一種微量多肽化學(xué)衍生體系及衍生方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種微量多肽化學(xué)衍生體系，該體系由置于Eppendorf槍頭中的、由上至下的三層填料層組成；其中，最上層的填料為反相硅膠，中間層的填料為磺酸基陽離子交換鍵合硅膠，最下層的填料為反相硅膠。本發(fā)明還提供了所述微量多肽化學(xué)衍生體系的制備方法，以及應(yīng)用所述微量多肽化學(xué)衍生體系進(jìn)行多肽正電荷衍生的方法。
【專利說明】一種微量多肽化學(xué)衍生體系及衍生方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及多肽分析領(lǐng)域，具體涉及一種微量多肽化學(xué)衍生體系及該體系的制備方法，還涉及利用該微量多肽化學(xué)衍生體系進(jìn)行多肽正電荷衍生的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]在質(zhì)譜(Mass Spectrometry, MS)技術(shù)中，串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)可用于獲得目標(biāo)物質(zhì)結(jié)構(gòu)的碎片，從而對目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。目前，通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(LC-MS/MS)可以很容易地分離與裂解復(fù)雜的多肽混合物，從而進(jìn)行蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析。
[0003]數(shù)據(jù)庫檢索法是使用串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析時的常規(guī)方法。該方法是從特定的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中提取目標(biāo)物質(zhì)所有的肽段序列，并將它們與串聯(lián)質(zhì)譜所得譜圖進(jìn)行比較和打分，找到可能性最大的肽段序列。但是，對于基因組未測序的物質(zhì)，由于無法建立相應(yīng)的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，常規(guī)的數(shù)據(jù)庫檢索方法無法獲得可以與質(zhì)譜譜圖進(jìn)行比較分析的多肽序列。
[0004]多肽從頭測序技術(shù)通過串聯(lián)質(zhì)譜譜圖上碎片離子之間的質(zhì)量差得到對應(yīng)的氨基酸殘基，可得到所有物種的肽段序列及翻譯后修飾，無需借助蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索和比較即可對多肽序列進(jìn)行鑒定。多肽從頭測序有著很大的發(fā)展?jié)摿?，但是目前低可信度的鑒定結(jié)果限制了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用。這種低可信度主要是由不充分的裂解以及同時產(chǎn)生的N-端系列離子和C-端系列離子相互重疊導(dǎo)致的。
[0005]目前，為了避免N-端與C-端系列離子的重疊，提高多肽從頭測序的可信度，可采用多肽N-末端衍生技術(shù)進(jìn)行圖譜簡化處理。該技術(shù)包括多肽N-末端的負(fù)電荷衍生與正電荷衍生。其中，多肽N-末端正電荷衍生是指在多肽N-末端引入一個季銨基團(tuán)或季膦基團(tuán)，從而提高二級譜圖中多肽N-末端碎片離子的信號強(qiáng)度。(琥珀酰亞胺氧基擬基甲基)三(2,4,6-三甲氧苯基)溴化憐(Succinimidyloxycarbonylmethyltris(2, 4, 6-trimethoxyphenyl)phosphonium bromide, TMPP-Ac-OSu)是一種重要的多妝N-端正電荷衍生試劑，它可在一個簡單、快速、溫和的條件下對多肽的N-端進(jìn)行特異性的衍生。
[0006]傳統(tǒng)的TMPP-Ac-OSu衍生方法為溶液方法，其缺點(diǎn)是衍生反應(yīng)產(chǎn)生大量以TMPP-Ac-OH為主的副產(chǎn)物，嚴(yán)重影響微量樣品(〈lpmol)或者復(fù)雜樣品中低豐度多肽的序列分析。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種微量多肽化學(xué)衍生體系，并提供該體系的制備方法。
[0008]本發(fā)明的另一目的是提供利用所述微量多肽化學(xué)衍生體系進(jìn)行正電荷衍生的方法，該方法可有效去除衍生反應(yīng)副產(chǎn)物，減少多肽衍生物的損失，提高衍生多肽的質(zhì)譜分析靈敏度。
[0009]本發(fā)明提供了一種微量多肽化學(xué)衍生體系，該體系由置于Eppendorf槍頭中的、由上至下的三層填料層組成，分別為最上層、中間層和最下層。
[0010]具體地，
[0011]最上層為衍生反應(yīng)層；其作用為為衍生反應(yīng)中的肽段與衍生試劑提供固相結(jié)合介質(zhì)。
[0012]最上層的厚度為3?5mm。
[0013]最上層的填料為反相硅膠填料，填料粒徑為3?10 μ m。
[0014]所述反相硅膠選用C8或C18,優(yōu)選為C8。
[0015]中間層為副產(chǎn)物去除層；其作用為去除衍生反應(yīng)中的鹽離子和反應(yīng)副產(chǎn)物等雜質(zhì)；作用原理為陽離子交換原理，即:衍生肽段與填料結(jié)合，副產(chǎn)物被洗脫。
[0016]中間層的厚度為3?5mm。
[0017]中間層的填料為磺酸基陽離子交換鍵合硅膠SCX填料，填料粒徑為3?10 μ m。
[0018]最下層為脫鹽洗脫層；其作用為將衍生反應(yīng)中的各種鹽去除得到純化的衍生多肽；作用原理為反相色譜洗脫原理，即:衍生肽段與填料結(jié)合，鹽被洗脫。
[0019]最下層的厚度為3?5mm。
[0020]最下層的填料為反相硅膠填料，填料粒徑為3?10 μ m。
[0021]所述反相硅膠選用C8或C18，優(yōu)選為C8。
[0022]所述Eppendorf槍頭為實(shí)驗(yàn)室常用Eppendorf槍頭,規(guī)格為200 μ I。
[0023]本發(fā)明還提供了所述微量多肽化學(xué)衍生體系的制備方法。
[0024]所述方法包括以下步驟:
[0025]I)將一片直徑為I?2mm的特氟龍薄膜水平放置到Eppendorf槍頭底部，以防止填料漏出；
[0026]2)將反相硅膠的甲醇懸濁液緩慢加入特氟龍薄膜之上，進(jìn)行離心，離心機(jī)轉(zhuǎn)速為1000 Xg,離心時間為5min,最下層即得；
[0027]3)將SCX的甲醇懸濁液緩慢加入步驟2)所得最下層之上，進(jìn)行離心，離心機(jī)轉(zhuǎn)速為1000 Xg,離心時間為5min,中間層即得；
[0028]4)將反相硅膠的甲醇懸濁液緩慢加入步驟3)所得中間層之上，進(jìn)行離心，離心機(jī)轉(zhuǎn)速為lOOOXg，離心時間為5min，微量多肽化學(xué)衍生體系即得。
[0029]本發(fā)明還提供了利用所述微量多肽化學(xué)衍生體系進(jìn)行多肽正電荷衍生的方法。
[0030]所述方法包括以下步驟:衍生體系的平衡；樣品與正電荷衍生試劑的載入；正電荷衍生反應(yīng)；副產(chǎn)物的洗脫；衍生多肽的脫鹽；衍生多肽的洗脫。
[0031]具體地，
[0032]所述正電荷衍生試劑選用TMPP-Ac-OSu ；
[0033]所述副產(chǎn)物包括TMPP-Ac-OH ；
[0034]所述方法包括以下具體步驟:
[0035]I)衍生體系的平衡:使用45%乙腈100 μ L進(jìn)行系統(tǒng)的清洗，使用0.1 %三氟乙酸溶液100 μ L進(jìn)行系統(tǒng)的平衡；
[0036]2)樣品的載入:將多肽樣品與TMPP-Ac-OSu衍生試劑以質(zhì)量比1:2溶解于含5%乙腈與0.1 %三氟乙酸的溶液100 μ L，載入微量反應(yīng)體系最上層；
[0037]3)衍生反應(yīng):載入ρΗ8.2、濃度為20mmol/L的碳酸氫鈉緩沖液100 μ L，引發(fā)衍生反應(yīng)；室溫下孵育2小時后，使用0.1 %三氟乙酸溶液100 μ L進(jìn)行清洗，終止衍生反應(yīng)；
[0038]4)副產(chǎn)物的去除:使用ΡΗ3.0、含有5mmol/L磷酸二氫鉀和45%乙腈的緩沖液AlOO μ L進(jìn)行洗脫，將衍生多肽產(chǎn)物從最上層洗脫下來并結(jié)合到中間層，同時將以TMPP-Ac-OH為主的衍生反應(yīng)副產(chǎn)物除去；使用ρΗ3.0、含有5mmol/L磷酸二氫鉀、500mmol/L氯化鉀和45 %乙腈的緩沖液BlOO μ L進(jìn)行洗脫，將衍生多肽產(chǎn)物從中間層洗脫下來并結(jié)合到最下層；
[0039]5)衍生多肽的脫鹽:使用0.1 %三氟乙酸溶液100 μ L進(jìn)行洗脫，去除衍生反應(yīng)中的鹽雜質(zhì)；
[0040]6)衍生多肽的洗脫:使用45%乙腈100μ L進(jìn)行洗脫，衍生多肽樣品即得。
[0041]本發(fā)明還提供了所述微量多肽化學(xué)衍生體系在多肽從頭測序中的應(yīng)用。
[0042]所述應(yīng)用為將由所述衍生體系及相應(yīng)衍生方法得到的衍生多肽用于質(zhì)譜分析。
[0043]本發(fā)明具有以下顯著技術(shù)效果:
[0044]1、傳統(tǒng)的正電荷衍生反應(yīng)在溶液中進(jìn)行，衍生多肽與大量副產(chǎn)物和雜質(zhì)混合在一起，影響反應(yīng)效率和后續(xù)的質(zhì)譜分析；本發(fā)明提供的微量多肽化學(xué)衍生體系結(jié)構(gòu)簡單、操作簡便，能有效去除副產(chǎn)物和雜質(zhì)，顯著提高了多肽正電荷衍生反應(yīng)的效率和衍生多肽的質(zhì)譜分析靈敏度；
[0045]2、本發(fā)明提供的微量多肽化學(xué)衍生體系將多肽的衍生與副產(chǎn)物的去除和脫鹽有效整合在一個體系內(nèi)進(jìn)行，可有效降低由于樣品多次轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的樣品損失。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0046]圖1為本發(fā)明所述微量多肽化學(xué)衍生體系結(jié)構(gòu)圖；其中，I為Eppendorf槍頭；2為最上層C8或C18填料層；3為中間層SCX填料層；4為最下層C8或C18填料層。
[0047]圖2為利用C8-SCX-C8衍生體系進(jìn)行多妝正電荷衍生反應(yīng)流程圖。
[0048]圖3為大鼠C6細(xì)胞的正電荷衍生多肽的總離子流圖，其中，(A)為傳統(tǒng)溶液衍生方法所得衍生多肽使用C18色譜柱分離所得總離子流圖，(B)為本發(fā)明所述方法所得衍生多肽使用C18色譜柱分離所得總離子流圖，(C)為本發(fā)明所述方法所得衍生多肽使用C8色譜柱分離所得總離子流圖。
【具體實(shí)施方式】
[0049]實(shí)施例1:C8-SCX_C8S生體系的制備
[0050]1、原料:
[0051 ] 特氟龍薄膜購自3M公司；
[0052]Eppendorf 槍頭規(guī)格為 2OO μ L,購自 Eppendorf 公司；
[0053]C8 填料粒徑為 5 μ m,購自 Agela Technologies 公司
[0054]SCX 填料粒徑為 5 μ m,購自 Agela Technologies 公司
[0055]2、步驟:
[0056]I)將一片直徑為1.5mm的特氟龍薄膜水平放置到Eppendorf槍頭底部；
[0057]2)將濃度為10mg/mL的C8填料的甲醇懸濁液100 μ L緩慢加入特氟龍薄膜之上，進(jìn)行離心，離心機(jī)轉(zhuǎn)速為1000 Xg,離心時間為5min,最下層C8填料層即得；[0058]3)將濃度為10mg/mL的SCX填料的甲醇懸濁液100 μ L緩慢加入步驟2)所得C8填料層之上，進(jìn)行離心，離心機(jī)轉(zhuǎn)速為lOOOXg，離心時間為5min，中間層SCX填料層即得；
[0059]4)將濃度為10mg/mL的C8填料的甲醇懸濁液100 μ L緩慢加入步驟3)所得SCX填料層之上，進(jìn)行離心，離心機(jī)轉(zhuǎn)速為lOOOXg，離心時間為5min，最上層C8填料層即得。
[0060]3、結(jié)果:C8-SCX-C8衍生體系如圖1所示。
[0061]實(shí)施例2:多肽的衍生
[0062]1、多肽的制備:提取來自大鼠C6細(xì)胞的蛋白；使用12.5%的SDS-PAGE凝膠進(jìn)行蛋白質(zhì)分離；經(jīng)G-250染色后，將含有蛋白質(zhì)的凝膠帶切下；使用IOmM的DTT和25mM的碘乙酰胺對蛋白質(zhì)進(jìn)行還原與封閉；使用胰蛋白酶(購自Promega公司)對蛋白質(zhì)進(jìn)行酶切；多肽混合 物即得。
[0063]2、衍生反應(yīng):
[0064]衍生反應(yīng)流程如圖2所示，具體包括以下步驟:
[0065]I)衍生體系的平衡:將實(shí)施例1所得C8-SCX-C8體系使用45%乙臆100 μ L進(jìn)行清洗，使用0.1 %三氟乙酸溶液100 μ L進(jìn)行平衡；
[0066]2)樣品的載入:將步驟I所得多肽樣品50 μ g與TMPP-Ac-OSu衍生試劑(購自Sigma公司)100 μ g溶解于含5 %乙腈與0.1 %三氟乙酸的溶液100 μ L中，載入微量反應(yīng)體系最上層CS填料層；
[0067]3)衍生反應(yīng):載入ρΗ8.2、濃度為20mmol/L的碳酸氫鈉緩沖液100 μ L ;室溫下孵育2小時后,使用0.1 %三氟乙酸溶液100 μ L進(jìn)行清洗；
[0068]4)副產(chǎn)物的去除:使用ΡΗ3.0、含有5mmol/L磷酸二氫鉀和45%乙腈的緩沖液A100 μ L進(jìn)行洗脫；接下來，使用ρΗ3.0、含有5mmol/L磷酸二氫鉀、500mmol/L氯化鉀和45%乙腈的緩沖液B100 μ L進(jìn)行洗脫；
[0069]5)衍生多肽的脫鹽:使用0.1 %三氟乙酸溶液100 μ L進(jìn)行洗脫；
[0070]6)衍生多肽的洗脫:使用45%乙腈100μ L進(jìn)行洗脫，衍生多肽樣品即得。
[0071]實(shí)施例3:衍生多肽的檢測
[0072]1、按照表1所述實(shí)驗(yàn)方案對衍生多肽的總離子流進(jìn)行檢測；
[0073]表1、實(shí)驗(yàn)方案
【權(quán)利要求】
1.一種微量多肽化學(xué)衍生體系，該體系由置于Eppendorf槍頭中的、由上至下的三層填料層組成；其中，最上層的填料為反相硅膠，中間層的填料為磺酸基陽離子交換鍵合硅膠，最下層的填料為反相硅膠。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)衍生體系，其特征在于，各填料層的厚度為3?5mm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)衍生體系，其特征在于，各填料的粒徑為3?10μ m。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)衍生體系，其特征在于，所述反相硅膠選用C8或C18，優(yōu)選為c8。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)衍生體系，其特征在于，所述Eppendorf槍頭為實(shí)驗(yàn)室常用Eppendorf槍頭，規(guī)格為200 μ I。
6.權(quán)利要求1所述微量多肽化學(xué)衍生體系的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: 1)將一片直徑為I?2mm的特氟龍薄膜水平放置到Eppendorf槍頭底部； 2)將反相硅膠懸濁液緩慢加入特氟龍薄膜之上，進(jìn)行離心，最下層即得； 3)將磺酸基陽離子交換鍵合硅膠懸濁液緩慢加入步驟2)所得最下層之上，進(jìn)行離心，中間層即得； 4)將反相硅膠懸濁液緩慢加入步驟3)所得中間層之上，進(jìn)行離心，微量多肽化學(xué)衍生體系即得； 其中，各離心步驟的離心機(jī)轉(zhuǎn)速為1000 X g，離心時間為5min。
7.一種應(yīng)用權(quán)利要求1所述微量多肽化學(xué)衍生體系進(jìn)行多肽正電荷衍生的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: I)衍生體系的平衡；2)樣品與正電荷衍生試劑的載入；3)正電荷衍生反應(yīng)；4)副產(chǎn)物的洗脫；5)衍生多肽的脫鹽；6)衍生多肽的洗脫。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的多肽正電荷衍生方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: 1)使用45%乙腈100μ L進(jìn)行系統(tǒng)的清洗，使用0.1 %三氟乙酸溶液100 μ L進(jìn)行系統(tǒng)的平衡； 2)將多肽樣品與TMPP-Ac-OSu衍生試劑以質(zhì)量比1:2溶解于含5%乙腈與0.1%三氟乙酸的溶液100 μ L,載入微量反應(yīng)體系最上層； 3)載入ρΗ8.2、濃度為20mmol/L的碳酸氫鈉緩沖液100 μ L，引發(fā)衍生反應(yīng)；室溫下孵育2小時后,使用0.1 %三氟乙酸溶液100 μ L進(jìn)行清洗,終止衍生反應(yīng)； 4)使用ρΗ3.0、含有5mmol/L磷酸二氫鉀和45%乙腈的緩沖液AlOO μ L進(jìn)行洗脫，將衍生多肽產(chǎn)物從最上層洗脫下來并結(jié)合到中間層，同時將以TMPP-Ac-OH為主的衍生反應(yīng)副產(chǎn)物除去；使用ΡΗ3.0、含有5mmol/L磷酸二氫鉀、500mmol/L氯化鉀和45%乙腈的緩沖液BlOO μ L進(jìn)行洗脫，將衍生多肽產(chǎn)物從中間層洗脫下來并結(jié)合到最下層； 5)使用0.1 %三氟乙酸溶液100 μ L進(jìn)行洗脫，去除衍生反應(yīng)中的鹽雜質(zhì)； 6)使用45%乙腈100μ L進(jìn)行洗脫，衍生多肽樣品即得。
9.權(quán)利要求1所述微量多肽化學(xué)衍生體系在多肽從頭測序中的應(yīng)用，其特征在于，將由所述體系進(jìn)行化學(xué)衍生得到的衍生多肽用于質(zhì)譜分析。
【文檔編號】G01N30/06GK103983716SQ201410184193
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月4日
【發(fā)明者】紀(jì)建國, 王青松, 安明瑞 申請人:北京大學(xué)