專利名稱：用于治療過敏的屬于歐蓍草(Parietaria judaica)脂質轉移家族的低變應原的嵌合蛋白質的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于預防和治療過^t，尤其是花粉過每丈，更尤其是由脂質 轉移家族的變應原引起的過敏，更為具體的是在墻草屬(尸"m^OT'")的花粉 中發(fā)現的變應原。
背景技術：
I型過敏在工業(yè)化國家中是重要的健康問題。這一類型的過敏是由于
對空氣中載有的抗原形成了 IgE抗體而導致。這些IgE抗體與肥大細胞和 嗜堿性粒細胞相互作用，釋放出生物介體例如組胺，并在約20°/。的人群中 導致過敏性鼻炎，結膜炎和支氣管哞喘[(l) Miyamoto, T. (1992)。 Increased prevalence of pollen allergy in Japan. In Advances in Allergology and Clinical Immunology. P. Godard, J. Bousquet, and F.B. Michel, eds. (Cornforth, UK: The Parthenon Publishing Group), pp. 343-347]。
特異性免疫療法(SIT)是一種對由特定抗原引發(fā)的過敏性反應的有 效治療方法，它基本上是由通過定期給藥來調節(jié)患者體內的免疫應答， 增加產生過敏的蛋白質(變應原提取物)的濃度組成。以高劑量注射的 變應原會誘導由抗原-遞呈細胞合成大量的IL-i2，例如樹枝狀細胞，這種 細胞優(yōu)先促進T細胞的發(fā)育，而這些T細胞是與TH1或TH0協(xié)同的處女 型細胞(iiTh)。 這使得從與TH2細胞相關的過敏應答類型的免疫應答向 Th1/Th0型的應答偏離，從而導致生成高水平的IFN-y [(2) Akdis, C.A. and Blaser, K. (2000)。 Mechanisms of allergen-specific immunotherapy. Allergy 55, 522-530]。 在產生免疫抑制因子細胞因子IL-10和TGF-p的調節(jié)T細 胞(TRl)的影響之下，通過誘導TH2記憶細胞的耐受(無反應性或克隆缺失)而使免疫偏離得以加強[(3) Akdis, C.A., Joss， A., Akdis, M., and Blaser, K. (2001) 。 Mechanism of IL-10 induced cell inactivation in allergic inflammation and normal response to allergens. Int. Arch Allergy Immunol.
180-182]。 Th2細胞的活化和增殖的減少伴隨b細胞導致的il-4以 及IgE的減少。Th2細胞的活性和浸潤進鼻和支氣管粘液的減少引起 IL-5合成的減少，從而減少了嗜伊紅粒細胞的浸潤，這導致了炎性介體如 MBP和ECP蛋白的釋放的更大的減少。優(yōu)勢表型抗原ThO的T細胞的新 的特異性克隆產生了 THl和Th2型細胞因子的混合物，其促進B細胞產 生大量的特異性IgG抗原抗體。另一方面，高水平的IL-10誘導了大量特 異性IgG4抗原抗體的合成。這兩種類型的特異性抗體可用作封閉抗體來 提供IgE抗體與它們的受體在肥大細胞中的交叉，從而抑制組胺的脫粒和 釋放[(4) Moverate, R. (2003)。 Immunological mechanisms of specific immunotherapy with pollen vaccines: implications for diagnostics and the development of improved vaccination strategies. Expert Rev. Vacc. 2, 85-97; (5) Wachholz, P.A., Soni, N.K., Till, S., and Durham, S.R. (2003). Inhibition of allergen-IgE binding to B cells by IgG antibodies after grass pollen immunotherapy. J. Allergy Clin. Immunol. "2; 915-922]。 它們還通過含抗 原的細胞來阻止IgE-介導的抗原的聚積，而這抑制了對抗原的免疫反應。
從天然源分離出的變態(tài)反應原提取物為蛋白質和其他分子的復雜混 合物。它們的組成，進而變應原性取決于使用的材料，并隨環(huán)境條件， 花粉的成熟狀態(tài)以及真菌類中螨類等的生長條件。 一些提取物中甚至可 含有濃度不足的主要變應原，且甚至可被一些對患者不過敏的不期望的 成分污染，或者兩種情況。目前的免疫療法完全使用全變態(tài)反應原提取 物，而這導致了許多問題，如
-由于疫苗與效應物分子的IgE的反應所致的嚴重的不良反應。
-免疫療法后在疫苗中出現對其他變應原的新的致敏作用。
-難以標準化變態(tài)反應原提取物。
所有的這些意味著免疫療法不是期望的安全有效的治療方法。對過 敏的發(fā)病機理以及特異性免疫療法的機理的更好的認識使得能夠更進一步地解決上述提及的問題。對IgE-介導的抗原在特異性變態(tài)反應原應答
Th2中的影響的認識增加了人們對產生不結合到IgE上的變應原的嘗試。 目前的特異性療法的主要目標是對變態(tài)反應原進行改性，旨在使IgE表位 失活，從而減少甚至消除對IgE的結合以及隨之引起的不良反應[(6) Valenta, R. and Linhart, B. (2005)。 Molecular design of allergy vaccines. Curr.Opin. Immunol. 77, 1-10]。這樣，改性的變態(tài)反應原將通過吞喧/胞飲 作用-介導的抗原收集機制而被引向T細胞，從而防止了 IgE交叉和IgE-依 賴的抗原的遞呈。這誘導了通過T細胞的Th0或Th1細胞因子的產生的 平衡，通過B細胞的IgE的產生減少而IgG的產生增加了；所有的這些將 導致在無過敏性反應的危險之下誘導出Th2型T細胞耐受性。在獲得變 態(tài)反應原和變態(tài)反應原衍生物的重組方法中的進展使得研發(fā)新的用于治 療過敏的疫苗的能力大大增加。由于可能對IgE表位的重要氨基酸進行突 變或缺失，以及對其進行分級分離和低聚作用，獲得低變應原疫苗是可能 的。這些分子具有較低的結合至IgE的能力但保持了它們對T細胞的反 應性，可以較大劑量使用，能夠用較少次數注射獲得更快更安全的免疫療 法。此外，重組的變應原可在發(fā)酵罐中使用微生物表達體系來大規(guī)模生 產，且其純化比它們的天然等同物更為有效和廉價。低變應原的衍生物 在免疫療法中的使用先前已用Bet v 1的三聚體片段[(7) Mederberger, V., Horak, F., Vrtala, S., Spitzauer, S., Krauth, M.T., Valent, P., Reisinger,丄， Pelzmann, M., Hayek, B., Kronqvist, M., GafVelin, G., Gr6nlund, H., Purohit, A., Suck, R., Fiebig, H., Cromwell, O., Pauli, G., van Hage-Hamsten, M., and Valenta, R. (2004) 。Vaccination with genetically engineered allergensprevents progression of allergic disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S, A.而, 14677-14682]、蜂毒蛋白(Api m 1, 2, 3)的多變應原的雜合體[(8) Schmid-Grendelmeier, P., Karamloo, F., Miiller, U., Housley-Marcovic, Z., Soldatova, L., Zumkehr, J., Kemeny, D.M., Kiindig, T., Reimers, A., von Beust, B.R., Salagianni, M., Akdis, M., Kussebi, F., Spangfort, M.D., Blaser, K., and Akdis, C.A. (2005). Prevention of allergy by a recombinant multi-allergen vaccine with reduced IgE binding and preserved T cell epitopes. Eur. J. Immunol. 35, 3268-3276]和以消除其三級結構的Parj 2和Parj 1的突變融
合體進行了描述。
一些作者提到，變應原疫苗不應用低變應原制備，這是由于對IgE 的結合可助于專門的抗原遞呈細胞的變應原的捕獲和遞呈，如表達具有高 親和力和低親和力的IgE的表面受體的樹突狀細胞和活化的B淋巴細胞。
的交叉也可導致T細胞對變應原應答的減少[(9) Allam, J.P., Novak, N., Fuchs, C., Asen, S., Berge, S., Appel, T., et al. (2003) Characterization of dendritic cells from human oral mucosa: a new Langerhans' cell type with high constitutive FcsRI expression. J. Allergy Clin. Immunol, "2,141-8. (10) von Bubnoff, D., Matz, H., Frahnert, C., Rao, M丄.，Hanau, D., de la Salle, H., Bieber, T. (2003) Fc汰I induces the triptophan degradation pathway involved in regulating T cell responses.丄Immunol. 769, 1810-1816]。許多研究者仍在 不引入缺失時制備這種類型的疫苗[(ll) Batard, T., Didierlaurent, A., Chabre, H., Mothes, N., Bussieres, L., Bohle, B., <2/. (2005) Characterization of wild-type recombinant Bet v la as a candidate vaccine against birch pollen allergy. Int. Arch. Allergy Immunol.風239-249. (12) Jutel, M,, Jaeger, L., Suck, R., Meyer, H., Fiebig, H., Cromwell, O. (2005) Allergen-specific immunotherapy with recombinant grass pollen allergens. J. Allergy Clin. Immunol. 608-13. (13) Niederberger, V., Horak, F" Vrtala, S., Spitzauer, S"Krauth, M.T., Valent, P., d a/. (2004) Vaccination with genetically engineered allergens prevents progression of allergic disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 川7, 14677-82. (14) Cromwell, O., Fiebig, H., Suck, R., Kahlert, H., Nandy, A., Kettner, J., d a/. (2006) Strategies for recombinant allergen vaccines and fruitful results from first clinical studies. Immunol. Allergy Clin. N. Am. 2<5, 261-81]。
墻草屬(尸^veton")是蕁麻目蕁麻科家族的雙子葉雜草屬，。墻草 屬中的4艮多種廣泛和大量的分布在地中海海岸[(15) Colombo, P., Duro, G., Costa, M.A., Izzo, V., Mirisola, M., Locorotondo, G., Cocchiara, R., and Geraci, D. (1998)。 An update on allergens. Parietaria pollen allergens. Allergy 53, 917-921]。最常見的種為歐蓍草(P. )w必,ca y>和藥用墻草(尸. o^^^c/wo/^ J, ^f旦其4也的種i3. /w57Yaw/c<3、尸.附ow/7Yfl"/ca和i5. crehca可在于 一些地區(qū)有一些存在。然而，地中海區(qū)域并不是唯一可發(fā)現墻草屬花粉 的地方，因為有這種花粉存在于英格蘭南部，奧地利，中歐和東歐的溫 帶區(qū)域，澳大利亞和加利福尼亞的描述[(16) Colombo, P., Bonura, A., Costa, M., Izzo, V., Passantino, R., Licorotondo, G., Amoroso, S., and Gerasi, D. (2003)。 The allergens of P腦'eto由.Int. Arch. Allergy Immunol. 730, 173-179; (17) Carreira, J. and Polo, F. (1995). The allergens of ewrapaea and /^n'efan'a 5pp. and their relevance in the Mediterranean Area. Allergy Clin. Immunol. News 7, 79-84].墻草屬的一個顯著特征是持續(xù)長達數月的授粉 期，從而導致在對墻草屬過敏的患者中出現幾乎常年性的癥狀，這些癥 狀范圍為從較輕的鼻結膜炎到嚴重的哮喘。應當注意的是，由于在墻草 屬的不同種之間表現出顯著的交叉反應性，正常的對墻草屬的輕微的單 特異性致敏作用包括對該屬中各種不同種的致敏作用。
已有對兩種最常見的種歐蓍草(P.7w^,caJ和藥用墻草(i5 p爐c,'"afoj
的變應原餾分純化和表征的各種論文。這些餾分的分子量在10-14 kDa的 范圍，并實際上涉及它們的提取物的全部變應原力。The allergens of Par/etona. Int. Arch. Allergy Immunol. 730, 173-179; (18) Ayuso, R., Carreira,J., Lombardero, M., Duffort, O., Peris, A., Basomba, A., and Polo, F. (1993). Isolation by mAb based affinity chromatography of two Par j isoallergens. Comparison of their physicochemical, immunochemical and allergenic properties. Mol. Immunol. 30, 1347-1354; (19) Polo, F., Ayuso, R., and Carreira, J. (1990). HPLC purification of the main allergen of ywt/a/ca pollen. Mol. Immunol. 27, 151-157; (20) Polo, F., Ayuso, R., and Carreira, J. (1991). Studies on the relationship between structure and IgE-binding ability of乂wtia^a allergen I. Mol. Immunol. 28, 169-175].重組DNA技術的發(fā)展使得能夠對墻草屬花粉變應原的分子表征 得以完成歐蓍草花粉的兩種主要變應原Parj 1和Par j 2已^皮克隆和測 序[(21) Duro, G., Colombo, P., Costa, M.A., Izzo, V., Porcasi, R., DiFiore, R., Locorotondo, G., Mirisola, M.G., Cocchiara, R., and Geraci, D. (1996). cDNA cloning, sequence analysis and allergological characterization of Par j 2.0101, a new major allergen of theyw^te'o pollen. FEBS Lett. 399, 295-298; (22) Costa, M.A., Colombo, P., Izzo, V., Kennedy, H., Venturella, S., Cocchiara, R., Mistrello, G., Falagiani, P., and Geraci, D. (1994). cDNA cloning expression and primary structure of Par j. I, a major allergen of i^hetor/a 7'W6iteca pollen. FEBS Lett. 347, 182-186; (23) Amoresano, A., Pucci, P., Duro, G., Colombo, P., Costa, M.A,, Izzo, V., Lambda, D., and Geraci, D. (2003). Assignment of disulphide bridges in Par j 2.0101, a major allergen ofj'"(ia/ca pollen. Biol. Chem. 384, 1165-1172]。 兩種變
應原均屬于非特異性脂質轉移蛋白(ns-LTP)家族，并在它們的末端區(qū)域具有信號肽，加工后產生分子量分別為14,726和11,344 Da的蛋白質并具 有約45%的相同殘基。已描述了在兩種抗原中可能的可能位于結構相關區(qū) i或內的IgE-結合線性表位[(24) Asturias, J.A., G6mez-Bay6n, N., Eseverri， J丄.，and Martinez, A. (2003). Par j 1 and Par j 2, the major allergens from 尸arz'e^3/7'a _/M(ifif/ca pollen, have similar immunoglobulin E epitopes. Clinical and Experimental Allergy 518-524]。這些區(qū)域是為能獲得最佳低變應原
分子來治療對歐蓍草花粉過敏而被作用的靶。
ns-LTP因能夠離體完成膜間交換和/或傳遞極性脂質而著稱。[(25) van Ree, R. (2002). Clinical importance of non-specific lipid transfer proteins as food allergens. Biochem. Soc. Trans 30, 910-913]。在植物中已表征了兩個主 要的家族，它們是分子量約為9 kDa的LTP1和分子量約為7 kDa的LTP2。 屬于LTP家族的變應原已在除食物外的植物中被鑒定，在這些植物中對它 們已進行了廣泛的研究。因此，來自巴西橡膠樹(heveabrasiliensis)乳膠的 Hevb]2為9.3kDa的堿性蛋白質，其顯示出與薔薇科果實中的變應原LTP 約65%的序列同 一性[(26) Beezhold, D.H., Hickey, V.L., Kostyal, D.A.， and et al. (2003). Lipid transfer protein from /fevea 6ms77z'e薦^ (Hev b 12), a cross-reactive latex protein. Ann Allergy Asthma Immunol 439-445] 。 jt匕夕卜，一 些花粉變應原被描述為LTP，例如北艾蒿(爿We附"',a vw/gw"')的Art v 3 [(27) Diaz-Perales, A., Lombardero, M., Sanchez-Monge, R., and et al. (2000). Lipid-transfer proteins as potential plant panallergens: cross-reactivity among proteins of y4w，/s/" pollen, nut and fruits, with different
IgE-binding capacities. Clin Exp Allergy 1403-1410]以及油橄欖(6>/ea 的Ole e 7 [(28) Tejera, M.L., Villalba, M., Batanero, E., and Rodriguez, R. (1999). Identification, isolation, and characterization of Ole e 7, a new allergen of olive tree pollen. J. Allergy Clin. Immunol. 797-802; (29) Rodriguez, R., Villalba, M., Batanero, E., and et al. (2002)。 Allergenic diversity of the olive pollen. Allergy 6-16],其為9-10 kDa且與食物的變應原的LTP具有30-55%的序列同一性。歐蓍草的主要變應原Par j 1和Parj 2， 一方面相互之間具有約45%的序列同 一性的，另 一方面具有比LTP家族中 的正常值高的分子量，分別為14.7和11.3 kDa [(16) Colombo, P., Bonura, A., Costa, M., Izzo, V., Passantino, R., Licorotondo, G., Amoroso, S., and Gerasi, D. (2003). The allergens of P譜'eto"'", Int. Arch. Allergy Immunol. 173-179]。然而，盡管兩變應原具有與LTP類似的結構，它們卻在共有的 序列區(qū)域具有與食物LTP的中等水平的同 一性(在Par j 1和桃LTP之間為 28% )。
WO2005/085278公開了含歐蓍草的兩種主要變態(tài)反應原的融合蛋白 的構建物，其中融合蛋白的三維結構通過取代每種抗原的一級序列中的一 些半胱氨酸殘基(更具體的是涉及形成二硫鍵中的半胱氨酸)被破壞，從 而使變應原的序列維持在幾乎相同的長度。根據后來的實驗，這將得到 比天然變應原的變應原性低1000倍的蛋白質。
本發(fā)明的發(fā)明者們已發(fā)現，不僅通過破壞變態(tài)反應原的三維結構，而 且通過使一些IgE-結合位點(已知為B表位)發(fā)生缺失可驚人的大大減少 變應原性，最令人吃驚的是，這不會導致免疫原性的降低。
本發(fā)明首次公開了通過將含少量IgE-結合表位的歐蓍草的兩種變應原 的片段(Parj 1和Parj 2)結合獲得的不同的嵌合蛋白質，以及獲得它們的 不同的方法和中間體。不僅本發(fā)明的嵌合蛋白質的三維結構被打斷，而 且一些B表位被缺失。根據本發(fā)明的嵌合蛋白質可稱為低變應原的嵌合 蛋白質，其變應原性降低了 99.99%,這是由于它們具有更低的結合IgE抗 體的能力，這一結論基于p離體的ELISA，使用對歐蓍草過敏的患者的 血清混合物進行ELISA抑制和免疫檢測測試；z"在對歐蓍草過敏的患者體 內進行皮膚反應性的活體內測試；以及,")使用對歐蓍草過敏的患者的單 一血清進行離體EAST抑制測試。根據本發(fā)明的嵌合蛋白質在另一方面保 持了它們的免疫原的能力，這通過對13名對歐蓍草過萄t的患者的外周血單核細胞(CMSP)的淋巴細胞增殖測試得以證實。
變應原提取物為蛋白質和非蛋白質分子的復雜混合物。用于檢測對 提取物中的組份特異的IgE水平的技術，其使用的增多使得能夠證實過敏 患者通常對多種組份產生反應。僅對單一 變態(tài)反應原反應的過敏患者的 例子非常稀少。由于變應原提取物在免疫療法中存在顯著的問題， 一種 解決方法是盡可能地將多種治療性能組合在單個分子中。

發(fā)明內容
本發(fā)明人成功地將兩種變應原結合在一個分子中，這不僅從工業(yè)化 生產和治療上受益，并且在不改變免疫原性之下還顯示出明顯降低的變 應原性。
出于這些原因，本發(fā)明涉及嵌合蛋白質(后面稱作Q1,Q2，和Q3)， 其由變應原Parj 1和Parj2的片段組成，由于它們失去了一些IgE-結合B 表位，因而它們的過敏應答性被降低，但未失去免疫原的能力。這樣， 所得的嵌合多肽就具有比兩個單獨的蛋白質的總和低的分子量。
本發(fā)明還涉及包含對前述嵌合多肽進行編碼的DNA的核苷酸序列， 表達體系包含具有表達和控制所需的序列的所述序列，以及由所述表達 體系轉化的受體細胞。
本發(fā)明還涉及該嵌合多肽的臨床應用，用于治療過敏的特異性免疫 療法，以及含有該嵌合多肽的可能的組合物，及其不同的施用方法。
允許用于免疫治療的本發(fā)明的嵌合蛋白質的低變應原的性能已經被
廣泛證實。由發(fā)明者們進行的免疫學實驗表明，嵌合體Q2在不識別對歐
蓍草過^t的患者血清中的1gE,這在圖lO和ll中示出。如圖12所示，Q2
具有的IgE結合能力低于兩種天然蛋白質混合物10,000倍。
這一低變應原性數據限制在通過在30名患者的皮膚點刺測試的活體 實驗進行。嵌合體Q1的變應原性比由兩種分離的天然蛋白質獲得的變應 原性低3.5倍(圖13)。在另一方面，由Parjl和Par j 2片段形成的Q2, 其不含有任何描述的B表位，變應原性比兩種分離的天然蛋白質獲得的變應原性j氐的112倍。
嵌合體Q2的低變應原性(IgE-結合能力)通過測量該分子與30名對
歐蓍草過敏的患者的血清的反應性而得以確證。這種在變應原性上的降
低出乎意料地伴隨著嵌合體Q2的免疫原能力的保持，這與單個天然蛋白 質的總和的免疫原能力沒有區(qū)別(圖16)。
免疫原性的保持將使得該嵌合體用作完全提取物的替代品，但其安全 性卻高的多(較低的變應原性)。
菌抹的保藏
根據國際承認用于專利程序的微生物保藏的布達佩斯條約，對應于本 發(fā)明的樣i生物的菌4朱保藏于巴倫西亞大學(University of Valencia) (Universidad de Valencia, Edificio de Investigaci6n, Campus de Burjasot, 46100 BURJASOT, Valencia)的西班牙典型培養(yǎng)物保藏中心(CECT)，并具 有以下參考
大腸桿菌C&c/ ^7c/2/"co/,), CECT7141,,保藏于2006年3月7曰。


圖1是Q1的構建圖。
圖2示出了 Q1的氨基酸和核苷酸序列。對應于載體pQE-32的親和 性尾部的殘基用下劃線表示。通過EcoRI (EF)部分引入的殘基用陰影表
示。半胱氨酸殘基用雙下劃線表示。
圖3示出了 Par j 1和Par j 2的IgE表位(方框)和T表位(下劃線) 的對比，指出了位于粗方框內的Q2缺失的表位。對相同的殘基()和 類似的殘基(.)進行了標記。
圖4是Q2的構建圖。
圖5示出了 Q2的氨基酸和核苷酸序列。對應于載體pQE-32的親和 性尾部的殘基用下劃線表示。通過EcoRI (EF) Pstl (LQ)和EcorRV (Dl)
部分引入的殘基用陰影表示。半胱氨酸殘基用雙下劃線表示。
圖6示出了 Par j 1和Par j 2的IgE表位(方框)和T表位(下劃線) 的對比，表明了位于雙線方框內的Q3缺失的表位。對相同的殘基()和類似的殘基(.)進行了標記。
圖7是Q3的構建圖。
圖8示出了 Q3的氨基酸和核苷酸序列。對應于載體pQE-32的親和 性尾部的殘基用下劃線表示。通過EcoRI (EF) Pstl (LQ)和EcorRV (Dl)， Bg111 (RS)，以及Kpnl (GT)部分引入的殘基用陰影表示。半胱氨酸殘基 用雙下劃線表示。
圖9示出了在電泳后用考馬斯藍對聚酰胺凝:膠進行染色的結果。Ql (帶1), Q2 (帶2), Q3 (帶3)。
圖10示出了對純化的蛋白質nParj l-nParj2, Q1,Q2，和Q3的圓二色
性分析結果。
圖11示出了用對歐蓍草過敏的患者的血清混合物的TgE抗體進行的免 疫才全測，包括nPar j 1-nPar j 2 (泳道1), rPar j 1 (泳道2)， rPar j 2 (泳道3), Ql (泳道4), Q2 (泳道5), Q3 (泳道6)。
圖12示出了使用15種對歐蓍草過敏的患者的血清(稀釋1/10)進行 的lgE抗體對Ql，Q2，和Q3的結合。示出了三次實驗的值和它們的偏差。
圖13示出了 ELISA抑制測試結果，用固相中的歐蓍草提取物以及nPar j l-Parj2, Q1,Q2，和Q3作為抑制劑，用對歐蓍草過l文的患者的血清混合 物。每個值均對應于三次實驗的平均值，標準偏差小于10%。
圖14示出了用歐蓍草提取物，nParj l-Parj 2以及Ql (50 pg/ml),和 Q3 (250嗎/ml)進行的皮膚測試結果。示出的數值是斑點的面積，單位為 mm」。
圖15示出了用歐蓍草提取物，nParj l-Parj 2以及Ql (50 ^g/ml),和 Q3 (250 ng/ml)進行的特異性IgE的確定。
圖16示出了用于研究在對歐蓍草過敏的患者中的T淋巴細胞增殖的 的最佳濃度的確定。刺激指數(正)。
圖17示出了用歐蓍草提取物和0，5嗎/ml三種嵌合蛋白質以及Par j 1 和Parj 2的天然的和重組的形式獲得的T淋巴細胞的增殖。顯示的數值是 刺激指數(％)的數值。無顯著性差異(ns)。
具體實施方式
根據本發(fā)明的 一個方面，提供了 一種具有低變應原性的嵌合蛋白質
或肽，其通過缺失任何B表位或IgE-結合表位或通過合成出無^f壬何B表位 或IgE-結合表位得到而得到。缺失優(yōu)選針對Par j 1和Par j 2的28 - 53處 的B表位進行。
這里使用的術語"低變應原性"及其類似變體為相對的術語，涉及與 野生型免疫原的相同能力相比，本發(fā)明的蛋白質或肽的活體內和離體刺激 過敏應答的能力的降低。
優(yōu)選的嵌合蛋白質包含示于SEQ ID No.:2， 4或6中的氨基酸序列， 最優(yōu)選的嵌合蛋白質包含示于SEQ ID No.:4中的氨基酸序列。
嵌合蛋白質可選地或可額外包含與示于SEQ ID No.:2, 4或6中的氨 基酸序列同源的序列。優(yōu)選的同源的序列與示于SEQ ID No.:2， 4或6中 的氨基酸序列，最優(yōu)選為與示于SEQ ID No.:4中的氨基酸序列具有至少 為70%，更優(yōu)選為至少80%，更優(yōu)選為至少90%,最優(yōu)選為100%的同源 性。
另一種優(yōu)選的實施方式包括與示于SEQ ID No.:2, 4或6中的氨基酸 序列中具有至少為70%,優(yōu)選為至少80%,更優(yōu)選為至少90%，最優(yōu)選為 100%的同源性的氨基酸序列的嵌合蛋白質或肽。
嵌合蛋白質也可包含有助于其純化的肽序列。這種肽是本技術領域 公知的，例如聚組氨酸尾。
構成嵌合蛋白質的片段可由合格培訓的人員按照已知的方案通過聚 合酶鏈式反應(PCR)擴增合成。所述片段，在被合適的限制性酶消化后， 可通過連接至表達載體而進行整合。該表達載體(如商用載體pQE32) 可具有將嵌合蛋白質與輔助純化的序列如位于末端氨基酸端的一 系列組 氨酸進行融合的能力。在構建嵌合蛋白質期間，由不同的限制性酶識別 的序列形成的接頭將不同的DNA片段結合在一起，而在天然變態(tài)反應原 的原始序列中不存在的殘基將出現在最終的嵌合分子中。這些不干涉正 確讀取蛋白質的新的殘基在圖2, 5,和8中的序列中被標記，并在相關的 實施例中進行了適當的描述。類似地，嵌合體在氨基端的區(qū)域具有14個 原始序列未出現的殘基，它們對應于富含組氨酸的區(qū)域，其允許通過與結 合至固體支持物的二價金屬相互作用而可實現快速純化。根據本發(fā)明的第二個方面，提供了對本發(fā)明的蛋白質或肽進行編碼的 多核苷酸。
優(yōu)選地，多核苷酸含有示于SEQ ID No.:l, 3或5中的核苷酸序列， 最優(yōu)選地，多核苷酸含有示于SEQIDNo.:3中的核苷酸序列。
多核普酸可可選地或附加地包含與示于SEQ ID No.:l, 3或5中的多 核苷酸序列同源的序列。優(yōu)選的同源的序列具有的與示于SEQ ID No.:l, 3 或5中的氨基酸序列至少為70%，更優(yōu)選為至少80%，更優(yōu)選為至少 90% ，最優(yōu)選為95%的同源性。
另一種優(yōu)選的實施方式包括與示于SEQ ID No.:l, 3或5中的核苷酸 序列具有至少為70%，優(yōu)選為至少80%,更優(yōu)選為至少90%,最優(yōu)選為 100%的同源性的核苷酸序列的多核苦酸。
多核苷酸可進一步包含一對信號肽進行編碼的序列。信號肽為一種
引發(fā)蛋白質跨內質網膜傳輸的氨基酸序列。適合的信號肽為本領域技術 人員所知。
本發(fā)明還包括由本發(fā)明的多核苷酸序列編碼的肽。
根據本發(fā)明的其他方面，提供了一種表達系統(tǒng)，其包含本發(fā)明的多核 苷酸序列，以及被所述表達系統(tǒng)轉化宿主細胞，其能夠表達本發(fā)明的蛋白 質或肽。
本發(fā)明還包括制備本發(fā)明的肽或蛋白質的方法，所述方法包括以下步
驟
(i) 制能夠在宿主細胞中表達對本發(fā)明的蛋白質或肽進行編 碼的核普酸序列的可復制的表達系統(tǒng)；
(ii) 用所述表達系統(tǒng)轉化宿主細胞；
(iii) 在允許表達所述蛋白質或肽的條件下培養(yǎng)所述轉化的宿主 細月包；以及
(iv) 任選地，回收所述的蛋白質或肽。
本發(fā)明還包括能夠產生本發(fā)明的蛋白質或肽的轉基因動物，例如在它 們的奶中或蛋中產生。
根據本發(fā)明的另一個方面，提供了本發(fā)明的蛋白質或肽在治療免疫疾 病，特別是超敏性疾病如過敏中的應用。根據本發(fā)明的再一個方面，提供了本發(fā)明的蛋白質或肽在制備治療免 疫疾病，特別是超敏性疾病如過敏的藥物中的應用。優(yōu)選的藥物為疫苗。
優(yōu)選地，超敏性疾病為對墻草屬花粉的過敏，更優(yōu)選的是對歐蓍草花 粉的過敏。
這里使用的術語治療以及其變體如"治療，，或"治療的"是指可使人 類或非人類動物受益的療法。治療可以是針對現存癥狀的，或可以是預 防疾病的(預防性治療)。治療可包括治愈，緩和或預防疾病的效果。優(yōu) 選地，治療為預防治療。
根據本發(fā)明的又一個方面，提供了一種藥物組合物，其包含有效量的 本發(fā)明的蛋白質或肽以及藥學上可接受的賦形劑。優(yōu)選的藥物組合物為 疫苗組合物。
根據本發(fā)明的又一方面，提供了一種治療免疫疾病，特別是超敏性疾 病如過敏的方法，所述方法包括向有需要的研究對象施用有效量的本發(fā)明 的蛋白質或肽。
根據本發(fā)明的另 一 個方面，提供了本發(fā)明的蛋白質或肽在治療免疫疾 病，特別是超敏性疾病如過敏中的應用。
對個體患者的合適的施用和劑量形式的選擇對本領域技術人員而言 是顯而易見的。
本發(fā)明覆蓋了本發(fā)明的嵌合體，優(yōu)選為嵌合體Q2，或尤其衍生的合成 的肽在哺乳動物中進行脫敏治療中的應用。脫敏的方法涉及通過腸胃外 途徑(皮下的，靜脈內的，或肌肉的)，或口腔，鼻或直腸途徑重復施用 所述的變態(tài)反應原。這些(多)肽可單獨施用或與其他稀釋劑組合，所 依據的是當前的法規(guī)和蓋倫制劑使用規(guī)程。
在發(fā)明中描述的嵌合體蛋白Q2和Q3是低變應原的因為它們對歐蓍 草過敏的患者的血清的反應性比全提取物或組合的天然蛋白質低，如圖 10， 11, 12和14所示，且這種低變應原性在活體內的皮膚測試中也有發(fā) 現(圖13 )。
嵌合分子Ql和Q2也具有與組合的天然蛋白質類似的免疫原能力(圖16 )。
這兩種特性(低變應原性和免疫原性)使得嵌合體Q2成為對歐蓍 草花粉過敏進行預防和治愈的優(yōu)異的候選對象，這些過^:表現為如鼻炎， 結膜炎，嗜喘，蕁麻滲，血管性水腫，濕滲，皮炎，或者甚至為過敏性休克。
對本發(fā)明的嵌合蛋白質的免疫學特性的描述將在后面給出。圖10示 出的免疫檢測，表明在患過敏癥的患者中，嵌合體Q2和Q3 (泳道5和泳 道6)具有比兩種天然蛋白質(泳道1 ),分離的重組蛋白質(泳道2和泳道 3 )或顯示為兩種完全且含有所有B表位的蛋白質的重組融合嵌合體(帶4 ) 大大降低的IgE-接合能力。應當指明的是，包括在殘基29和52之間的B 表位(嵌合體Q2)缺失貢獻變應原性的降低。當對15種不同血清與嵌合 蛋白質的反應性進行調查時獲得了類似的結果(圖11 )。 嵌合蛋白質Q2 和Q3具有比Q1中觀察到的在兩種完整變態(tài)反應原(Parj l-Parj2)的結 合性低得多的反應性。該變應原性的降低通過ELISA抑制采用來自對歐蓍 草過敏患者的血清混合物來進行定量(圖12 )。需要比兩種天然蛋白質混 合物多10,000倍的蛋白質Q2來達到60%提取物的抑制。因此，可以推 斷，其比天然蛋白質的變應原性低10,000倍，且比嵌合蛋白質Q1的變應 原性低約20倍。
對嵌合體的低變應原性的更為直接的測量可通過直接對30名對歐 蓍草花粉過敏的患者的皮膚反應性測量來獲得。圖13中給出的數據表明， 嵌合體Q2在皮膚反應性上有顯著降低。對各分布的描述進行的比較表明， 嵌合體Q2具有的平均斑點大小比兩種天然蛋白質中觀察到的小112倍，
這意味著致敏性活性降低了超過99%。
IgE與嵌合蛋白質Q2的低結合能力也通過進一步的30名對歐蓍草花 粉過^i:患者的單血清的EAST測量得以證實(圖14 )。
在所有的患者中， 與天然蛋白質的混合物相比，嵌合體Q2中的IgE-結合均大大降低。
這種在IgE-結合能力上的大大降低以及因此由于B表位缺失而誘發(fā)不 良反應的能力卻伴隨著免疫原能力的維持。蛋白質Q2表現出的淋巴增殖指數與天然提取物以及兩種純天然蛋白質組合的混合物引起的淋巴增殖
指數類似，這在圖16中示出。所有的這些都顯示出用片段Parj 1和Parj2 構建的嵌合蛋白質Q2含有更少的IgE表位，但仍保持了足夠以激發(fā)保護 性免疫應答的T表位。
將對本發(fā)明有更好的理解。這些實施例僅為示例性的，并不對本發(fā)明構 成限制。
實施例1: 01.02,和03融合體的構建
嵌合蛋白質是通過聚合酶的鏈式擴增反應(PCR)，使用含有對Par j 1.0103和Par j 2.0101編碼的序列的質粒作為基質以及在每個例子中的具體 引發(fā)劑構建的，其中Par j 1.0103和Par j 2.0101描述于GonzMez-Rioja等 人的"Expression and purification of the recombinant allergens Par j 1 and Par j 2" XXIII Congreso EAACI, Abstracts Book (2004), 181-182中。引發(fā)劑各種 不同限制性內切核酸酶(下劃線)的切斷位點的雜交區(qū)，以及一些錨定核 苷酸組成。PCR-引起的擴增反應在50 pi的反應體積內具有以下組分擴 增緩沖液xlO, 5 pi; 200 ^M的dNTPs;100皮摩爾的各種引發(fā)寡核苷酸 2.5單位的聚合酶Taq (Pfx DNA聚合酶，Invitrogen); 1 ng DNA基質和使體 積達到50 pl的無菌蒸餾水.擴增反應在RoboCycler熱循環(huán)儀(Stratagene) 中進行，反應進行具體條件將在每個情況中在下面描述。將反應產物在 瓊脂糖凝膠(2%)中進行電泳，用Geneclean (Biol01)按廠商描述的方法從 凝膠中分離出目的帶。分離出的片段用合適的限制性酶進行消化，并連 接到用相同的酶消化過的pBluescript載體上。連接混合物;故用于對大腸 桿菌DH5oc的感受態(tài)細胞(來自Invitrogen, Paisley, UK)進行轉化。使所得菌落進行生長以分離出它們的質粒DNA,其用適合的酶來消化以釋放出 目的片段。選擇陽性克隆對之進行測序。插入到pBluescript中的DNA 的測序是通過使用熒光二脫氧核苷酸的改進Sanger's法[(30) Hanahan, D. (1983). Studies on transformation of五sc/^hc/7/a co// with plasmids.丄Mol. Biol. /6<5, 557-580],在熱循環(huán)儀中用PRISM Ready Reaction DiDeoxy Termination Cycle Sequencing Kit. (Perkin Elmer)4安廠商i兌明進行的。 A)嵌合蛋白質Ql
在此例中，兩種蛋白質(Parj 1和Parj2)的完全序列被融合，以獲 得具有去穩(wěn)定的三級結構但保持了其完整的連續(xù)IgE表位的蛋白質。為 了獲得稱為Ql的構建物，使用克隆進載體KS-Bluescript中的Par j 1和 Par j 2的cDNA作為基質。為了融合兩個序列，需要具有接頭，在五coRI 耙的情況，為在Par j 1序列的C-末端和在Par j 2序列的N-末端，來完成 片段的隨后連接。所述靶被添加到相應的合成寡核苷酸(F1R1和 F1F2)，并整合到PCR過程中擴增的片段中。
使用的合成寡核苷酸
片段1: F1F1, CG GGATCC TGCAAGAAACCTGCGG CSamHI)和 F1R1, CG GAATTC GGCTTTTTCCGGTGCGG (EcoRI)。 條件94。C, 4 min (1次循環(huán))；94。C, 30 s — 53°C, 30 s — 72°C, 90 s (5次循環(huán))；94°C, 30 s — 60oC, 30 s - 72。C, 90 s (35次循環(huán))；72°C, 10 min (1次循環(huán))。
片段2: F1F2, CG GAATTC GAGGAGGCTTGCGGGA (五o RI)和 F1R2, CG AAGCTT CTAATAGTAACCTCTGA (//z力dl11)。 條件94°C, 4 min (1次循環(huán))；94°C, 30 s — 51°C, 30 s — 72。C, 90 s (5次循環(huán))；94°C, 30 s —59°C, 30 s — 72°C, 90 s (35次循環(huán))；72°C, 10 min (1次循環(huán))。
產生了分別對應于Par j 1和Par j 2的兩種PCR產物。對它們中的 第一種(Par j 1)，合成的寡核苷酸F1F1和F1R1分別用于N和C末端， 獲得了大約420個堿基對(pb)的大小。經擴增的片段克隆在 pKS-Bluescript載體中，且證實了它的序列。對與Par j 2相對應的第二種 片段，采用相同的程序，分別使用寡核香酸F1F2和F1R3作為N和C末端。這種情況下，獲得了大約為300 pb的片段，將其克隆在
pKS-Bluescript載體中，且證實了它的序列。通過EcoRI耙經連接將該 第二個片段接合到第一個片段上，Parjl在N-末端，Parj2在C-末端，所 得片段隨后亞克隆在商用表達載體pQE-32 (Qiagen)中，該pQE-32在N-末端含有額外的相當于親和尾的13個氨基酸序列(圖2)。 所述序列編 碼具有256個氨基酸且表觀分子量為28070 Da的多肽。
A)嵌合蛋白質Q2
當獲得該嵌合體時，兩種蛋白質的片段都被結合但不包括任何描述 的連續(xù)的IgE表位[(18) Asturias, J.A, G6mez-Bay6n, N., Eseverri, J丄.，and Martinez, A. (2003). Par j 1 and Par j 2, the major allergens from P腦'eton'a _/w<ia/ca pollen, have similar immunoglobulin E epitopes. Clinical and Experimental Allergy 33, 518-524].設計出了包括以下片段的一些合成寡核 苷酸Par j 1 (殘基1 - 28和53 - 139的片段)和Par j 2 (殘基1 - 28和 53 - 103的片段)(圖3和圖4)。
這樣，就消除了含IgE表位的序列部分。
四種片段(每種變態(tài)反應原各兩種)被擴增用于該構建物，且克隆在 pKS Bluescript載體中的Par j 1和Par j 2的cDNA被用作基質。新的蛋白 質的構建機制是使用限制性酶(在此種情況為iV/，五coi /和五coWK)來進 行不同擴增片段的連續(xù)接合。
使用的合成寡核苷酸
片段1: F1F1, CG GGATCC TGCAAGAAACCTGCGG (Bawffl)和 F2R1, CG CTGCAG CCCCTTTGACGGCTCTT 0^1)。 條件min (1次 循環(huán))；94°C, 30 s — 54°C, 30 s - 72°C, 90 s (35次循環(huán))；72°C, 10 min (1次 循環(huán))。
片段2: F2F2, CG CTGCAG ATCCAGACCGCCATGAA 和 F2R2, CG GAATTC GGCTTTTTCCGGTGCGGG —RI)。
片,爻3: F2F3, CG GAATTC GAGGAGGCTTGCGGGAA (五coRJ)和 F2R3, CG GATATC CTCCTTCGACGGCTCCTT (五coRV)。
片段4: F2F4， CG GATATC ATAGTGCGCGCCACGAA (TcoRV、和 F1R2, CG AAGCTT CTAATAGTAACCTCTGA (//,"dm)。
三種片段的條件是94。C,4min(1次循環(huán))；94。C, 30 s - 54°C, 30 s - 72°C, 90 s (5次循 環(huán))；94°C, 30 s — 62。C, 30 s — 72°C, 90 s (35次循環(huán))；72°C, 10 min (1次循 環(huán))。
這些中的的第一個，其對應于Par j 1 (片段l)，合成寡核苷酸FIFI 和F2R1被分別用作N和C末端，獲得了大約為90個威基對大小的片段 并克隆在pKS-Bluescript載體中。對與Par j 1相對應的第二個片段，釆 用相同的步驟分別使用寡核苦酸F2F2和F2F2作為N和C末端。在這種 情況下，獲得了大約為260 pb的片段并克隆在pKS-Bluescript載體中。該 最后一個片段由Pstl攜帶的靶的接頭通過連接而結合到第一個片段上，且 它的序列得到了證實。
就由Parj2(片段3和4)擴增出的兩種片段而言，采用片段1和2中描述 的程序。分別用于N和C末端的寡核苷酸F2F3/F2R3和F2F4/F1R4被用于 它們的擴增，片段3和4的PCR產物的大小約為90和150 pb。片段4由 五coRV攜帶的靶的接頭通過連接而結合到片段3上，且它的序列得到了驗 證。
在最后一步中，產生的兩個新片段(各自用于一種變態(tài)反應原)由 五coRI攜帶的靶的接頭通過連接而結合到一起，Parj l在N-末端而Parj 2在 C-末端。所述片段隨后亞克隆在商業(yè)表達載體pQE-32中，該pQE-32在N-末端含有對應于親和尾的額外13個氨基酸的序列(圖5)。 所述序列對具 有212個氨基酸且表觀分子量為23336 Da的多肽進行編碼。
B)嵌合蛋白質Q3
最后的這個構建物除了在這種情況以及試圖消除任何可能存在的IgE 表位之外，基本上與Q2相同，存在于序列Par j 1 (殘基71-80 )和Par j 1 (殘 基72-81 )(圖6和圖7 )中的另外的額外的8個氨基酸序列被消除。
使用的合成寡核苦酸
片段1: F1F1, CG GGATCC TGCAAGAAACCTGCGG (8amHI)和 F3R1, CG AGATCT GACCTCGCTGACGAG (Sg/H)。
片段2: F3F2, CG AGATCT AGCAAGCTCCCGCCC (Bg/II)和 F3R2, CG GGTACC GGGGACCTCGGCGAC (A>/I)。
2種片段的條件是940C, 4 min (1次循環(huán))；940C, 30 s - 54°C， 30 s - 720C, 90 s (5次循 環(huán))；94°C, 30 s _ 63°C, 30 s — 72°C, 90 s (35次循環(huán))；72°C, 10 min (1次循 環(huán))。
片段3: F3F3, CG CTCCCGCCCATCACC (^ "I)和F3R3，
TTTAAAAAGGCCGTAATATCC。 條件94。C, 4 min (1次循環(huán))；940C, 30 s — 56°C, 30 s — 72°C, 90 s (35次循環(huán))；72°C, 10 min (1次循環(huán))。
在本例中，構建物Q2-pQE-32被用作基質，對片段1， 2和3分別獲 得了大小約150, 370和290 pb的產物。使用的寡核苷酸是，對片段l為 F3F1和F3R1，對片段2為F3F2和F3R2，以及對片段3為F3F3和F3R3。 再次重復先前所述的序列連接步驟。使用的新的限制性酶是Sg/n和 《p"I。 在第三種即最后一種片段中，由于它很小只有66pb,因此決定對 載體pQE-32-Q2序列的 一部分進行擴增以獲得較大的片段，從而能夠更方 便地進行后續(xù)的純化過程。在各步驟中，通過PCR獲得的片段克隆在載 體pKS-Bluescript中并且驗證了它的序列。通過脯氨酸(P )在第 一種片 段產生了對應于第一個谷酰胺氨基酸(Q)的自發(fā)突變。
最后，所得片段在商業(yè)表達載體pQE-32中進行亞克隆，該pQE-32在 N-末端含有額外的對應于親和尾的13個氣基酸的序列(圖8)所述序列對 具有200個氨基酸且表觀分子量為21938 Da的多肽進行編碼。
實施例2: 嵌合蛋白質Ql， Q2，和03的表達和純化 從LB平板(分別補充了 100和25 pg/ml的氨比西林和卡那霉素)上 分離菌落開始，產生了 50ml的相同培養(yǎng)基的預接種體，并在攪拌下(260 rpm )于37 。C隔夜培養(yǎng)。用所述預接種體對1升到相同培養(yǎng)基進行接種， 從0.2的光學密度(600 nm )開始?；旌衔镌?7°C下攪拌培養(yǎng)1小時30 分鐘，然后用IPTG (1 mM的終濃度)在相同的培養(yǎng)條件下對其進行誘導3 小時。
在Q2的情況下，細胞在4 。C, 10,000 rpm的條件下離心15分鐘，再 重新懸浮于50 ml的裂解緩沖液(磷酸鹽20 mM, pH 7.4; 50 mM咪唑；0.5 MNaCl)中。37。C攪拌下用溶菌酶(終濃度0.1 mg/ml)處理重新懸浮的 物質30分鐘。然后進行超聲處理(20秒5脈沖)，并將混合物在4 。C，15000 rpm下離心15分鐘。上清液通過0.45 pm (Millex HV, Millipore)過 濾，并注入(2.5 ml/min)適用于AKTA Prime system (GE-Healthcare)的5 ml Hi-Trap螯合HP柱(GE-Hea他care)。 該柱用鎳進行螯合，并事先用10 體積的裂解緩沖液進行了平衡。用15體積的裂解緩沖液洗滌柱后，用洗 脫緩沖液(磷酸鹽20 mM pH 7.4; 0.5 M咪唑)對結合到柱上的蛋白質洗脫 至100%。 洗脫物經過5 ml Hi-Trap脫鹽柱(GE-Healthcare)以除去鹽并改 變20 mM pH 7磷酸鹽緩沖液樣品。將蛋白質保存在-40 °C。
在Ql和Q3的情況下，需要額外的純化步驟。在細胞的誘導之后， 將之在4 °C， 10,000 rpm下離心15分鐘，并重新懸浮于補充了尿素的50 ml的裂解緩沖液中，并采用在前面段落中描述的步驟。在第二步純化步 驟中，將獲得的洗脫物注入(l ml/min)事先用PBS平衡了的Hi-Load 16/60 Superdex-200柱(GE-Healthcare);在前面段落中描述的緩沖液中進行蛋白 質的洗脫。將蛋白質保存在-40。C。
在含SDS的聚酰胺凝膠(SDS-PAGE)中進行電泳。基本上按照 Laemmli 4苗述的方法[(31) Laemmli, U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 277, 680-685],采用MINI-PROTEAN電泳裝置(Bio-Rad)進行。測量為10 x 10 cm的且具有12.5%的聚丙烯酰胺濃度的凝膠，在tris-甘氨酸緩沖液中，進 行200伏特電流45分鐘的電泳。用作參照物的蛋白質是用于低分子量的 來自Bio-Rad的試劑盒的參照物。分子量的計算和凝膠的光密度分析使 用圖像分析儀(Diversity, BioRad)進行。
雜化蛋白質Ql表達為32 kDa的His-標簽的融合蛋白質(圖9 ),其產 生了終濃度2 mg/L的細菌培養(yǎng)物。Q2和Q3蛋白質表達為28 kDa的 His-標簽的融合蛋白質，終產量分別為5mg/L和7mg/L的細菌培養(yǎng)物(圖 9)。
實施例3:純化的雜化分子的圓二色性分析 用配備了20。C恒溫槽的Jasco PTC-423S溫度控制器的Jasco J-810旋 光分光計記錄pH 7.0和20。C時的Far-UV (190-250 nm) CD圖譜。在0.2 cm槽中的20 mM磷酸鈉緩沖液中的蛋白質的濃度為0.035 mg/ml，累計進行40 次掃描。所有的圖譜均減去適當的背景，并轉化為平均殘基橢圓率。
用天然墻草屬變態(tài)反應原混合物(Parj 1和Parj2)和雜化蛋白質通 過CD圖諳分析二級結構元素(圖10)。它們當中的雜化蛋白質的圖語幾 乎完全相同，但與天然的變態(tài)反應原的CD圖譜完全不同。NPA圖譜在 208 nm出現最小值，在222 nm出現清晰的肩峰，并在190 nm出現最大值， 而雜化蛋白質的圖譜向幾乎達到完全非折疊狀態(tài)的無規(guī)巻曲構象移動。
實施例4:免疫學試驗，以顯示嵌合蛋白質對對歐蓍草過敏的患者的 血清混合物具有低的IgE-固定反應活性 (A) 免疫檢測
對融合體1， 2和3的IgE-接合活性的首次評價是通過免疫轉移法釆 用對歐蓍草過敏的患者的血清混合物進行的。蛋白質提取物和純化的蛋白
質被載入聚丙烯酰胺凝膠后，按照Towbin等人的方法進行電轉移[(32) Towbin, H., Staehelin, I., and Gordon,丄(1979).Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets:Procedure and some 叩plications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354]。為此，由SDS誦PAGE 分離的蛋白質被電刺穿到PVDF Hybond-P膜(GE-Healthcare)。 膜在環(huán)境 溫度下阻斷1小時后，立即將它們用第一抗體在4。C隔夜溫育，并且在用 相同洗滌緩沖液洗滌數次后，將膜在環(huán)境溫度下用過氧化物酶偶聯第二抗 體溫育l小時。采用ECL化學發(fā)光法(GE-Healthcare),按照廠商描述，將 膜暴露于膠片(Hyperfilm.ECL, GE-Healthcare)， 檢測到了帶。
免疫檢測試驗顯示在三種融合體之間不同的IgE-接合能力；僅在Ql 的情況下出現對IgE抗體的識別(圖11 )。 在Q2的情況下，對IgE抗體 的識別出現急劇的下降，而在Q3的情況下，對IgE抗體的識別為O。
B)直接ELISA
IgE對三種融合體的反應性用ELISA法用來自對歐蓍草過敏的患者的 單個血清分析。在環(huán)境溫度下用在PBS緩沖液(磷酸鹽10 mM pH 7.2; 137mMNaC12.7mMKCl)中的每杯l 歐蓍草提取蛋白質或0.1 純蛋白質隔夜溫育聚苯乙烯盤(Greiner)。 它們用200 pl/杯的補充了 1 % BSA-0.05 % Tween 20的PBS進行封閉，并且保存在37°C 1小時。加入100 pl/杯的來自過敏患者的血清(稀釋1/10)，并在37°C溫育90分鐘。經3 次用200 pl/杯的PBS-T (PBS + 0.05 % Tween 20)洗滌后，加入100 pl/杯的 對偶聯過氧化物酶的人類IgE免疫球蛋白(Dako)的抗血清(稀釋1:1000)， 并在37°C溫育90分鐘。經3次用PBS-T洗滌后，加入按廠商說明配制的 200 nl/杯的鄰苯二胺(Sigma-Fast Tablet Sets, Sigma)溶液，并將盤保存在黑 暗中30分鐘。用50 pl/杯的3 M H2SO4終止反應，并在ELISAEasy Reader EAR-400 AT (SLT-Lab Instmments)酶表儀中測量492 nm處的吸收。
僅在Q1的情況中顯示出對IgE的反應性，而在Q2和Q3兩種情況下均 顯示基本上沒有對IgE抗體的識別(圖12)。
C) ELISA抑制
對于ELISA抑制實驗，將對歐蓍草過敏的患者的血清混合物在抑制 蛋白質的給定濃度下(1-1000 ng/ml)在4°C隔夜預溫育。后面的進行步 驟與ELISA直接測試中描述的相同。
在用歐蓍草過敏的患者的血清混合物進行的ELISA抑制實驗中，Ql 表現出的對歐蓍草花粉的IgE-結合活性的抑制程度約為50%,這比nPar j 1-Parj 2的抑制程度(92%)低一些，從而有必要加入多500倍的蛋白質(圖 13)。 嵌合體Q2和Q3達到約為60%的最大抑制程度，但要達到相同程 度的抑制，它們需要的蛋白質濃度比nPar j 1-Par j 2需要的要高出10,000 倍，這說明了這些嵌合體的變應原性降低了約99.99%。
實施例5:顯示嵌合蛋白質Ql, Q2,和Q3的低皮膚反應性的活體內實
驗
進行活體內皮膚反應(點刺)實驗來評價嵌合體1， 2和3的低變應 原性，只在確定候選低變應原分子，以能夠研發(fā)滿意的針對對歐蓍草花粉 過敏的免疫療法。
使用歐蓍草提取物，在大腸桿菌中表達的nPar j 1-Par j 2, rPar j 1和 rParj2,以及嵌合體l， 2和3進行皮膚試^^。純化的蛋白質在含有0.5 %苯酚和50%甘油的鹽水中稀釋。在天然Par j, Par j 2, Ql的情況下使用的 濃度為0.5, 5,和50嗎/ml;而在Q2或Q3的情況下使用的濃度為5, 50和 250 ng/ml。 分別4吏用0.9% NaCl和鹽酸組胺(10 mg/ml)作為陰性和陽性 對照。
在實驗中，將每種待檢測的變態(tài)反應原液滴沉積在前臂的手掌區(qū)，然
后用柳葉刀通過液滴穿刺。每個測試進行兩次，分別沿濃度增加和減小
的相反方向進行。15分鐘后，用尖端細的黑色記號筆勾畫出斑點的輪廓。
將低變應原的膠帶置于斑點上，并輕微按壓使墨水痕跡印到帶上；并將之
轉移到斑點記錄斧反上。斑點面積通過用Summasketch凄t字化圖形輸入板
掃描記錄以及計算機輔助的設計程序(Autocad v. 11)而測定。
所得的結果通過進行統(tǒng)計分析將結果描繪在方塊圖中并用Wilcoxon 檢驗相關變量進行說明(圖14)。 這些圖解表明對應皮膚反應的值的分布 (以斑點面積mm2測定)與關于提取物(平均值為65.25 mm2 -置信區(qū) 間95%:54.98-75.53 )和nParj l-Par j 2 (平均值為106.80 mm2 —置信區(qū)間 95%:91.90-121.70)的三種嵌合體的情況顯著不同(P<0.001)。 嵌合體2 和3的值幾乎為0: Q2 (平均值為0.95 mm2 -置信區(qū)間95%:0-2.89)以及 Q3 (平均值為0.15 mm2 -置信區(qū)間95%:0-0.47)。
實施例6:顯示嵌合蛋白質Ql, 02，和Q3低的IgE抗體結合能力的
實驗
作為對活體內實驗的補充，使用EAST-直接法通過確定特異的IgE來 再次進行離體實驗。
根據Ceska等人的方法[(33) Ceska, M. and Lundkvist, U. (1972).Anew and simple radioimmunoassay method for the determination of IgE.Immunochemistry 9, 1021-1030]，通過將天然的和重組的蛋白質(50 pg/ml)以及歐蓍草提取物(2 mg/ml)偶聯至用溴化氰活化過的盤來確定特 異的IgE。 隨后加入50 pi患者的血清，并在環(huán)境溫度下溫育1小時。洗 滌后，將盤在37°C下用接合到堿性磷酸酯酶上的人抗IgE抗體溫育30分鐘，然后按照廠商(Hycor Biomedical Inc.)用提供的IgE特異性Hytec試劑 盒EIA進行定量。
獲得的結果再次驗證了在活體內實驗中的結果；在三種嵌合體中，Ql 保持了它相對于nParj l-Parj 2的免疫能力，而Q2和Q3在所述能力上產 生了顯著下降(PO.OOl)(圖15)。
實施例7: 誘導的淋巴增殖實驗，以顯示嵌合蛋白質Q1， Q2和Q3 的免疫能力
在免疫療法中使用低變應原分子的一個基本要求是保持它的抗原性 (T表位)。因此，為驗證除了不結合IgE抗體外，我們的蛋白質是否保 持抗原性，在由在實驗中使用的各種蛋白質刺激的單核外周血細胞(CMSP) 上進行了淋巴增殖試驗。試驗通過比色法進行，其原理是用活細胞的線粒 體脫氫酶對四唑鹽WST-1進行消化而形成通過比色法測量的曱臜化合物。
通過重力梯度離心使用淋巴細胞分離溶液(Lymphoprep, Nycomed)對 來自13名對歐蓍草過敏的患者的CMSP進行分離。然后將CMSP以lx106 活細胞/ml重新懸浮于培養(yǎng)基中(無血清的培養(yǎng)基AIM V, Gibco),并用 0.25%的PBS中的臺盼藍(Sigma Chemical Co.)測定它們的生存力。制 備出的生存力大于90%的CMSP按照廠商的描述(細胞增殖試劑WST-1, Roche Diagnostics )被立即用于離體增殖測試。它們被沉積在平底的微盤 (Nunclon, NUNC)中，200 ^最終體積的培養(yǎng)基中有2xl05 CMSP，并在37°C 和5% C02濕潤的空氣中用純化至終濃度為0.0005-0.005-0.05-0.5-5 |ug/ml 的歐蓍草提取物和各種蛋白質進行測量，取三次測量值。在所有的情況 下均包括了未受刺激的培養(yǎng)物的三組對照。3天后，將20pl的細胞增殖 試劑WST-1加入到所有的杯中，并溫育4小時。由新陳代謝活躍的細胞產 生的曱臜化合物通過在450 nm的吸收進行定量。用于實驗中的重組蛋白 質為三種嵌合體以及在大腸桿菌中表達的rParj 1和rPar j 2。
在第一步中，對免疫性蛋白質進行掃描以確定用于后面實驗部分的 最佳濃度。在所有情況下均發(fā)現表現出最大增殖(IE %)的蛋白質濃度為0.5pg/ml(圖16)。
用13名對歐蓍草過敏的患者進行的增殖結果通過方塊圖統(tǒng)計分析以 及用于兩組成對樣品的非參數檢驗來確定。統(tǒng)計分析表明，用作對照的 歐蓍草提取物具有與nPar j 1-Par j 2 (P^.142)相差不大的抗原刺激能力， 并且Q1和Q2表現出的數值分布與提取物(分別為？=0.152和P=0.294) 和nPar j 1-Par j 2 (分別為P=0.484和P=0.182)無顯著不同(圖17)。 然而 Q3對提取物(P^.002)和nPar j 1-Par j 2 (P^.004)幾乎沒有刺激能力。另 一方面，需要指出的是rPar j 2和rPar j 1對提取物(分別為P= 0.142和 P=0.003)和nPar j 1-Par j 2 (分別為P=0.041和P,02)的較強的抗原能 力。
所得結果說明Q2仍保留了所述性能，而Q3則完全喪失。由以上所 述的為獲得不同低變應原的分子來治療對歐蓍草過敏的步驟可以總結 出，Q2應當為候選低變應原的分子，其產生滿意的對歐蓍草過敏免疫治療 效果。
施用方法
乳動物中的脫敏治療。脫敏的方法涉及通過腸胃外途徑(皮下的，靜脈內 的，或肌肉的)，或口腔，舌下，鼻或直腸途徑重復施用所述的變態(tài)反應 原。這些(多)肽可單獨施用或與其他藥學上可接受的稀釋劑和賦形劑 組合，根據當前的法規(guī)和蓋倫制劑使用規(guī)程。
參考文獻
1. Miyamoto, T. (1992). Increased prevalence of pollen allergy in Japan. In Advances in Allergology and Clinical Immunology. P. Godard, J. Bousquet, and F.B. Michel, eds. (Cornforth, UK: The Parthenon Publishing Group), pp. 343-347.
2. Akdis, C.A. Blaser, K. (2000). Mechanisms of allergen-specificimmunotherapy. Allergy 55, 518-524.
3. Akdis, C.A., Joss, A., Akdis, M., and Blaser, K. (2001). Mechanism of IL-10 induced cell inactivation in allergic inflammation and normal response to allergens. Int. Arch Allergy Immunol. 724, 180-182.
4. Moverate, R. (2003). Immunological mechanisms of specific immunotherapy with pollen vaccines: implications for diagnostics and the development of improved vaccination strategies. Expert Rev. Vacc. 2, 85-97.
5. Wachholz, RA., Soni, N.K., Till, S., and Durham, S.R. (2003). Inhibition of allergen-IgE binding to B cells by IgG antibodies after grass pollen immunotherapy. J. Allergy Clin. Immunol. 915-922.
6. Valenta, R. and Linhart, B. (2005). Molecular design of allergy vaccines. Curr. Opin. Immunol. 77, 1-10.
7. Niederberger, V" Horak, F., Vrtala, S., Spitzauer, S., Krauth, M.T., Valent, P., Reisinger, J., Pelzmann, M., Hayek, B., Kronqvist, M., Gafvelin, G., Gr6nlund, H., Purohit, A., Suck, R., Fiebig， H., Cromwell, O., Pauli, G., van Hage-Hamsten, M., and Valenta, R. (2004). Vaccination with genetically engineered allergens prevents progression of allergic disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.風14677-14682.
8. Schmid-Grendelmeier, P., Karamloo, F., Miiller, U., Housley-Marcovic, Z., Soldatova, L., Zumkehr,丄，Kemeny, D.M., Ktindig, T., Reimers, A., von Beust, B.R., Salagianni, M., Akdis, M., Kussebi, R, Spangfort, M.D., Blaser, K., and Akdis, C.A. (2005). Prevention of allergy by a recombinant multi-allergen vaccine with reduced IgE binding and preserved T cell epitopes. Eur. J. Immunol. 35, 3268-3276.
9. Allam, J.P., Novak, N., Fuchs, C., Asen, S., Berge, S., Appel, T., et al. (2003) Characterization of dendritic cells from human oral mucosa: a new Langerhans' cell type with high constitutive FceRI expression. J. Allergy Clin. Immunol. "2,141-8.
10. von Bubnoff, D., Matz, H., Frahnert, C., Rao, M丄.，Hanau, D., de la Salle, H., Bieber, T. (2003) FcsRl induces the triptophan degradation pathwayinvolved in regulating T cell responses. J. Immunol. 7(59, 1810-1816.
11. Batard, T., Didierlaurent, A., Chabre, H., Mothes, N., Bussieres, L., Bohle, B., a/. (2005) Characterization of wild-type recombinant Bet v la as a candidate vaccine against birch pollen allergy. Int. Arch. Allergy Immunol. "《239-249.
12. Jutel， M., Jaeger, L., Suck, R., Meyer, H., Fiebig, H., Cromwell, O. (2005) Allergen-specific immunotherapy with recombinant grass pollen allergens. J. Allergy Clin. Immunol.風608-13.
13. Niederberger, V., Horak, F., Vrtala, S., Spitzauer, S., Krauth, M.T., Valent, R, a/. (2004) Vaccination with genetically engineered allergens prevents progression of allergic disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 14677-82.
14. Cromwell, O., Fiebig, H., Suck, R.， Kahlert, H.， Nandy, A., Kettner, J., d a/. (2006) Strategies for recombinant allergen vaccines and fruitful results from first clinical studies. Immunol. Allergy Clin. N. Am. 2(5, 261-81.
15. Colombo, P., Duro, G., Costa, M.A., Izzo, V., Mirisola, M., Locorotondo, G., Cocchiara, R., and Geraci, D. (1998). An update on allergens. Parietaria pollen allergens. Allergy 53, 917-921.
16. Colombo, P., Bonura, A., Costa, M., Izzo, V., Passantino, R., Licorotondo, G., Amoroso, S., and Gerasi, D. (2003). The allergens ofInt. Arch. Allergy Immunol. 730, 173-179.
17. Carreira, J. and Polo, F. (1995). The allergens of ewra戸e(3 and Pan'eterr/a and their relevance in the Mediterranean Area. Allergy Clin. Immunol. News 7, 79-84.
18. Ayuso, R., Carreira, J., Lombardero, M., Duffort, O., Peris, A., Basomba, A., and Polo, F. (1993). Isolation by mAb based affinity chromatography of two Par j isoallergens. Comparison of their physicochemical, immunochemical and allergenic properties. Mol. Immunol. 30, 1347-1354.
19. Polo, F., Ayuso, R., and Carreira，丄(1990). HPLC purification of the main allergen of尸腦'欲〃.a,(steca pollen. Mol. Immunol. 27, 151-157.
20. Polo, F., Ayuso, R., and Carreira,丄(1991). Studies on the relationship<formula>formula see original document page 32</formula>olive tree pollen. J. Allergy Clin. Immunol. 797-802.
29. Rodriguez, R., Villalba, M., Batanero, E., and et al. (2002). Allergenic diversity of the olive pollen. Allergy 6-16.
30. Hanahan, D. (1983). Studies on transformation of foc/ ehc/z/" co// with plasmids. J. Mol. Biol. 766, 557-580.
31. Laemmli, U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assambly of the head of bacteriophage T4. Nature 277, 680-685.
32. Towbin, H., Staehelin, I., and Gordon,丄(1979). Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354.
33. Ceska, M. and Lundkvist, U. (1972). Anew and simple mdioimmimoassay method for the determination of IgE. Immunochemistry 9, 1021-1030.
權利要求
1. 嵌合蛋白質，其特征在于它包含衍生自一種非特異性的1類脂質攜帶蛋白質的氨基酸序列，該嵌合蛋白質的氨基酸序列缺少一個或多個結合至IgE抗體的表位，其中IgE抗體對應于衍生出該嵌合蛋白質的氨基酸序列。
2. 權利要求1的嵌合蛋白質，其特征在于它包含氨基酸序列，所述氨 基酸序列衍生于對應于稱為Parj 1和Parj 2的歐蓍草花粉的主要變態(tài)反 應原。
3. 權利要求1或2的嵌合蛋白質，其特征在于所述嵌合蛋白質氨基酸 序列包含Par j 1或Par j 2的28-53位置。
4. 權利要求3的嵌合蛋白質，其特征在于該嵌合蛋白質包含衍生自 缺少位于Parj 1和Parj 2的第28-53位的氛基酸序列的Parj 1和Parj 2。
5. 嵌合蛋白質，其特征在于它包含與SEQIDNo.:2、 SEQIDNo.:4或 SEQ ID No.:6的同源性至少為70%的氨基酸序列。
6. 權利要求5的嵌合蛋白質，其特征在于它包含與SEQ ID No.:4的 同源性至少為70%的氨基酸序列。
7. 嵌合蛋白質，其特征在于它包含氨基酸序列SEQIDNo.:2、 SEQ ID No.:4或SEQ ID No.:6。
8. 權利要求7的嵌合蛋白質，其特征在于它包含氨基酸序列SEQ ID No. :4。
9. 用于治療免疫學病癥的嵌合蛋白質。
10. 權利要求9的嵌合蛋白質，用于治療過敏。
11. 多核苷酸，包含編碼權利要求1-10中任一項的蛋白質的核苦酸序列。
12. 多核苷酸，包含與序列SEQ ID No.:l、 SEQ ID No.:3或SEQ ID No.:5的核苷酸序列同源性至少為70%的核苷酸。
13. 多核苷酸，包含與序列SEQ ID No.:3的核苦酸序列同源性至少為 70%的核苷酸。
14. 多核苷酸，包含核苷酸序列SEQ ID No.:l、 SEQ ID No.:3或SEQ IDNo.:5。
15. 權利要求14的多核苷酸，包含核苷酸序列SEQIDNo.:3。
16. 在轉化的宿主生物內的微生物表達載體，其為自我復制的，并被 用于表達權利要求11-15中的多核苷酸。
17. 宿主生物，其用權利要求16中的微生物表達載體進行轉化。
18. 4又利要求17的生物，該生物為原核生物。
19. 權利要求18的生物，該原核生物屬于大腸桿菌(Ec^)屬。
20. 權利要求17的生物，該生物為真核生物。
21. 產生含權利要求1-10中任一項的嵌合蛋白質的多肽的方法，其特 征在于該方法包括培養(yǎng)含有微生物表達載體的宿主生物，其中的微生物 表達載體在上述生物中進行自復制，并被用于表達權利要求1-10中任一 項的嵌合蛋白質。
22. 純化權利要求1-10中任一項的嵌合蛋白質的方法，該方法包括從 培養(yǎng)物、細胞或兩者分離嵌合蛋白質。
23. 權利要求1-10中任一項的蛋白質在治療免疫病癥中的應用。
24. 權利要求1-10中任一項的蛋白質在制備治療免疫病癥的藥物中的應用。
25. 權利要求23或24所述的應用，其中免疫病癥為過敏。
26. 權利要求25所述的應用，其中過敏為對歐蓍草(尸anetoha^^a/o ) 花粉的過敏。
27. 藥物組合物，含有有效量的權利要求1-10中任一項的蛋白質和藥 學上可接受的賦形劑。
28. 權利要求27所述的藥物組合物，其中組合物為疫苗組合物。
29. 治療免疫病癥的方法，所述方法包括將權利要求27或28的藥物 組合物向需要的研究對象施用。
全文摘要
用于治療過敏的屬于歐蓍草(Parietaria judaica)脂質轉移家族的低變應原的嵌合蛋白質。本發(fā)明涉及對歐蓍草的不同變態(tài)反應原的嵌合多肽進行編碼的重組DNA分子，其可用于預防和治療過敏，尤其是花粉過敏。具體來說，描述了由具有低變應原特性的變態(tài)反應原Par j 1和Par j 2的片段構成的嵌合多肽。還描述了在異源表達系統(tǒng)中生產這些重組多肽的方法。還描述了對這些嵌合蛋白質進行純化的有效方法。
文檔編號C12N15/29GK101421296SQ200780013384
公開日2009年4月29日 申請日期2007年4月11日 優(yōu)先權日2006年4月12日
發(fā)明者羅伯托·岡薩雷斯·里奧哈, 胡安-安德烈斯·阿斯圖里亞斯-奧特加, 阿爾貝托·馬丁尼茲-葛雷特 申請人:拜爾工業(yè)制藥有限公司