專利名稱：用于確定生物學(xué)上感興趣的肽和蛋白質(zhì)的高靈敏度免疫分析和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫分析領(lǐng)域，其使得能檢測(cè)樣品中的肽和蛋白質(zhì)并提供了比現(xiàn)有技 術(shù)的分析法更高的靈敏度。本發(fā)明還涉及試劑盒，其提供進(jìn)行所述免疫分析所需的組分。
背景技術(shù)：
阿爾茨海默病(AD)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的進(jìn)行性的退行性疾病，特征為進(jìn)行性和不 斷加重的記憶喪失，接著是四肢控制和身體功能的喪失以及最終死亡。它是目前為止最為 常見的癡呆病因，影響到超過(guò)65歲人群的1 %至6 %，超過(guò)80歲人群的10至20 %。AD在幾個(gè)病理特征方面與其它類型的癡呆不同，包括在患者腦內(nèi)神經(jīng)元之間的細(xì) 胞外空隙進(jìn)行性出現(xiàn)老年斑。該老年斑具有淀粉樣沉積物中央核心，主要由稱為淀粉樣3 肽(A0)的40-42氨基酸肽的纖維形成，周圍是退化的神經(jīng)炎和膠質(zhì)細(xì)胞。這種肽源于稱為 3淀粉樣前體蛋白(0APP)的前體蛋白的蛋白水解加工。在生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)0APP有不同亞 型，這些亞型源自0APP編碼基因的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本的可變剪接。這些亞型主要是0APP-695、 3APP-751和0APP-77O，其中數(shù)字指氨基酸的數(shù)量。0APP基因存在于人21號(hào)染色體中， 該染色體的三體型(唐氏綜合征)導(dǎo)致0APP蛋白的過(guò)表達(dá)以及患者腦內(nèi)過(guò)早出現(xiàn)淀粉樣 斑(Selkoe D.J. (2001) Physiol. Rev. 81，741-766)。3 APP 為跨膜蛋白，可被不同的蛋白 水解酶(分泌酶)加工而產(chǎn)生不同的產(chǎn)物。通常，0APP在其胞外區(qū)被a分泌酶切割，產(chǎn) 生可溶性長(zhǎng)分泌片段和稱為C83的較短膜錨定片段，C83被Y _分泌酶進(jìn)一步切割產(chǎn)生P3 肽(p34(l或p342)以及被其它蛋白酶進(jìn)一步降解的57或59肽。當(dāng)3APP被分泌酶切割 時(shí)，其產(chǎn)生可溶性分泌片段(S0APP-0)和C99片段，該C99片段可被分泌酶切割而產(chǎn) 生淀粉樣肽A3和錨定在膜內(nèi)的57或59氨基酸肽(SelkoeD. J. (2001)Physiol. Rev. 81, 741-766)。根據(jù)出現(xiàn)的年齡，可以將AD分類為早期發(fā)作型(低于60歲)和晚期發(fā)作型(高 于60歲)，以及根據(jù)常染色體顯性遺傳的存在，可以將AD分類為家族性AD或散發(fā)性AD。早 期發(fā)作的家族型AD可與編碼0APP、早老蛋白1和早老蛋白2的基因(分別位于第21、14 和1號(hào)染色體上)中的已知突變相關(guān)。這些分類并不是相互排斥的。最常見的形式為散發(fā) 性晚期發(fā)作型。在臨床實(shí)踐中，采用基于典型的臨床標(biāo)志的存在來(lái)進(jìn)行AD診斷，并采用神經(jīng)成像 技術(shù)和血液分析來(lái)排除其它類型的癡呆。采用這些標(biāo)準(zhǔn)，診斷可靠性是可接受的，盡管根據(jù) 采用腦尸檢進(jìn)行的研究，有10-20%的診斷為AD的患者患有不同的疾病。另外，只有當(dāng)神經(jīng) 退行性過(guò)程進(jìn)展至患者患有嚴(yán)重癡呆和腦損傷廣泛至治療措施的數(shù)量有限時(shí)，目前的診斷 方法才能實(shí)施。明確診斷有賴于對(duì)死后腦組織的病理檢查。因此，亟需鑒定用于AD早期診斷的靈敏和特異的生物標(biāo)志物，其使得能區(qū)分年老 引起的認(rèn)知損害和與該過(guò)程的早期癥狀相關(guān)的認(rèn)知損害，以及區(qū)分AD引起的變化和其它 退行性疾病引起的變化。根據(jù)Growdon等人(Neurobiol. Aging，1998，19 :109_116)，用于 AD的理想標(biāo)志物應(yīng)滿足以下條件
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-其應(yīng)該檢測(cè)神經(jīng)病理學(xué)的基本特征-其應(yīng)該在該疾病的神經(jīng)病理學(xué)證實(shí)的病例中得到驗(yàn)證-對(duì)于檢測(cè)AD，其應(yīng)該顯示至少80%的靈敏度-對(duì)于區(qū)分AD和其它類型的癡呆，其應(yīng)該顯示至少80%的特異性，以及-其應(yīng)該是可靠的、可重復(fù)的、非侵入性的、易于操作的和廉價(jià)的?，F(xiàn)有技術(shù)中已知通過(guò)檢測(cè)患者腦或CSF內(nèi)存在的生物標(biāo)志物的水平來(lái)診斷AD的 方法。已經(jīng)對(duì)在CSF內(nèi)測(cè)定的不同生物標(biāo)志物進(jìn)行了表征。CSF直接反映了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的 細(xì)胞外空隙的成分，因此提供了較高濃度的生物標(biāo)志物。但是，只能通過(guò)腰椎穿刺獲取CSF， 這不是容易被患有癡呆的患者接受的常規(guī)診斷方法，更不用說(shuō)具有記憶病癥的患者。因此， 亟需這樣的AD生物標(biāo)志物，其可在通過(guò)非侵入性方式從身體獲取的樣品中被檢測(cè)到?，F(xiàn)有技術(shù)中描述的可在血漿中檢測(cè)的適合AD生物標(biāo)志物包括(i)源于淀粉樣斑 的標(biāo)志物，(ii)針對(duì)A3或3APP的自身抗體，(iii)炎性標(biāo)志物，例如IL-6，其受體或gp 130，C反應(yīng)性蛋白或氧化應(yīng)激(異構(gòu)前列腺素)，(iv)脂代謝的標(biāo)志物(apoE，氧固醇)以 及(v)血管性疾病標(biāo)志物(同型半胱氨酸，脂蛋白b Clq) (Scheuner D et al. (1996) Nature Med 2,864-870)。然而，鑒于A3在AD患者腦內(nèi)累積并且為AD發(fā)病機(jī)制中的中心要素，該蛋白被 認(rèn)為是AD標(biāo)志物的最適合候選者。但是，將A0用作AD的血漿生物標(biāo)志物面臨A3肽 (A3 (1-40)和A0 (1-42))在血清中的濃度極低的問(wèn)題，以致沒(méi)有足夠靈敏的能可靠檢測(cè) 所述肽類的分析法。Scheuner等人(Nature Med.，1996，2 :864_870)進(jìn)行了初步研究來(lái)檢測(cè)在攜帶家 族性AD相關(guān)突變的家族患者中早老蛋白1、早老蛋白2或0APP的胞外濃度是否升高。盡 管在具有 FAD 相關(guān) PS1 (P < 0. 0001)、PS2N141I (P = 0. 009)、APPK67(1N, M671L，(P < 0. 0001)和 APPV7171 (—例個(gè)體)突變的個(gè)體血漿中觀察到升高水平的A 0 1-42(43)，但是這些研究對(duì) 于分析其中A0肽在血清中的濃度低得多的散發(fā)性AD無(wú)效。本文中使用的測(cè)定試劑盒為 Suzuki,N.等人(Science, 1994，264 1336-1340)之前描述的ELISA夾心測(cè)定法，其使用捕 獲抗體和過(guò)氧化物酶結(jié)合的檢測(cè)抗體。已有人指出，A3水平與散發(fā)性AD之間沒(méi)有關(guān)聯(lián)性。相應(yīng)地，Tamaoka A等人(J Neurol Sci.，1996，141,65-68)測(cè)量了來(lái)自28例散發(fā)性AD患者、40例具有不同神經(jīng)學(xué)過(guò)程 的癡呆患者以及40名健康對(duì)照的血漿中的A0水平。這些作者得出結(jié)論，A0 40和A3 42 的血漿水平在對(duì)照個(gè)體和患有散發(fā)性AD的患者中是類似的。Kosaka等人(Neurology， (1997)48,741-745)得到了類似的結(jié)果。Tamaoka及其同事使用的測(cè)定法就測(cè)量血漿中 的A0 1-40在W0200722015中有進(jìn)一步的說(shuō)明。該測(cè)定法為ELISA夾心測(cè)定法，其中采用 1A10單克隆抗體(mAb)將A0 40和A0 42肽捕獲在固體支持物上并采用過(guò)氧化物酶結(jié)合的 14FlmAb進(jìn)行檢測(cè)。這種測(cè)定法提供了個(gè)位數(shù)pg/ml范圍內(nèi)的靈敏度水平。Vanderstichele H 等人(Amyloid，2000，7，245-258)測(cè)定了 12 名健康對(duì)照、39 例 AD患者和6例患有路易體癡呆的患者、10例具有其它類型癡呆的患者以及9例具有其它神 經(jīng)學(xué)病狀而不表現(xiàn)癡呆的患者的CSF、血漿和尿中的A0 (1-42)水平，但是在A0 (1-42)水 平和診斷結(jié)果、性別或MMSE結(jié)果之間沒(méi)有觀察到關(guān)聯(lián)性。對(duì)于這些研究，使用了基于ELISA 夾心測(cè)定法的INNOTEST0-淀粉樣蛋白(1-42)測(cè)試，其中采用識(shí)別A0 (1-42)的N-末端區(qū)的21F12mAb將A0 (1-42)捕獲在固體支持物上，并采用識(shí)別A0 (42)C-末端區(qū)的生物素 化3D6mAb和偶聯(lián)至HRP的鏈霉抗生物素進(jìn)行檢測(cè)。Fukomoto y col. (Arch. Neurol. 2003，60，958-964)在 146 例 AD 患者、37 例輕度 認(rèn)知損害患者和96例帕金森病患者中研究了血漿A0 40和A0 42水平與不同的臨床、人口 統(tǒng)計(jì)學(xué)和遺傳變量的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果表明，隨年齡有顯著增加，但是相對(duì)于診斷、家族史、ApoE 基因型或諸如乙酰膽堿酯酶抑制劑或他汀類的不同藥物的治療沒(méi)有差異。這些測(cè)量使用 ELISA夾心測(cè)定法完成，采用了識(shí)別A0的第11至28位氨基酸的mAb(BNT77)和特異識(shí)別 A 3 40 禾口 A 3 42 的 HRP 偶聯(lián)的 mAb (BA27 和 BC05mAb)。Mehta 等人(Arch. Neurol. 57，2000,100-105)測(cè)量了 78 例 AD 患者和 61 名健康對(duì) 照中血漿和CSF的A 0 40和A 0 42水平，觀察到，具有ApoE4等位基因的AD患者中A 0 40血 漿水平高于沒(méi)有所述等位基因的對(duì)照組，A0 42水平在AD患者和對(duì)照之間類似，就性別或 簡(jiǎn)易精神狀態(tài)檢查(MMSE)評(píng)分而言無(wú)差異。這些測(cè)量使用ELISA夾心測(cè)定法完成，采用了 作為捕獲抗體的抗A 0 mAb 6E10和針對(duì)A 0 42和A 0 40特異的肽產(chǎn)生的生物素化抗血清。Mayeux, R.等人(Ann Neurol. 1999，46，412-416)采用了與 Mehta 等人(Arch. Neurol. 57，2000，100-105)相同的ELISA測(cè)定法測(cè)量了個(gè)體隊(duì)列(530)中的血漿A3 40和 A3 42水平，并在18個(gè)月后再次測(cè)量(307例個(gè)體)。研究期間他們觀察到患有AD的個(gè)體 具有比未患有AD的個(gè)體更高的A 0 42水平。在確定的AD診斷三年后A 0 42水平下降。相 對(duì)于AD表型未觀察到差異。Lanz, T. A 禾口 Schacthter，J. B. (J. Neuroscience Methods,2006,157 :71_81)描 述了用于檢測(cè)A 0肽總含量或A 0 40和A 0 42肽的單獨(dú)含量的比色和熒光ELISA夾心測(cè)定 法。對(duì)于檢測(cè)A 3肽的總量，利用6￡10-13捕獲六3肽，然后采用生物素化的4G8和銪結(jié)合 的鏈霉抗生物素或HRP-鏈霉抗生物素進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)于檢測(cè)A 0 40和A 0 42的量，6E10mAb 被用作捕獲抗體，并采用了對(duì)每一片段特異的生物素化兔多克隆抗體，接著是銪結(jié)合的鏈 霉抗生物素或HRP-鏈霉抗生物素。但是，這種方法提供10pg/ml的最低檢測(cè)限，并僅用于 測(cè)量腦提取物中的A3。W0200750359描述了檢測(cè)多聚體形式的A0 42的免疫分析法，其包括采用對(duì)所述 多聚體形式特異的多克隆抗體捕獲A 0 42衍生的肽并采用mAb和HRP結(jié)合的抗小鼠IgG檢 測(cè)所結(jié)合的肽的量。但是，這種分析法提供1000-3000pM的檢測(cè)限，相當(dāng)于4000pg/ml。W00162801描述了檢測(cè)A 0的ELISA夾心測(cè)定法，其將3D6mAb抗N-末端作為包 被抗體，將識(shí)別成熟A0的第15至24位氨基酸的mAb用于檢測(cè)，但是僅用于測(cè)量100至 200pg/mL范圍內(nèi)的A 3濃度值。W00315617描述了測(cè)量血漿中A0 40和A0 42的ELISA測(cè)定法，其使用識(shí)別成熟 A 3肽的第13至28位氨基酸的抗體，但是僅能夠檢測(cè)250-400pg/ml范圍內(nèi)濃度的所述肽， 因此，僅適合于測(cè)量具有家族性AD的血漿中的A3。W00246237描述了測(cè)量腦勻漿液中總A 3種類(A 3 40禾口 A 3 42)的ELISA夾心測(cè) 定法，其采用了作為捕獲抗體的對(duì)A042的第13至28位氨基酸特異的mAb以及對(duì)A342 肽的N-末端區(qū)特異的生物素化3D6mAb，然后采用了結(jié)合至過(guò)氧化物酶的鏈霉抗生物素。這 篇文章還描述了 A3 42特異的ELISA夾心測(cè)定法，其將對(duì)A3 42的第33-42位氨基酸特異 的mAb 21F12用作捕獲抗體，將生物素化的3D6mAb用作檢測(cè)抗體。但是，這些分析法具有較低的靈敏度水平，對(duì)于總A 0分析為50ng/ml，對(duì)于A0 42特異的分析為125mg/ml，這使 得它們不適合于測(cè)量血漿或血清中的總A 0或A 0 42。TO0413172描述了用于測(cè)量甲酸腦提取物和CSF中淀粉樣蛋白(1-42)的 ELISA夾心測(cè)定法，該方法將mAb 3D6用作檢測(cè)抗體，將對(duì)成熟A 0肽不同區(qū)域特異的多克 隆抗體用作捕獲抗體。但是，迄今已知的所有基于ELISA的分析最多只具有個(gè)位數(shù)pg/mL范圍的檢測(cè)下 限，這對(duì)于檢測(cè)CSF中A 0 40和A 0 42以及對(duì)于檢測(cè)患有家族性AD的患者血漿中所述種類 是足夠的，但是不適合于檢測(cè)患有散發(fā)性AD的患者血漿中的A0 42，其中的A0 42血漿濃度 低得多。具體地，INNOTEST0淀粉樣蛋白(1-42)測(cè)試具有20pg/ml的檢測(cè)下限，這能夠檢測(cè) CSF中的A0 42以及在患有家族性AD的患者中進(jìn)行血漿測(cè)量，但是對(duì)于檢測(cè)血漿中A3 42 濃度低得多的散發(fā)性AD患者中的A0 42還不夠靈敏。僅建議將這種試劑盒用于測(cè)量CSF 中的A0肽水平。最近采用INNOTEST0-淀粉樣蛋白(1_42)的研究進(jìn)一步驗(yàn)證了這種建 議，這項(xiàng)研究顯示，CSF中的肽水平比血漿中的高100至1000倍(Lewczuk，P et al. (2004) Neurobiol. Aging 25,273—281)。另一種商品化試劑盒為BiosourceP淀粉樣蛋白(1_40)和0淀粉樣蛋白(1_42) 試劑盒。這些試劑盒提供ELISA夾心測(cè)定法，其中采用針對(duì)成熟肽的氨基末端的mAb將所 述肽捕獲在支持物上，并采用與成熟0 -肽的C-末端區(qū)反應(yīng)的兔多克隆抗體和抗兔IgG過(guò) 氧化物酶進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)制造商的說(shuō)明，這種試劑盒具有小于10pg/mL的靈敏度，但用于檢 測(cè)15. 6至1000pg/mL的A0濃度。制造商建議所述Biosource試劑盒用于檢測(cè)血清、CSF 和細(xì)胞培養(yǎng)物中的A 0肽。但是，散發(fā)性AD患者血清中A 0 40和A 0 42平均水平低于該測(cè) 定的靈敏度下限，這樣看起來(lái)就不可能將它們用于血清中的測(cè)量。對(duì)應(yīng)國(guó)際專利申請(qǐng)W0200646644的加拿大專利申請(qǐng)(CA2585148)描述了唯一的顯 示出檢測(cè)下限為0. 5pg/mL的A0肽分析法。這篇文獻(xiàn)中使用的分析法為電化學(xué)發(fā)光(ECL) 夾心分析法，其中將mAb 21F12(其識(shí)別A 3 42的第33-42位氨基酸)偶聯(lián)至磁珠，然后將 其用于在含有A0 42的樣品中捕獲A0 42肽，再與結(jié)合至釕復(fù)合物的3D6mAb進(jìn)行接觸。然 后，通過(guò)施加電能時(shí)釕復(fù)合物發(fā)射的光來(lái)檢測(cè)所結(jié)合的3D6抗體的量。采用這種測(cè)定法，發(fā) 明人能夠檢測(cè)低至0. 5pg/mL的A 0 42標(biāo)準(zhǔn)品。但是，當(dāng)該測(cè)定法被用于比較來(lái)自AD患者和 健康對(duì)照的血漿樣品中的A0 42時(shí)，在兩組之間沒(méi)有觀察到顯著差異，這使發(fā)明人推斷由 于降解導(dǎo)致血清中完整A 0 42的量非常低，并求助于采用21F12mAb的競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定法， 其提供ng/mL范圍內(nèi)的靈敏度下限。因此，本領(lǐng)域亟需用于檢測(cè)A0衍生肽的改進(jìn)免疫學(xué)測(cè)定法和試劑盒，它們克服 現(xiàn)有技術(shù)中方法和試劑盒的問(wèn)題，尤其是，以可靠的方式足夠靈敏地檢測(cè)患有散發(fā)性AD的 患者血漿中的A3肽。發(fā)明_既述在第一方面，本發(fā)明涉及用于確定或測(cè)定選自A 0 42、A 0 40及其混合物的靶多肽 的試劑盒，所述試劑盒包括(i)第一抗體或抗體組合，其識(shí)別所述靶多肽(ii)第二抗體或抗體組合，其識(shí)別與所述第一抗體或抗體組合識(shí)別的區(qū)域不同的 所述靶多肽的區(qū)域
(iii)對(duì)所述第二抗體顯示出親和性的試劑，其被偶聯(lián)至結(jié)合對(duì)的第一成員，以及(iv)結(jié)合對(duì)的第二成員，其被偶聯(lián)至可檢測(cè)的標(biāo)簽。
在第二方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明試劑盒的用途，用于測(cè)定或檢測(cè)樣品中耙多肽以 及用于診斷個(gè)體中的神經(jīng)退行性病癥。在第三方面，本發(fā)明涉及用于測(cè)定或檢測(cè)樣品中選自A β 42、A β 40及其混合物的 靶多肽的量的方法，包括以下步驟(i)用特異結(jié)合所述靶多肽的第一抗體或抗體組合捕獲存在于樣品中的所述靶多 肽，(ii)將步驟(a)中形成的免疫復(fù)合物與第二抗體或抗體組合接觸，所述第二抗體 或抗體組合識(shí)別與所述第一抗體或抗體組合識(shí)別的區(qū)域不同的所述靶多肽的區(qū)域，(iii)將步驟(ii)中形成的復(fù)合物與對(duì)所述第二抗體顯示出親和性并被偶聯(lián)至 結(jié)合對(duì)的第一成員的試劑接觸，(iv)將步驟(iii)中形成的復(fù)合物與偶聯(lián)至可檢測(cè)標(biāo)簽的結(jié)合對(duì)的第二成員接 觸，以及(ν)測(cè)定或檢測(cè)連接至所述結(jié)合對(duì)的第二成員的可檢測(cè)標(biāo)簽的活性或量。在第四方面，本發(fā)明涉及診斷個(gè)體中退行性病癥的方法，其包括采用本發(fā)明的方 法確定患者樣品中Αβ 40或Αβ 42的量，并參照健康個(gè)體樣品中一種肽或兩種肽的濃度將 所述患者樣品中所述一種或兩種肽的濃度與退行性病癥的出現(xiàn)相關(guān)聯(lián)。


圖1顯示了 ELISA夾心測(cè)定法的標(biāo)準(zhǔn)滴定曲線，其中將450nm處的吸光度值對(duì) Αβ 40標(biāo)準(zhǔn)制劑的已知濃度(pg/mL)作圖。圖2顯示了 ELISA夾心測(cè)定法的標(biāo)準(zhǔn)滴定曲線，其中將450nm處的吸光度值對(duì) Αβ 42標(biāo)準(zhǔn)制劑的已知濃度(pg/mL)作圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的作者出人意料地發(fā)現(xiàn)，通過(guò)使用具有權(quán)利要求1中定義的組分的試劑 盒，有可能以低于0. lpg/ml的檢測(cè)下限測(cè)定Αβ 40和Αβ 42的水平。這種試劑盒能夠在任 何個(gè)體的任何樣品中，特別是在來(lái)自疑似患有散發(fā)性AD的個(gè)體的血漿中對(duì)所述分子種類 進(jìn)行可靠的定量，其中所述血漿濃度太低以至于迄今為止還不可能進(jìn)行可靠的測(cè)量。因此，在第一方面，本發(fā)明涉及用于確定或測(cè)定選自Αβ 42、Αβ 40及其混合物的 靶多肽的試劑盒，所述試劑盒包括(i)第一抗體或抗體組合，其識(shí)別所述靶多肽，(ii)第二抗體或抗體組合，其識(shí)別與所述第一抗體或抗體組合識(shí)別的區(qū)域不同的 所述靶多肽的區(qū)域，(iii)對(duì)所述第二抗體顯示出親和性的試劑，其被偶聯(lián)至結(jié)合對(duì)的第一成員，以及(iv)結(jié)合對(duì)的第二成員，其被偶聯(lián)至可檢測(cè)標(biāo)簽。不希望被任何特定理論所束縛，可以認(rèn)為該提高的靈敏度是由于使用了試劑 (iii)，其使得源于檢測(cè)抗體的信號(hào)被放大。
用在本文時(shí)，“Α β 42”指對(duì)應(yīng)第672至713位氨基酸(SEQ IDNO 4)的42個(gè)氨基 酸肽，其由β-和Y-分泌酶相繼蛋白水解切割淀粉樣前體蛋白(SEQ ID NO 6)而產(chǎn)生。用在本文時(shí)，“Α β 40”指對(duì)應(yīng)第672至711的氨基酸(SEQ IDNO 5)的40個(gè)氨基 酸肽，其由β-和Y-分泌酶相繼蛋白水解切割淀粉樣前體蛋白(SEQ ID NO 6)而產(chǎn)生。
在本發(fā)明上下文中，第一抗體將被認(rèn)為是“捕獲”抗體，含義是該抗體被用于從樣 品中獲取該抗體特異結(jié)合的所有分子種類。就可用作捕獲抗體的抗體類型而言實(shí)際上沒(méi)有 任何限制，只要其含有至少一個(gè)對(duì)A β 40和/或A β 42特異的抗原結(jié)合部位。因此，適合用 作捕獲抗體的抗體分子包括-“完整”抗體，其包含抗原結(jié)合可變區(qū)以及輕鏈恒定區(qū)(CL)和重鏈恒定區(qū)CH1、 CH2 禾口 CH3，_產(chǎn)生于木瓜蛋白酶消化完整抗體的“Fab”片段，其包含單一抗原結(jié)合部位以及 CL 禾口 CHl 區(qū)，-產(chǎn)生于胃蛋白酶消化完整抗體的“F(ab’)2”片段，其含有兩個(gè)抗原結(jié)合部位，- “Fab”’片段含有輕鏈恒定區(qū)和重鏈的第一恒定區(qū)(CHl)，并僅具有一個(gè)抗原結(jié) 合位點(diǎn)。Fab’片段與Fab片段的不同之處是在重鏈CHl區(qū)的羧基末端添加了數(shù)個(gè)殘基，包 括一個(gè)或多個(gè)來(lái)自抗體鉸鏈區(qū)的半胱氨酸，- “Fv”為最小的抗體片段，其含有完整的抗原識(shí)別和抗原結(jié)合部位。該區(qū)域由緊 密、非共價(jià)結(jié)合的一個(gè)重鏈和一個(gè)輕鏈可變區(qū)的二聚體組成。其構(gòu)型為每一可變區(qū)的三個(gè) 超變區(qū)(CDR)相互作用以在VH-VL 二聚體的表面上限定抗原結(jié)合部位。六個(gè)超變區(qū)共同賦 予抗體抗原結(jié)合特異性。但是，即使是單一可變區(qū)(或僅包含三個(gè)特異于抗原的超變區(qū)的 半個(gè)Fv)也能識(shí)別和結(jié)合抗原，盡管親和性小于完整結(jié)合部位。-單鏈FV或〃scFv"抗體片段包含抗體的VL和VH區(qū)，其中這些區(qū)存在于單一多 肽鏈中。優(yōu)選地，該VL和VH區(qū)通過(guò)多肽接頭連接，其使得scFv能形成抗原結(jié)合所需要的 結(jié)構(gòu)。-“雙抗體” (diabody)包含在同一多肽鏈(VH-VL)上通過(guò)肽接頭相互連接的重鏈 可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)，其中過(guò)短的肽接頭使得同一鏈上的兩結(jié)構(gòu)域不能配對(duì)。這 迫使與另一鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)，并促進(jìn)具有兩個(gè)功能性抗原結(jié)合部位的二聚體分子的組裝。-“雙特異性抗體” (BAb)為單鏈雙價(jià)抗體(或其免疫治療上有效的片段)，其具有 兩個(gè)特異性不同的抗原結(jié)合部位。這兩個(gè)抗原部位可以化學(xué)上連接在一起，或者通過(guò)現(xiàn)有 技術(shù)中已知的遺傳工程方法連接在一起。所有這些抗體片段都可以單獨(dú)或組合采用現(xiàn)有技術(shù)中已知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)一步修 飾，例如通過(guò)采用現(xiàn)有技術(shù)中已知的氨基酸刪除、插入、置換、添加、和/或重組(和/或 任何其它修飾(例如，翻譯后和化學(xué)修飾，例如糖基化和磷酸化)。向構(gòu)成免疫球蛋白鏈 氨基酸序列的基礎(chǔ)的DNA序列中引入這類修飾的方法在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的；例如參見， Sambrook等人；Molecular Cloning :A Laboratory Manual (分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))；Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 第二版禾口 2001 年第三版。適合作為捕獲抗體的抗體包括多克隆和單克隆抗體。為了產(chǎn)生多克隆抗體，可以 通過(guò)注射具有免疫原性質(zhì)的對(duì)應(yīng)于A β 40或A β 42的片段的肽來(lái)免疫各種宿主，包括山羊、兔、大鼠、小鼠、駱駝、單峰駱駝、美洲駝、人、鳥等。取決于宿主種類，可以使用不同的佐劑增 強(qiáng)免疫反應(yīng)。這類佐劑包括但不限于，弗氏佐劑，礦物凝膠如氫氧化鋁，以及表面活性物質(zhì) 如溶血卵磷脂，聚陰離子，肽，油乳劑，KLH和二硝基酚。在人體內(nèi)使用的佐劑中，BCG(卡介 苗)和短小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)是尤其優(yōu)選的。如果抗原是肽，則有益的 是將其偶聯(lián)至在待免疫物種中有免疫原性的蛋白。例如，采用雙功能或衍生化試劑，如馬來(lái) 酰亞胺苯甲酸硫代琥珀酰亞胺酯(通過(guò)半胱氨酸殘基偶聯(lián))、N-羥基琥珀酰亞胺(通過(guò)賴 氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酐或SOCl2,抗原可以被偶聯(lián)至鑰孔戚血藍(lán)蛋白(keyhole limpet hemocyanin, KLH)、藍(lán)載體(Blue Carrier,從 Concholepas concholepas 分離的血藍(lán)蛋 白)、牛甲狀腺球蛋白、或大豆胰蛋白酶抑制劑。
為了產(chǎn)生單克隆抗體，可以使用常規(guī)技術(shù)。例如，可以使用Kohleret al. ,Nature, 256:495(1975)最先描述的雜交瘤方法制備單克隆抗體，采用Ausubel，F(xiàn). M等人(Current Protocols in Molecular Biology (現(xiàn)代分子生物學(xué)規(guī)程)，John Wiley & Sons Inc ；活 頁(yè)版，2003)的11. 4至11. 11單元中詳細(xì)描述的步驟。或者，可以通過(guò)重組DNA操作從采 用McCafferty等人，Nature, 348 =552-554(1990)描述的技術(shù)生成的抗體噬菌體文庫(kù)中 分離單克隆抗體。Clacksoii 等人，Nature, 352 624-628 (1991)和 Marks 等人，J. Mol. Biol.，222 :581-597 (1991)分別描述了采用噬菌體文庫(kù)分離鼠和人抗體。后來(lái)的出版物 描述了通過(guò)鏈替換產(chǎn)生高親和性(nM范圍)人抗體(Marks et al.，Bio/Technology, 10 779-783(1992))，以及組合感染和體內(nèi)重組作為構(gòu)建極大噬菌體文庫(kù)的策略(Waterhouse et al.，Nucl. Acids. Res. ,21 :2265_2266 (1993))。因此，對(duì)于分離單克隆抗體，這些技術(shù)是 傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤技術(shù)的可行的替代方案。在取血并去除纖維蛋白凝塊后，從經(jīng)免疫的宿主獲得的抗血清可直接作為多克隆 抗體使用。雜交瘤培養(yǎng)物上清液或在適合宿主腹膜腔內(nèi)植入雜交瘤后的腹水可直接作為單 克隆抗體使用?？蛇x擇地，不論是多克隆的還是單克隆的，免疫球蛋白分子都可在其使用 前通過(guò)常規(guī)手段純化，例如采用衍生自A β 40或A β 42的肽的親和純化，非變性凝膠純化， HPLC或RP-HPLC，體積排阻，蛋白 A柱純化(purification onprotein A column)，或這些技 術(shù)的任意組合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，捕獲抗體識(shí)別Αβ 40和Αβ 42的共有區(qū)域，以便能夠用單一 抗體種類同時(shí)捕獲這二者。原則上，任何對(duì)Αβ40和Αβ42的序列的共有區(qū)域特異的抗體 都可用作捕獲抗體?？杀徊东@抗體靶向的優(yōu)選表位包括位于Aβ 40或Αβ 42的第1至16 位、第1至17位、第13至28位、第15至24位、第1至5位和第1至11位氨基酸內(nèi)的表位。 在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述捕獲抗體針對(duì)A β 40和/或A β 42中不同于C末端區(qū)的區(qū)域。 在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述捕獲抗體針對(duì)A β 40和A β 42肽的N-末端區(qū)的表位。在另一 優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述捕獲抗體為單克隆抗體。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述捕獲抗體識(shí) 別對(duì)應(yīng)Αβ肽的第1-16位氨基酸的區(qū)域。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，用作捕獲抗體的單克隆 抗體為 6E10mAb，其在 Kim，K. S. (Neuroscience Res. Comm. 1988,2:121-130)中已有描述。本發(fā)明的試劑盒的第二組分對(duì)應(yīng)于抗體或抗體組合，它們識(shí)別與第一抗體或抗體 組合識(shí)別的區(qū)域不同的靶多肽的區(qū)域。在本發(fā)明上下文中，第二抗體被認(rèn)為是“檢測(cè)抗體”， 因?yàn)檫@種抗體被用于檢測(cè)捕獲抗體保留的抗原的量。如同捕獲抗體，就可用作檢測(cè)抗體的抗體類型而言實(shí)際上沒(méi)有限制。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)了解的是，檢測(cè)抗體(i)必須結(jié)合不被捕獲抗體占據(jù)的抗原區(qū)域以及(ii)必須不僅含有抗原結(jié)合部位，還含有被對(duì)所述抗體顯示出高親和性結(jié)合的試劑可特異檢測(cè)的 一個(gè)或多個(gè)其它區(qū)域，以便能檢測(cè)與由捕獲抗體捕獲的抗原結(jié)合的該抗體。優(yōu)選地，被所述 試劑特異結(jié)合的所述其它區(qū)域?qū)?yīng)免疫球蛋白分子的恒定區(qū)。適合的檢測(cè)抗體包括完整抗體、Fab、F(ab' )2、Fab，和Fv片段、單鏈FV抗體、雙 抗體、雙特異性抗體等，其中這些化合物如前文所定義的。與捕獲抗體的情況類似，檢測(cè)抗 體采用與針對(duì)捕獲抗體描述的方法相同的方法，可以為多克隆的或單克隆的，天然的或翻 譯后修飾的，以及純的或富集抗原結(jié)合分子的。技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到，為了使用檢測(cè)抗體，其 必須被稀釋至適合的工作濃度，以及為每批抗體可以常規(guī)地確定所述稀釋度。此外，顯而 易見的是，適當(dāng)?shù)墓ぷ飨♂尪葘⑷Q于使用抗血清還是純化的IgG成分。通常的稀釋度為 1/1000、1/2000、1/3000、1/4000、1/5000、1/6000、1/7000、1/8000、1/9000、1/10000 等。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述檢測(cè)抗體包含選自下組的任何多克隆抗體(i)針對(duì)對(duì)應(yīng)A β 42肽的C-末端區(qū)的肽制備的多克隆抗體，其特異結(jié)合A β 42而 不與Αβ 40或Αβ 43產(chǎn)生任何明顯的交叉反應(yīng)(ii)針對(duì)對(duì)應(yīng)Αβ 40肽的C-末端區(qū)的肽制備的多克隆抗體，其特異結(jié)合Αβ 40而 不與八3 42、八3 39、八3 38、八3 41或八3 43產(chǎn)生任何明顯的交叉反應(yīng)(iii)同時(shí)識(shí)別A β 40禾口 A β 42的C末端區(qū)的抗體，或(iv) (i)和(ii)中抗體的組合。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于制備A β 42特異抗體的對(duì)應(yīng)A β 42肽的C末端區(qū)的 肽為SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2中定義的肽在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于制備A β 40 特異抗體的對(duì)應(yīng)A β 40肽的C末端區(qū)的肽為SEQ ID NO 3中定義的肽。A β 40禾口 A β 42特 異性抗體以及它們的制備方法在W02004024770和W02004098631中有詳細(xì)說(shuō)明，通過(guò)參考 將其內(nèi)容并入本文。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會(huì)理解，所述方法可用于檢測(cè)A β 40、A β 42或同時(shí)檢測(cè)二 者，這取決于該方法中使用的捕獲和檢測(cè)抗體的類型。為了特異性測(cè)定或確定A β 40，捕獲抗體可以是識(shí)別A β 40的N-末端區(qū)(以及 Αβ42的N-末端區(qū)，因?yàn)閮煞N肽具有相同的N末端區(qū))的抗體，檢測(cè)抗體可以是特異識(shí)別 A β 40的C-末端區(qū)而不與A β 42產(chǎn)生任何交叉反應(yīng)的抗體?；蛘撸梢圆捎米R(shí)別A β 40 的C-末端區(qū)而不與Aβ 42產(chǎn)生任何交叉反應(yīng)的捕獲抗體以及識(shí)別Aβ 40和Αβ 42共有的 A β 40區(qū)域(優(yōu)選A β 42/Α β 40的N-末端區(qū))的檢測(cè)抗體來(lái)特異性檢測(cè)A β 40。為了特異性測(cè)定或確定A β 42，捕獲抗體可以是識(shí)別A β 42的N-末端區(qū)(以及 Αβ40的N-末端區(qū)，因?yàn)閮煞N肽具有相同的N末端區(qū))的抗體，檢測(cè)抗體可以是特異識(shí)別 A β 42的C-末端區(qū)而不與A β 40產(chǎn)生任何交叉反應(yīng)的抗體。或者，可以采用識(shí)別A β 42的 C-末端區(qū)的捕獲抗體以及識(shí)別Αβ 42和Αβ 40共有的Αβ 42區(qū)域的檢測(cè)抗體來(lái)特異性檢測(cè) Αβ42。為了同時(shí)測(cè)定或確定A β 42禾口 A β 40，捕獲抗體可以是識(shí)別A β 42禾口 A β 40共有的 N-末端區(qū)的抗體，而檢測(cè)抗體可以是至少兩種抗體的組合，其中第一抗體特異識(shí)別Αβ 42 的C-末端區(qū)而不與A β 40產(chǎn)生任何交叉反應(yīng)，第二抗體特異識(shí)別A β 40的C-末端區(qū)而不與 Aβ 42產(chǎn)生任何交叉反應(yīng)?；蛘?，捕獲抗體可以是識(shí)別Aβ 42和Αβ 40共有的N-末端區(qū)的抗體，而檢測(cè)抗體可以是識(shí)別Aβ 40和Αβ 42 二者的C-末端區(qū)的抗體?；蛘?，可采用至少 兩種抗體的混合物作為捕獲抗體以及識(shí)別Aβ 42和Αβ 40共有的N-末端區(qū)的檢測(cè)抗體來(lái) 同時(shí)檢測(cè)A β 42和A β 40，其中所述混合物包含特異識(shí)別A β 42的C-末端區(qū)而不與A β 40 產(chǎn)生任何交叉反應(yīng)的第一抗體和特異識(shí)別A β 40的C-末端區(qū)而不與A β 42產(chǎn)生任何交叉 反應(yīng)的第二抗體?；蛘?，可以采用識(shí)別Αβ 42和Αβ 40 二者的C-末端區(qū)的抗體作為捕獲 抗體以及識(shí)別A β 42和A β 40 二者的N-末端區(qū)的抗體作為檢測(cè)抗體，來(lái)同時(shí)檢測(cè)A β 42和Αβ40ο在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第一和/或第二抗體或抗體組合被親和純化，其中采 用了包含用于制備它們的多肽的序列的多肽。試劑盒的第三組分對(duì)應(yīng)于對(duì)所述檢測(cè)抗體顯示出親和性并偶聯(lián)至結(jié)合對(duì)的第一 成員的試劑。該抗體結(jié)合試劑可以非共價(jià)地結(jié)合至抗體或抗體片段的特定型、特定類和/ 或特定亞類?；蛘?，該抗體結(jié)合試劑可以非共價(jià)地結(jié)合對(duì)特定抗原特異的抗體。在某些實(shí)施 方案中，抗體結(jié)合試劑非共價(jià)地結(jié)合檢測(cè)抗體的Fc區(qū)或F(ab)區(qū)。優(yōu)選的抗體結(jié)合試劑包 括蛋白A、蛋白G、蛋白V、蛋白L、抗Fc抗體或抗體結(jié)合片段以及Fc受體(FcR)或其抗體結(jié) 合片段?？梢苑枪矁r(jià)地結(jié)合檢測(cè)抗體的抗體的非限定性實(shí)例包括單克隆抗體、多克隆抗體、 多特異性抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單結(jié)構(gòu)域抗體、單鏈Fvs (scFv)單鏈抗體、 Fab片段、F(ab')片段、二硫鍵連接的Fvs (sdFv)、內(nèi)抗體和抗獨(dú)特型(抗-Id)抗體，以及 任何上述抗體的表位結(jié)合片段。Fc受體的非限定性實(shí)例包括Fc y RI.Fc y RIIA、Fc y RIIB、 Fc y RIIC, Fc y RIIIAa ,Fc y RIIIB.Fc e RI a、Fc e RI ξ 禾口 Fc γ RIIIA ξ。本發(fā)明的試劑盒的第四方面對(duì)應(yīng)于結(jié)合對(duì)的第二成員，其被偶聯(lián)至可檢測(cè)標(biāo)簽。 適合的結(jié)合對(duì)包括■半抗原或抗原/抗體，例如地高辛和抗地高辛抗體■生物素或生物素類似物(例如，氨基生物素、亞氨基生物素或脫硫生物素)/抗 生物素蛋白或鏈霉抗生物素■糖/凝集素■酶和輔因子■葉酸/葉酸鹽■選擇性結(jié)合蛋白質(zhì)的雙鏈寡核苷酸/轉(zhuǎn)錄因子?！龊怂峄蚝怂犷愃莆?互補(bǔ)核酸，■受體/配體，例如，留類激素受體/留類激素。應(yīng)理解的是，術(shù)語(yǔ)“結(jié)合對(duì)”的“第一”和“第二”成員是相對(duì)的，上述成員的每一個(gè) 都可看作該結(jié)合對(duì)的第一或第二成員。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合對(duì)的第一成員為生物素 或其功能上的等同變體，結(jié)合對(duì)的第二成員為抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素或其功能上的 等同變體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合對(duì)的第二成員為鏈霉抗生物素。適合的可檢測(cè)標(biāo)簽包括，但不限于，熒光部分(例如，熒光素、若丹明、藻紅蛋白、 香豆素、噁嗪、試鹵靈(resorufin)、菁藍(lán)及其衍生物)，發(fā)光部分(例如，Quantum Dot Corporation, Palo Alto, CA提供的Qdot 納米顆粒)。如果可檢測(cè)標(biāo)簽為酶，則該酶必須 能夠在例如添加激活劑、底物、放大劑(amplifying agent)等時(shí)生成可檢測(cè)的信號(hào)。適合用作本發(fā)明可檢測(cè)標(biāo)簽的酶和對(duì)應(yīng)底物包括 堿性磷酸酶類 〇生色底物基于對(duì)硝基苯磷酸鹽(P-NPP)、5_溴-4-氯_3_吲哚基磷酸鹽/硝基 藍(lán)四氮唑(BCIP/NPT)、固紅/萘酚-AS-TS磷酸鹽的底物〇熒光底物4-甲基傘形酮酰磷酸鹽(4-MUP)、2-(5'-氯_2’ -磷?；趸?基)-6_氯-4-(3H)_喹唑酮(CPPCQ)、3，6-熒光素二磷酸鹽(3，6-FDP)、固藍(lán)BB、固紅TR或 固紅紫色LB重氮鹽類 過(guò)氧化物酶類〇基于2，2-連氮基雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、鄰苯二胺(OPT)、 3,3' ,5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、鄰聯(lián)茴香胺、5-氨基水楊酸、3-二甲基氨基苯甲酸 (DMAB)和3-甲基-2-苯并噻唑啉腙(MBTH)、3_氨基-9-乙基咔唑(AEC)-和3，3 ‘ - 二氨 基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽(DAB)的生色底物。〇熒光底物4_羥基-3-甲氧基苯基乙酸、還原吩噁嗪和還原苯并噻嗪，包括 Amplex Red 試劑、Amplex UltraRed 和還原二氫咕噸。 糖苷酶類〇生色底物鄰硝基苯基-β -D-半乳糖苷(o-NPG)、對(duì)硝基苯基-β -D-半乳糖苷 和4-甲基傘形酮?；?β -D-半乳糖苷(MUG)，用于β -D-半乳糖苷酶。〇熒光底物試鹵靈β -D-吡喃半乳糖苷、熒光素二半乳糖苷(FDG)、熒光素二葡 萄糖苷酸、4-甲基傘形酮?；?-D-批喃半乳糖苷、羧基傘形酮酰基β -D-批喃半乳糖苷和 氟化香豆素β-D-吡喃半乳糖苷類。 氧化還原酶類(熒光素酶)〇發(fā)光底物蟲熒光素。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可檢測(cè)標(biāo)簽為辣根過(guò)氧化物酶，檢測(cè)試劑為ΤΜΒ。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑盒還包括固體支持物。用在本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“支持物” 或“表面”指固體相，其為多孔或無(wú)孔的水不溶性材料，可具有多種形狀中的任一種，例如狹 條、棒、顆粒，包括乳膠顆粒、磁性顆粒、微粒、小珠、膜、微量滴定孔和塑料管。原則上，任何 材料都適合用作固體支持物，只要其能夠結(jié)合足夠量的捕獲抗體。因此，對(duì)固體相材料的選 擇基于所希望的測(cè)定形式工作特性來(lái)確定。適合用于固體支持物的材料包括聚合物材料， 尤其是纖維質(zhì)材料和纖維素衍生材料，例如含纖維的紙，例如濾紙、色譜紙、玻璃纖維紙等； 合成的或經(jīng)改性的天然產(chǎn)生的聚合物，例如硝酸纖維素、醋酸纖維素、聚氯乙烯、聚丙烯酰 胺、交聯(lián)葡聚糖、瓊脂糖、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚苯乙烯、聚甲基 丙烯酸酯、聚對(duì)苯二甲酸乙二酯、尼龍、聚乙烯基丁醛等；它們單獨(dú)使用或者與其它材料聯(lián) 合使用；玻璃，例如可作為生物玻璃獲得的玻璃，陶瓷，金屬，等等。優(yōu)選苯乙烯和羧化苯乙 烯或以其它活性基團(tuán)如氨基、羥基、鹵素等功能化的苯乙烯的未交聯(lián)聚合物。某些情況下， 將使用取代的苯乙烯與二烯如丁二烯的共聚物。固體支持物和捕獲抗體在試劑盒中可以分開提供，或者支持物可以在交貨時(shí)已經(jīng) 被捕獲抗體預(yù)包被。這種情況下，該支持物可能在結(jié)合捕獲抗體后已經(jīng)用封閉溶液處理過(guò)。 如果該支持物是預(yù)包被的，則優(yōu)選該支持物被濃縮的海藻糖溶液處理，并經(jīng)干燥，這種情況 下，干燥的海藻糖在支持物上形成暈圈(halo)。這些含有干燥的海藻糖的支持物極其穩(wěn)定，避光4°C存放時(shí)可保存長(zhǎng)達(dá)2年。試劑盒的其它組分可以包括·從患者獲取待分析樣品的裝置·用于制備靶肽的標(biāo)準(zhǔn)曲線的緩沖劑和溶液·在測(cè)定期間洗滌和封閉固體支持物的緩沖劑和溶液
·用于以包被抗體包被固體支持物的緩沖劑和溶液·用于顯示來(lái)自可檢測(cè)標(biāo)簽的顏色或熒光信號(hào)的試劑·終止來(lái)自可檢測(cè)標(biāo)簽的顏色或熒光產(chǎn)物的形成的試劑(如INH2SO4)·維持肽為未折疊狀態(tài)的試劑(如，濃鹽酸胍) 含有A β 40或A β 42Α肽或其組合的儲(chǔ)備液的樣品在優(yōu)選的實(shí)施方案中，捕獲抗體被固定至固體支持物上。該固定可以在結(jié)合待檢 測(cè)靶多肽之前進(jìn)行，或者在肽/蛋白質(zhì)結(jié)合至捕獲抗體時(shí)進(jìn)行。任一情況下，如果使用固 體支持物，則合適的是在添加含有待測(cè)定靶多肽的樣品之前封閉載體上多余的蛋白結(jié)合位 點(diǎn)。優(yōu)選地，采用補(bǔ)加了大分子化合物(例如，牛血清白蛋白、脫脂奶粉、western封閉試 齊U、酪蛋白、乳清蛋白、卵清蛋白)的與每次結(jié)合反應(yīng)后用于洗滌復(fù)合物相同的緩沖液(例 如，50mM Tris-HCl，pH 8，PBS或TBS，任選地包含Tween 20)進(jìn)行支持物上肽結(jié)合位點(diǎn)的封 閉或淬滅，該大分子化合物在緩沖液中的濃度為約0. 05%至10%，優(yōu)選1至5%，更優(yōu)選約 3%。如果包含固定的捕獲抗體的支持物要保存一定時(shí)間，則優(yōu)選用濃海藻糖溶液處理該支 持物并使其干燥，這種情況下干燥的海藻糖在支持物上形成暈圈(halo)。這些含有干燥的 海藻糖的支持物極其穩(wěn)定，避光4°C存放時(shí)可保存多至2年。本發(fā)明的試劑盒使得能以高靈敏度測(cè)定或確定被試劑盒的第一和第二抗體組分 特異識(shí)別的多肽。因此，在另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的試劑盒用于測(cè)定樣品中蛋白或蛋 白的用途。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該試劑盒被用于測(cè)定樣品中選自Αβ40、Αβ42及其組合 的肽?！皹悠贰痹诒景l(fā)明中理解為包括組織培養(yǎng)物、血漿、血清、唾液、精液、痰、腦脊液 (CSF)、淚液、黏液、汗液、乳汁、腦提取物等中的任一種。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該樣品為血 漿樣品。鑒于本發(fā)明試劑盒提供了對(duì)任何樣品中Αβ 40和Αβ 42濃度的高靈敏度測(cè)定的能 力，其可被用于診斷這兩種肽的任何一種在任一細(xì)胞液或組織中有濃度變化的任何疾病， 尤其是退行性疾病，更具體地，神經(jīng)退行性疾病?；诖嬖诟淖兊腁 β 40和/或A β 42水平 可以診斷的退行性疾病的非限制性實(shí)例包括 骨退行性病癥，例如骨質(zhì)減少、骨軟化、骨質(zhì)疏松、骨髓瘤、骨營(yíng)養(yǎng)不良、佩吉特氏 病、成骨不全、骨硬化、再生障礙性骨病、體液高鈣性骨髓瘤、多發(fā)性骨髓瘤和轉(zhuǎn)移后的骨變 稀。·軟骨退行性病癥，例如Gorham-Stout綜合征；關(guān)節(jié)炎疾?。还顷P(guān)節(jié)炎；類風(fēng)濕性 關(guān)節(jié)炎；銀屑病關(guān)節(jié)炎；類風(fēng)濕??；以及脆骨病?！ぜ∪馔诵行约膊?，例如肌肉萎縮癥、肌肉萎縮、充血阻塞性肺病、肌肉消耗綜合 征、肌肉減少癥、惡病質(zhì)。·心臟退行性疾病，包括缺血導(dǎo)致的心臟細(xì)胞死亡，移植排斥導(dǎo)致的組織和器官死亡，自毒作用導(dǎo)致的聽力損失?！ひ暰W(wǎng)膜退行性疾病，例如視網(wǎng)膜色素變性·神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病，例如亞歷山大病、Alper病、阿爾茨海默病、肌萎縮性側(cè)索硬化、共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥、Batten病、牛海綿狀腦病(BSE)、Canavan病、科凱 恩綜合征(Cockayne syndrome)、皮質(zhì)基底節(jié)變性、Creutzfeldt-Jakob病、亨廷頓病、HIV 相關(guān)癡呆、肯尼迪病、克拉伯病、路易體癡呆、Machado-Jos印h病(脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)3 型)、多發(fā)性硬化、多系統(tǒng)萎縮、神經(jīng)疏螺旋體病、帕金森病、Pe 1 izaeus-Merzbacher病、 皮克氏病、原發(fā)性側(cè)索硬化、朊病毒病、雷夫蘇姆病、桑德霍夫病、希爾德病、精神分裂癥、 Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten病(也稱為Batten病)、脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)、脊髓性肌 萎縮、Steele-Richardson-Olszewski病、脊髓癆。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，采用本發(fā)明的試 劑盒診斷的神經(jīng)退行性疾病為阿爾茨海默病。應(yīng)意識(shí)到，判定一種可能的疾病所需的參數(shù)不僅是絕對(duì)A β 40和A β 42濃度，還有 源于所述值的組合的參數(shù)，例如A β 40/Α β 42或A β 42/Α β 40比，A β 42和A β 40相對(duì)于總 A β肽的百分比或A β 42和A β 40濃度的總和。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，基于在AD患者樣品中出現(xiàn)較低濃度的A β 40和/或Αβ 42 肽(與從健康個(gè)體獲得的相同來(lái)源的生物學(xué)樣品中所述一種或多種肽的量相比)，可被診 斷的疾病為阿爾茨海默病，更尤其是散發(fā)性AD。使用時(shí)，本發(fā)明的試劑盒允許進(jìn)行五步法來(lái)測(cè)定樣品中選自Αβ 42、Αβ 40及其組 合的靶多肽的量。所述方法為本發(fā)明的另一目的，包括以下步驟(i)用特異結(jié)合所述靶多肽的第一抗體或抗體組合捕獲存在于樣品中的靶多肽，(ii)將步驟(a)中形成的免疫復(fù)合物與第二抗體或抗體組合接觸，所述第二抗體 或抗體組合與第一抗體或抗體組合識(shí)別靶多肽的不同區(qū)域，(iii)將步驟(ii)中形成的復(fù)合物與對(duì)第二抗體顯示出親和性并被偶聯(lián)至結(jié)合 對(duì)的第一成員的試劑接觸，(iv)將步驟(iii)中形成的復(fù)合物與偶聯(lián)至可檢測(cè)標(biāo)簽的結(jié)合對(duì)的第二成員接 觸，以及(ν)檢測(cè)連接至結(jié)合對(duì)的第二成員的酶的活性或化合物的熒光發(fā)射。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所檢測(cè)的肽為所述肽的非寡聚體形式，更優(yōu)選地，為Αβ 40 或Αβ 42的單體形式。用在所述方法每一步驟中的試劑已在上文中詳細(xì)說(shuō)明。在本發(fā)明所述方法的第一步驟中，含有Αβ 40和/或Αβ 42肽的樣品與第一抗體 接觸，以便形成第一免疫復(fù)合物。在進(jìn)行了第一結(jié)合步驟后，可以洗滌復(fù)合物以除去原始樣品中存在的未與捕獲抗 體結(jié)合的任何剩余的蛋白質(zhì)/肽。優(yōu)選的可用于本發(fā)明中的洗滌緩沖液包括PH接近生理 值的任何緩沖液(例如50mMTris-HCl)，任選地包含鹽(例如150mM NaCl)并任選地包含低 濃度的去垢劑(例如，0. 05% Tween-20)。在第二步驟中，接著將捕獲抗體和樣品中的一種或多種Αβ肽形成的復(fù)合物與第 二抗體接觸，以便形成“夾心型”免疫復(fù)合物。在進(jìn)行了第二步驟后，可以采用與前文描述基本上相同的緩沖液和操作來(lái)洗滌免疫復(fù)合物，以去除非特異結(jié)合的抗體。在第三步驟中，本發(fā)明的方法包括將捕獲的一種或多種肽與檢測(cè)抗體之間形成的 復(fù)合物與對(duì)檢測(cè)抗體顯示出親和性且偶聯(lián)至結(jié)合對(duì)的第一成員的試劑接觸。 在第四步驟中，本發(fā)明的方法包括將抗體結(jié)合試劑與檢測(cè)抗體之間形成的復(fù)合物 與偶聯(lián)至可檢測(cè)標(biāo)簽的結(jié)合對(duì)的第二成員接觸。在本發(fā)明所述方法的第五步驟中，該方法包括測(cè)定所述可檢測(cè)標(biāo)簽。應(yīng)理解的是， 對(duì)可檢測(cè)標(biāo)簽的檢測(cè)和/或定量取決于標(biāo)簽的性質(zhì)，并且在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的。當(dāng)完整 底物或可檢測(cè)標(biāo)簽含有發(fā)光或染料組分，可以通過(guò)在UV透射儀上目測(cè)或通過(guò)使用基于UV 的電子耦合器件(CCD)相機(jī)檢測(cè)系統(tǒng)、基于激光的凝膠掃描儀、基于氙弧的CCD相機(jī)檢測(cè)系 統(tǒng)、與UV透射儀聯(lián)合的波拉德相機(jī)以及各種用于光檢測(cè)的其它設(shè)備來(lái)檢測(cè)。當(dāng)可檢測(cè)標(biāo)簽 為酶時(shí)，本發(fā)明所述方法的第五步驟包括將標(biāo)簽標(biāo)記的免疫復(fù)合物(例如，捕獲的肽、檢測(cè) 抗體和用可檢測(cè)標(biāo)簽標(biāo)記的試劑)與所述用作可檢測(cè)標(biāo)簽的酶的激活劑、底物或放大劑接 觸。公知的能產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的可檢測(cè)標(biāo)簽包括酶標(biāo)記的抗體。公知的用于該目的的示例 性酶包括辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶和糖苷酶，包括β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶和 β-葡萄糖苷酸酶。例如，特異結(jié)合檢測(cè)抗體的試劑可帶有辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)簽。在形成捕 獲部分_檢測(cè)抗體_試劑復(fù)合物后，接著可利用所述作為可檢測(cè)標(biāo)簽的酶的多種公知底物 的任一種來(lái)進(jìn)行測(cè)定。在另一方面，本發(fā)明涉及診斷神經(jīng)退行性疾病的方法，其包括測(cè)量疑似患有所述 疾病的個(gè)體的樣品中Aβ 40和/或Αβ 42的水平，并參照健康個(gè)體樣品中所述一種或兩種 肽的濃度將所述患者樣品中所述一種和/或兩種肽的濃度與退行性病癥的出現(xiàn)相關(guān)聯(lián)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該神經(jīng)退行性疾病為阿爾茨海默病，其中如果所述樣品中 肽Αβ 40、Αβ 42或其組合的量低于來(lái)自健康個(gè)體的樣品中所述一種或多種肽的量，則表明 所述個(gè)體患有阿爾茨海默病。優(yōu)選地，所述測(cè)定在血漿或血清中進(jìn)行。優(yōu)選平行采用待測(cè)定樣品和具有逐漸增加的已知濃度的待測(cè)定化合物的多個(gè)樣 品進(jìn)行該方法的另外步驟。如果A β 40和/或A β 42為待測(cè)定的，則必須采用逐漸增加的 濃度來(lái)制備每種肽的標(biāo)準(zhǔn)曲線。該標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)現(xiàn)兩個(gè)目的(i)確定信號(hào)隨靶肽的濃度線 性增加的濃度范圍和(ii)通過(guò)在曲線中內(nèi)推用測(cè)試樣品獲得的信號(hào)獲得濃度值，來(lái)確定 肽的濃度。鑒于本發(fā)明所述分析法的高靈敏度，優(yōu)選的測(cè)試樣品濃度為例如3. 125 ；6. 25 ； 12. 5 ；25 ；50 ； 100和200pg/mL。應(yīng)意識(shí)到，用于獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品的濃度將隨每種測(cè)試 底物而變化。但是，技術(shù)人員可通過(guò)常規(guī)手段容易地確定分析的線性范圍。由于與具有散 發(fā)性AD的患者血清相比，A β 42和A β 40肽在CSF樣品中以及在具有家族形式AD的患者 血清樣品中具有較高的量，因此優(yōu)選地，如果本發(fā)明的試劑盒被用于確定CSF或來(lái)自患有 家族性AD的患者血清樣品中的Αβ肽，則這些樣品應(yīng)被稀釋，以便Αβ 40/Αβ 42的最終濃 度范圍落入所述分析的線性邊線(linear side)內(nèi)。以下的實(shí)施例用來(lái)解釋說(shuō)明，而不應(yīng)被認(rèn)為是限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例實(shí)施例1具有生物素-鏈霉抗生物素放大的比色ELISA夾心法為了增加靈敏度，可以采用生物素_鏈霉抗生物素來(lái)放大信號(hào)。采用識(shí)別淀粉樣A β 40和淀粉樣A β 42肽的第1-17位氨基酸的6E10mAb捕獲抗體包被板。在溶于IOOmM pH =9. 6的碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液中的5 μ g/ml濃度下于4°C過(guò)夜進(jìn)行所述包被。然后用 300 μ 1 的封閉液(50mM Tris-HCl，pH 8,0, 2% Tween-20,0, 5%BSA)室溫下?lián)u動(dòng)封閉板3h 或37°C下封閉板2h。需要時(shí)，在封閉后，可用100μ 1含20mg/ml海藻糖的50mM Tris-HCl 溶液(PH 8)處理板。使板蒸發(fā)至海藻糖特征性的白色暈圈出現(xiàn)。這樣處理的板可在4°C下 以鋁箔覆蓋保存，可穩(wěn)定2年。在6E10mAb包被并經(jīng)海藻糖處理的板上從肽A β 40y A β 42的200pg/ml儲(chǔ)備液制備標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。由這些溶液在SDB中進(jìn)行1 2的連續(xù)稀釋，以便產(chǎn)生200、100、50、25、 12. 5,6. 25和3. 125pg/ml的濃度。將100 μ 1的每種稀釋或未稀釋的樣品稀釋或不稀釋地 添加在SDB中(1/1. 000. 000)并在4°C孵育過(guò)夜(或37°C 2h)。將檢測(cè)抗體(針對(duì)對(duì)應(yīng)A β 42肽的C-末端區(qū)的肽制備的多克隆抗體，或針對(duì)對(duì)應(yīng) A β 40肽的C-末端區(qū)的肽制備的多克隆抗體，這取決于檢測(cè)A β 42還是A β 40)在SDB中稀 釋。取100 μ 1添加至各孔中并室溫孵育lh。接著，加入100 μ 1在SDB中以1/5000稀釋的生物素標(biāo)記的抗兔IgG抗體(SIGMA)， 并在室溫下?lián)u動(dòng)孵育lh。然后向每孔中加入100 μ 1在SDB中以1/4000稀釋的HRP偶聯(lián)的 鏈霉抗生物素(來(lái)自SIGMA)，并室溫孵育lh。為了讓板顯色，加入100 μ 1的生色底物TMB (ZEU Inmunotec)并避光孵育 15-30分鐘。向每孔加入作為終止液的50μ 1 IN H2S04。在酶標(biāo)儀Synergy HT(BioTek Instruments)上讀取450nm處的吸光度。各個(gè)步驟之間，采用自動(dòng)洗板儀(Elx50 Bio Tek Instruments)洗滌板，設(shè)定為 每次進(jìn)行5遍清洗。洗滌溶液含有50mM de Tris-HCl pH 8,0, 05% Tween-20和150mM NaCl (使用前過(guò)濾)。實(shí)施例2熒光ELISA夾心測(cè)定法將板用溶于碳酸氫鹽緩沖液中的6E10 (5 μ g/ml)于4°C包被過(guò)夜。然后在室溫下 搖動(dòng)封閉板3h(300y 1/孔)。接著向板添加測(cè)試和標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，并于4°C孵育過(guò)夜。向每 孔加入檢測(cè)抗體(抗Αβ40或抗Αβ42血清)的1/4000稀釋液，并在室溫下?lián)u動(dòng)孵育lh。 添加FITC偶聯(lián)抗抗體(1/1000，1/5000，1/10000稀釋)的連續(xù)稀釋液，室溫下避光孵育lh。 采用485nm的激發(fā)波長(zhǎng)產(chǎn)生熒光，發(fā)射波長(zhǎng)為528?？蛇x擇地，可以采用Quanta-Blu(PIERCE)熒光底物進(jìn)行該測(cè)定，這提高了 ELISA 測(cè)定的靈敏度。最大激發(fā)波長(zhǎng)為325nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為420nm。可在315-340nm激發(fā)范圍 和370-470nm發(fā)射范圍內(nèi)檢測(cè)。通過(guò)將9份QuantaBlu底物溶液與1份QuantaBlu穩(wěn)定過(guò) 氧化物酶溶液混合制備QuantaBlu工作溶液(溶液室溫下穩(wěn)定24小時(shí))?？稍谑覝叵路跤?1. 5分鐘至90分鐘，并且可在終止反應(yīng)或不終止情況下讀數(shù)(產(chǎn)生藍(lán)色)。將板用溶于碳酸氫鹽緩沖液(5 μ g/ml)中的6E10mAb于4°C包被過(guò)夜，然后在室溫 下?lián)u動(dòng)封閉3h (300 μ 1/孔)。用以下濃度的A β 42和A β 40肽制備不同標(biāo)準(zhǔn)曲線· 1000，500，250，125,62. 5,31. 25 和 15. 65pg/mL· 200，100，50，25，12. 5,6. 25 和 3. 125pg/mL· 25，12. 5,6. 25，3. 125，1. 56，0. 78 和 0. 39pg/mL
· 10,5,2. 5，1. 25，0· 625,0. 3125 和 0. 156pg/mL· 5,2. 5，1. 25，0· 625,0. 3125,0. 156 和 0. 078pg/mL· 1,0. 5,0. 25,0. 125,0. 0625,0. 03125 和 0. 0156pg/mL加入(1/4000稀釋的)檢測(cè)抗體(抗Αβ 40或抗Αβ 42血清)于室溫下?lián)u動(dòng)lh。 然后添加HRP偶聯(lián)的抗兔IgG的1/1000稀釋液，在室溫下?lián)u動(dòng)孵育lh。為了使反應(yīng)顯色， 添加100 μ 1的Quanta-Blue工作溶液，接著在室溫下避光孵育30’、60’和90’。然后在不 終止反應(yīng)或以STOP溶液終止反應(yīng)情況下讀取30，、60，和90，時(shí)的熒光(激發(fā)360/40nm ； 發(fā)射460/40nm)。實(shí)施例3制備Αβ40和Αβ42標(biāo)準(zhǔn)曲線 為了制備A β 40標(biāo)準(zhǔn)曲線，將人A β 40的凍干樣品重溶至10 μ g/mL。由該儲(chǔ)備液制 備含有以下濃度(pg/mL)的樣品:25，000pg/ml、2，500pg/ml、25pg/ml、12.5pg/ml、6.25pg/ ml,3. 125pg/ml、l. 56pg/ml、0. 78pg/ml。在ImM蛋白酶抑制劑AEBSF存在下制備樣品。然 后根據(jù)前面的實(shí)施例中定義的方法處理樣品。結(jié)果顯示在圖1中。為了制備A β 42標(biāo)準(zhǔn)曲線，將人A β 42的凍干樣品重溶至10 μ g/mL。由該儲(chǔ)備液制 備含有以下濃度(pg/mL)的樣品:25，000pg/ml、2，500pg/ml、25pg/ml、12.5pg/ml、6.25pg/ ml,3. 125pg/ml、l. 56pg/ml、0. 78pg/ml。在ImM蛋白酶抑制劑AEBSF存在下制備樣品。然 后根據(jù)前面的實(shí)施例中定義的方法處理樣品。結(jié)果顯示在圖2中。實(shí)施例4AD診斷與A β 40/Α β 42水平的關(guān)聯(lián)性采用前文實(shí)施例中描述的ELISA夾心測(cè)定法，確定來(lái)自對(duì)照個(gè)體隊(duì)列和來(lái)自采用 簡(jiǎn)易精神狀態(tài)檢查(MMSE)評(píng)分(分界值為24)診斷為患有AD的患者隊(duì)列的血漿樣品中 A β 40和A β 42水平。以pg/mL表示的A β 40和A β 42濃度顯示在表1中。表 1 計(jì)算了平均值，結(jié)果顯示在表2中。表權(quán)利要求
測(cè)定選自Aβ42、Aβ40及其混合物的靶多肽的試劑盒，其包含(i)第一抗體或抗體組合，其識(shí)別所述靶多肽，(ii)第二抗體或抗體組合，其識(shí)別與所述第一抗體或抗體組合識(shí)別區(qū)域不同的所述靶多肽的區(qū)域，(iii)對(duì)所述第二抗體顯示出親和性的試劑，其被偶聯(lián)至結(jié)合對(duì)的第一成員，以及(iv)結(jié)合對(duì)的第二成員，其被偶聯(lián)至可檢測(cè)標(biāo)簽。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述第一抗體或抗體組合識(shí)別A0 40和/或A 3 42 中不同于C-末端區(qū)的區(qū)域。
3.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述第一抗體識(shí)別所述A0 42和A 0 40肽的N-末端區(qū)。
4.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其中所述第一抗體針對(duì)位于A0 40和A 0 42的第1至 16位氨基酸內(nèi)的表位。
5.如權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述第一抗體為單克隆抗體。
6.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其中所述單克隆抗體為6E10mAb。
7.如權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述第二抗體選自(i).針對(duì)對(duì)應(yīng)所述A042肽的C-末端區(qū)的肽制備的多克隆抗體，其特異結(jié)合A0 42而 不與A 0 40產(chǎn)生任何明顯的交叉反應(yīng)，(ii) 針對(duì)對(duì)應(yīng)所述A 0 40肽的C-末端區(qū)的肽制備的多克隆抗體，其特異結(jié)合A 3 40 而不與A 0 42產(chǎn)生任何明顯的交叉反應(yīng)，(iii).同時(shí)識(shí)別A340和A3 42的C末端區(qū)的抗體，以及(iv).(i)和(ii)中所述抗體的組合。
8.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其中用于制備所述第二抗體的所述A0 42肽的C-末端 區(qū)為 SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO 2 的肽。
9.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其中用于制備所述第二抗體的所述A0 40肽的C-末端 區(qū)為SEQ ID NO 3的肽。
10.如權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述第一和/或第二抗體或抗體組 合已采用包含用于制備它們的所述多肽的序列的多肽親和純化。
11.如權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中對(duì)所述第二抗體顯示出親和性的 所述試劑選自抗IgG抗體、蛋白A或蛋白G或其功能上的等同變體。
12.如權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述結(jié)合對(duì)的第一成員為生物素。
13.如權(quán)利要求12所述的試劑盒，其中所述結(jié)合對(duì)的第二成員為抗生物素蛋白、鏈霉 抗生物素或其功能上的等同變體。
14.如權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述可檢測(cè)標(biāo)簽選自 ⑴酶，(ii)熒光分子。
15.如權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的試劑盒，還包含固體支持物。
16.如權(quán)利要求15所述的試劑盒，其中所述抗體或抗體組合之一被預(yù)先結(jié)合至所述固 體支持物。
17.如權(quán)利要求16所述的試劑盒，其中所述第一抗體被預(yù)先結(jié)合至所述固體支持物。
18.如權(quán)利要求17所述的試劑盒，其被濃縮的海藻糖溶液處理過(guò)并經(jīng)過(guò)干燥。
19.如權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)所述的試劑盒，還包括含有A0 40和/或A 0 42肽的樣品。
20.如權(quán)利要求14所述的試劑盒，其中，如果所述可檢測(cè)標(biāo)簽為酶，則所述試劑盒還包 含能被所述酶轉(zhuǎn)化為可檢測(cè)產(chǎn)物的底物。
21.權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)所述的試劑盒確定或測(cè)定樣品中多肽的用途，其中所述 待確定或測(cè)定的靶多肽選自A 0 40、A 0 42或其混合物。
22.如權(quán)利要求21所述的用途，其中所述樣品選自血液、血漿、血清或CSF。
23.權(quán)利要求1至20所述的試劑盒用于診斷個(gè)體中退行性病癥的用途。
24.如權(quán)利要求23所述的用途，其中所述退行性病癥為神經(jīng)退行性病癥。
25.如權(quán)利要求24所述的用途，其中所述神經(jīng)退行性病癥為阿爾茨海默病。
26.用于確定或測(cè)定樣品中選自A042、A0 40及其混合物的靶多肽的量的方法，包括 以下步驟(i)用特異結(jié)合所述靶多肽的第一抗體或抗體組合捕獲存在于所述樣品中的所述靶多肽，(ii)將步驟(a)中形成的免疫復(fù)合物與第二抗體或抗體組合接觸，所述第二抗體或抗 體組合識(shí)別與所述第一抗體或抗體組合識(shí)別的區(qū)域不同的所述靶多肽的區(qū)域，(iii)將步驟(ii)中形成的復(fù)合物與對(duì)所述第二抗體顯示出親和性并被偶聯(lián)至結(jié)合 對(duì)的第一成員的試劑接觸，(iv)將步驟(iii)中形成的復(fù)合物與偶聯(lián)至可檢測(cè)標(biāo)簽的結(jié)合對(duì)的第二成員接觸，以及(v)測(cè)定或確定連接至所述結(jié)合對(duì)的第二成員的可檢測(cè)標(biāo)簽的活性或量。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述第一抗體識(shí)別A0 40和A 0 42共有的區(qū)域，其 不同于C-末端區(qū)。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述第一抗體識(shí)別所述A0 42和A 0 40肽的N-末端區(qū)。
29.如權(quán)利要求26至28中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一抗體針對(duì)位于A0 40和 A3 40的第1至16位氨基酸內(nèi)的表位。
30.如權(quán)利要求26至29中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一抗體為單克隆抗體。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述單克隆捕獲抗體為6E10mAb。
32.如權(quán)利要求26至31中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第二抗體選自(i).針對(duì)對(duì)應(yīng)所述A042肽的C-末端區(qū)的肽制備的多克隆抗體，其特異結(jié)合A0 42而 不與A 0 40產(chǎn)生任何明顯的交叉反應(yīng)，(ii) 針對(duì)對(duì)應(yīng)所述A 0 40肽的C-末端區(qū)的肽制備的多克隆抗體，其特異結(jié)合A 3 40 而不與A 0 42產(chǎn)生任何明顯的交叉反應(yīng)，(iii).同時(shí)識(shí)別A340和A3 42的C末端區(qū)的抗體，以及(iv).(i)和(ii)中所述抗體的組合。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中用于制備所述第二抗體的所述A0 42肽的C-末端 區(qū)為選自 SEQ ID N0:1、SEQ ID NO :2 的肽。
34.如權(quán)利要求32所述的方法，其中用于制備所述第二抗體的所述A0 40肽的C-末端 區(qū)為選自SEQ ID NO 3的肽。
35.如權(quán)利要求26至34中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一和/或第二抗體已采用包 含用于制備它們的所述多肽的序列的多肽親和純化。
36.如權(quán)利要求26至35中任一項(xiàng)所述的方法，其中對(duì)所述第二抗體顯示出親和性的所 述試劑選自抗IgG抗體、蛋白A或蛋白G或其功能上的等同變體。
37.如權(quán)利要求26至36中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述結(jié)合對(duì)的第一成員為生物素。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述結(jié)合對(duì)的第二成員為抗生物素蛋白、鏈霉抗 生物素或其功能上的等同變體。
39.如權(quán)利要求26至38中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述可檢測(cè)標(biāo)簽選自⑴酶，(ii)熒光分子。
40.如權(quán)利要求26至39中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述生物樣品選自血液、血清、血漿 和 CSF。
41.如權(quán)利要求26至40中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一抗體已被預(yù)先固定在固體 支持物中。
42.診斷個(gè)體中退行性病癥的方法，包括采用權(quán)利要求26至40中任一項(xiàng)所述的方法確 定患者樣品中A0 40或A0 42的量，并參照健康個(gè)體樣品中一種或兩種肽的濃度將所述患 者樣品中所述一種或兩種肽的濃度與所述退行性病癥的出現(xiàn)相關(guān)聯(lián)。
43.如權(quán)利要求42所述的方法，其中所述退行性病癥為神經(jīng)退行性病癥。
44.如權(quán)利要求43所述的方法，其中所述神經(jīng)退行性病癥為阿爾茨海默病，并且其中 如果所述樣品中A0 40和/或A0 42的量低于從健康個(gè)體獲得的相同來(lái)源的生物學(xué)樣品中 所述一種或兩種肽的量，則表明所述個(gè)體患有阿爾茨海默病。
45.如權(quán)利要求42至44中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述樣品為血漿或血清樣品，在所 述樣品中，所述A 0 40和/或A 0 42待檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明涉及免疫分析法，其使得能以比現(xiàn)有技術(shù)中分析法更高的靈敏度檢測(cè)樣品中的多肽。本發(fā)明還涉及試劑盒，其提供了進(jìn)行所述免疫分析法所需的組分。
文檔編號(hào)C07K16/18GK101861521SQ200780053472
公開日2010年10月13日 申請(qǐng)日期2007年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月2日
發(fā)明者J·曼紐爾·薩拉薩巴里歐 申請(qǐng)人:艾拉科隆生物技術(shù)公司