一種中藥材多指標(biāo)成分含量的快速測(cè)定方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種中藥材多指標(biāo)成分含量的快速測(cè)定方法，所述中藥材主要包括水蛭和地龍藥材。是利用偏最小二乘回歸方法建立水蛭或地龍藥材的光譜與其多指標(biāo)成分（水分、可溶性固形物、次黃嘌呤、總糖、多糖、游離氨基酸和多肽）化學(xué)值之間的近紅外定量分析模型，實(shí)現(xiàn)水蛭和地龍藥材關(guān)鍵質(zhì)控指標(biāo)的快速測(cè)定。與游離氨基酸、多肽、糖類的傳統(tǒng)測(cè)定方法相比，所建立的方法簡便、快速、準(zhǔn)確。本發(fā)明有利于提高水蛭和地龍藥材的質(zhì)量控制水平，從而確保其成品質(zhì)量的有效與均一。
【專利說明】一種中藥材多指標(biāo)成分含量的快速測(cè)定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于中藥質(zhì)量控制【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種以近紅外光譜快速測(cè)定中藥多指標(biāo)成分含量的快速測(cè)定方法，尤其涉及一種水蛭或地龍藥材多指標(biāo)成分含量的快速測(cè)定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]水蛭是一味傳統(tǒng)中藥，有效成分包括氨基酸、多肽、次黃嘌呤、黃嘌呤、總磷脂、多糖、生物活性物質(zhì)等。近年來，發(fā)現(xiàn)其對(duì)心腦血管疾病具有很好的治療作用，臨床上用于腦血栓、冠狀動(dòng)脈粥硬化性心臟病及腦水腫的治療。
[0003]地龍具有悠久的藥用歷史，富含多種氨基酸、核酸成分，具有抗血栓、抗癌、增強(qiáng)免疫、抗?jié)?、保肝等作用。近幾十年?duì)地龍的化學(xué)成分和藥理作用研究，臨床用于咳喘、頭痛目赤、咽喉腫痛、小便不通、風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、半身不遂等癥。
[0004]水蛭和地龍藥材是我國常用藥材之一，因來源復(fù)雜，成分含量差異很大。過去藥材的傳統(tǒng)投料方式直接影響其成品質(zhì)量的均一性，甚至導(dǎo)致成品批次間的較大差異，本發(fā)明能夠科學(xué)準(zhǔn)確控制藥材的投料量。
[0005]近紅外光譜分析技術(shù)，近年來隨化學(xué)計(jì)量學(xué)而迅速發(fā)展，已經(jīng)越來越多被應(yīng)用于中藥研究，包括藥材產(chǎn)地鑒別、有效組分含量測(cè)定和制藥過程的在線檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了快速測(cè)定藥材的有效成分，杜絕盲目投料，科學(xué)控制投料量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種中藥材多指標(biāo)成分含量的快速測(cè)定方法，是一種基于近紅外光譜快速測(cè)定水蛭和地龍藥材多指標(biāo)成分含量的快速測(cè)定方法，可實(shí)現(xiàn)快速評(píng)價(jià)水蛭和地龍藥材綜合質(zhì)量。所述中藥材包括水蛭和地龍藥材。
[0007]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
(O采集水蛭或地龍藥材的近紅外光譜:將不同產(chǎn)地、不同采收季節(jié)的水蛭或地龍藥材，置恒溫烘箱中除去表面水分，打粉過篩并取適量水蛭或地龍藥材粉末置近紅外光譜儀的旋轉(zhuǎn)杯中，平鋪I cm厚度的藥材粉末，保持粉末表面平整，使用近紅外積分球漫反射采集光譜，以空氣為參比，掃描次數(shù)為32，分辨率為8 cnT1，吸光度數(shù)據(jù)格式為:logl/R，光譜掃描范圍為4000?10000 cnT1，將得到的光譜數(shù)據(jù)分為校正集和驗(yàn)證集兩類。
[0008](2)測(cè)定水蛭或地龍藥材的多指標(biāo)成分含量:水蛭或地龍藥材的多指標(biāo)成分相同，都包括水分、可溶性固形物、次黃嘌呤、總糖和多糖及游離氨基酸和多肽。采用烘干法測(cè)定水分和可溶性固形物，間接碘量法(碘液-硫代硫酸鈉滴定法)測(cè)定總糖和多糖，高效液相色譜法測(cè)定次黃嘌呤、游離氨基酸和多肽。
[0009](a)水分含量的測(cè)定:采用《中國藥典》一烘干法測(cè)得水蛭或地龍藥材的水分含量，采集水蛭或地龍藥材的近紅外光譜后，取適量水蛭或地龍藥材粉末于105°C的恒溫干燥箱中5 h，在干燥器中冷卻20?30 min后稱量，再在105°C下干燥I h，冷卻，稱重，至連續(xù)兩次稱重的差異不超過5 mg,根據(jù)減失的重量，計(jì)算樣品的水分含量。
[0010](b)可溶性固形物含量的測(cè)定:采用烘干法測(cè)定水蛭或地龍藥材的可溶性固形物含量；精密移取0.1 g/mL的水蛭或地龍藥材浸提液4 mL至已烘干至恒重的扁形瓶(Xtl),稱重(X1)，置105°C烘箱中，每隔一個(gè)小時(shí)稱重，直至連續(xù)兩次稱重重量差距小于5 mg，最終重量計(jì)X2，可溶性固形物(％)= (X2 - X0) / (X1 - X。)X 100%，計(jì)算樣品的可溶性固形物含量。
[0011](C)次黃嘌呤含量的測(cè)定:采用HPLC測(cè)定水蛭或地龍藥材的次黃嘌呤含量；取適量0.1 g/mL的水蛭或地龍藥材浸提液過濾膜，取濾液進(jìn)樣10 μ I，按如下HPLC色譜條件用高效液相色譜法測(cè)定峰面積，用外標(biāo)法計(jì)算樣品的次黃嘌呤含量；
次黃嘌呤HPLC色譜條件:色譜柱Eclipse XDB-C18柱(4.6 mmX250 mm, 5 μ m);流動(dòng)相A:0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液；流動(dòng)相B:50%甲醇；梯度洗脫步驟:0?5 min為100%A相，5?10 min為100%?99%A相，10?50 min為99%?0%A相，后運(yùn)行10 min ;檢測(cè)波長254 nm ;進(jìn)樣量10 μ I ;柱溫25 V ;流速I mL/min。
[0012](d)總糖和多糖含量的測(cè)定:采用間接碘量法的碘液-硫代硫酸鈉滴定法測(cè)定水蛭或地龍藥材的總糖和單糖，依據(jù)硫代硫酸鈉的消耗量，先計(jì)算碘液的消耗量，再計(jì)算樣品的總糖和單糖，多糖含量通過總糖含量減去單糖含量得到。
[0013](e)游離氨基酸和多肽含量的測(cè)定:采用HPLC柱前衍生方法測(cè)定水蛭或地龍藥材的游離氨基酸和總氨基酸含量，多肽含量通過總氨基酸含量減去游離氨基酸含量得到。
[0014]游離氨基酸衍生前供試品溶液的制備:精密稱取水蛭或地龍藥材粉末一定量，用新制的0.9%氯化鈉溶液浸提，得0.1 g/mL浸提液，過濾膜備用。
[0015]總氨基酸衍生前供試品溶液的制備:將藥材粉末浸提液、含1%苯酚的6 mol/L鹽酸和40%氫氧化鈉按體積比為1:4:2.4混合；具體:精密移取藥材浸提液和含1%苯酚的6mol/L鹽酸到水解管，混合，充氮?dú)馊コ鯕猓杆倜芊?，?10°C恒溫干燥器內(nèi)22小時(shí)，精密加入一定體積的40%氫氧化鈉,渦旋混勻,過膜待用。
[0016]流動(dòng)相A液的配制:配制0.01 mol/L三水合醋酸鈉溶液I L，精密加入三乙胺180μ I，攪拌混勻，滴加2%冰醋酸，調(diào)pH = 7.20，加四氫呋喃3 mL,混勻。
[0017]流動(dòng)相B液的配制:配制0.05 mol/L三水合醋酸鈉溶液400 mL,滴加2%冰醋酸，調(diào)pH = 7.20，與乙腈-甲醇(V: v=l:1)的混合液混勻，得三水合乙酸鈉-乙腈-甲醇(v: V: v=l:2:2)體系。
[0018]硼酸緩沖液:0.2 mol/L硼酸鈉溶液用10%氫氧化鈉溶液調(diào)pH = 10.4。
[0019]衍生試劑:①鄰苯二甲醛(OPA)衍生試劑:配制含0.1%3-巰基丙酸(3-MPA)的4g/L鄰苯二甲醛100 mL，避光并4°C下保存芴甲氧羰酰氯(FM0C-C1)衍生試劑:配制Ig/L的芴甲氧羰酰氯50 mL ;避光并4°C下保存。
[0020]進(jìn)樣前的衍生操作:首先分別精密移取混合氨基酸對(duì)照品溶液和四硼酸氫鈉0.1 mL和0.5 mL，混勻，再移取0.1 mL OPA衍生試劑，混勻靜置一分鐘，然后移取0.1 mLFM0C-C1衍生試劑，同樣混勻靜置一分鐘，進(jìn)樣。
[0021]采用HPLC測(cè)定水蛭或地龍藥材的游離氨基酸和多肽含量，色譜條件:色譜柱Eclipse XDB-C18 柱(4.6 mmX 250 mm, 5 μ m);流速 1.0 mL/min ;進(jìn)樣量 10 μ I ;柱溫 30°C ;檢測(cè)波長:0 ?46 min 為 338 nm, 46 ?54.5 min 為 262 nm, 54.5 ?60 min 為 338 nm,梯度洗脫步驟:0?4 min為97%A相，4?10 min為97%?92%A相，10?24 min為92%?70%A 相，24 ?30 min 為 70%A 相，30 ?45 min 為 70% ?40%A 相，45 ?55 min 為 40% ?0%A相，55?60 min為0%?97%A相，后運(yùn)行10 min。
[0022]按上述的色譜條件用高效液相色譜法測(cè)定峰面積，通過外標(biāo)法計(jì)算樣品的游離氨基酸和總氨基酸含量，多肽含量通過總氨基酸含量減去游離氨基酸含量得到。
[0023](3)建立多指標(biāo)成分的定量分析模型:將步驟(2)所得的水分含量、可溶性固形物含量、次黃嘌呤含量、總糖和多糖含量以及游離氨基酸和多肽含量分別與步驟(I)的近紅外光譜數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)，對(duì)于每個(gè)指標(biāo)成分，都對(duì)光譜進(jìn)行不同的預(yù)處理并采用不同建模波段，運(yùn)用偏最小二乘回歸方法建立每個(gè)指標(biāo)成分的多個(gè)定量分析模型。
[0024](4)確定多指標(biāo)成分的最佳定量分析模型:最佳定量分析模型通過模型參數(shù)確定。模型參數(shù)包括相關(guān)系數(shù)R、驗(yàn)證誤差均方根(RMSEP)、校正誤差均方根(RMSEC)、驗(yàn)證集相對(duì)預(yù)測(cè)誤差(RSEP)。若R越接近1，RMSEC與RMSEP越接近，則模型的預(yù)測(cè)值與標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)值之間的相關(guān)性好，RMSEC, RMSEP, RSEP值越小，則模型的預(yù)測(cè)精度越高。通過模型參數(shù)來評(píng)價(jià)步驟(3)所建立的每個(gè)指標(biāo)的多個(gè)定量分析模型的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，選擇模型參數(shù)最佳的近紅外定量分析模型檢測(cè)未知的水蛭或地龍藥材的多指標(biāo)含量。
[0025]本發(fā)明利用偏最小二乘回歸方法建立水蛭或地龍藥材的近紅外光譜與其多指標(biāo)成分(水分、可溶性固形物、次黃嘌呤、總糖、多糖、游離氨基酸和多肽)化學(xué)值之間的定量分析模型，實(shí)現(xiàn)水蛭和地龍藥材關(guān)鍵質(zhì)控指標(biāo)的快速測(cè)定。傳統(tǒng)分析方法雖然較精確，但往往繁瑣耗時(shí)，比如氨基酸含量測(cè)定多數(shù)采用HPLC法、毛細(xì)管電泳法等，以及糖含量測(cè)定一般是采用滴定法、分光光度法等。與之相比，近紅外光譜測(cè)定氨基酸和糖含量具有明顯的無損快速優(yōu)勢(shì)，能夠?qū)崿F(xiàn)同時(shí)測(cè)定多種指標(biāo)成分含量，而且有助于達(dá)到實(shí)時(shí)在線監(jiān)測(cè)。本發(fā)明有利于提高水蛭和地龍藥材的質(zhì)量控制水平，從而確保其成品質(zhì)量的有效、均一。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]附圖1是水蛭藥材水分含量實(shí)測(cè)值與近紅外預(yù)測(cè)值的相關(guān)圖。
[0027]附圖2是水蛭藥材驗(yàn)證集的水分含量實(shí)測(cè)值與近紅外預(yù)測(cè)值的趨勢(shì)對(duì)照?qǐng)D。
[0028]附圖3是水蛭藥材可溶性固形物含量實(shí)測(cè)值與近紅外預(yù)測(cè)值的相關(guān)圖。
[0029]附圖4是水蛭藥材驗(yàn)證集的可溶性固形物含量實(shí)測(cè)值與近紅外預(yù)測(cè)值的趨勢(shì)對(duì)照?qǐng)D。
[0030]附圖5是水蛭藥材次黃嘌呤含量實(shí)測(cè)值與近紅外預(yù)測(cè)值的相關(guān)圖。
[0031]附圖6是水蛭藥材驗(yàn)證集的次黃嘌呤含量實(shí)測(cè)值與近紅外預(yù)測(cè)值的趨勢(shì)對(duì)照?qǐng)D。
[0032]附圖7是水蛭藥材總糖含量實(shí)測(cè)值與近紅外預(yù)測(cè)值的相關(guān)圖。
[0033]附圖8是水蛭藥材驗(yàn)證集的總糖含量實(shí)測(cè)值與近紅外預(yù)測(cè)值的趨勢(shì)對(duì)照?qǐng)D。
[0034]附圖9是水蛭藥材多糖含量實(shí)測(cè)值與近紅外預(yù)測(cè)值的相關(guān)圖。
[0035]附圖10是水蛭藥材驗(yàn)證集的多糖含量實(shí)測(cè)值與近紅外預(yù)測(cè)值的趨勢(shì)對(duì)照?qǐng)D。
[0036]附圖11是水蛭藥材游離氨基酸含量實(shí)測(cè)值與近紅外預(yù)測(cè)值的相關(guān)圖。
[0037]附圖12是水蛭藥材驗(yàn)證集的游離氨基酸含量實(shí)測(cè)值與近紅外預(yù)測(cè)值的趨勢(shì)對(duì)照?qǐng)D。
[0038]附圖13是水蛭藥材多肽含量實(shí)測(cè)值與近紅外預(yù)測(cè)值的相關(guān)圖。
[0039]附圖14是水蛭藥材驗(yàn)證集的多肽含量實(shí)測(cè)值與近紅外預(yù)測(cè)值的趨勢(shì)對(duì)照?qǐng)D。[0040]附圖15是地龍藥材水分含量實(shí)測(cè)值與近紅外預(yù)測(cè)值的相關(guān)圖。
[0041]附圖16是地龍藥材驗(yàn)證集的水分含量實(shí)測(cè)值與近紅外預(yù)測(cè)值的趨勢(shì)對(duì)照?qǐng)D。
[0042]附圖17是地龍藥材可溶性固形物含量實(shí)測(cè)值與近紅外預(yù)測(cè)值的相關(guān)圖。
[0043]附圖18是地龍藥材驗(yàn)證集的可溶性固形物含量實(shí)測(cè)值與近紅外預(yù)測(cè)值的趨勢(shì)對(duì)照?qǐng)D。
[0044]附圖19是地龍藥材次黃嘌呤含量實(shí)測(cè)值與近紅外預(yù)測(cè)值的相關(guān)圖。
[0045]附圖20是地龍藥材驗(yàn)證集的次黃嘌呤含量實(shí)測(cè)值與近紅外預(yù)測(cè)值的趨勢(shì)對(duì)照?qǐng)D。
[0046]附圖21是地龍藥材總糖含量實(shí)測(cè)值與近紅外預(yù)測(cè)值的相關(guān)圖。
[0047]附圖22是地龍藥材驗(yàn)證集的總糖含量實(shí)測(cè)值與近紅外預(yù)測(cè)值的趨勢(shì)對(duì)照?qǐng)D。
[0048]附圖23是地龍藥材多糖含量實(shí)測(cè)值與近紅外預(yù)測(cè)值的相關(guān)圖。
[0049]附圖24是地龍藥材驗(yàn)證集的多糖含量實(shí)測(cè)值與近紅外預(yù)測(cè)值的趨勢(shì)對(duì)照?qǐng)D。
[0050]附圖25是地龍藥材游離氨基酸含量實(shí)測(cè)值與近紅外預(yù)測(cè)值的相關(guān)圖。
[0051]附圖26是地龍藥材驗(yàn)證集的游離氨基酸含量實(shí)測(cè)值與近紅外預(yù)測(cè)值的趨勢(shì)對(duì)照?qǐng)D。
[0052]附圖27是地龍藥材多肽含量實(shí)測(cè)值與近紅外預(yù)測(cè)值的相關(guān)圖。
[0053]附圖28是地龍藥材驗(yàn)證集的多肽含量實(shí)測(cè)值與近紅外預(yù)測(cè)值的趨勢(shì)對(duì)照?qǐng)D。
[0054]實(shí)施例1水蛭藥材多指標(biāo)成分含量快速測(cè)定 (I)水蛭藥材的近紅外漫反射光譜的采集
收集不同產(chǎn)地、不同采收季節(jié)的水蛭藥材有6份樣品，每份按“頭、尾、身”分為3份，每份“身”再分成5份，共有水蛭樣品42個(gè)。
[0055]將42份水蛭藥材過80目篩，放入旋轉(zhuǎn)杯中，平鋪I cm厚度的藥材粉末，使用近紅外積分球漫反射采集光譜，以空氣為參比，掃描次數(shù)為32，分辨率為8 cm—1，吸光度數(shù)據(jù)格式為:logl/R，光譜掃描范圍為4000?10000 cm—1，得光譜數(shù)據(jù)。
[0056](2)測(cè)定水蛭藥材的多指標(biāo)成分含量
(a)水分含量的測(cè)定:采用《中國藥典》——烘干法測(cè)得水蛭藥材的水分含量。取近紅外光譜采集后的水蛭藥材粉末置于105°C的恒溫干燥箱中5 h，在干燥器中冷卻至室溫后稱量，再在105°C下干燥I h，冷卻，稱重，至連續(xù)兩次稱重的差異不超過5 mg，根據(jù)減失的重量，計(jì)算水蛭樣品的含水量。
[0057](b)可溶性固形物含量的測(cè)定:在近紅外光譜采集后，精密稱取0.5 g水蛭藥材粉末，精密移取現(xiàn)配的0.9%氯化鈉5 mL浸提24 h，離心，精密移取浸提液4 mL至已烘干至恒重的扁形瓶(Xtl),稱重(X1)，置105°C烘箱中，每隔一個(gè)小時(shí)稱重，直至連續(xù)兩次稱重重量差距小于5 mg，最終重量計(jì)X2，可溶性固形物(％) = (X2 - X0) / (X1 - X0) X 100%。
[0058](c)次黃嘌呤含量的測(cè)定:采用HPLC法測(cè)定水蛭藥材的次黃嘌呤含量。
[0059]對(duì)照品溶液的制備:精密稱取次黃嘌呤對(duì)照品0.0101 g，置100 mL容量瓶中，加流動(dòng)相A溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。
[0060]供試品溶液的制備:精密稱取水蛭藥材粉末0.5 g于10 mL試管中用5 mL移液管移取5 mL新制的0.9%生理鹽水，封口膜密封，放置24 h，以3000 r/min離心10 min，取上清液過0.45 μπι濾膜備用。取濾液進(jìn)樣10 μ I，按如下色譜條件，用高效液相色譜法測(cè)定峰面積，通過外標(biāo)法計(jì)算樣品中次黃嘌呤的含量。
[0061]采用HPLC測(cè)定水蛭藥材的次黃嘌呤含量，色譜條件:色譜柱Eclipse XDB-C18柱(4.6 mmX250 mm, 5 μ m);流動(dòng)相A:0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液；流動(dòng)相B:50%甲醇；梯度洗脫步驟:0?5 min為100%A相，5?10 min為100%?99%A相，10?50 min為99%?0%A相，后運(yùn)行10 min ;檢測(cè)波長254 nm ;進(jìn)樣量10 μ I ;柱溫25 V ;流速I mL/min。
[0062](d)總糖和多糖含量的測(cè)定:采用間接碘量法的碘液-硫代硫酸鈉滴定法測(cè)定水蛭藥材的總糖和多肽含量。間接碘量法的碘液-硫代硫酸鈉滴定法測(cè)定水蛭藥材的總糖和單糖含量，依據(jù)硫代硫酸鈉消耗量，先計(jì)算碘液的消耗量，再計(jì)算水蛭藥材的總糖和單糖含量，然后通過總糖含量減去單糖含量計(jì)算多糖含量，最后將總糖含量和多糖含量分別與近紅外光譜數(shù)據(jù)相結(jié)合，用偏最小二乘回歸方法建立定量分析模型。
[0063]自制試劑:0.1 mol/L硫代硫酸鈉溶液，10%稀鹽酸，10%稀硫酸，0.5%酚酞指示劑，0.5%淀粉指示劑，0.1 mol/L碘液。硫代硫酸鈉溶液和碘液標(biāo)定結(jié)果:硫代硫酸鈉溶液濃度為 0.010408 mol/L ;碘液濃度為 0.009373 mol/L。
[0064]取每個(gè)樣品提取液0.2 mL兩份，一份作為總糖含量測(cè)定的樣品備用，另一份作為單糖含量測(cè)定的樣品備用；每個(gè)用于總糖含量測(cè)定的樣品都先經(jīng)酸水解45 min后，再堿調(diào)到中性，然后同單糖含量測(cè)定一致操作。單糖含量通過碘液-硫代硫酸鈉滴定法測(cè)定。
[0065](e)游離氨基酸和多肽含量的測(cè)定
混合氣基酸對(duì)照品溶液的制備:精密稱取一定量的氣基酸標(biāo)準(zhǔn)品置于100 mL掠色容量瓶中，用0.1 mol/L氯化氫溶解并定容至刻度線。
[0066]游離氨基酸衍生前供試品溶液的制備:每個(gè)樣品經(jīng)近紅外光譜掃描后精密稱取0.3 g，再精密移取3 mL剛配制的0.9%氯化鈉溶液，震搖一分鐘，靜置提取24 h后離心，取上清液濾膜待用。
[0067]總氨基酸衍生前供試品溶液的制備:精密移取上述上清液0.5 mL和1%苯酚的6mol/L鹽酸2 mL到水解管，混合，充氮?dú)庖环昼?，迅速密封，?10°C恒溫干燥器內(nèi)22小時(shí)，取出，放冷，精密加入40%氫氧化鈉1.2 mL,渦旋混勻，過膜待用。
[0068]流動(dòng)相A液的配制:精密稱取1.36 g三水合醋酸鈉溶解于I L水中，攪拌精密加入三乙胺180 μ I，混勻，滴加2%冰醋酸，調(diào)pH = 7.20，加四氫呋喃3 mL，混勻。
[0069]流動(dòng)相B液的配制:精密稱取2.72 g三水合醋酸鈉溶解于400 mL水中，攪拌，滴加2%冰醋酸，調(diào)pH= 7.20，過膜量取200 mL加至乙腈-甲醇(v: v=l:1)的混合液800 mL,混勻；
硼酸緩沖液:0.2 mol/L硼酸鈉溶液用10%氫氧化鈉溶液調(diào)pH = 10.4。
[0070]衍生試劑:①OPA衍生試劑:精密稱取0.4 g鄰苯二甲醛置100 mL棕色容量瓶，精密加入400 μ I的3-ΜΡΑ用少量乙腈溶解后定容，搖勻，避光并4°C下保存。②FM0C-C1衍生試劑:精密稱量0.05 g FM0C-C1置50 mL棕色容量瓶中加乙腈溶解并定容；避光并4°C下保存。
[0071]進(jìn)樣前的衍生操作:首先分別精密移取混合氨基酸對(duì)照品溶液和四硼酸氫鈉0.1 mL和0.5 mL，混勻，再移取0.1 mL OPA衍生試劑，混勻靜置一分鐘，然后移取0.1 mLFM0C-C1衍生試劑，同樣混勻靜置一分鐘,最后進(jìn)樣10 μ ι。
[0072]采用HPLC測(cè)定水蛭藥材的游離氨基酸和總氨基酸含量，色譜條件:色譜柱Eclipse XDB-C18 柱(4.6 mmX250 mm, 5 μ m);流速 1.0 mL/min ;進(jìn)樣量 10 μ I ;柱溫 30°C ;檢測(cè)波長:0 ?46 min 為 338 nm, 46 ?54.5 min 為 262 nm, 54.5 ?60 min 為 338 nm,梯度洗脫步驟:0?4 min為97%A相，4-10 min為97%?92%A相，10?24 min為92%?70%A 相，24 ?30 min 為 70%A 相，30 ?45 min 為 70% ?40%A 相，45 ?55 min 為 40% ?0%A相，55?60 min為0%?97%A相，后運(yùn)行10 min。
[0073]按上述的色譜條件用高效液相色譜法測(cè)定峰面積，用外標(biāo)法計(jì)算水蛭藥材的游離氨基酸和總氨基酸含量，多肽含量通過總氨基酸含量減去游離氨基酸含量得到。
[0074](3)建立水蛭藥材多指標(biāo)成分的定量分析模型
將所得的水分含量、可溶性固形物含量、次黃嘌呤含量、總糖和多糖含量以及游離氨基酸和多肽含量分別與近紅外光譜數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)，對(duì)于每個(gè)指標(biāo)成分，都對(duì)光譜進(jìn)行不同的預(yù)處理并采用不同建模波段，運(yùn)用偏最小二乘回歸方法建立每個(gè)指標(biāo)成分的多個(gè)定量分析模型。
[0075](4)確定水蛭藥材的多指標(biāo)成分的最佳定量分析模型
最佳定量分析模型通過模型評(píng)價(jià)參數(shù)確定。模型評(píng)價(jià)參數(shù)包括相關(guān)系數(shù)R、驗(yàn)證誤差均方根(RMSEP)、校正誤差均方根(RMSEC)、驗(yàn)證集相對(duì)預(yù)測(cè)誤差(RSEP)。若R越接近1，RMSEC與RMSEP越接近，則模型的預(yù)測(cè)值與標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)值之間的相關(guān)性好，RMSEC, RMSEP, RSEP值越小，則模型的預(yù)測(cè)精度越高。
[0076](a)水蛭藥材水分含量的最佳定量分析模型
水蛭藥材水分含量的最佳定量分析模型見附圖1和附圖2。采用一階導(dǎo)數(shù)和Savitzky-Golay filter 處理，R 為 0.8704，建模波段為 4987.01 ?4794.17 cnT1，因子數(shù)3，RMSEC 為 0.15，RMSEP 為 0.13，RSEP 為 0.34%。
[0077](b)水蛭藥材可溶性固形物含量的最佳定量分析模型
水蛭藥材可溶性固形物含量的最佳定量分析模型見附圖3和附圖4。采用原始光譜和 Savitzky-Golay filter 處理，R 為 0.9866，建模波段為 5415.13 ?5391.99 cnT1 和7119.90 ?5997.53 cnT1，因子數(shù) 5，RMSEC % 0.60, RMSEP % 0.75, RSEP 為 0.24%。
[0078](c)水蛭藥材次黃嘌呤含量的最佳定量分析模型
水蛭藥材次黃嘌呤含量的最佳定量分析模型見附圖5和附圖6采用一階導(dǎo)數(shù)和Norris derivative filter 處理，R 為 0.9164,建模波段為 4489.47 ?4346.76 cm 1 和5928.11 ?5804.68 cnT1，因子數(shù) 4，RMSEC 為 0.12，RMSEP 為 0.10，RSEP 為 0.46%。
[0079](d)水蛭藥材總糖和多糖含量的最佳定量分析模型
水蛭藥材總糖的最佳定量分析模型見附圖7和附圖8，采用原始光譜無光滑處理，R為0.8577，建模波段為 7131.47 ?5098.87 cnT1，因子數(shù) 10，RMSEC 為 1.99，RMSEP 為 3.14，RSEP為2.60% ;水蛭藥材多糖的最佳定量分析模型見附圖9和附圖10，采用原始光譜無光滑處理，R 為 0.7376，建模波段為 7370.60 ?5445.99 cnT1，因子數(shù) 7，RMSEC 為 2.24，RMSEP% 2.33, RSEP 為 26.91%。
[0080](e)水蛭藥材游離氨基酸和多肽含量的最佳定量分析模型
水蛭藥材游離氨基酸的最佳定量分析模型見附圖11和附圖12，采用一階導(dǎo)數(shù)和Savitzky-Golay filter 處理，R 為 0.7557，建模波段為 9885.32 ?9083.00 cnT1，因子數(shù)6，RMSEC為1.90，RMSEP為2.33，RSEP為2.36%。水蛭藥材多肽的最佳定量分析模型見附圖13和附圖14，采用一階導(dǎo)數(shù)和Savitzky-Golay filter處理，R為0.7222，建模波段為9999.00 ?9300.00 cnT1 和 7400.00 ?7300.00 cnT1，因子數(shù) 5，RMSEC 為 4.72，RMSEP 為
4.55，RSEP 為 7.87%。
[0081]實(shí)施例2地龍藥材多指標(biāo)成分含量快速測(cè)定
(I)地龍藥材的近紅外漫反射光譜的采集
收集不同產(chǎn)地、不同采收季節(jié)的地龍藥材有7份樣品，每份按“頭、尾、身”分為3份，每份“身”再分成5份，共有地龍樣品49個(gè)。
[0082]將49份地龍藥材過80目篩，放入旋轉(zhuǎn)杯中，平鋪I cm厚度的藥材粉末，使用近紅外積分球漫反射采集光譜，以空氣為參比，掃描次數(shù)為32，分辨率為8 cm—1，吸光度數(shù)據(jù)格式為:logl/R，光譜掃描范圍為4000?10000 cm—1，得光譜數(shù)據(jù)。
[0083](2)測(cè)定地龍藥材的多指標(biāo)成分含量
(a)水分含量的測(cè)定:采用《中國藥典》——烘干法測(cè)得地龍藥材的水分含量。取近紅外光譜采集后的地龍藥材粉末置于105°C的恒溫干燥箱中5 h，在干燥器中冷卻至室溫后稱量，再在105°C下干燥I h，冷卻，稱重，至連續(xù)兩次稱重的差異不超過5 mg，根據(jù)減失的重量，計(jì)算地龍樣品的含水量。
[0084](b)可溶性固形物含量的測(cè)定:在近紅外光譜采集后，精密稱取0.5 g藥材粉末，精密移取現(xiàn)配的0.9%氯化鈉5 mL浸提24 h，離心，精密移取浸提液4 mL至已烘干至恒重的扁形瓶(Xtl),稱重(X1)，置105°C烘箱中，每隔一個(gè)小時(shí)稱重，直至連續(xù)兩次稱重重量差距小于5 mg，最終重量計(jì)X2，可溶性固形物(％) = (X2 - X0) / (X1 - X0) X 100%。
[0085](C)次黃嘌呤含量的測(cè)定
對(duì)照品溶液的制備:精密稱取次黃嘌呤對(duì)照品0.0101 g，置100 mL容量瓶中，加流動(dòng)相A溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。
[0086]供試品溶液的制備:精密稱取地龍藥材0.5 g于10 mL試管中(各平行5份)用5mL移液管移取5 mL新制的0.9%生理鹽水，封口膜密封，放置24 h，以3000 r/min離心10min,取上清液過0.45 μ m濾膜，進(jìn)樣10 μ 1，按色譜條件用高效液相色譜法測(cè)定峰面積，用外標(biāo)法計(jì)算樣品中次黃嘌呤的含量。
[0087]采用HPLC測(cè)定地龍藥材的次黃嘌呤含量，色譜條件:色譜柱Eclipse XDB-C18柱(4.6 mmX250 mm, 5 μ m);流動(dòng)相A:0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液；流動(dòng)相B:50%甲醇；梯度洗脫步驟:0?5 min為100%A相，5?10 min為100%?99%A相，10?50 min為99%?0%A相，后運(yùn)行10 min ;檢測(cè)波長254 nm ;進(jìn)樣量10 μ I ;柱溫25 V ;流速I mL/min。
[0088](d)總糖和多糖含量的測(cè)定:采用間接碘量法的碘液-硫代硫酸鈉滴定法測(cè)定水蛭藥材的總糖和多肽含量。間接碘量法的碘液-硫代硫酸鈉滴定法測(cè)定地龍藥材的總糖和單糖含量，依據(jù)硫代硫酸鈉消耗量，先計(jì)算碘液的消耗量，再計(jì)算地龍藥材的總糖和單糖含量，然后將總糖含量減去單糖含量計(jì)算多糖含量，最后將總糖含量和多糖含量分別與近紅外光譜數(shù)據(jù)相結(jié)合，用偏最小二乘回歸方法建立定量分析模型。
[0089]自制試劑:0.1 mol/L硫代硫酸鈉溶液，10%稀鹽酸，10%稀硫酸，0.5%酚酞指示劑，0.5%淀粉指示劑，0.1 mol/L碘液。硫代硫酸鈉溶液和碘液標(biāo)定結(jié)果:硫代硫酸鈉溶液濃度為 0.010408 mol/L ;碘液濃度為 0.009373 mol/L。
[0090]取每個(gè)樣品提取液0.2 mL兩份，一份作為樣品總糖含量測(cè)定備用，另一份作為樣品單糖含量測(cè)定備用；每個(gè)用于測(cè)定總糖含量到的樣品都先經(jīng)酸水解45 min后，再堿調(diào)到中性，然后同單糖含量測(cè)定一致操作。單糖含量通過碘液-硫代硫酸鈉滴定法測(cè)定。
[0091](e)游離氨基酸和多肽含量的測(cè)定
混合氣基酸對(duì)照品溶液的制備:精密稱取一定量的氣基酸標(biāo)準(zhǔn)品置于100 mL掠色容量瓶中，用0.1 mol/L氯化氫溶解并定容至刻度線。
[0092]游離氨基酸衍生前供試品溶液的制備:每個(gè)樣品經(jīng)近紅外光譜掃描后精密稱取0.3 g，再精密移取3 mL剛配制的0.9%氯化鈉溶液，震搖一分鐘，靜置提取24 h后離心，取上清液濾膜待用。
[0093]總氨基酸衍生前供試品溶液的制備:精密移取上述上清液0.5 mL和1%苯酚的6mol/L鹽酸2 mL到水解管，混合，充氮?dú)庖环昼?，迅速密封，?10°C恒溫干燥器內(nèi)22小時(shí)，取出，放冷，精密加入40%氫氧化鈉1.2 mL,渦旋混勻，過膜待用。
[0094]流動(dòng)相A液的配制:精密稱取1.36 g三水合醋酸鈉溶解于I L水中，攪拌精密加入三乙胺180 μ I，混勻，滴加2%冰醋酸，調(diào)pH = 7.20，加四氫呋喃3 mL，混勻。
[0095]流動(dòng)相B液的配制:精密稱取2.72 g三水合醋酸鈉溶解于400 mL水中，攪拌，滴加2%冰醋酸，調(diào)pH= 7.20，過膜量取200 mL加至乙腈-甲醇(v: v=l:1)的混合液800 mL,混勻；
硼酸緩沖液:0.2 mol/L硼酸鈉溶液用10%氫氧化鈉溶液調(diào)pH = 10.4。
[0096]衍生試劑:①OPA衍生試劑:精密稱取0.4 g鄰苯二甲醛置100 mL棕色容量瓶，精密加入400 μ I的3-ΜΡΑ用少量乙腈溶解后定容，搖勻，避光并4°C下保存。②FMOC-Cl衍生試劑:精密稱量0.05 g FMOC-Cl置50 mL棕色容量瓶中加乙腈溶解并定容；避光并4°C下保存。
[0097]進(jìn)樣前的衍生操作:首先分別精密移取混合氨基酸對(duì)照品溶液和四硼酸氫鈉
0.1 mL和0.5 mL，混勻，再移取0.1 mL OPA衍生試劑，混勻靜置一分鐘，然后移取0.1 mLFMOC-Cl衍生試劑，同樣混勻靜置一分鐘,最后進(jìn)樣10 μ ι。
[0098]采用HPLC測(cè)定地龍藥材的游離氨基酸和總氨基酸含量，色譜條件:色譜柱Eclipse XDB-C18 柱(4.6 mmX 250 mm, 5 μ m);流速 1.0 mL/min ;進(jìn)樣量 10 μ I ;柱溫 30°C ;檢測(cè)波長:0 ?46 min 為 338 nm, 46 ?54.5 min 為 262 nm, 54.5 ?60 min 為 338 nm,梯度洗脫步驟:0?4 min為97%A相，4-10 min為97%?92%A相，10?24 min為92%?70%A 相，24 ?30 min 為 70%A 相，30 ?45 min 為 70% ?40%A 相，45 ?55 min 為 40% ?0%A相，55?60 min為0%?97%A相，后運(yùn)行10 min。
[0099]按上述的色譜條件用高效液相色譜法測(cè)定峰面積，用外標(biāo)法計(jì)算地龍藥材的游離氨基酸和總氨基酸含量，多肽含量通過總氨基酸含量減去游離氨基酸含量得到。
[0100](3)建立地龍藥材的多指標(biāo)成分的定量分析模型
將烘干法測(cè)得的水分含量、烘干法測(cè)得的可溶性固形物含量、HPLC測(cè)定的次黃嘌呤含量、碘液-硫代硫酸鈉滴定法測(cè)定的總糖和多糖以及HPLC柱前衍生測(cè)定的游離氨基酸和多肽含量分別與地龍藥材的近紅外光譜數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)，對(duì)于每個(gè)指標(biāo)成分，都對(duì)光譜進(jìn)行不同的預(yù)處理并采用不同建模波段，運(yùn)用偏最小二乘回歸方法建立每個(gè)指標(biāo)成分的多個(gè)定量分析模型。
[0101](4)確定地龍藥材的多指標(biāo)成分的最佳定量分析模型 最佳定量分析模型通過模型評(píng)價(jià)參數(shù)確定。模型評(píng)價(jià)參數(shù)包括相關(guān)系數(shù)R、驗(yàn)證誤差均方根(RMSEP)、校正誤差均方根(RMSEC)、驗(yàn)證集相對(duì)預(yù)測(cè)誤差(RSEP)。若R越接近1，RMSEC與RMSEP越接近，則模型的預(yù)測(cè)值與標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)值之間的相關(guān)性好，RMSEC, RMSEP, RSEP值越小，則模型的預(yù)測(cè)精度越高。
[0102](a)地龍藥材水分含量的最佳定量分析模型
地龍藥材水分含量的最佳定量分析模型見附圖15和附圖16，采用原始光譜和Savitzky-Golay filter 處理，R 為 0.9372，建模波段為 7054.33 ?4582.04 cnT1，因子數(shù)6，RMSEC 為 0.16，RMSEP % 0.41, RSEP 為 2.17%。
[0103](b)地龍藥材可溶性固形物含量的最佳定量分析模型
地龍藥材可溶性固形物含量的最佳定量分析模型見附圖17和附圖18，采用一階導(dǎo)數(shù)和 Norris derivative filter 處理，R 為 0.9663，建模波段為 9900.75 ?7262.61 cnT1，因子數(shù) 5，RMSEC 為 0.64，RMSEP 為 0.90，RSEP 為 0.59%。
[0104](c)地龍藥材次黃嘌呤含量的最佳定量分析模型
地龍藥材次黃嘌呤含量的最佳定量分析模型見附圖19和附圖20，采用原始光譜和 Savitzky-Golay filter 處理，R 為 0.9296，建模波段為 4516.47 ?4273.48 cnT1 和7062.04 ?4574.32 cnT1，因子數(shù) 5，RMSEC 為 0.24，RMSEP 為 0.19，RSEP 為 5.52%。
[0105]Cd)地龍藥材總糖和多糖含量的最佳定量分析模型
地龍藥材總糖的最佳定量分析模型見附圖21和附圖22，采用原始光譜無光滑處理，R為 0.9557，建模波段為 4724.74 ?4192.49 cnT1，因子數(shù) 10，RMSEC 為 1.33, RMSEP % 1.36,RSEP為0.29% ;地龍藥材多糖的最佳定量分析模型見附圖23和附圖24，采用原始光譜無光滑處理，R 為 0.8321，建模波段為 4724.74 ?4192.49 cm—1，因子數(shù) 7，RMSEC 為 1.14, RMSEP為 1.39，RSEP 為 12.12%。
[0106](e)地龍藥材游離氨基酸和多肽含量的最佳定量分析模型
地龍藥材游離氨基酸的最佳定量分析模型見附圖25和附圖26，采用二階導(dǎo)數(shù)和Norris derivative filter 處理，R 為 0.7557，建模波段為 4277.34 ?4057.49 cnT1 和7400.00 ?7100.00 cnT1，因子數(shù) 9，RMSEC 為 3.37，RMSEP 為 2.60，RSEP 為 0.75% ;地龍藥材多肽的最佳定量分析模型見附圖27和附圖28,采用一階導(dǎo)數(shù)和Savitzky-Golay filter處理，R 為 0.8008，建模波段為 7500.00 ?7300.00 cnT1 和 5800.00 ?5700.00 cnT1，因子數(shù) 4，RMSEC 為 3.35，RMSEP 為 3.58，RSEP 為 10.69%。
【權(quán)利要求】
1.一種中藥材多指標(biāo)成分含量的快速測(cè)定方法，其特征在于，所述中藥材是水蛭或地龍藥材，通過以下步驟實(shí)現(xiàn): (1)采集水蛭或地龍藥材的近紅外光譜:將不同產(chǎn)地、不同采收季節(jié)的水蛭或地龍藥材，置恒溫烘箱中除去表面水分，打粉過篩；取適量水蛭或地龍藥材粉末置近紅外光譜儀的旋轉(zhuǎn)杯中，保持粉末表面平整，采集近紅外漫反射光譜，將得到的光譜數(shù)據(jù)分為校正集和驗(yàn)證集兩類； (2)測(cè)定水蛭或地龍藥材的多指標(biāo)成分含量:所述的多指標(biāo)成分為水分、可溶性固形物、次黃嘌呤、總糖和多糖以及游離氨基酸和多肽；采用烘干法測(cè)定水分含量和可溶性固形物含量，高效液相色譜法測(cè)定次黃嘌呤含量，高效液相色譜柱前衍生法測(cè)定游離氨基酸和多肽含量，碘液-硫代硫酸鈉滴定法測(cè)定總糖和多糖含量； (3)建立多指標(biāo)成分的定量分析模型:將步驟(2)所測(cè)定的水蛭或地龍藥材的水分含量、可溶性固形物含量、次黃嘌呤含量、總糖和多糖含量以及游離氨基酸和多肽含量分別與步驟(1)水蛭或地龍的近紅外光譜數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)，對(duì)于每個(gè)指標(biāo)成分，都對(duì)光譜進(jìn)行不同的預(yù)處理并采用不同建模波段，運(yùn)用偏最小二乘回歸方法建立每個(gè)指標(biāo)成分的多個(gè)定量分析模型； (4)確定多指標(biāo)成分的最佳定量分析模型:最佳定量分析模型通過模型參數(shù)確定，模型參數(shù)包括相關(guān)系數(shù)(R)、驗(yàn)證誤差均方根(RMSEP)、校正誤差均方根(RMSEC)、驗(yàn)證集相對(duì)預(yù)測(cè)誤差(RSEP);若R越接近1，RMSEC與RMSEP越接近，則模型的預(yù)測(cè)值與標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)值之間的相關(guān)性好，RMSEC, RMSEP, RSEP值越小，則模型的預(yù)測(cè)精度越高；通過模型參數(shù)來評(píng)價(jià)步驟(3)所建立的每個(gè)指標(biāo)的多個(gè)定量分析模型的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，選擇模型參數(shù)最佳的近紅外定量分析模型來檢測(cè)未知的水蛭或地龍藥材的多指標(biāo)含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種中藥材多指標(biāo)成分含量的快速測(cè)定方法，其特征在于，步驟(1)采集水蛭或地龍藥材的近紅外光譜使用近紅外積分球漫反射采集光譜，以空氣為參比，掃描次數(shù)為32，`分辨率為8 cnT1，吸光度數(shù)據(jù)格式為:logl/R，光譜掃描范圍為4000~10000 cm 1O
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種中藥材多指標(biāo)成分含量的快速測(cè)定方法，其特征在于，步驟(2)中 Ca)水分含量的測(cè)定:采用《中國藥典》——烘干法測(cè)得水蛭和地龍藥材的水分含量； (b)可溶性固形物含量的測(cè)定:采用烘干法測(cè)定水蛭和地龍藥材的可溶性固形物含量；精密移取0.1 g/mL的水蛭或地龍藥材浸提液4 mL至已烘干至恒重的扁形瓶(Xtl),稱重(X1)，置105°C烘箱中，每隔一個(gè)小時(shí)稱重，直至連續(xù)兩次稱重重量差距小于5 mg，最終重量計(jì)X2，可溶性固形物(％) =(X2 - X0) / (X1 - X0) X 100%，計(jì)算樣品的可溶性固形物含量； (c)次黃嘌呤含量的測(cè)定:采用HPLC測(cè)定水蛭和地龍藥材的次黃嘌呤含量； 取適量0.1 g/mL的水蛭或地龍藥材浸提液過0.45 μ m濾膜，取濾液進(jìn)樣10 μ 1，按如下色譜條件用高效液相色譜法測(cè)定峰面積，通過外標(biāo)法計(jì)算樣品的次黃嘌呤含量； 次黃嘌呤HPLC色譜條件:色譜柱Eclipse 乂08_(:18柱，4.6 mmX250 mm, 5 μ m,;流動(dòng)相A:0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液；流動(dòng)相B:50%甲醇；梯度洗脫步驟:0~5 min為100%A相，5~10 min為100%~99%A相，10~50 min為99%~0%A相，后運(yùn)行10 min ;檢測(cè)波長254 nm ;進(jìn)樣量10 μ I ;柱溫25 V ;流速I mL/min ；(d)總糖和多糖含量的測(cè)定:采用間接碘量法的碘液-硫代硫酸鈉滴定法測(cè)定水蛭或地龍藥材的總糖和單糖，依據(jù)硫代硫酸鈉的消耗量，先計(jì)算碘液的消耗量，再計(jì)算樣品的總糖和單糖，多糖含量通過總糖含量減去單糖含量而得到； (e)游離氨基酸和多肽含量的測(cè)定:采用HPLC柱前衍生化方法測(cè)定水蛭或地龍藥材的游離氨基酸和總氨基酸含量，再將總氨基酸含量減去游離氨基酸含量計(jì)算多肽含量； 游離氨基酸衍生前供試品溶液的制備:精密稱取水蛭或地龍藥材粉末一定量，用新制的0.9%氯化鈉溶液浸提，得0.1 g/mL浸提液，每I ml浸提液含0.1 g水蛭或地龍藥材粉末，過濾膜備用； 總氨基酸衍生前供試品溶液的制備:將藥材粉末浸提液、含1%苯酚的6 mol/L鹽酸和40%氫氧化鈉按體積比為1:4:2.4混合；具體操作:精密移取藥材浸提液和含1%苯酚的6mol/L鹽酸到水解管，混合，充氮?dú)馊コ鯕?，迅速密封，?10°C恒溫干燥器內(nèi)22小時(shí)，精密加入一定體積的40%氫氧化鈉,渦旋混勻,過膜待用； 流動(dòng)相A液的配制:配制0.01 mol/L三水合醋酸鈉溶液I L，精密加入三乙胺180 μ I,攪拌混勻，滴加2%冰醋酸，調(diào)pH = 7.20，加四氫呋喃3 mL，混勻； 流動(dòng)相B液的配制:配制0.05 mol/L三水合醋酸鈉溶液400 mL,滴加2%冰醋酸，調(diào)pH = 7.20,與體積比1:1的乙腈-甲醇混合液混勻，得體積比1:2:2的三水合乙酸鈉-乙腈-甲醇體系； 硼酸緩沖液:0.2 mol/L硼酸鈉溶液用10%氫氧化鈉溶液調(diào)pH =10.4； 衍生試劑:①鄰苯二甲醛衍生試劑:配制含0.1%巰基丙酸的4 g/L鄰苯二甲醛100mL，避光并4°C下保存；②芴甲氧羰酰氯衍生試劑:配制I g/L的芴甲氧羰酰氯50 mL，避光并4°C下保存；` 進(jìn)樣前的衍生操作:首先分別精密移取混合氨基酸對(duì)照品溶液和四硼酸氫鈉0.1 mL和0.5 mL，混勻，再移取0.1 mL OPA衍生試劑，混勻靜置一分鐘，然后移取0.1 mL芴甲氧羰酰氯衍生試劑，同樣混勻靜置一分鐘，進(jìn)樣； 采用HPLC測(cè)定水蛭或地龍藥材的游離氨基酸和總氨基酸含量，色譜條件:色譜柱Eclipse XDB-C18 柱(4.6 mmX 250 mm, 5 μ m);流速 1.0 mL/min ;進(jìn)樣量 10 μ I ;柱溫 30°C ;檢測(cè)波長:0 ~46 min 為 338 nm, 46 ~54.5 min 為 262 nm, 54.5 ~60 min 為 338 nm,梯度洗脫步驟:0~4 min為97%A相，4~10 min為97%~92%A相，10~24 min為92%~70%A 相，24 ~30 min 為 70%A 相，30 ~45 min 為 70% ~40%A 相，45 ~55 min 為 40% ~0%A相，55~60 min為0%~97%A相，后運(yùn)行10 min ； 按上述的色譜條件用高效液相色譜法測(cè)定峰面積，通過外標(biāo)法計(jì)算樣品的游離氨基酸和總氨基酸含量，多肽含量通過總氨基酸含量減去游離氨基酸含量得到。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種中藥材多指標(biāo)成分含量的快速測(cè)定方法，其特征在于，所述水蛭或地龍藥材的游離氨基酸和多肽含量測(cè)定的HPLC色譜條件:色譜柱EclipseXDB-C18 柱，4.6 mmX250 mm, 5 μ m, ；Aff1:0.01 mol/L醋酸鈉緩沖液體系；Bff1:體積比為2:2:1的甲醇-乙腈-醋酸鈉緩沖液體系；流速1.0 mL/min ;進(jìn)樣量10 μ I ;柱溫30 V ；檢測(cè)波長:0 ~46 min 為 338 nm, 46 ~54.5 min 為 262 nm, 54.5 ~60 min 為 338 nm,梯度洗脫步驟:0~4 min為97%A相，4~10 min為97%~92%A相，10~24 min為92%~70%A 相，24 ~30 min 為 70%A 相，30 ~45 min 為 70% ~40%A 相，45 ~55 min 為 40% ~0%A相， 55~60 min 為0%~97%A相，后運(yùn)行10 min。
【文檔編號(hào)】G01N21/359GK103884676SQ201410068578
【公開日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2014年2月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月27日
【發(fā)明者】吳永江, 劉雪松, 吳春艷, 欒連軍, 金葉, 李頁瑞, 李振國, 倪開嶺, 黃靖梅 申請(qǐng)人:浙江大學(xué), 牡丹江友搏藥業(yè)股份有限公司