專利名稱：化學(xué)修飾的多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種化學(xué)修飾的多肽，其中該多肽分子中的至少一個羥基被用聚亞烷基二醇衍生物修飾；一種制備該修飾多肽的方法；一種使用該修飾多肽治療粒細(xì)胞或血小板減小病人的方法；一種包含該修飾多肽的用于治療的組合物；以及該修飾多肽的用途。
背景技術(shù)：
業(yè)已知其中多肽分子中的至少一個氨基、羧基、巰基或胍基被用聚亞烷基二醇衍生物修飾(WO95/023165)以及多肽分子中的半胱氨酸殘基的游離巰基被修飾(EP0668353)的化學(xué)修飾的多肽。然而，當(dāng)多肽分子中的至少一個氨基、羧基、巰基、胍基或半胱氨酸殘基的游離巰基被用聚亞烷基二醇衍生物修飾時，多肽的活性可能顯著增加或完全喪失。
例如，當(dāng)其氨基被用聚乙二醇修飾時，白介素-15的活性完全消失[生物化學(xué)雜志，272:2312(1997)]。
對其中多肽分子中的至少一個羥基被用聚亞烷基二醇衍生物修飾的化學(xué)修飾的多肽了解甚微。
主要注意力針對開發(fā)(1)一種用于分析羥基對多肽活性的影響的方法，其中相關(guān)的羥基位于多肽的活性位點，(2)一種新的化學(xué)修飾方法，其中其可避免當(dāng)多肽被用常規(guī)化學(xué)修飾方法處理時，多肽的生物活性被極大地破壞的可能的情況，以及通過該方法獲得的化學(xué)修飾的多肽，和(3)一種新的可提高多肽對蛋白酶、凍融和變性劑的抗性的方法。
發(fā)明公開本發(fā)明涉及一種化學(xué)修飾的多肽，其中該多肽分子中的至少一個羥基被用聚亞烷基二醇衍生物修飾；一種制備該修飾多肽的方法；一種使用該修飾多肽治療粒細(xì)胞或血小板減小病人的方法；修飾多肽的用途；包含該修飾多肽的藥物組合物；以及包含該修飾多肽的用于治療的組合物。
對于可用于本發(fā)明的多肽，可使用任何多肽，只要它含有一個羥基并具有生理活性或藥物活性。實例包括具有如天冬酰胺酶、谷氨酰胺酶、尿酸酶、超氧化物歧化酶、乳鐵結(jié)合蛋白、鏈激酶、纖溶酶、腺苷脫氨酶、白介素-1至13、白介素-15、干擾素-α、干擾素-β、干擾素-γ、人粒細(xì)胞集落刺激因子(下文稱為“hG-CSF”)等活性的那些。
具有hG-CSF活性的多肽的實例包括包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的多肽、包含該序列部分氨基酸序列的多肽、包含其中序列的某些部分的氨基酸被不同的氨基酸置換的氨基酸序列的多肽[自然，319:415(1986)，日本公開未審專利申請?zhí)?67292/88、日本公開未審專利申請?zhí)?99/88、WO87/01132]等。包含其中SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的某些部分的氨基酸被不同的氨基酸置換的氨基酸序列的多肽的具體實例(hG-CSF衍生物)示于表1中。表1
*未被置換的氨基酸聚亞烷基二醇衍生物的實例包括聚乙二醇衍生物、聚丙二醇衍生物、聚乙二醇-聚丙二醇共聚物衍生物等。
可使用包括上面的聚亞烷基二醇衍生物的化學(xué)修飾劑制備本發(fā)明的被化學(xué)修飾的多肽，由下式(Ⅰ)所示的化合物可例舉為優(yōu)選的化學(xué)修飾劑。
化合物包括由下式代表的聚亞烷基二醇衍生物R1-(M)n-X-R2(Ⅰ)(其中R1代表烷基或烷酰基；M代表
-OCH2CH2-,-OCH2CH2CH2-或(OCH2CH2)r-(OCH2CH2CH2)s(其中r和s相同或不相同，各自代表任意可變的正整數(shù))；n為任意可變的正整數(shù)；X代表一個鍵、O、NH或S；以及R2代表
<其中R3代表OH、鹵素或-Xa-(Ma)na-R1a)(其中Xa、Ma、R1a和na均分別具有與上面X、M、R1和n相同的含義)；和Y代表鹵素或-Z-(CH2)p-(O)m-W[其中Z代表O、S或NH；和W代表羧基或其活性衍生物或
(其中R4代表烷基，以及Hal代表鹵素)；p為0-6的整數(shù)；和m為0或1]>，-(CO)m-(CH2)t-W(其中t為0-6的整數(shù)；和m和w具有如上定義的相同的含義)，
(其中Hala、pa和R4a各自分別具有與上面Hal、p和R4相同的含義)，
(其中R3和W具有如上定義的相同含義)，
(其中R3、t和W具有如上定義的相同含義)，
(其中W具有如上定義的相同含義)，
或
(其中R5代表其中一個氨基和一個羧基被從氨基酸中除去的殘基；以及W具有如上定義的相同含義)｝。
對于由式(Ⅰ)代表的上述化合物，由R1、R4等代表的烷基的實例包括具有1-18個碳原子的直鏈或支鏈烷基，如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基、己基、異己基、庚基、辛基、異辛基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、十八烷基等；由R1代表的烷?；ň哂?-18個碳原子的直鏈或支鏈烷?；?，如甲酰基、乙?；?、丙酰基、丁酰基、戊?；?、新?；?、戊?；?、月桂酰基、肉豆蔻?；?、棕櫚酰基、硬脂酰基等。由R3、Y、Hal等代表的鹵素的實例包括氯、溴和碘原子；由W等代表的羧基的活性衍生物的實例包括?；u、如?；?、?；宓?。活性酯，為如對硝基苯基酯、N-羥基琥珀酰亞胺酯等，以及含有碳酸單乙酯的混合酸酐、碳酸單異丁酯等；由R5代表的氨基酸的實例包括谷氨酸、L-丙氨酸、L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-絲氨酸、D-丙氨酸、D-纈氨酸、D-亮氨酸、D-絲氨酸、β-丙氨酸等。由n、r或s代表的正整數(shù)為1-20,000，對于n優(yōu)選為50-5,000，對于r和s優(yōu)選為1-5,000。
聚亞烷基二醇衍生物具有500-1,000,000的分子量，優(yōu)選3,000-1,000,000。
在多肽分子中可存在多個羥基，當(dāng)多肽被化學(xué)修飾時，化學(xué)修飾這些基團(tuán)中的至少一個可能是足夠的。
多肽分子中的羥基的實例包括絲氨酸或蘇氨酸殘基的羥基，優(yōu)選絲氨酸殘基的羥基。
可通過將化學(xué)修飾劑與具有羥基的多肽反應(yīng)來對多肽進(jìn)行化學(xué)修飾，其中化學(xué)修飾劑為如選自聚乙二醇衍生物、聚丙二醇衍生物、聚乙二醇-聚丙二醇共聚物衍生物等的聚亞烷基二醇衍生物。
將多肽分子中的羥基與化學(xué)修飾劑如聚乙二醇衍生物或聚丙二醇衍生物反應(yīng)的方法的實例包括描述在日本公開未審專利申請?zhí)?16400/89，生物技術(shù)通訊，14:559-564(1992)，生物/技術(shù)，8:343-346(1990)等中的方法以及其改進(jìn)方法。即，可使用的方法的具體實例包括將聚乙二醇衍生物或聚丙二醇衍生物加入到被調(diào)至pH6-10的為1-200摩爾蛋白量的蛋白水溶液中并在0-37℃的溫度下讓其反應(yīng)1小時-3天的方法。
將多肽分子中的羥基與聚乙二醇衍生物-聚丙二醇共聚物的衍生物反應(yīng)的方法的實例包括描述在日本公開未審專利申請?zhí)?9629/84、日本公開未審專利申請?zhí)?76586/85、WO89/06546、EP0539167A2等中的方法以及其改進(jìn)方法。即，可使用的的方法的具體實例包括將選自聚乙二醇-聚丙二醇共聚物衍生物的化學(xué)修飾劑加入到被調(diào)至pH6-10的為1-200摩爾蛋白量的蛋白水溶液中并在0-37℃的溫度下讓其反應(yīng)1小時-3天的方法。
通過上面方法用聚亞烷基二醇衍生物修飾多肽分子中的至少一個羥基可提供(1)在相關(guān)的羥基位于多肽的活性位點的情況下，一種用于分析羥基對多肽活性的影響的方法，(2)當(dāng)多肽被用常規(guī)化學(xué)修飾法處理時，一種可避免多肽生物活性減弱的新的化學(xué)修飾法，以及由該方法獲得的化學(xué)修飾的多肽，和(3)一種新的可提高多肽對蛋白酶、凍融或變性劑抗性的方法，以及具有增加的抗蛋白酶、凍融或變性劑抗性的化學(xué)修飾的多肽。
被作為本發(fā)明具體描述的化學(xué)修飾的多肽的一個實例為具有hG-CSF活性的多肽。
其中hG-CSF或hG-CSF衍生物中的至少一個羥基被用由下式(Ia)或(Ib)代表的化學(xué)修飾劑進(jìn)行化學(xué)修飾的化學(xué)修飾的多肽可例舉為本發(fā)明的化學(xué)修飾的多肽。
化學(xué)修飾劑(Ia)R1-(OCH2CH2)n-X-R2a(Ia){其中R1、n和X具有如上定義的相同含義；以及R2a代表
}。
化學(xué)修飾劑(Ib)
(其中R1、M、R3、Z、n和p具有如上定義的相同含義；以及Wa代表羧基或其活性衍生物)。
至少一個聚乙二醇衍生物、聚丙二醇衍生物或聚乙二醇-聚丙二醇共聚物衍生物與化學(xué)修飾的hG-CSF或化學(xué)修飾的hG-CSF衍生物結(jié)合。因此，化學(xué)修飾的hG-CSF或化學(xué)修飾的hG-CSF衍生物可以混合物形式或通過分離一個或多個分子與其相連的化合物來使用。
可使用各種類型的層析法來進(jìn)行化學(xué)修飾的hG-CSF或化學(xué)修飾的hG-CSF衍生物的分離，如離子交換層析、凝膠過濾層析、反向?qū)游?、疏水層析等，以及通常用于長鏈多肽等的分離的硫酸銨分級分離等方法。
通過使用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)方法監(jiān)測化學(xué)修飾的hG-CSF的遷移率的變化可確定化學(xué)修飾的程度。
根據(jù)本發(fā)明的多肽的含量可通過下面分析方法來測定。分析方法1通過Lowry的方法[Lowry O.H.等生物化學(xué)雜志，193:265(1951)]測定多肽的含量。分析方法2根據(jù)Laemmli的方法[U.K.Laemmli，自然，227:680(1970)]，通過進(jìn)行SDS-PAGE，用考馬斯亮蘭染色在凝膠上被分離的多肽以及接著用層析掃描儀(CS-930,Shimadzu公司)測定來計算多肽含量。
本發(fā)明的化學(xué)修飾的多肽可以其本身或以各種劑量的制劑形式使用。
本發(fā)明的藥物制劑可通過將有效量的作為活性成分的化學(xué)修飾的多肽均勻地與藥學(xué)上可接受的載體混合來制備。這些藥物制劑優(yōu)選為適宜于注射給藥的單劑形式。
可使用化學(xué)活性多肽和包括蒸餾水、鹽溶液、葡萄糖或鹽溶液與葡萄糖的混合物的載體來制備溶液形式的注射劑。還以常規(guī)方式使用適宜助劑將它們制成溶液劑、懸浮劑或分散劑。也可通過冷凍干燥溶液而將它們制成冷凍干燥制劑。雖然冷凍干燥條件沒有特別限制，但通常通過在-50℃或更低時冷凍1-5小時，在50-150毫乇的真空度下，在-20℃-0℃的貯存溫度下干燥24-48小時并接著在50-100毫乇的真空度下，在10℃-30℃的貯存溫度下干燥16-24小時來獲得冷凍干燥產(chǎn)物。
而且，化學(xué)小時多肽制劑可含有各種常用的藥物載體、填料、稀釋劑、穩(wěn)定劑、防吸附劑等。
在為本發(fā)明的化學(xué)修飾的多肽，例如含有化學(xué)修飾的hG-CSF或化學(xué)修飾的hG-CSF衍生物的嗜中性粒細(xì)胞和凝血細(xì)胞生長增強(qiáng)性制劑的情況下，根據(jù)給藥方式、各病人的年齡和體重、治療的疾病以及各病人的疾病情況來決定其劑量和給藥方式；然而，每個成人通常每周以15μg-1.5mg，優(yōu)選25-500μg的量給藥1-7次含有化學(xué)修飾的hG-CSF或化學(xué)修飾的hG-CSF衍生物的藥物制劑。
本發(fā)明的化學(xué)修飾的多肽制劑的給藥方法的實例包括靜脈注射、皮下注射等以及以栓劑或鼻滴劑形式的給藥。
下面，通過試驗實施例描述本發(fā)明的化學(xué)修飾的多肽的藥物活性。試測試?yán)瘜W(xué)修飾的hG-CSF或化學(xué)修飾的hG-CSF衍生物對小鼠白血病細(xì)胞NFS60的生長促進(jìn)活性根據(jù)Asano等的方法[Yakuri to Chiryo,19:2767(1991)]測定在后面將描述的參考實施例和實施例5,14,17和20中獲得的G-CSF衍生物、化學(xué)修飾的hG-CSF和化學(xué)修飾的hG-CSF衍生物的增強(qiáng)小鼠白血病細(xì)胞NFS60生長的活性[K.Holmes等Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:6687(1985)]。讓表2-1和2-2所示的各種濃度的每一種化合物作用于細(xì)胞，結(jié)果也示于表2-1和2-2中。表2-1<
>*1通過根據(jù)參考實施例1中獲得的hG-CSF衍生物(12.5ng/ml)的活性(=100)或hG-CSF(5ng/ml)的活性的相對值(％)表示。
表2-2
*1通過根據(jù)參考實施例1中獲得的hG-CSF衍生物(25ng/ml)的活性(=100)的相對值(％)表示測試?yán)?在全身輻射小鼠中的促進(jìn)血小板減少癥恢復(fù)的作用通過137Cs輻射源(RI-433,Toshiba制造)，使用3Gy/小鼠對每組4只雄性BALB/c小鼠(6周齡)進(jìn)行全身輻射(下文稱為“全身輻射”)，并接著飼養(yǎng)在為特定的無病原體(SPF)的飼養(yǎng)環(huán)境的裝置的干凈支架上。對它們隨意提供飲用水和飼料。作為未處理的對照組，將未輻射的小鼠以與其類似的方式飼養(yǎng)。
將在后面將描述的實施例4中獲得的各種化學(xué)修飾的hG-CSF衍生物溶解在生理鹽水中，在全身輻射的第二天以5μg/0.2ml/動物的劑量經(jīng)皮下對小鼠給藥一次化學(xué)修飾的hG-CSF衍生物溶液。
從小鼠眼底靜脈定期收集血樣以通過自動血細(xì)胞計數(shù)器(CC-180A,Toa Iyo Denshi制造)測定血小板的數(shù)目。結(jié)果示于表3。
在用3Gy的全身輻射處理的小鼠中，觀察到血小板數(shù)目的顯著減少，并且在全身輻射后8-9天時血小板的數(shù)目變得最低，接著逐漸增加，但未恢復(fù)到輻射處理前的水平。另一方面，在給藥了化學(xué)修飾的hG-CSF衍生物的小鼠中，血小板數(shù)目的減少被抑制，且在第8或9天時或之后，血小板的數(shù)目顯著增加，在第11或12天時完全恢復(fù)到輻射處理前的同等水平。在全身輻射的第二天或第5天進(jìn)行給藥的組中觀察到類似作用。
表3
1通過根據(jù)全身輻射來處理對照組中的血小板的平均數(shù)(=100)的相對值(％)表示測試?yán)?小鼠中的白細(xì)胞增加作用使用在從日本Charles River購得后被初步飼養(yǎng)的SPF/VAF小鼠(BALB/cAnNCri系，雄性，8周齡，4只動物/組)，證實了正常小鼠中的白細(xì)胞增加活性。
用生理鹽水將實施例5獲得的二取代物(0.34mg/ml)稀釋至100或10μg/ml，以10μl/g(小鼠體重)的比例經(jīng)皮下給藥一次。因此，劑量為1或0.1mg/kg。作為對照組，經(jīng)皮下給藥一次生理鹽水。給藥前以及從給藥后的第二天定期收集血樣，使用自動血細(xì)胞計數(shù)器(Sysmex F800)測定外周血細(xì)胞數(shù)目。
結(jié)果，在給藥后2天時，兩組給藥組中白細(xì)胞的數(shù)目增加至比對照組高2.4-2.6倍的水平。此后，在0.1mg/kg的給藥組中，這種藥效減弱并在給藥后4天時回到對照組的類似水平，但是，甚至在給藥后2天時，1mg/kg給藥組中的白細(xì)胞數(shù)目繼續(xù)增加，在給藥后4天時達(dá)到比對照組高3.5倍的水平。此后，在給藥后7天時數(shù)目恢復(fù)到與對照組類似的水平。
實施例和參考例示于下文中。實施發(fā)明的最好方式實施例1聚乙二醇修飾的hG-CSF衍生物反應(yīng)溶液的制備用磷酸鹽緩沖液(pH7.5)將參考例1中制備的hG-CSF衍生物調(diào)至4.6mg/ml，并將12ml被如此調(diào)節(jié)的溶液與205.5mg一甲氧基聚乙二醇丙酸的N羥基琥珀酰亞胺酯(M-SPA-20,000,ShearwaterPolymer制造)混合，4℃下將混合物攪拌一整晝夜以制備聚乙二醇修飾的hG-CSF衍生物反應(yīng)溶液(1)。實施例2聚乙二醇修飾的hG-CSF衍生物反應(yīng)溶液的制備用磷酸緩沖液(pH7.5)將參考實施例1中制備的hG-CSF衍生物調(diào)至4.6mg/ml，并將12ml如此調(diào)節(jié)的溶液與469.8mg羧甲基一甲氧基聚乙二醇的N-羥基琥珀酰亞胺酯(M-SCM-20,000,ShearwaterPolymer制造)混合，4℃下將混合物攪拌一整晝夜以制備聚乙二醇修飾的hG-CSF衍生物反應(yīng)溶液(2)。實施例3聚乙二醇修飾的hG-CSF衍生物反應(yīng)溶液的制備用磷酸緩沖液(pH7.5)將參考例1中制備的hG-CSF衍生物調(diào)至4.6mg/ml，并將6.6ml如此調(diào)節(jié)的溶液與96.9mg一甲氧基聚乙二醇丙酸的N-羥基琥珀酰亞胺酯(M-SSPA-20,000,ShearwaterPolymer制造)混合，4℃下將混合物攪拌一整晝夜以制備聚乙二醇修飾的hG-CSF衍生物反應(yīng)溶液(3)。實施例4聚乙二醇修飾的成分的分離將實施例2中制備的聚乙二醇修飾的hG-CSF衍生物反應(yīng)溶液(2)(蛋白含量為55mg)用20mM含有150mM氯化鈉的乙酸鹽緩沖液(pH4.5)稀釋5倍，將其通過用已事先用相同緩沖液平衡的填充有Sephacryl S-400(Pharmacia制造)的柱，并將洗脫液分級分離。通過此操作，獲得主要含有被兩分子聚乙二醇修飾的成分(二取代物)的級分以及主要含有被一分子聚乙二醇修飾的成分(一取代物)的粗級分。
將各種級分通過用TSK凝膠G4000SWXL(7.8mm I.D.×300mm,Tosoh公司制造)填充的柱以獲得含有二取代物或一取代物的級分。此后，在下面條件下，用SP-5PW(21.5mmI.D.×150mm,Tosoh公司制造)純化各種級分以獲得一種二取代物為主成分的級分(0.39mg/ml×3.0ml)和一種一取代物為主成分的級分(0.55mg/ml×3.0ml)。SP-5PW純化條件柱SP-5PW(21.5mm I.D.×150mm)(Tisoh公司制造)檢測280nm溶液A:20mM乙酸鹽緩沖液(pH4.5)溶液B含有0.5M氯化鈉的20mM乙酸鹽緩沖液(pH4.5)洗脫用溶液A至溶液B的線性密度梯度洗脫實施例5聚乙二醇修飾的成分的分離將實施例1中制備的聚乙二醇修飾的hG-CSF衍生物反應(yīng)溶液(1)(蛋白含量為55mg)用20mM含有150mM氯化鈉的乙酸鹽緩沖液(pH4.5)稀釋5倍，將其通過用已事先用相同緩沖液平衡的填充有Sephacryl S-400(Pharmacia制造)的柱，并將洗脫液分級分離。通過此操作，獲得含有被三分子聚乙二醇修飾的成分(三取代物)的級分以及含有被二分子聚乙二醇修飾的成分(二取代物)的粗級分和含有被一分子聚乙二醇修飾的成分(一取代物)的粗級分。
將各種級分通過用TSK凝膠G4000SWXL(7.8mm I.D.×300mm,Tosoh公司制造)填充的柱以獲得含有三取代物、二取代物或一取代物的級分。此后，在如實施例4描述的相同條件下，使用陽離子交換柱SP-5PW(Tosoh公司制造)純化各種級分以獲得兩種三取代物為主成分的級分(三取代物1:1.4mg/ml×0.5ml，三取代物2:1.0mg/ml×0.8ml)，一種二取代物為主成分的級分(0.34mg/ml×3.0ml)和兩種一取代物為主成分的級分(一取代物1:0.48mg/ml×0.4ml，一取代物2:1.58mg/ml×0.5ml)。
如在后面實施例中將描述的，從一取代物1N末端算起的66位Ser的羥基和一取代物2的N末端Met被一分子聚乙二醇修飾。實施例6聚乙二醇修飾的成分的分離將實施例3中制備的聚乙二醇修飾的hG-CSF衍生物反應(yīng)溶液(3)(蛋白含量為30mg)用20mM含有150mM氯化鈉的乙酸鹽緩沖液(pH4.5)稀釋5倍，將其通過用已事先用相同緩沖液平衡的填充有Sephacryl S-400(Pharmacia制造)的柱，并將洗脫液分級分離。通過此操作，獲得含有被二分子聚乙二醇修飾的成分(二取代物)的粗級分。
將該級分通過用TSK凝膠G4000SWXL(7.8mm I.D.×300mm,Tosoh公司制造)填充的柱以獲得含有二取代物的級分。
在如實施例4描述的相同條件下，使用陽離子交換柱SP-5PW(Tosoh公司制造)純化由此獲得的級分以獲得一種三取代物為主成分的級分(0.43mg/ml×3.0ml)。實施例7hG-CSF衍生物的肽作圖用磷酸緩沖液(pH7.5)將參考實施例1中制備的hG-CSF衍生物調(diào)至2mg/ml，在“蛋白質(zhì)和多肽的高效液相色譜(Ⅱ),Kagaku Zokan117(153-160(1990)；由Kagaku Zokan公開)”中描述的條件下，用V8蛋白酶(Seikagaku Kogyo制造)處理1.0ml一份的如此調(diào)節(jié)的溶液，接著將50μl如此處理的溶液注射到HPLC中以在下面條件下進(jìn)行HPLC分析。HPLC分析的條件柱PROTEIN & PEPTIDE C18(4.6mm I.D.×250mm)(VYDAC)溶液A:0.1％三氟乙酸溶液B:90％的含有0.1％三氟乙酸的乙晴洗脫從溶液A至溶液B的線性密度梯度洗脫檢測215nm流速0.5ml/分鐘在用V8蛋白酶消化的hG-CSF衍生物的分析圖譜中發(fā)現(xiàn)9個峰。當(dāng)分離各個峰并對其分子量進(jìn)行分析時，這些峰被確定為如表4所示。
表4通過V8蛋白酶的對hG-CSF衍生物的肽作圖
實施例8通過肽作圖對聚乙二醇結(jié)合位點的推斷通過與實施例7中描述的hG-CSF衍生物肽作圖的類似方法，將實施例5中獲得的各種一取代物1、一取代物2、二取代物、三取代物1和三取代物2用蛋白酶消化。
結(jié)果，在實施例5中獲得的各種一取代物1、一取代物2、二取代物、三取代物1和三取代物2中發(fā)現(xiàn)特定峰消失或顯著降低(表5)。
表5純化的聚乙二醇修飾的hG-CSF衍生物成分的肽作圖(與未修飾的hG-CSF衍生物比較)
現(xiàn)認(rèn)為當(dāng)與實施例7的hG-CSF衍生物的分析圖譜比較時，與聚乙二醇連接的肽片斷的HPLC峰將發(fā)生變化。根據(jù)表4的結(jié)果，在為如實施例5所示的一取代物1、二取代物、三取代物1和三取代物2情況下，推測聚乙二醇的結(jié)合部位為至少一個對應(yīng)于hG-CSF衍生物的-1-19個氨基酸殘基片段(峰5)的肽殘基(包括N末端氨基基團(tuán))。
對于一取代物2，發(fā)現(xiàn)一取代物2的N末端Met殘基被一分子的聚乙二醇修飾，因為當(dāng)使用由Shimadzu公司制造的蛋白質(zhì)測序儀PPSQ-10測定序列時未觀察到其N-末端序列。
對于三取代物1和三取代物2，推測聚乙二醇還與至少一個對應(yīng)于hG-CSF衍生物的34-46個氨基酸殘基片段(峰3)的肽殘基(包括Lys的氨基基團(tuán))結(jié)合。
此外，由于在各種一取代物1、二取代物、三取代物1和三取代物2中峰8消失或明顯降低，因此推測聚乙二醇還與對應(yīng)于各種成分的47-93個氨基酸殘基片段的一個肽殘基(除開賴氨酸等的游離氨基基團(tuán))結(jié)合。實施例9通過肽作圖對聚乙二醇結(jié)合位點的推斷通過與實施例7中描述的hG-CSF衍生物肽作圖的類似方法，將實施例6中獲得的二取代物級分用蛋白酶消化。
當(dāng)與實施例7的hG-CSF衍生物的分析圖譜比較時，在實施例6獲得的二取代物中發(fā)現(xiàn)表6所示的特定峰消失或顯著降低。
表6純化的聚乙二醇修飾的hG-CSF衍生物成分的肽作圖(與未修飾的hG-CSF衍生物比較)成分 消失或顯著降低的峰號實施例5的二取代物 5,8預(yù)測當(dāng)與實施例7的hG-CSF衍生物的分析圖譜比較時，與聚乙二醇連接的肽片斷的HPLC峰將發(fā)生變化。根據(jù)類似于實施例8的情況的表5的結(jié)果，在如實施例6所示的二取代物的情況下，推測聚乙二醇的結(jié)合位點為對應(yīng)于hG-CSF衍生物的-1-19個氨基酸殘基片段的肽殘基(包括N-末端氨基基團(tuán))和對應(yīng)于hG-CSF衍生物的47-93個氨基酸殘基片段的肽殘基(除開Lys等的游離氨基基團(tuán))。實施例10通過肽作圖的對聚乙二醇結(jié)合位點的判斷通過與實施例7和8類似的方式的肽作圖測定通過類似于實施例4的方法獲得的二取代物的聚乙二醇結(jié)合位點。在如實施例4所示的二取代物的情況下，推測聚乙二醇還與對應(yīng)于hG-CSF衍生物的-1-19個氨基酸殘基片段的肽殘基(包括N-末端氨基基團(tuán))和對應(yīng)于hG-CSF衍生物的47-93個氨基酸殘基片段的肽殘基(除開Lys等的游離氨基基團(tuán))結(jié)合。實施例11聚乙二醇修飾的肽的純化為了測定在對應(yīng)于hG-CSF衍生物或hG-CSF的47-93位點的氨基酸殘基并不含游離氨基的肽片段中的聚乙二醇結(jié)合的氨基酸殘基，通過下面方法從二取代物組分中分離聚乙二醇結(jié)合肽片段，其中這些殘基為在實施例4,5,6的二取代物、實施例5的三取代物1和三取代物2、實施例5的一取代物、實施例14的一取代物1和二取代物、實施例17的二取代物、三取代物1和三取代物2或?qū)嵤├?0的二取代物、三取代物1和三取代物2中證實的聚乙二醇結(jié)合位點。
即，以類似于實施例5的方法，通過陽離子交換層析柱SP-SPW，從用類似于實施例1的方法制備的聚乙二醇修飾的hG-CSF衍生物反應(yīng)溶液中獲得30ml含有二取代物作為主成分的級分(蛋白濃度為2.2mg/ml)。接著將其用嗜熱芽孢茵蛋白酶(Sigma制造)。使用凝膠過濾柱(Sephacryl S-300,Pharmacia制造)，分級分離酶反應(yīng)溶液以獲得所需的與聚乙二醇結(jié)合的肽級分(約30mg)。
肽級分的質(zhì)譜法(MALDI-TOFMS)結(jié)果為22155.89(M+H)，氨基酸分析的結(jié)果顯示Ser 2.7(3),Pro 1.0(1),Leu 1.0(1)和Cys 0.9(1)。
根據(jù)質(zhì)譜法和氨基酸分析的結(jié)果，推斷通過上面方法分離的樣品為其中聚乙二醇與hG-CSF衍生物的61位殘基至66位殘基肽[亮氨酰絲氨酰絲氨酰半胱氨酰脯氨酰絲氨酰(亮氨酰絲氨酰絲氨酰-S-酰氨基甲基半胱氨酰脯氨酰絲氨酸)殘基]結(jié)合的片段。實施例12通過1H-NMR對聚乙二醇結(jié)合位點的測定通過肽固相合成法(PSSM 8,Shimadzu公司)合成對應(yīng)于hG-CSF衍生物的61-66位氨基酸殘基的肽LeuSerSerCysProSer(亮氨酰絲氨酰絲氨酰半胱氨酰脯氨酰絲氨酸)并在如“蛋白質(zhì)和肽的高效液相色譜(Ⅱ),Kagaku Zokan 117(153-160(1990)；Kagaku Dojin公開)”所示條件下將其酰氨基甲基化，接著通過反向HPLC純化酰氨基甲基化的肽(亮氨酰絲氨酰絲氨酰-S-酰氨基甲基半胱氨酰脯氨酰絲氨酸)。將0.6mg一份的酰氨基甲基化肽溶解在氘取代的二甲亞砜(d6-DMSO)中以進(jìn)行1H-NMR分析(500MHz)。用類似方法，使用20mg實施例11獲得的聚乙二醇結(jié)合肽進(jìn)行1H-NMR分析。各分析中觀察到的質(zhì)子的化學(xué)位移(除開來源于聚乙二醇的那些)示于表7和8中。從這些結(jié)果中，證實所有來自于三個Ser的γOH基團(tuán)的質(zhì)子在于通過合成獲得的酰氨基甲基化的肽中。另一方面，除開來源于聚乙二醇的質(zhì)子信號，在實施例11獲得的聚乙二醇結(jié)合肽中觀察到一些現(xiàn)象，即未觀察到來源于hG-CSF衍生物的66位Ser殘基的γOH基團(tuán)的質(zhì)子，相同Ser殘基的β質(zhì)子位移至約低0.6ppm的磁場中以及與其它酰氨基質(zhì)子相比，相同的Ser殘基的酰氨基質(zhì)子產(chǎn)生寬的信號。根據(jù)上面的結(jié)果，證實聚乙二醇的結(jié)合位點為hG-CSF衍生物的66位Ser殘基。
表7在合成的酰氨基甲基化的肽的NMR分析中的質(zhì)子的化學(xué)位移(ppm)殘基NH CαHCβH 其它Leu61 8.063.86 1.52,157γH1.67,δCH30.92Ser62 8.664.47 3.57,364γOH5.138.664.49 3.63γOH5.04Ser63 8.034.32 3.58γOH4.858.064.32 3.57γOH4.80Cys64 8.194.68 2.63,2.96CH23.12,NH27.05,7.427.974.60 2.63,2.90CH23.12,NH27.10,7.45Pro65 4.42 1.91,2.02 γH1.86,δH3.614.80 1.98,2.20 γH1.83,δH3.45,3.40Ser66 7.984.23 3.60,3.70 γOH4.948.404.24 3.80,3.72 γOH4.90斜體形式代表Cis-Pro.
表8在從聚乙二醇修飾的hG-CSF衍生物分離的聚乙二醇修飾的肽的NMR分析中的質(zhì)子的化學(xué)位移(ppm，除開聚乙二醇部分)殘基NHCαH CβH 其它Leu61 3.66 1.44,1.56 γH1.70, δCH30.903.73 1.47,1.60 γH1.67, δCH30.90Ser62 8.51 4.43 3.57,3.64 γOH5.178.90 4.37 3.64Ser63 8.03 4.30 3.60 γOH4.858.06 4.21 3.58,3.63Cys64 8.18 4.68 2.6 8,3.03 CH23.12, NH27.02,7.438.08 4.62 2.67,2.90 CH23.12, NH27.02,7.62Pro654.33 1.87,2.02 γH1.86, δH3.674.60 2.12,2.04 γH1.72, 1.83,δH3.40,3.52Ser66 7.88 4.28 4.17,4.327.66 4.21 4.16,4.46斜體形式代表Cis-Pro實施例13聚乙二醇修飾的hG-CSF衍生物反應(yīng)溶液的制備將用磷酸緩沖液(pH7.5)制備的一份4.0ml的4.0mg/ml hG-CSF衍生物溶液與83g一甲氧基聚乙二醇丙酸的N-羥基琥珀酰亞胺酯(M-SPA-20,000,Shearwater Polymer制造)混合，4℃下將混合物攪拌一整晝夜。實施例14聚乙二醇修飾的成分的分離將實施例13中制備的聚乙二醇修飾的hG-CSF衍生物反應(yīng)溶液(蛋白含量為16mg)用20mM含有150mM氯化鈉的乙酸鹽緩沖液(pH4.5)稀釋5倍，將其通過用已事先用相同緩沖液平衡的填充有SephacrylS-400(Pharmacia制造)的柱，并將洗脫液分級分離。通過此操作，獲得主要含有被兩分子聚乙二醇修飾的成分(二取代物)的級分以及主要含有被一分子聚乙二醇修飾的成分(一取代物)的粗級分。將各種級分通過用TSK凝膠G4000SWX1,(7.8mm I.D.×300mm,Tosoh公司制造)填充的柱以獲得含有二取代物或一取代物的級分。此后，用SP-5PW(21.5mm I.D.×150mm,Tosoh公司制造)純化各種級分以獲得一種二取代物為主成分的級分(0.61mg/ml×0.6ml)和兩種一取代物為主成分的級分(一取代物1:0.46mg/ml×1.0ml，一取代物2:0.61mg/ml×0.7ml)。實施例15通過肽作圖的對聚乙二醇結(jié)合位點的判斷通過與實施例7中描述的hG-CSF衍生物肽作圖的類似方法，將實施例14獲得的各種一取代物1、一取代物2、二取代物用蛋白酶消化。
結(jié)果，當(dāng)與實施例8中發(fā)現(xiàn)的hG-cSF的分析圖譜比較時，發(fā)現(xiàn)特定峰的消失或顯著降低。
根據(jù)與實施例8類似的方法，推斷聚乙二醇的結(jié)合位點如下一取代物1該位點位于對應(yīng)于由SEQ ID NO:1代表的氨基酸序列的47-93位殘基的肽片段中(不包括Lys等的游離氨基基團(tuán))，并根據(jù)實施例12描述的方法，證實從N末端算起的66位Ser的羥基基團(tuán)被一分子聚乙二醇修飾。一取代物2該位點位于對應(yīng)于由SEQ ID NO:1代表的氨基酸序列的-1-19位殘基的肽片段中(包括N末端氨基基團(tuán))，并根據(jù)實施例7描述的方法，證實N末端Met被一分子聚乙二醇修飾。二取代物對應(yīng)于由SEQ ID NO:1代表的氨基酸序列的-1-19位殘基的肽片段(包括N末端氨基基團(tuán))，以及對應(yīng)于47-93位殘基的肽片段(不包括Lys等殘基的游離氨基基團(tuán))。實施例16聚乙二醇修飾的hG-CSF衍生物反應(yīng)溶液的制備用磷酸緩沖液(pH7.2)將參考實施例1中制備的hG-CSF衍生物調(diào)至0.9mg/ml以獲得600ml的調(diào)節(jié)溶液。在冰浴冷卻的同時，將如此獲得的溶液與8.7g通過與參考例2類似的方法獲得的2,4-雙(鄰甲氧基-聚乙二醇)6-(3羧基丙基氨基)-s一三嗪的N-羥基琥珀酰亞胺酯混合，4℃下將混合物攪拌48小時以制備聚乙二醇修飾的hG-CSF衍生物反應(yīng)溶液(4)。實施例17聚乙二醇修飾的成分的分離將通過與實施例16類似的方法獲得的聚乙二醇修飾的hG-CSF衍生物反應(yīng)溶液(4)(蛋白含量為40mg)通過用已事先用20mM含有150mM氯化鈉的乙酸鹽緩沖液(pH4.5)平衡的填充有Sephacryl S-400(Pharmacia制造)的柱，并將洗脫液分級分離。通過此操作，獲得含有被三分子聚乙二醇修飾的成分(三取代物)的粗級分以及含有被二分子聚乙二醇修飾的成分(二取代物)的粗級分。
以類似于實施例4的方法，使用陽離子交換柱SP-5PW(Tosoh公司制造)純化各種級分以獲得兩種三取代物為主成分的級分(三取代物1:0.49mg/ml×1.3ml，三取代物2:0.57mg/ml×1.5ml)和一種二取代物為主成分的級分(1.94mg/ml×1.2ml)。實施例18通過肽作圖的對聚乙二醇結(jié)合位點的判斷通過與實施例7和8中描述的肽作圖類似的方式測定在實施例17中獲得的二取代物、三取代物1和三取代物2的聚乙二醇結(jié)合位點。
還在實施例17所獲得的的二取代物、三取代物1和三取代物2中，推測聚乙二醇與對應(yīng)于hG-CSF衍生物的-1-19位殘基的肽片段(包括N-末端氨基基團(tuán))和對應(yīng)于hG-CSF衍生物的47-93位殘基的肽片段(不包括Lys等的游離氨基基團(tuán))結(jié)合。在三取代物1和三取代物2中，推測聚乙二醇還與至少一個對應(yīng)于hG-CSF衍生物的34-46位殘基(峰3)的肽片段(包括Lys的氨基基團(tuán))結(jié)合。實施例19聚乙二醇修飾的hG-CSF衍生物反應(yīng)溶液的制備用磷酸緩沖液(pH7.3)將參考實施例1中制備的hG-CSF衍生物調(diào)至0.9mg/ml以獲得560ml的調(diào)節(jié)溶液。在冰浴冷卻的同時，將如此獲得的溶液與22.4g通過與參考例4類似的方法獲得的2,4-雙(鄰甲氧基-聚乙二醇)-6-(3羧基丙基氨基)-s一三嗪的N-羥基琥珀酰亞胺酯混合，4℃下將混合物攪拌48小時以制備聚乙二醇修飾的hG-CSF衍生物反應(yīng)溶液(5)。實施例20聚乙二醇修飾的成分的分離
將通過與實施例19類似的方法獲得的聚乙二醇修飾的hG-CSF衍生物反應(yīng)溶液(蛋白含量為15mg)通過用已事先用20mM含有150mM氯化鈉的乙酸鹽緩沖液(pH4.5)平衡的填充有Sephacryl S-400(Pharmacia制造)的柱，并將洗脫液分級分離。通過此操作，獲得含有被三分子聚乙二醇修飾的成分(三取代物)的粗級分以及含有被二分子聚乙二醇修飾的成分(二取代物)的粗級分。
以類似于實施例4的方法，使用陽離子交換柱SP-5PW(Tosoh公司制造)純化各種級分以獲得兩種三取代物為主成分的級分(三取代物1:3.53mg/ml×0.4ml，三取代物2:0.26mg/ml×2.1ml)和一種二取代物為主成分的級分(0.84mg/ml×1.2ml)。實施例21通過肽作圖對聚乙二醇結(jié)合位點的判斷通過與實施例7和8中描述的肽作圖類似的方法測定實施例20中獲得的二取代物、三取代物1和三取代物2的聚乙二醇結(jié)合位點。還在實施例20所獲得的的二取代物，三取代物1和三取代物2中，推測聚乙二醇與對應(yīng)于hG-CSF衍生物的-1-19位殘基的肽片段(包括N-末端氨基基團(tuán))和對應(yīng)于hG-CSF衍生物的47-93位殘基的肽片段(不包括Lys等的游離氨基基團(tuán))結(jié)合。在三取代物1和三取代物2中，推測聚乙二醇還與至少一個對應(yīng)于hG-CSF衍生物的34-46位殘基的肽片段(包括Lys的氨基基團(tuán))結(jié)合。實施例22化學(xué)修飾的多肽的蛋白酶抗性將實施例14獲得的0.5ml一份的兩種以一取代物為主成分的級分通過已用10mM磷酸緩沖液(pH5.0)平衡的凝膠過濾柱[SephadexG-25(NAP-5,Amersham Pharmacia制造)]，以1.0ml一份回收洗脫液液。
將由此回收的各種級分用10mM磷酸緩沖液(pH5.0)稀釋以將蛋白質(zhì)濃度調(diào)至0.2mg/ml。
將2ml一份的各種稀釋級分與0.2mg/ml嗜熱芽孢菌蛋白酶混合(酶/底物比例=1/50),30℃下，讓混合物發(fā)生反應(yīng)。
以100μl一份定期從反應(yīng)溶液中收集樣品并與2μl乙酸混合以終止反應(yīng)。
使用50μl各種反應(yīng)終止樣品，在下面條件下進(jìn)行HPLC分析柱TSK凝膠G4000SWxL(7.8mm I.D.×300mm)(Tosoh制造)檢測280nm流動相150mM NaCl/20mM乙酸鈉緩沖液(p4.5)流速0.8ml/分鐘一取代物1和2在12分鐘的保留時間處被洗脫。當(dāng)用嗜熱芽孢茵蛋白酶水解這些一取代物時，在12分鐘的位置發(fā)現(xiàn)檢測峰降低，這樣可證實嗜熱芽孢菌蛋白酶對這些一取代物的水解程度。
表9表明從在12分鐘位置發(fā)現(xiàn)的檢測峰的降低比例而計算的一取代物的剩余比例的周期性變化。
表9抗嗜熱芽孢菌蛋白酶的穩(wěn)定性
從表9所示結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中Ser被聚乙二醇修飾的一取代物1比其中N末端被修飾的一取代物2對嗜熱芽孢茵蛋白酶更具有抗性。實施例23化學(xué)修飾的多肽的抗凍融的穩(wěn)定性將實施例5獲得的1ml一份的每兩種一取代物成分通過已用5mM乙酸鈉緩沖液(pH4.5)或5mM乙酸鈉緩沖液(pH5.0)平衡的兩個凝膠過濾柱[Sephadex G-25(NAP-10,Amersham Pharmacia制造)]，以1.5ml一份從各柱回收洗脫液液。
將由此回收的各種級分的蛋白濃度調(diào)至300μg/ml。
將各種調(diào)節(jié)的級分以500μl一份分散，冷凍于-30℃下，并接著室溫下在水浴中融化。
將這種凍融處理重復(fù)4遍，接著在實施例22描述的凝膠過濾HPLC條件下測定各種修飾多肽的剩余量(回收產(chǎn)率)。
結(jié)果示于表10中。
表10
從表10所示的結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中Ser被聚乙二醇修飾的一取代物1比其中N末端被修飾的一取代物2對凍融更為穩(wěn)定。實施例24化學(xué)修飾的多肽的體外活性根據(jù)Asano等的方法[Yakuri to Chiryo,19:2767(1991)]，通過下面系列稀釋法測定實施例14獲得的兩種一取代物為主成分的級分的增強(qiáng)小鼠白血病細(xì)胞NFS 60生長的活性[K.Holmes等Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:6687(1985)]。
將用G-CSF(-)培養(yǎng)基洗滌的細(xì)胞懸液以50μl一份分散在96井平板的各井中。
將實施例14獲得的一取代物1調(diào)節(jié)至25ng/ml，將50μl一份的調(diào)節(jié)溶液加入到第一個井中并充分混合以將溶液調(diào)至12.5ng/ml。
從井中吸取50μl一份的溶液，加入到第二個井中，并充分混合以將溶液調(diào)至6.25ng/ml。通過重復(fù)該步驟，制備11步兩倍稀釋的系列。
以相同方式，使用實施例14獲得的一取代物2(25ng/ml)和含有參考實施例1的hG-CSF衍生物的標(biāo)準(zhǔn)溶液(5ng/ml)制備二倍稀釋系列。通過這種方法，在各井以50μl一份從12.5ng/ml制備一取代物2的稀釋系列和從2.5ng/ml制備標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋系列。
將各種樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液的NFS60細(xì)胞的生長活性測定三次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液的活性(100％)計算各種一取代物的相對活性。
一取代物1顯示比一取代物2高1.06-1.13倍的活性。參考例1根據(jù)日本審查專利申請?zhí)?96558/95參考實施例中描述的方法，通過用丙氨酸置換1位的蘇氨酸，蘇氨酸置換3位的亮氨酸，酪氨酸置換4位的甘氨酸，精氨酸置換5位的脯氨酸以及絲氨酸置換17位的半胱氨酸，從hG-CSF獲得具有如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的hG-CSF衍生物(表1中的化合物K)。
即，37℃下，將含有包含編碼上述hG-CSf衍生物的DNA片段的質(zhì)粒pCfBD28的大腸桿菌W3110strA菌株(大腸桿菌ECfBD,FERMBP-1479)在LG培養(yǎng)基[通過將10g細(xì)菌培養(yǎng)用胰蛋白胨、5g酵母、5g氯化鈉和1g葡萄糖溶解在1L水中并用NaOH將其pH調(diào)至7.9來制備]中培養(yǎng)18小時，將5ml一份的培養(yǎng)肉湯接種到100ml含有25μg/ml色氨酸和50μg/ml氨芐青霉素的MCG培養(yǎng)基中(0.6％Na2HPO4、3％KH2PO4、0.5％氯化鈉、0.5％水解酪蛋白氨基酸、1mMMgSO4和4μg/ml維生素B1,pH7.2),30℃下，將混合物培養(yǎng)4-8小時。接著，將10μg/ml色氨酸誘導(dǎo)物3β-吲哚丙烯酸(下文稱為“IAA”)加入到培養(yǎng)基中，再繼續(xù)培養(yǎng)2-12小時。以8,000rpm將產(chǎn)生的培養(yǎng)肉湯離心10分鐘，將收集的細(xì)胞用30mM氯化鈉和30mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)洗滌。將洗滌的細(xì)胞懸浮于30ml上述緩沖液中，0℃下，使用超聲破碎儀(SINIFIER CELL DISRUPTOR 200,OUTPUT CONTROL 2,BRANSON SONIC POWER COMPANY制造)超聲破碎10分鐘。超聲破碎后，以9,000rpm將細(xì)胞懸液離心30分鐘以獲得細(xì)胞殘渣。
此后，根據(jù)Marston等的方法[F.A.O.Marston等，生物/技術(shù)，2:800(1984)]從細(xì)胞殘渣中提取和純化hG-CSF衍生物并溶解和再生。參考例22,4-雙(鄰甲氧基聚乙二醇)-6-(3-羧基丙基氨基)-s一三嗪的N-羥基琥珀酰亞胺酯的制備將412mg(4.0mmol)γ-氨基丁酸溶解在300ml 0.1M硼酸鹽緩沖液(pH10)中，將產(chǎn)生的被冰浴冷卻的溶液與20g(2mmol)2,4-雙(鄰甲氧基聚乙二醇)-6-氯-s-三嗪(Seikagaku Kogyo制造)混合，4℃下，讓混合物反應(yīng)一整晝夜并接著在室溫下反應(yīng)6小時。
通過加入1N鹽酸將反應(yīng)溶液調(diào)至pH1，并接著用氯仿萃取2，4-雙(鄰甲氧基聚乙二醇)-6-(3-羧基丙基氨基)-s-三嗪。氯仿相用無水硫酸鈉干燥，過濾除去不溶物，減壓蒸發(fā)溶劑以獲得羧酸衍生物。
從無水丙酮中將羧酸衍生物重結(jié)晶以獲得15.8g(1.6mmol)的羧酸衍生物晶體。
將10g(1.0mmol)一份的晶體和230mg N-羥基琥珀酰亞胺溶解在100ml無水二氯甲烷中，在冰浴和氬氣流中冷卻的同時，將產(chǎn)生的溶液與413mgN,N’-二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)混合，并將混合物攪拌30分鐘。完成攪拌后，讓反應(yīng)混合物的溫度回到室溫，再攪拌1.5小時，過濾除去不溶物(N,N’-二環(huán)己基脲(DCU))，接著減壓下將產(chǎn)生的濾液濃縮至40ml。
將濃縮液滴加至600ml無水二乙基醚中以形成沉淀。將沉淀用無水二乙基醚洗滌，接著減壓除去溶劑以獲得7.7g(0.77mmol)2,4-雙(鄰甲氧基-聚乙二醇)-6-(3羧基丙基氨基)-s一三嗪的N-羥基琥珀酰亞胺酯(產(chǎn)率77％)。參考例32,4-雙(鄰甲氧基-聚乙二醇)-6(3-羧基丙基氨基)-s一三嗪的制備將100g(8.33mmol)充分干燥的具有12,000平均分子量的一甲氧基聚乙二醇(Nippon油脂公司制造)、9.3g氧化鋅(Wako純化學(xué)品工業(yè)公司)和83.5g分子篩(4A型)(Wako純化學(xué)品工業(yè)公司)溶解在無水苯中，室溫下氬氣流中，讓溶液靜置一整晝夜。
除去分子篩后，接著80℃氬氣流中，使用蒸餾裝置蒸餾反應(yīng)溶液，80℃氬氣流中使用已用約100g分子篩(4A型)填充的Soxhlet提取器(用于固相)將其共沸蒸餾一整晝夜。
冷卻通過脫水回流獲得的反應(yīng)溶液，與736mg(4.0mmol)氰尿酰氯混合，接著用與上述類似的方式共沸蒸餾5天。此后，將溶液冷卻至室溫，與300ml無水苯混合，接著以3,600rpm將混合物離心10分鐘以除去不溶物。
減壓下，將獲得的上清濃縮至300ml，并滴加到3,000ml無水二乙基醚中以形成沉淀?；厥粘恋?，用無水二乙基醚洗滌，減壓除去溶劑以獲得干燥的沉淀。
在冰浴冷卻的同時，將100g干燥的沉淀加入到通過將1.24g(12.0mmol)γ-氨基丁酸溶解在1,000ml 0.1M硼酸鈉緩沖液(pH10)而制備的溶液中，4℃下，將混合物攪拌一整晝夜。室溫下再攪拌6小時后，用1N鹽酸將溶液調(diào)至pH1.0，接著用氯仿萃取2,4-雙(鄰甲氧基-聚乙二醇)-6-(3-羧基丙基氨基)-s一三嗪。
將含有化合物的氯仿相用無水硫酸鈉干燥并過濾，減壓下從產(chǎn)生的濾液中除去溶劑。將形成的白色固體從無水丙酮中重結(jié)晶以獲得90g 2,4-雙(鄰甲氧基-聚乙二醇)-6-(3-羧基丙基氨基)-s一三嗪(產(chǎn)率90％)。參考例42,4-雙(o-甲氧基-聚乙二醇)-6-(3-羧基丙基氨基)-s一三嗪的N-羥基琥珀酰亞胺酯的制備將25g(1.0mmol)用與參考例3類似的方法合成并充分干燥的2,4-雙(鄰甲氧基-聚乙二醇)-6-(3-羧基丙基氨基)-s一三嗪和240mg N-羥基琥珀酰亞胺溶解在400ml無水二氯甲烷中，在冰浴和氬氣流中冷卻的同時，將產(chǎn)生的溶液與431mg N,N’-二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)混合，將混合物攪拌30分鐘。
完成攪拌后，讓反應(yīng)混合物回到室溫，再攪拌1.5小時，過濾除去不溶物(N,N’-二環(huán)己基脲(DCC))，減壓下將產(chǎn)生的濾液濃縮至160ml。
將濃縮液滴加到2,400ml無水二乙基醚中以形成沉淀。將沉淀用無水二乙基醚洗滌，接著減壓除去溶劑以獲得21.4g(0.89mmol)2,4雙(鄰甲氧基-聚乙二醇)-6-(3-羧基丙基氨基)-s一三嗪的N-羥基琥珀酰亞胺酯(產(chǎn)率89％)。工業(yè)實用性本發(fā)明提供一種化學(xué)修飾的多肽，其中該多肽分子中的至少一個羥基被用聚亞烷基二醇衍生物修飾；一種制備該修飾多肽的方法；一種使用該修飾多肽的治療方法；修飾多肽的用途；一種包含該修飾多肽的藥物制劑；以及包含該修飾多肽的治療組合物。
序列表SEQ ID NO:1序列長度174序列類型氨基酸鏈型單鏈拓樸學(xué)線性分子類型蛋白質(zhì)序列Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu-1 1 5 10 15Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu20 25 30Gln Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu35 40 45Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser50 55 60Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His65 70 75Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile80 85 90 95Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala100 105 110Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala115 120 125Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala130 135 140Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser145 150 155Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro160 165 170
權(quán)利要求
1．一種化學(xué)修飾的多肽，其中該多肽分子中的至少一個羥基基團(tuán)被用聚亞烷基二醇衍生物修飾。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的化學(xué)修飾的多肽，其中多肽分子中的羥基基團(tuán)為來源于絲氨酸殘基的羥基基團(tuán)。
3．根據(jù)權(quán)利要求1或2的化學(xué)修飾的多肽，其中多肽為具有粒細(xì)胞集落刺激因子活性的多肽。
4．根據(jù)權(quán)利要求3的化學(xué)修飾的多肽，其中具有粒細(xì)胞集落刺激因子活性的多肽為包含SEQ ID NO:1代表的氨基酸序列的多肽，或包含在SEQ ID NO:1代表的氨基酸序列中至少一個氨基酸缺失、取代或摻入的氨基酸序列并具有粒細(xì)胞集落刺激因子活性的多肽。
5．根據(jù)權(quán)利要求1或2的化學(xué)修飾的多肽，其中聚亞烷基二醇衍生物具有500-1,000,000的分子量。
6．根據(jù)權(quán)利要求1的化學(xué)修飾的多肽，其中它被包括聚亞烷基二醇衍生物的化學(xué)修飾劑修飾。
7．根據(jù)權(quán)利要求6的化學(xué)修飾的多肽，其中化學(xué)修飾劑為由下式代表的聚亞烷基二醇衍生物R1-(M)n-X-R2(Ⅰ)(其中R1代表烷基或烷?；?；M代表-OCH2CH2-,-OCH2CH2CH2-或-(OCH2CH2)r-(OCH2CH2CH2)s-(其中r和s相同或不相同，各自代表任意可變的正整數(shù))；n為任意可變的正整數(shù)；X代表一個鍵、O、NH或S；以及R2代表
<其中R3代表OH、鹵素或-Xa-(Ma)na-R1a(其中Xa、Ma、R1a和na均分別具有與上面X、M、R1和n相同的含義)；和Y代表鹵素或-Z-(CH2)p-(O)m-W[其中Z代表O、S或NH；和W代表羧基或其活性衍生物或
(其中R4代表烷基，以及Hal代表鹵素)；p為0-6的整數(shù)；和m為0或1]>，-(CO)m-(CH2)t-W(其中t為0-6的整數(shù)；和m和w具有如上定義的相同的含義)，
(其中Hala、pa和R4a各自分別具有與上面Hal、p和R4相同的含義)，
(其中R3和W具有如上定義的相同含義)，
(其中R3、t和W具有如上定義的相同含義)，
(其中W具有如上定義的相同含義)，
或
(其中R5代表其中一個氨基和一個羧基被從氨基酸中除去的殘基；以及W具有如上定義的相同含義)}。
8．根據(jù)權(quán)利要求7的化學(xué)修飾的多肽，其中化學(xué)修飾劑為由下式(Ib)代表的聚亞烷基衍生物
(其中R1、M、R3、Z、n和p具有如上定義的相同含義；以及Wa代表羧基或其活性衍生物)。
9．一種制備化學(xué)修飾的多肽的方法，其特征在于將多肽分子中的至少一個羥基基團(tuán)與包括聚亞烷基二醇衍生物的化學(xué)修飾劑反應(yīng)。
10．包含根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項化學(xué)修飾的多肽的藥物制劑。
11．一種治療粒細(xì)胞或血小板減小病人的方法，其包括給藥有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項化學(xué)修飾的多肽。
12．根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項化學(xué)修飾的多肽在制備可有效治療粒細(xì)胞或血小板減小病人的藥物組合物中的用途
13．根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項化學(xué)修飾的多肽在治療粒細(xì)胞或血小板減小病人中的用途。
14．一種用于治療粒細(xì)胞或血小板減小病人的組合物，其包含藥物可接受的載體和為藥物可接受劑量形式的有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項化學(xué)修飾的多肽。
全文摘要
本發(fā)明提供一種化學(xué)修飾的多肽,其中該多肽分子中的至少一個羥基被用聚亞烷基二醇衍生物修飾;一種制備該修飾多肽的方法;一種使用該修飾多肽的治療方法;修飾多肽的用途;一種包含該修飾多肽的藥物制劑;以及包含該修飾多肽的治療組合物。
文檔編號A61K38/00GK1236370SQ98801074
公開日1999年11月24日 申請日期1998年6月5日 優(yōu)先權(quán)日1997年6月6日
發(fā)明者山基生, 須澤敏行, 小林健, 小西升, 秋永士朗, 丸山久美子 申請人:協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會社