專利名稱：編碼殺蟲蛋白基因Cry1Ab-Ma、其表達載體及應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程和生物防治領(lǐng)域，具體地說，涉及抗蟲基因CrylAb-Ma、其表 達載體及應用。
背景技術(shù)：
Bt基因編碼殺蟲晶體蛋白，來自蘇云金芽孢桿菌(BacillusthuringHansis)。它 在芽孢形成過程中產(chǎn)生S -內(nèi)毒素的殺蟲伴胞晶體蛋白，這些蛋白具有很高的殺蟲活性。 其作用原理為這種抗蟲蛋白能被堿性腸液溶解，水解為更小的活性毒素片段-核心片段 (Hofte和Whiteley，1989)。該活性片段能抗蛋白酶的進一步水解，被激活的蛋白質(zhì)結(jié)合在 昆蟲腸道上的刷狀小泡上，引起穿孔從而影響滲透平衡，細胞膨脹并溶解，靶標生物停止取 食并最后死亡。研究表明許多靶標害蟲的腸道上皮細胞都具有Bt蛋白高親和性的結(jié)合位 點(Hofte和Whiteley，1989)。在過去的幾十年里，已確定數(shù)十種蘇云金芽孢桿菌菌系及 130多種它們編碼的殺蟲晶體蛋白。1986年，首批轉(zhuǎn)基因植物(抗蟲、抗除草劑)被批準進入田間試驗。1987年，比 利時Vaeck等人首次獲得轉(zhuǎn)Bt殺蟲蛋白的抗蟲煙草，但只能檢測到微弱的抗蟲性，其表達 蛋白幾乎檢測不到，只占可溶性蛋白的0. 001%。同年又有兩次獲得Bt轉(zhuǎn)基因植株的報道 (Barton等，1987 ；Fischhoff等，1987)。1989年哺乳動物抗體重鏈和輕鏈基因在煙草中成 功表達并正確組裝成有功能的抗體。到1990年，至少有7個研究小組獲得Bt轉(zhuǎn)基因植物 并應用于大田試驗(Estruch J等，1996)。Adang等(1993)改造了 Cry3A基因，該基因在 馬鈴薯中高效表達。1993年，Michael等人對CrylAb基因進行改造，獲得Bt轉(zhuǎn)基因植株， 對玉米螟有很好的抗性。KozHal (199 等培育出了抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米，轉(zhuǎn)基因植株能高水平 表達CryIA(b)抗蟲基因。1996年，Joachim W等人將CrylAb進行截短修飾，轉(zhuǎn)化水稻，獲 得轉(zhuǎn)Bt水稻，靶標害蟲死亡率達100%。1998年，Cheng等人根據(jù)植物所偏愛的密碼子，改 造了 CrylAb和CrylAc基因用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化水稻獲得轉(zhuǎn)基因植株，R2代蟲試，5天內(nèi)有 100%致死率。Bohotova等Q001)人工改造合成CrylB基因，轉(zhuǎn)化熱帶玉米得到轉(zhuǎn)基因玉 米能有效防治玉米螟。我國對Bt殺蟲蛋白基因的研究主要是1992年，郭三堆等人采用植物優(yōu)化密碼子 方法首先在國內(nèi)人工合成全長ISMbp的GFMCrylA殺蟲基因，獲得了中國第一代單價抗蟲 棉。丁群星等(199 和王國英等(19卯)分別用子房注射法和基因槍法將pB48. 415質(zhì)粒 轉(zhuǎn)入玉米愈傷組織中獲得轉(zhuǎn)基因植株，抗蟲性測定表明其具有一定抗蟲性。1994年，中國農(nóng) 業(yè)大學在國內(nèi)外首次用子房注射的方法把抗蟲基因Bt轉(zhuǎn)入玉米并獲得轉(zhuǎn)基因植株，以自 主知識產(chǎn)權(quán)基因Bt為代表的抗蟲玉米已展示了良好的開發(fā)前景。1998年，中國農(nóng)業(yè)科學院 將GFM殺蟲基因構(gòu)建到pMG6質(zhì)粒上，導入到玉米中(周逢勇等，1998)，后代檢測表明Bt基 因以孟德爾遺傳方式遺傳到下一代(Liu YJ等，2003)。我國在轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究方面，已經(jīng) 建立了比較成熟的玉米轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系。CrylAb蛋白是一類由蘇云金芽孢桿菌產(chǎn)生的對鱗翅目害蟲具有毒殺作用的伴胞晶體，其在生物防治領(lǐng)域具有重要的應用前景。蘇云金桿菌S-內(nèi)毒素基因CrylAb來源于 微生物，但其轉(zhuǎn)基因植物存在表達量低、表達產(chǎn)物不穩(wěn)定、抗蟲性效果差等問題。通過改造 堿基序列提高GC含量能提高其在轉(zhuǎn)基因植物中的表達量，達到殺蟲目的(Koziel，1993)。 通過比較蘇云金芽孢桿菌和玉米的密碼子使用情況，可以發(fā)現(xiàn)兩者在密碼子偏好上存在很 大差異，利用植物的偏好密碼子，重新設計和改造CrylAb并獲得新型抗蟲基因CrylAb-Ma， 以實現(xiàn)轉(zhuǎn)新基因作物具有較好的抗蟲性。玉米是重要的糧食作物，又是重要的飼料和工業(yè)原料，當前玉米蟲害(以玉米螟 為主)嚴重，造成玉米大量減產(chǎn)，因此采取有效措施控制其危害對提高玉米產(chǎn)量、增加農(nóng)民 收入具有重要的意義。由于缺乏合適的抗蟲品種，目前解決蟲害的主要方法是在生長過程 中噴施化學殺蟲劑；但是化學殺蟲劑同時殺死害蟲及其天敵，造成生態(tài)不平衡和環(huán)境污染。 通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可以將抗蟲基因?qū)胗衩灼贩N中，進而提高轉(zhuǎn)基因玉米的抗蟲性，降低農(nóng) 藥的使用量，節(jié)省人力、物力及社會資源。因此，應用新的抗蟲基因、提高殺蟲蛋白的表達量 以及培育新型抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米是解決上述問題的最有效途徑之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能夠在植物中穩(wěn)定高效表達的抗蟲基因CrylAb-Ma及 其表達載體。本發(fā)明的另一目的是提供抗蟲基因CrylAb-Ma在提高轉(zhuǎn)基因植物抗蟲性中的應用。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種抗蟲基因CrylAb-Ma，其具有SEQ ID No. 1所 示的核苷酸序列，或該序列經(jīng)取代、缺失和/或添加一個或幾個核苷酸形成的編碼同等功 能蛋白的由SEQ ID No. 1衍生的核苷酸序列。上述抗蟲基因CrylAb-Ma編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。含有抗蟲基因CrylAb-Ma的載體，優(yōu)選雙價載體。含有上述載體的宿主細胞，優(yōu)選EHA105。含有抗蟲基因CrylAb-Ma的轉(zhuǎn)化植物細胞?？瓜x基因CryIAb-Ma在提高轉(zhuǎn)基因植物抗蟲性中的應用。優(yōu)選，所述植物為農(nóng)作 物、果樹或蔬菜，如玉米、水稻、馬鈴薯、棉花等。本發(fā)明的目的還可以采用以下的技術(shù)措施來進一步實現(xiàn)去掉原始Bt基因CrylAb 3’端1623bp的一段堿基序列，只留下部分缺失的5’端 1845bp的一段堿基序列；在保持序列CrylAb N端蛋白的氨基酸組成總體不變的情況下，用 植物偏愛的密碼子進行堿基置換，初步獲得一個改造的DNA序列；排除DNA序列中存在的造 成植物轉(zhuǎn)錄不穩(wěn)定的富含AT序列以及常用限制性酶切位點(McI)，然后通過置換密碼子 的方法進行改正消除；并在3’端加上終止密碼子TAG ；確定并化學合成改造的Bt基因，其 核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示；根據(jù)克隆需要在序列兩端加上限制性內(nèi)切酶識別位點序 列并構(gòu)建到相應的表達載體上。將本發(fā)明基因CrylAb-Ma與原核表達載體可操作地連接，能夠快速初步檢測本發(fā) 明合成的Bt基因表達產(chǎn)物對玉米螟的毒性。將本發(fā)明基因CrylAb-Ma與植物表達載體可 操作地連接，并將表達載體導入相應的農(nóng)桿菌中，進而通過農(nóng)桿菌介導法進行遺傳轉(zhuǎn)化，培育抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米。也可以對其它農(nóng)作物或者果樹等進行遺傳轉(zhuǎn)化，使其具備抗蟲活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以將本發(fā)明基因轉(zhuǎn)化細菌或真菌，通過大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)Bt 蛋白，并將其制備成殺蟲劑，用于農(nóng)作物害蟲的防治。本發(fā)明至少具有下列優(yōu)點及有益效果本發(fā)明人工合成的抗蟲基因CrylAb-Ma序列與原始CrylAb序列相比，大大增強了 其在植物中的表達。使用植物偏愛性密碼子，減少了原始DNA序列中的富含AT序列和存在 的反向重復序列以及不明確的真核DNA內(nèi)含子序列，改造后的CrylAb-Ma基因G+C含量為 63. 04%,與原始DNA序列的同源性為66%。本發(fā)明的抗蟲基因CrylAb-Ma可在植物細胞中 高效穩(wěn)定的表達。將抗蟲基因CrylAb-Ma導入玉米后，可以得到穩(wěn)定遺傳的CrylAb-Ma轉(zhuǎn)化體。此 外，該基因也可以轉(zhuǎn)化棉花、水稻、蔬菜等農(nóng)作物，使其具備相應的抗蟲活性，從而降低農(nóng)藥 的使用量，以減少環(huán)境污染，具有重要的經(jīng)濟價值和廣闊的應用前景。


圖IA 圖ID為本發(fā)明CrylAb基因與合成的CrylAb-Ma基因編碼序列分析圖。圖 2 為 CPB(pCAMBIA1300-35S-MCS-Bar)質(zhì)粒圖譜。圖3為采用農(nóng)桿菌介導法獲得的轉(zhuǎn)CrylAb基因玉米；其中，愈傷組織的篩選 (左)、再生(中)以及轉(zhuǎn)基因植株移栽到大田(右)。圖4為Ttl代轉(zhuǎn)化體中目的基因CrylAb-Ma的PCR檢測結(jié)果，其中，M為 M:DL2000plus ；CKl為陽性質(zhì)粒對照；CK2為未轉(zhuǎn)基因陰性對照；空白為雙蒸水對照；1_8是 Ab-Mal 至Ij Ab-Ma8。圖5為Ttl代轉(zhuǎn)化體選擇標記基因Bar的PCR檢測結(jié)果，其中，M為M:DL2000plus ； CKl為陽性質(zhì)粒對照；CK2為未轉(zhuǎn)基因陰性對照；空白為雙蒸水對照；1-8是Ab-Mal到 Ab-Ma8。圖6為Ttl代轉(zhuǎn)化體目的蛋白CrylAb-Ma的免疫學檢測，其中CKl為未轉(zhuǎn)基因苗陰 性對照；1-8 % Ab-Mal 到 Ab_Ma8。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。以下實施例中的試驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。以下實施例中所用的試 驗材料及試劑，如無特別說明，均購自常規(guī)生化試劑公司。實施例ICrylAb-Ma基因的合成根據(jù)Bt基因CrylAb的原始核苷酸序列，去掉3’端1623bp的一段堿基序列，只留 下部分缺失的5’端1845bp的一段堿基序列；在保持序列CrylAb N端蛋白的氨基酸組成總 體不變的情況下，用植物偏愛的密碼子進行堿基置換，初步獲得一個改造的DNA序列；排除 DNA序列中存在的造成植物轉(zhuǎn)錄不穩(wěn)定的富含AT序列(如ATTTA、AATGAA等)以及常用限 制性酶切位點(McI)，然后通過置換密碼子的方法進行改正消除；并在3’端加上終止密碼 子TAG;確定并化學合成改造的Bt基因，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示；根據(jù)克隆需要 在序列兩端加上限制性內(nèi)切酶識別位點序列并構(gòu)建到相應的表達載體上。
將原始Bt基因CrylAb與合成的CrylAb-Ma基因編碼序列進行比對分析(圖1)， 兩個序列的同源性為66%。堿基組成的統(tǒng)計結(jié)果為原始基因的G+C%為37. 34%，新合成 基因的6+(%為63.04(%。編碼的氨基酸序列的比對分析顯示，兩者編碼的氨基酸序列(其 氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示)一致。新Bt基因CrylAb-Ma的合成工作由生工生物工程(上海)有限公司完成。實施例2CryIAb-Ma基因在原核系統(tǒng)中的表達和產(chǎn)物的毒性檢測為了檢測改造的CrylAb-Ma基因體外表達及對玉米螟的毒性情況，我們構(gòu)建了 Bt 原核表達載體。根據(jù)克隆Bt基因需要，在引物序列的5’端添加NdeI內(nèi)切酶識別位點序 列CATATG，3’端添加HindIII內(nèi)切酶識別位點序列AAGCTT。設計引物序列(上游引物Fl 5 “-CATATGGACAACAACCCGAACATC-3，；下游引物 Rl :5，-AAGCTTCTAGTACTCCGCCTCG-3，)。以pUCAb-Ma質(zhì)粒為模板，以Fl和Rl為引物，擴增CrylAb-Ma基因，用限制性內(nèi)切 酶NdeI和HindIII進行酶切，凝膠回收試劑盒回收純化CrylAb-Ma基因片段。用限制性內(nèi) 切酶NdeI和HindIII酶切pET28b+，凝膠回收試劑盒回收純化5. 3kb片段。兩個片段進行 連接反應，構(gòu)建所得原核表達質(zhì)粒命名為pETAb-Ma。用不同限制性內(nèi)切酶進行酶切鑒定，表 明載體構(gòu)建正確。用pETAb-Ma轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細胞。用含有pETAb-Ma的大腸桿菌BL21菌液經(jīng)IPTG誘導后，提取Bt蛋白，以清水和含 空載體pET28b+大腸桿菌BL21菌液為對照，用玉米螟進行蟲試。具體步驟如下①接種大腸桿菌BL21單菌落于5ml LB (含卡那霉素)液體培養(yǎng)基中，37°C過夜培養(yǎng)。②將菌液接種到500ml LB(含卡那霉素)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD ^ 0. 5。③加入IPTG至終濃度0. 5mM繼續(xù)搖動誘導4小時。④4000rpm離心lOmin，收集菌體。⑤加入36ml裂解緩沖液QmM Tris-HCl ；0. 2mM CaCl2 ；PH = 8.0),重新懸浮菌體， 加入溶菌酶至終濃度lmg/ml，冰上放置30min。⑥超聲波破碎菌體(破碎參數(shù)工作10s，間隔5s，40次，冰浴破碎)，4000rpm離 心lOmin，收集上清。⑦將收集的上清加入到飼養(yǎng)玉米螟的飼料中。以含空載體pET28b大腸桿菌BL21 菌液為陰性對照。⑧在每個試管中放入一條飼料，并接入10頭初孵未進食玉米螟，各接10個試管。 放入溫度沈 觀度，相對濕度70%左右的環(huán)境中培養(yǎng)，8天后進行毒性鑒定結(jié)果表明，分 泌表達的CrylAb-Ma基因編碼的Bt蛋白有較好的殺蟲效果，玉米螟的死亡率達到90. 67%, 而且對玉米螟的生長有明顯的抑制作用(表1)。表ICrylAb-Ma基因原核表達產(chǎn)物的毒性檢測結(jié)果
權(quán)利要求
1.抗蟲基因CrylAb-Ma，其具有SEQID No. 1所示的核苷酸序列，或該序列經(jīng)取代、缺 失和/或添加一個或幾個核苷酸形成的編碼同等功能蛋白的由SEQ ID No. 1衍生的核苷酸 序列。
2.含有權(quán)利要求1所述基因的載體。
3.如權(quán)利要求2所述的載體，其為雙價載體。
4.含有權(quán)利要求3所述載體的宿主細胞。
5.如權(quán)利要求4所述的宿主細胞，其為EHA105。
6.含有權(quán)利要求1所述基因的轉(zhuǎn)化植物細胞。
7.權(quán)利要求1所述的基因在提高轉(zhuǎn)基因植物抗蟲性中的應用。
8.如權(quán)利要求7所述的應用，所述植物為農(nóng)作物、果樹或蔬菜。
9.如權(quán)利要求8所述的應用，所述植物為玉米、水稻、馬鈴薯、棉花。
10.如權(quán)利要求9所述的應用，所述植物為玉米。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種抗蟲基因Cry1Ab-Ma，其是在依據(jù)原始蘇云金芽胞桿菌Bt蛋白(Cry1Ab)N端氨基酸序列，使用單子葉植物(玉米)偏愛密碼子，通過人工改造合成新的Cry1Ab DNA序列，以及進行原核表達載體和植物表達載體的構(gòu)建，并進行相應宿主細胞的轉(zhuǎn)化。體外實驗證明改造合成的Bt基因產(chǎn)毒蛋白對玉米螟有顯著的殺蟲效果，本發(fā)明的抗蟲基因Cry1Ab-Ma能夠在單子葉植物中穩(wěn)定高效表達，進而用于生產(chǎn)抗蟲轉(zhuǎn)基因植物。
文檔編號C12N15/82GK102094030SQ201010574708
公開日2011年6月15日 申請日期2010年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月30日
發(fā)明者岳潤清, 李新海, 翁建峰, 謝傳曉, 郝轉(zhuǎn)芳, 鐵雙貴 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所, 河南省農(nóng)業(yè)科學院