和 nParj1-Parj 2 (分別為 P = O. 484 和 P = O. 182)無(wú)顯著不同(圖17)。然而Q3對(duì)提取物(P = O. 002)和nParj1-Parj 2 (P = O. 004)幾乎沒(méi)有刺激能力。另一方面，需要指出的是rParj 2和rPar j I對(duì)提取物(分別為P =
O.142 和 P = O. 003)和 nParj1-Parj 2 (分別為 P = O. 041 和 P = O. 002)的較強(qiáng)的抗原能力。所得結(jié)果說(shuō)明Q2仍保留了所述性能，而Q3則完全喪失。由以上所述的為獲得不同低變應(yīng)原的分子來(lái)治療對(duì)歐蓍草過(guò)敏的步驟可以總結(jié)出，Q2應(yīng)當(dāng)為候選低變應(yīng)原的分子，其產(chǎn)生滿意的對(duì)歐蓍草過(guò)敏免疫治療效果。施用方法本發(fā)明涉及所述的 低變應(yīng)原嵌合體或由其衍生出的合成肽，以用于哺乳動(dòng)物中的脫敏治療。脫敏的方法涉及通過(guò)腸胃外途徑(皮下的，靜脈內(nèi)的，或肌肉的)，或口腔，舌下，鼻或直腸途徑重復(fù)施用所述的變態(tài)反應(yīng)原。這些(多)肽可單獨(dú)施用或與其他藥學(xué)上可接受的稀釋劑和賦形劑組合，根據(jù)當(dāng)前的法規(guī)和蓋倫制劑使用規(guī)程。參考文獻(xiàn)1. Miyamoto, T. (1992).1ncreased prevalence of pollen allergy in Japan.1n Advances in Allergology and Clinical Immunology. P. Godard, J. Bousquet, andF. B. Michel, eds. (Cornforth，UK :The Parthenon Publishing Group), pp.343-347.2. Akdis, C. A. Blaser, K. (2000). Mechanisms of allergen-specificimmunotherapy. Allergy 55，518—524.3. Akdis, C. A.，Joss, A.，Akdis, M.，and Blaser, K. (2001) · Mechanism ofIL-1Oinduced cell inactivation in allergic inflammation and normal response toallergens.1nt. Arch Allergy Immunol. 124,180-182.4. Moverate,R. (2003).1mmunological mechanisms of specific immunotherapywith pollen vaccines !implications for diagnostics and the development ofimproved vaccination strategies. Expert Rev. Vacc. 2,85-97.5. Wachholz, P. A.，Soni, N. K.，Till，S.，and Durham, S. R. (2003).1nhibitionof allergen-1gE binding to B cells by IgG antibodies after grass pollenimmunotherapy. J. Allergy Clin.1mmunol. 112 ；915-922.6. Valenta, R. and Linhart，B. (2005). Molecular design of allergy vaccines.Curr. Opin.1mmunol. 17，1-10.7. Niederberger, V.，Horak，F(xiàn). , Vrtala, S.，Spitzauer，S. , Krauth, M. T.，Valent，P.，Reisinger，J.，Pelzmann, M.，Hayek, B.，Kronqvist, M.，Gafvelin, G.，G ' η κ , H.，Purohit, A.，Suck，R.，F(xiàn)iebig, H.，Cromwell, 0.，Pauli, G.，van Hage-Hamsten, M.，andValenta, R. (2004). Vaccination with genetically engineered allergens preventsprogression of allergic disease. Proc. Natl. Acad. Sc1. U. S. A. 101,14677-14682.8. Schmid-GrendeImeier, P.，Karamloo，F(xiàn).，Muller, U.，Housley-Marcovic,Z.，Soldatova, L，Zumkehr, J.，Kemeny, D. M.，Kiindig, T.，Reimers, A.，von Beust，
B.R.，Salagianni，M.，Akdis, M.，Kussebi, F.，Spangfort，M. D.，Blaser, K.，and Akdis,
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權(quán)利要求
1.嵌合蛋白質(zhì)，其包含氨基酸序列，所述氨基酸序列衍生于對(duì)應(yīng)于稱為ParjI和Parj2的歐蓍草花粉的主要變態(tài)反應(yīng)原，所述嵌合蛋白氨基酸序列缺少一個(gè)或多個(gè)結(jié)合至IgE抗體的表位，所述IgE抗體對(duì)應(yīng)于衍生出該嵌合蛋白的氨基酸序列，其中所述嵌合蛋白與衍生出該嵌合蛋白的變態(tài)反應(yīng)原相比，變應(yīng)原性降低500倍。
2.權(quán)利要求1的嵌合蛋白質(zhì)，其特征在于變應(yīng)原性的降低是通過(guò)ELISA抑制測(cè)試測(cè)量的。
3.權(quán)利要求1或2的嵌合蛋白質(zhì)，其特征在于其包含ParjI和Par j 2 二者的完全氨基酸序列。
4.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的嵌合蛋白質(zhì)，其特征在于所述嵌合蛋白質(zhì)包含ParjI和Parj 2的所有連續(xù)IgE表位。
5.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的嵌合蛋白質(zhì)，其特征在于所述嵌合蛋白質(zhì)氨基酸序列包含Parj I 或 Parj 2 的第 28-53 位。
6.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的嵌合蛋白質(zhì)，其特征在于純化的蛋白質(zhì)具有幾乎完全非折疊狀態(tài)。
7.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的嵌合蛋白質(zhì)，其特征在于其具有與結(jié)合的天然ParjI和Parj 2蛋白相似的免疫能力。
8.嵌合蛋白質(zhì)，其特征在于它包含與SEQID No. :2的同源性至少為70%的氨基酸序列。
9.嵌合蛋白質(zhì)，其特征在于它包含SEQID No. :2的氨基酸序列。
10.嵌合蛋白質(zhì)，其特征在于它由SEQID No. :2的氨基酸序列組成。
11.多核苷酸，包含編碼權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
12.多核苷酸,包含與序列SEQID No. :1的核苷酸序列同源性至少為70%的核苷酸。
13.多核苷酸，包含核苷酸序列SEQID No. :1。
14.多核苷酸，由SEQID No. 1的核苷酸序列組成。
15.在轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞內(nèi)的微生物表達(dá)載體，其為自我復(fù)制的，并被用于表達(dá)權(quán)利要求11-14的多核苷酸。
16.宿主細(xì)胞，其用根據(jù)權(quán)利要求15的微生物表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
17.權(quán)利要求16的宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞來(lái)自原核生物或真核生物。
18.權(quán)利要求17的宿主細(xì)胞，所述原核生物屬于大腸桿菌(E.coli)屬。
19.產(chǎn)生含權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的嵌合蛋白質(zhì)的多肽的方法，其特征在于該方法包括培養(yǎng)含有微生物表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，其中所述微生物表達(dá)載體在上述細(xì)胞中進(jìn)行自復(fù)制，并被用于表達(dá)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的嵌合蛋白質(zhì)。
20.純化權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的嵌合蛋白質(zhì)的方法，該方法包括從培養(yǎng)物、細(xì)胞或兩者分離嵌合蛋白質(zhì)。
21.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)在制備治療免疫病癥的藥物中的應(yīng)用。
22.權(quán)利要求21所述的應(yīng)用，其中免疫病癥為過(guò)敏，例如對(duì)歐蓍草(Parietariajudaica)花粉的過(guò)敏。
23.藥物組合物，含有有效量的權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)和藥學(xué)上可接受的賦形劑。
24.權(quán)利要求23所述的藥物組合物，其中組合物為疫苗組合物。
全文摘要
用于治療過(guò)敏的屬于歐蓍草(Parietaria judaica)脂質(zhì)轉(zhuǎn)移家族的低變應(yīng)原的嵌合蛋白質(zhì)。本發(fā)明涉及對(duì)歐蓍草的不同變態(tài)反應(yīng)原的嵌合多肽進(jìn)行編碼的重組DNA分子，其可用于預(yù)防和治療過(guò)敏，尤其是花粉過(guò)敏。具體來(lái)說(shuō)，描述了由具有低變應(yīng)原特性的變態(tài)反應(yīng)原Parj 1和Parj 2的片段構(gòu)成的嵌合多肽。還描述了在異源表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)這些重組多肽的方法。還描述了對(duì)這些嵌合蛋白質(zhì)進(jìn)行純化的有效方法。
文檔編號(hào)C12P21/02GK103059140SQ20121046898
公開(kāi)日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2007年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月12日
發(fā)明者胡安-安德烈斯·阿斯圖里亞斯-奧特加, 阿爾貝托·馬丁尼茲-葛雷特, 羅伯托·岡薩雷斯·里奧哈 申請(qǐng)人:拜爾工業(yè)制藥有限公司