專利名稱：：包含修飾的Fc結(jié)構(gòu)域的多聚Fc受體多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及抑制白細(xì)胞F(ry受體(FcryR)和免疫5求蛋白G(IgG)相互作用的可溶性多聚Fc受體多肽(multimericFcreceptorpolypeptide)和蛋白質(zhì)。所述多肽和蛋白質(zhì)在炎癥疾病，特別是免疫復(fù)合物介導(dǎo)的炎癥疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、免疫性血小板減少性紫癜(ITP)和系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的治療中是有用的。通過引用并入本專利申請(qǐng)要求如下申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)-于2006年12月13日提交的題目為"多聚Fc受體多肽"的PCT/AU2006/001890，以及-于2007年6月13日提交的題目為"多聚Fc受體多肽"的US11/762,664。通過引用將這些申請(qǐng)的全部內(nèi)容并入本文。
背景技術(shù)：
：自身免疫性疾病和其它炎癥疾病如RA和SLE的治療進(jìn)入了一個(gè)嶄新且令人興奮的階段，對(duì)免疫系統(tǒng)中涉及到的分子認(rèn)識(shí)的增加允許對(duì)關(guān)4建性的炎癥分子如腫瘤壞死a因子(TNFo!)和白細(xì)胞介素1/5(IL-1②進(jìn)行特異性抑制。例如，在近期的研究中，已經(jīng)證明抗體在RA的發(fā)病機(jī)理中起了強(qiáng)大的作用，且在人類臨床試驗(yàn)中，對(duì)去除產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞的抗CD20單克隆抗體(MAb)療法的應(yīng)用發(fā)生的陽性反應(yīng)已經(jīng)產(chǎn)生了強(qiáng)有力的證據(jù)來證明抗體在RA中的顯著性角色(Emery等，2001)。由于Fc受體(FcR)在基于免疫球蛋白的效應(yīng)器系統(tǒng)中扮演關(guān)鍵的角色，F(xiàn)cR功能的抑制可以為很多疾病的有效治療提供基礎(chǔ)。而且，6由于Fcry受體(FcryR)對(duì)于IgG的效應(yīng)器系統(tǒng)是關(guān)4建性的，以白細(xì)月包FcryRs和抗體之間的相互作用為靶向?yàn)镽A的治療介入提供了可能(Nabbe等，2003)。本申請(qǐng)人感興趣的實(shí)現(xiàn)所述介入的一種途徑是使用FqR可溶形式作為"假體(decoy)"以防止白細(xì)胞被抗體激活。Fc受體(FcR)是與抗體的Fc部分特異結(jié)合的白細(xì)胞表面的糖蛋白。IgG的受體，即FcryR，分布最為廣泛且最具多樣性，其主要類型有FctkRI(CD64)、Fc7RII(CD32)、FcryRIII(CD16)。在有機(jī)體內(nèi)正常的免疫反應(yīng)中形成的免疫復(fù)合物(IC)，及見于自體免疫疾病如RA的病理學(xué)中的免疫復(fù)合物(IC)能同時(shí)接合(engage)很多FcR。例如，在人體中，激活的巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞和肥大細(xì)胞能表達(dá)FcryRI、FcyRIIa、FryRIIb和FcyyRIII(Takai，2002)。然而，在這些FcR中，F(xiàn)c下RIIa是IC-介導(dǎo)的炎癥的主要引發(fā)物，且盡管所有FcyR型接合IgGFc結(jié)構(gòu)域(domain)和CH2結(jié)構(gòu)域的下4交4連區(qū)(lowerhingeregion)以至于任何可溶性Fc7R假體多肽均可以抑制IgG與所有種類的Fc7R結(jié)合，本申請(qǐng)人認(rèn)識(shí)到由于Fc7RIIa顯示出對(duì)強(qiáng)烈的IgG免疫復(fù)合物結(jié)合最廣泛的結(jié)合特異性和最高的選擇性，可溶性Fc7RIIa的發(fā)展和研究提供了最大的潛力。實(shí)際上，現(xiàn)有研究已經(jīng)證明簡單的重組可溶性FcyyRIIa多肽(rsFcyRIIa單體)，包含F(xiàn)cryRIIa外結(jié)構(gòu)域(Ierino等，1993a)，明顯能抑制IC-介導(dǎo)的炎癥。在這些研究中，用Arthus反應(yīng)測試rsFc7RIIa，其中免疫復(fù)合物通過被動(dòng)給予抗體和抗原在真皮中形成(Pflum等，1979)，這是血管炎(關(guān)節(jié)炎中額外的關(guān)節(jié)并發(fā)癥)的一種模型，也發(fā)生在SLE中。發(fā)現(xiàn)在rsF(ryRIIa單體與抗體和抗原同時(shí)給藥抑制炎癥和嗜中性粒細(xì)胞滲透時(shí)，因?qū)γ庖邚?fù)合物相對(duì)低水平的選擇性而需要大量的rsFc7RIIa單體。為了解決這個(gè)問題，本申請(qǐng)人建議用rsFc^RIIa假體的多聚體形式，且驚喜地發(fā)現(xiàn)，這些多聚體形式不僅能成功表達(dá)，且對(duì)免疫復(fù)合物表現(xiàn)出增高的選擇性。這些多聚rsFcryRIIa多肽因此顯示出治療諸如RA和SLE的IC-介導(dǎo)的炎癥疾病的可觀前景。發(fā)明概述因此，在第一方面，本發(fā)明提供了能夠抑制白細(xì)胞Fc7受體(FcryR)與免疫球蛋白G(IgG)的相互作用的可溶性多聚多肽，所述多肽包含兩個(gè)或更多以首對(duì)尾排列方式連接的Fc結(jié)合區(qū)，以及經(jīng)修飾以降低或防止與所述Fc結(jié)合區(qū)結(jié)合和/或改變效應(yīng)功能的免疫球蛋白的Fc結(jié)構(gòu)域，其中至少一個(gè)Fc結(jié)合區(qū)4汙生自Fc7R型受體。優(yōu)選地，多肽是衍生自Fc7Ri1型受體，特別是Fc7RIIa的Fc結(jié)合區(qū)的多聚體。這種分子可以被認(rèn)為是同源多聚體，一種特別優(yōu)選的這種類型的分子是衍生自F(ryRII型受體的Fc結(jié)合區(qū)的同源二聚體。然而，本發(fā)明也包括下述情形分子可以是衍生自Fc7R型受體(如Fc7RH型受體)的Fc結(jié)合區(qū)及另外來源的Fc結(jié)合區(qū)(如來自另一Fc受體型或合成性Fc結(jié)合多肽的Fc結(jié)合區(qū))的多聚體。這種類型的分子可以4皮認(rèn)為是異源多聚體，一種特別優(yōu)選的此類分子是衍生自Fc7RII型受體的Fc結(jié)合區(qū)和衍生自FcryRIII型受體的Fc結(jié)合區(qū)的異源二聚體。Fc結(jié)合區(qū)可以通過肽鍵或通過短連接子序列(如單個(gè)氨基酸或例如2至20個(gè)氨基酸長度的短肽)相連。在第二方面，本發(fā)明提供了包含如第一方面所述多肽的可溶性多聚蛋白質(zhì)。在第三方面，本發(fā)明提供了包含編碼如第一方面所述多肽或如第二方面所述蛋白質(zhì)的核苷酸序列的多聚核苷酸分子。所述多聚核苷酸分子可以存在于表達(dá)盒或表達(dá)載體中(如導(dǎo)入細(xì)菌宿主細(xì)胞的質(zhì)粒，或病毒載體如用于轉(zhuǎn)染昆蟲宿主細(xì)胞的桿狀病毒載體，或質(zhì)?；虿《据d體如用于轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的慢病毒)。因此，在第四方面，本發(fā)明提供了包含第三方面所述的多聚核苷酸分子的重組宿主細(xì)胞。在第五方面，本發(fā)明提供了制備多肽或蛋白質(zhì)的方法，所述方法包含以下步驟(i)提供包含如第三方面所述的多聚核芬酸分子的重組宿主細(xì)胞，(ii)在合適的培養(yǎng)基中和適合于所述多肽或蛋白質(zhì)表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，及(iii)從培養(yǎng)物，以及任選地從培養(yǎng)基中，分離所述多肽或蛋白質(zhì)。在第六方面，本發(fā)明提供了治療個(gè)體炎癥疾病的方法，所述方法包括將如第一方面所述的多肽或如第二方面所述的蛋白質(zhì)給予所述個(gè)體，所述多肽或蛋白質(zhì)任選地與藥學(xué)上或獸醫(yī)可接受的載體或賦形劑結(jié)合。附圖簡述圖1提供了兩個(gè)Fc7RIIa細(xì)胞外區(qū)域的首對(duì)尾同源二聚體構(gòu)建體的核苷酸序列(及翻譯后的氨基酸序列)，每一區(qū)域都包含兩個(gè)FcryRIIa外結(jié)構(gòu)域即外結(jié)構(gòu)域1和外結(jié)構(gòu)域2。所述Fc7RIIa外結(jié)構(gòu)域1和外結(jié)構(gòu)域2由FcyRIIa多肽序列的氨基酸1至174組成，氨基酸1至88包含結(jié)構(gòu)域1,氨基酸89至174包含結(jié)構(gòu)域2(HIbbsHibbs等，1988;人類IgG的Fc片段，低親和性IIa受體(CD32)(FCGR2A)，mRNA，ACCESSIONNM—021642;和Powell等，1999)。圖中，氨基酸1至182衍生自Fc下RIIa的纟田月包夕卜區(qū)，其中氨基酸1至174包含F(xiàn)cryRIIa的外結(jié)構(gòu)域1和外結(jié)構(gòu)域2，氨基酸175至182包含膜近端莖(其在FcryRIIa中將外結(jié)構(gòu)域1和外結(jié)構(gòu)域2連接至跨膜序列)。因此包含二聚物的Fc7RIIa第一個(gè)細(xì)胞外區(qū)由氨基酸1至182組成，且FcryRIIa第二個(gè)細(xì)胞外區(qū)由氨基酸184至362組成(對(duì)應(yīng)于Fc7RIIa的氨基酸3至182)。加下劃線的氨基酸表示非FcyyRIIa連接子的氨基酸殘基，粗體的氨基酸則突出顯示了C端His6標(biāo)簽。圖2顯示由圖1所示的核苷酸序列表達(dá)的重組可溶性(rs)多聚形式的FcryRIIa的蛋白質(zhì)印跡分析(WestemBlotanalysis)。rsFc7RIIa二聚體基本上是穩(wěn)定的，只有一小部分rsFc7RIIa單體分解產(chǎn)物的跡象。另一方面，rsFc7RIIa三聚體和四聚體形式是不穩(wěn)定的，基本上降解為rsFc7RIIa二聚體形式。這種降解可以通過制備時(shí)使用蛋白酶抑制劑或另外通過修飾多聚體形式的序列以移除裂解位點(diǎn)加以避免。圖3顯示從具有30kDa期望大小的rsFc7RIIa單體(哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá))(a)和具有SOkDa期望大小的rsFc7RIIa二聚體(b)的純化物中收集的部分的考馬斯(Coomassie)染色的SDS-PAGE(12。/。丙烯酰胺凝膠，在非還原的條件下)。圖4圖示rsFcryRIIa單體對(duì)固定的(a)IgG單體(Sandoglobulin)和(b)模式免疫復(fù)合物熱聚集的IgG(HAGG)的平衡結(jié)合反應(yīng)。圖5圖示rsFc下RIIa二聚體對(duì)固定的(a)IgG單體(Sandoglobulin)和(b)模式免疫復(fù)合物HAGG的平衡結(jié)合反應(yīng)。圖6提供了在與人類IgG單體(Sandoglobulin)和二聚體-IgG在溶液中發(fā)生在前反應(yīng)后，rsFc7RIIa單體(a)及由圖1的核苦酸序列表達(dá)的rsFcryRIIa二聚體(b)與固定的人類IgG單體(Sandoglobulin)結(jié)合的圖(Wright等，1980)，通過標(biāo)準(zhǔn)BIAcore測定方案確定。圖7提供了(a)通過純化的rsFcyRIIa單體和二聚體對(duì)二聚體-IgG與人類嗜中性粒細(xì)胞(志愿者V5)結(jié)合的抑制，以未被抑制的二聚體-IgG結(jié)合活性的百分比計(jì)算和(b)通過純化的rsFcryRIIa二聚體(由圖1的核苷酸序列所表達(dá))對(duì)二聚體-IgG與人類嗜中性粒細(xì)胞(志愿者VI)結(jié)合的抑制，以二聚體-IgG結(jié)合二聚體的百分比計(jì)算。圖8提供了(a)在rsFcyRIIa二聚體(2.5pg/ml,在上清中)不存在和存在時(shí)，免疫復(fù)合物(二聚體-IgG)刺激的TNF從分化24小時(shí)的人類MDMs(志愿者V5)中分泌的圖；(b)在rsFc7RIIa二聚體(2.5pg/ml)不存在和存在時(shí)，免疫復(fù)合物(二聚體-IgG)刺激的TNF從分化24小時(shí)的人類MDMs(志愿者Vl)中分泌的圖。圖9提供了免疫復(fù)合物(HAGG)刺激人類血小板活化的圖，通過在rsFc7RIIa二聚體(30i!g/ml)不存在和存在時(shí)，P-選擇素表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度(MFI)來測定。圖10提供了在(a)非還原和(b)還原條件下的SDS-PAGE、(c)采用抗Fc^RIIa抗體的蛋白質(zhì)印跡以及(d)HPLC時(shí)，分離自穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO-S細(xì)胞的rsFc7RIIa二聚體的分析結(jié)果。所述rsFc7RIIa二聚體在期望的分子量(50kD)處遷移出單帶，與抗Fc7RIIa抗體反應(yīng)，且通過HPLC分析確定純度大于96%。圖11提供了在rsFcryRIIa單體或rsFc^RIIa二聚體存在時(shí)，免疫復(fù)合物(HAGG)與細(xì)胞表面表達(dá)的人類rsFc7RIIb(在鼠科B淋巴瘤細(xì)胞系IIA1.6上)結(jié)合的圖。圖12提供了在rsFc7RIIa單體或rsFcryRIIa二聚體(由圖1的核苷酸序列所表達(dá))存在時(shí)，用HAGG處理后活化的血小板(CD41和CD62P呈陽性)圖，以用HAGG單獨(dú)處理后活化的血小板的百分比表示。圖13提供了在rsFcryRIIa單體或rsFcryRIIa二聚體存在時(shí)，用OVA免疫復(fù)合物孵育后，TNF-a從MC/9細(xì)胞中釋放的圖，以在OVA免疫復(fù)合物單獨(dú)存在時(shí)TNF-a釋放的百分比表示。圖14顯示rsFc7RIIa融合蛋白的蛋白質(zhì)印跡分析。(1)rsFc7RIIa單體；(2)rsFcryRIIa二聚體；(3)融合于IgG,-Fcryl(L234A,L235A)的rsFc7RIIa單體;(4)融合于IgG廣Fc71(L234A,L235A)的rsFc，Ia二聚體；。)融合于人類血清蛋白(HSA)的rsFc7RIIa單體；(6)融合于HSA的rsFcr/RIIa二聚體；(7)純化的rsFryRIIa單體標(biāo)準(zhǔn)品；和(8)純化的rsFcryRIIa二聚體標(biāo)準(zhǔn)品。圖15提供了用rsFcryRIIa單體和rsFcr/RIIa二聚體融合物進(jìn)行的HAGG-捕獲ELISA的結(jié)果，(a)以0.75嗎/ml開始的rsFcyRIIa單體標(biāo)準(zhǔn)品(Powell等，1999)(單體標(biāo)準(zhǔn)品)；來自于用rsFcyRIIa單體構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的蛋白質(zhì)(轉(zhuǎn)染426(單體))；來自于用融合于IgG-Fc7l(L234A,L235A)的rsFcyRIIa單體構(gòu)建體(單體-Fc)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的蛋白質(zhì)；來自于用融合于HSA的rsFcryRIIa單體構(gòu)建體(HSA-單體)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的蛋白質(zhì)；(b)以0.5^g/ml開始的rsFc7RIIa二聚體標(biāo)準(zhǔn)品(二聚體標(biāo)準(zhǔn)品)；來自于用rsFc7RIIa二聚體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的上清(轉(zhuǎn)染427(二聚體))；來自于用融合于IgG-Fc7l(L234A,L235A)的rsFc7RIIa二聚體(二聚體-Fc)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的上清；來自于用融合于HSA的rsFc7RIIa二聚體(HSA-二聚體)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的上清。圖16提供了在rsFc7RIIa單體和rsFc7RIIa二聚體融合蛋白質(zhì)上的捕獲-標(biāo)簽ELISA(CAPTURE-TAGELISA)中獲得的結(jié)果，以i正實(shí)確立受體一皮合適地折疊的抗原表位的存在。(A)以0.75pg/ml開始的rsFc7RIIa單體標(biāo)準(zhǔn)物(單體標(biāo)準(zhǔn)品)；來自于用rsFc7RIIa單體(轉(zhuǎn)染426(單體))轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的上清；來自于用融合于IgG-Fc7l(L234A,L235A)的rsFcyRIIa單體(單體-Fc)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的上清；來自于用融合于HSA的rsFcryRIIa單體(HSA-單體)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的上清；(B)以0.5^g/ml開始的rsFcryRIIa二聚體標(biāo)準(zhǔn)品(實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部制備)；來自用rsFcryRIIa二聚體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的上清(轉(zhuǎn)染427(二聚體))；來自用融合于IgG-Fc^l(L234A,L"SA)的rsFc^RIIa二聚體(二聚體-Fc)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的上清；來自于用融合于HSA的rsFc7RIIa二聚體(HSA-二聚體)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的上清。圖17提供了(a)rsFcryRIIa單體；(b)rsFcryRIIa二聚體；(c)融合于IgG-Fcryl(L234A，L235A)的rsFcryRIIa單體的二聚體，(d)融合于IgG-Fcryl(L234A,L235A)rsFcryRIIa二聚體的二聚體，(e)融合于HSA的rsFcryRIIa單體；和(f)融合于HSA的rsFcryRHa二聚體的示意圖。其中(c)中的二聚化過程是通過rsFc7RIIa單體融合多肽的Fc結(jié)構(gòu)域來實(shí)現(xiàn)，提供了具有兩個(gè)Fc結(jié)合區(qū)的分子(也就是一個(gè)蛋白質(zhì)分子對(duì)Fc結(jié)合區(qū)而言是二聚的，或具有"二價(jià)")；其中(d)中的二聚化過程是通過rsFcRIIa二聚體融合多肽的兩個(gè)Fc結(jié)構(gòu)域來實(shí)現(xiàn)，提供了具有四個(gè)Fc結(jié)合區(qū)的分子(也就是一個(gè)蛋白質(zhì)分子對(duì)Fc結(jié)合區(qū)而言是四聚的，或具有"四價(jià)，，)。圖中，Dl和D2分別表示外結(jié)構(gòu)域1和外結(jié)構(gòu)域2，D2相鄰的實(shí)心條表示連接子序列，在(c)和(d)中二聚的Fc結(jié)構(gòu)域上面的暗環(huán)表示二硫鍵，H6則表示His標(biāo)簽；圖18顯示rsFc7RIIa二聚體(無融合搭檔)在小鼠關(guān)節(jié)炎模型中的作用。在rsFc7RIIa二聚體不存在(黑方塊)和存在(白方塊)時(shí)，用致關(guān)節(jié)炎的抗膠原抗體處理小鼠；圖19提供了本發(fā)明實(shí)施方案的氨基酸序列，即融合于衍生自IgG2a的Fc結(jié)構(gòu)域的rsFc7RIIa二聚體(此融合蛋白在下文中稱為D2蛋白)；圖20提供了編碼圖19中的D2蛋白的核苷酸序列；圖21圖示了用于表達(dá)圖20中核苷酸序列(編碼D2蛋白)的質(zhì)粒；圖22顯示通過SDS-PAGE(A圖)和蛋白質(zhì)印跡(B圖)對(duì)圖19中純化的D2蛋白的分析；圖23顯示(圖19中的)D2蛋白在MC/9肥大細(xì)胞測定中對(duì)TNF-釋放的影響；圖24顯示(圖19中的)D2蛋白對(duì)人類嗜中性粒細(xì)胞活化的影響；以及圖25顯示(圖19中的)D2蛋白對(duì)人類血小板活化的影響。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了能夠抑制白細(xì)胞F(ry受體(Fc7R)和免疫球蛋白G(IgG)的相互作用的可溶性多聚多肽和蛋白，所述免疫球蛋白G包含兩個(gè)或更多Fc結(jié)合區(qū)，其中一個(gè)區(qū)基本上衍生自Fc7R型受體。這種多肽和蛋白對(duì)免疫復(fù)合物的選擇性高于先前觀察到的可溶性單體多肽如rsFcyRIIa單體的選4奪性，因此為作為"假體"分子用于IC-介導(dǎo)的炎癥性疾病如RA和SLE的治療提供了可觀的前景。因此在第一方面，本發(fā)明提供了能夠抑制白細(xì)胞Fry受體(Fc7R)和免疫球蛋白G(IgG)之間相互作用的可溶性多聚多肽，所述多肽包含兩個(gè)或更多以首對(duì)尾排列方式連接的Fc結(jié)合區(qū)，和經(jīng)修飾以降低或防止與所述Fc結(jié)合區(qū)結(jié)合和/或改變效應(yīng)器功能的免疫球蛋白的Fc結(jié)構(gòu)域，其中至少一個(gè)Fc結(jié)合區(qū)衍生自Fc7R型受體。如本文所使用，術(shù)語"可溶性"表示多肽(或蛋白質(zhì))沒有結(jié)合在細(xì)胞膜上，因此其特征為跨膜(也就是親脂的)結(jié)構(gòu)域的全部或主要部分的缺乏或功能的破壞，以至于多肽(或蛋白質(zhì))缺乏任何膜錨定功能。細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域也可以不存在。如本文所使用，術(shù)語"Fc結(jié)合區(qū)"表示能與免疫球蛋白，包括其基因修飾形式的Fc結(jié)構(gòu)域(如免疫球蛋白的木瓜蛋白酶水解制備的Fc片段)結(jié)合的Fc受體以及合成性Fc結(jié)合多肽的任一部分或多個(gè)部分。所述至少一個(gè)書f生自Fc7R型受體的Fc結(jié)合區(qū)可以書f生自，例如，與IgG有低親和性，即與IgG的親和性低于5x107M"的Fc7R。這種低親和性的受體包括FcyRII型受體(例如包括多形變體、FcryRIIa-H131和Fc7RIIa隱R131的Fc7RIIa(Stuart等，1987;Brooks等，1989;Seki等，1989)、FcryRIIb和Fc7RIIc)、Fc7RHI型受體(例如FcryRIIIa和Fc7RIIIb)、Fc7RI型受體(如FcryRIa和Fc7RIb)的截短形式如包含F(xiàn)cryRI受體三個(gè)外結(jié)構(gòu)域中第一個(gè)和第二個(gè)的截短多肽(Hulett等，1991;Hulett等，1998),及FcryRI的基因修飾形式，所述修飾形式通常對(duì)IgG有高的親和性但是由于修飾(例如一個(gè)或更多氨基酸取代、刪除和/或添加)顯示出與IgG有^氐于5x107mt'的降^[氐的親和性。優(yōu)選地，所述多肽為衍生自諸如低親和性Fc"kR的FcryR受體的Fc結(jié)合區(qū)的同源多聚體。合適的Fc結(jié)合區(qū)由Fc7R受體的一個(gè)或更多外結(jié)構(gòu)域的全部或一個(gè)Fc結(jié)合部分或多個(gè)部分組成。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地鑒別FcyR受體的Fc結(jié)合外結(jié)構(gòu)域，因?yàn)檫@些結(jié)構(gòu)域?qū)儆贗gG結(jié)構(gòu)域超家族(Hulett等，1994、Hulett等，1995、Hulett等，1998和Tamm等，1996)且其典型特征為"色氨酸夾層(atryptophansandwich)"(例如Fc7RIIa的殘基W90和W113)和其它殘基(例如在Fc7RIIa中；外結(jié)構(gòu)域1和外結(jié)構(gòu)域2的連接子殘基，及外結(jié)構(gòu)域2的BC(W113-V119)、C，E(F132-P137)和FG(G159-Y160)環(huán)(Hulett等，1994))。更優(yōu)選地，所述多肽為FcryRIIa的Fc結(jié)合區(qū)的同源多聚體。合適的Fc7RIIa的Fc結(jié)合區(qū)由Fc7RIIa的外結(jié)構(gòu)域1和外結(jié)構(gòu)域2的全部或一個(gè)Fc結(jié)合部分或多個(gè)部分。Fr/RIIa的外結(jié)構(gòu)域1和外結(jié)構(gòu)域2被發(fā)現(xiàn)在FcryRIIa氨基酸序列的1至172位氨基酸內(nèi)(Hibbs等，1988和ACCESSSIONNM—021642)。Fc7RIIa的外結(jié)構(gòu)域1和外結(jié)構(gòu)域2的Fc結(jié)合部分的一個(gè)實(shí)例是包含F(xiàn)cyRIIa氨基酸序列的90至174位氨基酸的片段，其包括外結(jié)構(gòu)域1和外結(jié)構(gòu)域2連接子殘基和外結(jié)構(gòu)域2的BC(W113-V119)、C，E(F132-P137)和FG(G159-Y160)環(huán)。X-線結(jié)晶學(xué)研究表明在此片段內(nèi)，氨基酸113-116、129、131、133、134、155、156和158-160對(duì)能夠與IgG的Fc結(jié)構(gòu)域結(jié)合的片l殳表面^t出了重要貢獻(xiàn)。所述多肽也可以為^f;f生自F(yyRII型受體的Fc結(jié)合區(qū)和另外來源的Fc結(jié)合區(qū)(例如衍生自另外Fc受體類型如另外FcryR類型的Fc結(jié)合區(qū)或書t生自另外免疫3求蛋白受體如IgA和IgE的受體的Fc結(jié)合區(qū))的異源多聚體。一種特別優(yōu)選的此類分子是衍生自Fc7RII型受體(特別地，F(xiàn)c7RIIa)的Fc結(jié)合區(qū)和衍生自FcryRIII型受體的Fc結(jié)合區(qū)的異源二聚體。被認(rèn)為"衍生自"特定的Fc受體的Fc結(jié)合區(qū)包括與Fc受體具有等同的氨基酸序列的Fc結(jié)合區(qū)，以及包含存在于Fc受體的Fc結(jié)合區(qū)的序列的一個(gè)或更多氨基酸修飾。這些氨基酸修飾可以包括氨基酸的取代、刪除、添加或這些修飾的任意組合，并且相對(duì)于Fc受體的生物活性，這些修飾可以改變Fc結(jié)合區(qū)的生物活性(例如，所述氨基酸》務(wù)飾可以提高免疫復(fù)合物的選擇性或親和性，在氨基酸133、134、158-161的這些修飾在國際專利WO96/08512的說明書中有描述)。另一方面，衍生自特定的Fc受體的Fc結(jié)合區(qū)可以包括一個(gè)或更多相對(duì)于Fc受體的生物活性而言，基本上不改變Fc結(jié)合區(qū)的生物活性的氨基酸修飾。此種類型的氨基酸修飾通常包括保守性氨基酸取代。下面的表1給出了示例性的保守性氨基酸取代。想到的特定的保守性氨基酸取代有G、A、V、I、L、M;D、E、N、Q;S、C、T;K、R、H:和P，Na畫烷基氨基酸。一般地，保守性氨基酸取代的選擇是在它們對(duì)(a)取代位置處Fc結(jié)合區(qū)的多肽骨架的結(jié)構(gòu)、(b)取代位置處多肽的電荷或疏水性，和/或(c)取代位置處氨基酸側(cè)鏈的大小沒有任何實(shí)質(zhì)影響的基礎(chǔ)上進(jìn)行。當(dāng)包含一個(gè)或更多保守氨基酸取代的Fc結(jié)合區(qū)通過合成制備時(shí)，F(xiàn)c結(jié)合區(qū)還可以包括不被遺傳密碼編碼的一種氨基酸或氨基酸，例如，羧基谷氨酸和羥基脯氨酸及D-氨基酸。表1示例性保守性氨基酸取代保守性取代AlaVal*,Leu，lieArgLys*,Gin,AsnAsnGin*,His,Lys,Arg,AspAspGlu*,AsnCysSerGinAsn*,His,Lys,GluAsp*，y-羧基谷氨酸(Gla)GlyProHisAsn,Gin,Lys，Arg*lieLeu*，Val，Met，Ala，Phe,正亮氨酸(Nle)LeuNle，Ile*，Val,Met,Ala,PheLysArg*，Gln，Asn,鳥氨酸(Orn)MetLeu*，lie,Phe,NlePheLeu*，Val,Ile，AlaProGly*,羥脯氨酸(Hyp),Ser，ThrSerThrThrSerTrpTyrTyrTrp,Phe*,Thr,SerVallie,Leu*,Met,Phe,Ala,Nle*表示優(yōu)選的保守性取代所述Fc結(jié)合區(qū)優(yōu)選通過肽鍵或通過短連接子序列(如單個(gè)氨基酸或如2至20個(gè)氨基酸長度的短肽)連接。然而，在特定情況下，通過其它合適的連接方式(如通過化學(xué)交聯(lián))來連接所述Fc結(jié)合區(qū)是優(yōu)選的或理想的。本發(fā)明中所述多肽的Fc結(jié)合區(qū)是以"首對(duì)尾"排列方式連接的。即第一個(gè)FC結(jié)合區(qū)的C-末端("尾")會(huì)以串聯(lián)的方式連接于第二個(gè)Fc結(jié)合區(qū)的N-端("首")。至少有兩個(gè)Fc結(jié)合區(qū)，通常為2至4個(gè)Fc結(jié)合區(qū)以這種方式相連，然而多肽可以有多至10個(gè)或更多(如20個(gè))個(gè)以首對(duì)尾排列方式相連的Fc結(jié)合區(qū)。Fc結(jié)合區(qū)域通常通過肽鍵或通過短連接子物序列(例如單個(gè)氨基酸或如2至20個(gè)氨基酸分子長度或更優(yōu)選地，2至15個(gè)氨基酸分子長度、2至IO個(gè)氨基酸分子長度、2至8個(gè)氨基酸分子長度或最優(yōu)選地，2至5個(gè)氨基酸分子長度的短肽)相連。合適的短連接子序列可以是短隨機(jī)序列或可以包括FcryR的短的非Fc結(jié)合區(qū)片段(例如來自于Fc^R膜莖(membranestalk)的近端區(qū)域的20個(gè)或更少氨基酸的短片段)。連接子序列可以是合成性連接子序列如，例如對(duì)蛋白質(zhì)水解具有低易感性的GGGGSGGGGS(SEQIDNO:4)。這樣的連接子序列可以是2至5個(gè)串聯(lián)的"Gly4Ser"單位的形式。通過肽鍵或短連接子序列連接Fc結(jié)合區(qū)允許用重組表達(dá)系統(tǒng)制備多肽。因此，在如本發(fā)明所述多肽的第一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽包括兩個(gè)至四個(gè)衍生自FcryRIIa以首對(duì)尾排列方式連接的Fc結(jié)合區(qū)。在如本發(fā)明所述多肽的第二個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽包括兩個(gè)衍生自FcryRIIa以首對(duì)尾排列方式連接的Fc結(jié)合區(qū)。且在如本發(fā)明所述多肽的第三個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽包括兩個(gè)均包含外結(jié)構(gòu)域1和外結(jié)構(gòu)域2的FcryRIIa細(xì)胞外區(qū)，其中所述細(xì)胞外區(qū)通過包含l至20個(gè)氨基酸的連接子以首對(duì)尾排列方式相連。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，多肽中的Fc結(jié)合區(qū)通過組成Fc7RIIa的膜近端莖區(qū)的肽連接子相連，以序列PSMGSSSP(SEQIDNO:7)為代表。具有相似二級(jí)結(jié)構(gòu)的等價(jià)連接子也是有用的，包括并入了保守性氨基酸取代的等價(jià)物。此外，這種氨基酸序列的截短和延伸，具有少一個(gè)或兩個(gè)或另外的氨基酸，也是有用的。合適的連接子一般是那些允許多聚多肽采用如下結(jié)構(gòu)的連接子每一Fc結(jié)合區(qū)均能參與與具有Fc結(jié)構(gòu)域的分子的結(jié)合。在這種方式下，連接子允許，例如包含兩個(gè)已連接的Fc結(jié)合區(qū)的多肽比相應(yīng)的單體結(jié)合更多數(shù)量的具有FC結(jié)構(gòu)域的分子?？梢栽谌绫疚乃纠耐矄蔚慕Y(jié)合實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上選擇適合于此目的的連接子。本發(fā)明所述的多肽還可以包含載體蛋白質(zhì)(即，使所述多肽是載體蛋白質(zhì)和所述兩個(gè)或更多連接的FC結(jié)合區(qū)和修飾的FC結(jié)構(gòu)域的"融合物")。載體蛋白質(zhì)可以是任何本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的載體蛋白質(zhì)，但是優(yōu)選地，是人類血清蛋白(HSA)或另一種常用于的載體蛋白質(zhì)以提高生物利用率(也就是當(dāng)給予個(gè)體后，通過提高所述多肽的血清半衰期)。方便地，載體蛋白質(zhì)可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任一種方法通過將所述多肽表達(dá)為與所述載體蛋白的融合蛋白而融合于所述多肽上。本發(fā)明所述的多肽可以進(jìn)一步包含其它有用的連接的分子，例如乙二醇(也就是制備聚乙二醇化的多肽)以提高生物利用率、補(bǔ)體調(diào)節(jié)分子如CD46、CD55和CD59，細(xì)胞因子(例如能夠?qū)⒓?xì)胞因子遞送至炎癥部位)和細(xì)胞因子受體。本發(fā)明所述的多肽包括免疫球蛋白的Fc結(jié)構(gòu)域。此Fc結(jié)構(gòu)域能夠與另一Fc結(jié)構(gòu)域結(jié)合(也就是形成二聚體)從而提供了連接兩個(gè)或更多如本發(fā)明所述的多肽以形成蛋白質(zhì)的方式。因此，通過利用例如包含兩個(gè)或更多已連接的Fc結(jié)合區(qū)的多肽，可以制備出包含至少四個(gè)Fc結(jié)合區(qū)的蛋白質(zhì)(換句話說，可溶性多聚蛋白質(zhì)包含四個(gè)或更多Fc結(jié)合區(qū))，所述多肽融合于能夠與另一Fc結(jié)構(gòu)域結(jié)合的Fc結(jié)構(gòu)域，所述另一Fc結(jié)構(gòu)域可能相同或不同且其自身已融合于另一包含兩個(gè)或更多已連接的Fc結(jié)合區(qū)的多肽，。所述Fc結(jié)構(gòu)域可以選自任一免疫球蛋白(例如IgG如IgG!、IgG2a或IgG4)。野生型形式的IgG4Fc結(jié)構(gòu)域?qū)c7Ri1受體具有相對(duì)低的親和性，因此可以無需修飾就用于本發(fā)明所述的多肽以避免與所述多肽已連接的Fc結(jié)合區(qū)(也就是衍生自FcyyRII型受體)的自行退火。然而更理想地，所選Fc結(jié)構(gòu)域是經(jīng)修飾的(例如通過在對(duì)于與Fc受體結(jié)合關(guān)鍵的殘上的氨基酸取代)以防止Fc結(jié)構(gòu)域與連接的Fc結(jié)合區(qū)的自行退火(也就是"自結(jié)合")，以及優(yōu)選地，以防止在有機(jī)體內(nèi)與Fc受體結(jié)合(也就是，所述修飾的FC結(jié)構(gòu)域?qū)Y(jié)合內(nèi)源性Fc受體而不是新生的Fc受體(FcRn)，包括例如FcryRI、FcryRII和F(ryRIII，優(yōu)選地顯示出降低的親和性)。同樣地，所選Fc結(jié)構(gòu)域期望被修飾以改變效應(yīng)器功能，如此以降低補(bǔ)體結(jié)合和/或降低或消除補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)。這些修飾已經(jīng)被例如Clark和其同事廣泛地描述，他們設(shè)計(jì)且描述了一系列突變的IgGl、IgG2和IgG4Fc結(jié)構(gòu)域和它們的Fc7R結(jié)合性質(zhì)(Armour等，1999;Armour等，2002，其內(nèi)容在本申請(qǐng)中作為參考文獻(xiàn)#皮并入)。例如，在234、235、236、237、297、318、320和322位的任一或更多氨基酸可以^皮修飾(例如通過氨基酸取代)以改變與效應(yīng)器配體，如Fc受體或補(bǔ)體的Cl組分的親和性(Winter等，美國專利第5,624,821號(hào)和第5,648,260號(hào))。同樣，在329、331和322位的一個(gè)或更多氨基酸可以#^奮飾(例如通過氨基酸取代)以改變Clq的結(jié)合性和/或降低或消除CDC(例如被Idusogie等人在美國專利第6,194,551號(hào)中描述)，和/或降低或消除抗體依賴性的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)。在一特別優(yōu)選的經(jīng)修飾的Fc結(jié)構(gòu)域中，F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域衍生自IgG,(Wines等，2000)且包含在氨基酸234和/或235,即Leu"4和/或Leu235上的氨基酸修飾。這些亮氨酸殘基處于IgG!的下絞鏈區(qū)內(nèi)，在那里Fc受體與Fc結(jié)構(gòu)域接合。所述亮氨酸殘基的一個(gè)或兩個(gè)都可以被取代或刪除以防止Fc受體接合(也就是結(jié)合)；例如Leu^和Leu235中的一個(gè)或兩個(gè)可以被丙氨酸(也就是L234A和/或L235A)或另外合適的氨基酸取代(Wines等，2000)。在另一特別優(yōu)選的經(jīng)修飾的Fc結(jié)構(gòu)域中，F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域衍生自IgG2a且包含氨基酸235、318、320和322，即Leu235、Glu318、Lys，和Lys322中的任一個(gè)或多個(gè)的氨基酸修飾。優(yōu)選地，Leu235用谷氨酸取代，Glu318、Lys，和Lys322用丙氨酸取代。在另一特別優(yōu)選的經(jīng)修飾的Fc結(jié)構(gòu)域中，F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域衍生自IgG4，包括人類IgG4，且包含氨基酸228、233、234、235和236中任一個(gè)或多個(gè)的氨基酸修飾。優(yōu)選地，在lgG4Fc結(jié)構(gòu)域中的氨基酸修飾引入Pro228、Pro233、Val234、Ala235，且刪除236(也就是Del236)。在第二方面，本發(fā)明提供了包含如第一方面所述的多肽的可溶性多聚蛋白質(zhì)。在第三方面，本發(fā)明提供了包含編碼如第一方面所述的多肽或如第二方面所述的蛋白質(zhì)的核苷酸序列的多聚核香酸分子。所述多聚核苷酸分子可以存在于表達(dá)盒或表達(dá)載體中(例如導(dǎo)入細(xì)菌宿主細(xì)胞中的質(zhì)粒、或如轉(zhuǎn)染昆蟲宿主細(xì)胞的桿狀病毒載體的病毒載體、或如轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的慢病毒的質(zhì)粒或病毒載體)。對(duì)于包含如本發(fā)明所述多肽的二聚體的可溶性多聚蛋白質(zhì)，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，在宿主細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，編碼多聚核苷酸分子將會(huì)產(chǎn)生融合多肽的單鏈，此單鏈然后會(huì)產(chǎn)生作為宿主細(xì)胞分泌產(chǎn)物的期望的多聚蛋白質(zhì)。在第四方面，本發(fā)明提供了包含如第三方面所述的多聚核苷酸分子的重組宿主細(xì)月包。所述重組宿主細(xì)胞可以選自諸如大腸桿菌(E.co/z')的細(xì)菌細(xì)胞、如曱醇酵母(p.;^^on'"的酵母細(xì)胞、如甜菜夜蛾Sf9細(xì)胞的昆蟲細(xì)胞、諸如中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)、猴腎細(xì)胞(COS)和人胚腎細(xì)胞293(HEK293)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞以及植物細(xì)胞。在第五方面，本發(fā)明提供了制備多肽或蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括以下步驟(i)提供了包含如第四方面所述的多聚核苷酸分子的重組宿主細(xì)胞，(ii)在合適的培養(yǎng)基上和適合于所述多肽或蛋白質(zhì)表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)力包，以及(iii)從培養(yǎng)物，和任選地從培養(yǎng)基中，分離所述多肽或蛋白質(zhì)。所述多肽或蛋白質(zhì)可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任一種方法分離。例如，所述多肽或蛋白質(zhì)可以用金屬親和性色譜技術(shù)或用固定化IgG或熱聚集的IgG(HAGG)色譜技術(shù)容易地分離。在第六方面，本發(fā)明提供了治療個(gè)體炎癥疾病的方法，所述方法包括將如第一方面所述的多肽或如第二方面所述的蛋白質(zhì)給予所述個(gè)體，所述多肽或蛋白任選地與藥學(xué)上可接受的或獸醫(yī)可接受的載體或賦形劑結(jié)合。所述方法適合于治療炎癥性疾病如IC-介導(dǎo)的炎癥性疾病，包括RA、ITP、SLE、腎小球性腎炎和肝素誘導(dǎo)的血小板減少伴血栓形成綜合征(HITTS)。所述個(gè)體通常為人類，但是第六方面的所述方法也可以適用于其它動(dòng)物個(gè)體如家畜(例如竟技馬)和寵物。術(shù)語"藥學(xué)上可接受的或獸醫(yī)可接受的載體或賦形劑"意指用于將本發(fā)明所述的多肽或蛋白質(zhì)遞送至個(gè)體的任一藥學(xué)上或獸醫(yī)可接受的溶劑、懸浮劑或媒介(vehicle)。所述多肽或蛋白質(zhì)可以通過任一本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的途徑，尤其是靜脈給藥(iv)、皮內(nèi)給藥(id)和皮下給藥(sc)及口服給藥和鼻給藥對(duì)所述個(gè)體進(jìn)行給藥。對(duì)于皮下給藥，可以通過注射或通過插入皮下的導(dǎo)管實(shí)現(xiàn)?？蛇x擇地，皮下給藥可以通過緩釋植入組合物或可注射的儲(chǔ)存組合物來實(shí)現(xiàn)。通常，所述多肽或蛋白質(zhì)給藥的劑量會(huì)是每天0.5mg/kg個(gè)體體重至15mg/kg個(gè)體體重。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員明白"有效劑量"(也就是在治療炎癥性疾病中有效的劑量)的量會(huì)隨著一系列因素包括個(gè)體的年齡和一般健康狀況及所治療的炎癥性疾病的嚴(yán)重度而變化。為每一特定的個(gè)體確定或優(yōu)化合適的有效劑量在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)范圍內(nèi)。在本發(fā)明的另一方面，提供了包含如第一方面所述的多肽或如第二方面所述的蛋白質(zhì)的藥物組合物，所述多肽或蛋白質(zhì)任選地與藥學(xué)上或獸醫(yī)可接受的載體或賦形劑結(jié)合，以及提供了如第一方面所述的多肽或如第二方面所述的蛋白質(zhì)在制備用于治療炎癥疾病的藥物中的用途。另外，本發(fā)明所述的多肽或蛋白質(zhì)在治療個(gè)體炎癥疾病之外的應(yīng)用中有用。也就是說，它們可用于4企測與自體免疫疾病如RA和SLE的病理學(xué)有關(guān)的循環(huán)免疫復(fù)合物(IC)的診斷測定，其中所述多肽或蛋白質(zhì)可用于"捕獲"IC的步驟中(例如通過將所述多肽或蛋白質(zhì)結(jié)合到合適的基質(zhì)如ELISA培養(yǎng)板上)，取代了這種測定中典型的沉淀步驟(用聚乙二醇)。在從待測定的樣品(例如來自于個(gè)體的血清或滑液樣品)中捕獲IC后，所捕獲的IC可以用本發(fā)明的多肽或蛋白質(zhì)以一種形式檢測，由此所述多肽或蛋白質(zhì)連接到作為標(biāo)志物或報(bào)告分子的分子(例如放射性同位素示蹤標(biāo)記的分子、化學(xué)發(fā)光分子、生物發(fā)光分子、熒光分子或能產(chǎn)生可檢測信號(hào)的酶如辣根過氧物酶)上?？蛇x擇地，所捕獲的IC可以用對(duì)某些自身抗原(例如在RA中的瓜氨酸(citrullene)、SLE中的DNA、Sj0gren綜合征中的La/SS-B和硬皮病中的DNA拓樸異構(gòu)酶I)特異性的抗體檢測或"探測"以使能夠確定特異性自身抗原在循環(huán)IC中的水平，這可以允許對(duì)自身免疫疾病具有改良的診斷或預(yù)后結(jié)果的測定的開發(fā)。而且，以相似的方式，結(jié)合到合適底物上的本發(fā)明所述多肽或蛋白質(zhì)捕獲的IC可以用對(duì)某些傳染性病原體的抗原(例如細(xì)菌如葡萄球菌和鏈球菌、寄生蟲如惡性癡原蟲(癡疾)和病毒如肝炎C病毒(HCV)、埃-巴二氏病毒(EBV)、人類免疫缺陷病毒(HFV)及誘發(fā)登革熱的蟲媒病毒)特異性的抗體檢測或"探測"以在鑒別誘發(fā)感染病原體、疾病預(yù)后和/或感染處理方面提供有用的信息。另外，本發(fā)明所述的多肽或蛋白質(zhì)在各種生物測定中也是有用的，其中它們可以有效地抑制腫瘤壞死因子(TNF)從細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞、樹狀突細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞中釋放。而且，當(dāng)連接到如上所述的可以充當(dāng)標(biāo)志物或報(bào)告分子的分子時(shí)，所述多肽或蛋白質(zhì)可以用于體內(nèi)炎癥部位的成像。進(jìn)一步地，本發(fā)明所述的多肽和蛋白質(zhì)對(duì)與IC-介導(dǎo)的炎癥疾病有關(guān)的循環(huán)IC的移除是有用的，其中所述多肽或蛋白質(zhì)結(jié)合于如惰性珠、纖維或其它表面的合適基質(zhì)且暴露于來自含有IC復(fù)合物的個(gè)體的生物流體下(特別是血液)，如此以至于IC被捕獲且隨后從生物流體中移除。基本上沒有IC的經(jīng)處理的生物流體可以返回至獲得所述流體的個(gè)體。為了使本發(fā)明的性質(zhì)可以被更清楚地理解，現(xiàn)在結(jié)合下述的非限制實(shí)施例描述其優(yōu)選的形式。實(shí)施例22實(shí)施例1FcR多聚體多肽的制備、純化和表征材料和方法FryW//a/菜#4這我'謬的一々建通過使用熱穩(wěn)定聚合酶/Vo(Roche)、作為cDNA模板的克隆Hu3.0(Hibbs等，1998,ACCESSIONNM一021642)和引物oBW10GTAGCTCCCCCAAAGGCTG(SEQIDNO:1)和oBWllCTACCCGGGTGAAGAGCTGCCCATG(SEOIDNO:2)，擴(kuò)增包含人類Fc7RIIa外結(jié)構(gòu)域1和外結(jié)構(gòu)域2的Fc結(jié)合區(qū)。加下劃線于半S"aBI(全部DNA》務(wù)飾酶均來自NewEnglandBiolabs)和Smal位點(diǎn)。用T4DNA連接酶將平端PCR產(chǎn)物在用DNA聚合酶I的《/ewow片段補(bǔ)平的五coRI位點(diǎn)處，連接到pPIC9(Invitrogen，LifeTechnologies)載體，得到pBAR14載體。為了制備編碼Fc7RIIa串聯(lián)外結(jié)構(gòu)域的pBAR28載體，pBAR14用S"flBI消化，pBAR14的SwaBI/Smal片段連接于所述SnaBI位點(diǎn)。用于表達(dá)FcryRIIa多聚化的外結(jié)構(gòu)域的桿狀病毒載體以如下方式構(gòu)建編碼F(ryRIIa前導(dǎo)序列和外結(jié)構(gòu)域1及外結(jié)構(gòu)域2的片段通過用五coRI和義6al消化從pVL-1392中獲得(Powell等，1999及Maxwell等，1999),然后連接于4奮飾的pBACPAK9(InvitrogenLifeTech)的五coRIAY&al位點(diǎn)中，其中多克隆位點(diǎn)中的5amHI位點(diǎn)首先通過用SamHI消化去除，用DNA聚合酶的《/ewovv片^殳補(bǔ)平然后再連接。pBAR69載體這種構(gòu)建體用5amHI消化，連接于pBAR28SamHI片段，得到分別編碼Fc7RIIa二聚體、三聚體和四聚體的pBAR71載體、pBAR72載體和pBAR73載體。插入物大小通過五coRI/X6al消化來確定，多聚化5amHI片段的正確取向通過用標(biāo)準(zhǔn)方法的消化來篩選。編碼FcryRIIa單體和二聚體的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體以如下方式制備使用accuprime#PCR(Invitrogen，LifeTechnologies)*/"增Fc7RIIacDNA克隆Hu3.0(Hibbs等，1988和DEFINITION:HomosapiensFcfragmentofIgG,lowaffinityIIa,rec印tor(CD32)(FCGR2A),mRNA,ACCESSIONNM—021642(定義人類IgG的Fc片段，低親和性IIa,受體(CD32)(FCGR2A)，mRNA，ACCESSIONNM—021642)，并按照生產(chǎn)商的說明書利用BPclonaseTM反應(yīng)將FcyRIIacDNA克隆Hu3.0克隆入Gateway載體pDONRTM221(Invitrogen,LifeTechnologies)中，得到pNB6。采用pNB6的聚合酶accuprimep/x連同引物oBWll和oBW302AAG(SEQIDNO:3)的PCR，用消化，用T4連接酶連接，得到編碼具有C-末端六個(gè)組氨酸標(biāo)簽的rsFcryRIIa的pBAR3卯。用5amHI消化pBAR390,連接于pBAR28的5a附HI片段，得到編碼rsFc7RIIa二聚體的pBAR397載體。然后用PraII消化來篩選二聚化5amHI片段的取向以及用ABIBigDye3.1(AppliedBiosytems)測序來證實(shí)目標(biāo)序列。然后用GatewayLR克隆酶反應(yīng)(Invitrogen,LifeTechnologies)^1Fc7RIIa單體(pBAR390)或二聚體(pBAR397)轉(zhuǎn)移入GatewayTM閱讀框架畫A盒(Invitrogen，LifeTechnologies)適合的表達(dá)載體pAPEX3P(Evans等，1995及Christiansen等，1996)中，得到表達(dá)載體pBAR426和pBAR427。同樣地，用GatewayLR酶克隆反應(yīng)將FcryRIIa單體(pBAR390)或二聚體(pBAR397)轉(zhuǎn)移入Gateway閱讀框架-A盒(Invitrogen,LifeTechnologies)適應(yīng)的表達(dá)載體pIRESneo(Clontech)中。圖1示出用于構(gòu)建表達(dá)載體pBAR427的pBAR397內(nèi)的FcryRIIa"首對(duì)尾"二聚體構(gòu)建體的多聚核苷酸序列(及翻譯的氨基酸序列)。氨基酸1至174(也就是第一個(gè)Fc結(jié)合區(qū))和184至362(也就是第二個(gè)Fc結(jié)合區(qū))作為兩個(gè)重復(fù)顯示，且通過Fc7RIIa膜近端莖的短片段(8氨基酸序列；殘基175至182)加另外的纈氨酸殘基(圖1中加下劃線的殘基183)連接。圖1中所示序列的氨基酸-31至-l表示Fc7RIIa的天然前導(dǎo)序列。raFryi//"卓沐;fp二,謬/應(yīng)的斜務(wù)重組可溶性Fc7RIIa(rsFc7RIIa)單體和二聚體多肽在HEK293E細(xì)胞中的表達(dá)根據(jù)生產(chǎn)商的說明書通過在10cn^孔中用5/xg質(zhì)粒DNA(pBAR426,pBAR427)和陽離子脂質(zhì)體2000(Lipofectamine2000)試劑(Invitrogen,LifeTechnologies)或Transiti式劑(BioRadLaboratories)哞爭染來進(jìn)行。48小時(shí)后，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞通過在4jag/ml嘌呤霉素中孵育來選擇。然后噤呤霉素選擇的細(xì)胞在添加1%FCS的CD293培養(yǎng)基(Invitrogen，LifeTechnologies)中生長至靜止期。重組產(chǎn)物隨后通過固定的鎳(Qiagen)或鈷(Clontech)柱色譜純化，用Superdex200或SuperdexG75(Amersham/Pharmacia)尺寸排阻色譜法進(jìn)一步純化。aFc7i//a卓謬^^二,傳/應(yīng)襲/p'^^/量的化凝釆用標(biāo)準(zhǔn)BIAcore測定方案(Wines等，2001;Wines等，2003)對(duì)純化的rsFcyRIIa單體和二聚體進(jìn)行親和性測量；將不同的濃度的rsFcyRIIa單體或二聚體注射在固定的人類IgG單體(Sandoglobulin,Novartis)或熱聚集的IgG(HAGG，Wines等，1988;Wines等，2003)上方60分鐘，之后表面會(huì)重新形成(Wines等，2003)。人類IgG單體在生物傳感器表面的固定化使之成為模擬免疫復(fù)合物的多價(jià)陣列。raFc^/7a卓謬和二菜沐/農(nóng)^伊對(duì);^/4的比較純化的rsF(ryRIIa單體和二聚體用漸增濃度的人類IgG單體(Sandoglobulin)和二聚體-IgG(Wright等，1985)溶液孵育。然后游離受體多肽的量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)BIAcore測定方案通過注射在固定化的人類IgG單體上方進(jìn)行測量。^Pc7i//a卓沐和二菜沐/農(nóng)^^危^復(fù)合務(wù)和乂類勿/《潛合的,尸斜在純化的rsFc7RIIa單體和二聚體不存在和存在時(shí)，通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析(CurrentProtocolsinImmunology(免疫學(xué)通用方法)，WileyInterscience)確定小免疫復(fù)合物(以二聚體-IgG為代表)與人類嗜中性粒細(xì)胞(志愿者VI和V5)的結(jié)合。"Fc^/Az##和二,#/1,,4,于^瘦^合參^^/變的MZ)M^卓核的巨的T7VF為\必的氺尸劍在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，外周單核細(xì)胞從人類血液(志愿者V5)中提取，用全自動(dòng)細(xì)胞分選儀(MiltenyiBiotec)基于CD14表達(dá)進(jìn)行正向分選，并且用不同濃度的小免疫復(fù)合物(以二聚體-IgG為代表)在rsFc7RIIa二聚體(上清中為2.5Mg/ml)不存在和存在下進(jìn)行刺激前，使外周單核細(xì)胞在M-CSF存在下分化24小時(shí)，分化至MDMs(單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞)。然后根據(jù)生產(chǎn)商的方案(BDPharmingen)通過人類TNFELISA測量來自于MDMs的TNF分泌。在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，MDMs在體外從人類血液(這次來自于志愿者Vl)中類似地制備，并且用不同濃度的小免疫復(fù)合物(也就是二聚體-IgG)在rsFc7RIIa二聚體(上清中為2.5jiig/ml)不存在和存在下進(jìn)行刺激前，使外周單核細(xì)胞分化24小時(shí)。mFct///"二,體,農(nóng)^^血V、我付義瘦復(fù)合參活^的^伊賴洗滌過的血小板通過全血的低速離心(Thai等，2003)制備，用熱聚集的IgG(HAGG)刺激。血小板的活化用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法通過P-選擇素(CD62P)增加的表面表達(dá)來測量(Lau等，2004)。結(jié)果^々^蟲勿/《的"^^//""#謬和,果^/炎的^這感染的細(xì)胞上清的蛋白質(zhì)印跡分析證實(shí)了重組可溶的Fc/yRIIa二聚體和三聚體形式的成功制備(圖2)。盡管某些三聚體多肽被檢測到，然而其被大量地裂解成二聚體形式，且四聚體沒有被檢測到，其大量裂解得到二聚體形式。由于FcryRIIa二聚體在本質(zhì)上是最穩(wěn)定的，其在哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)(也就是HEK293E細(xì)胞)中被進(jìn)一步被表征和開發(fā)。然而，由于天然的FcryRIIa可以通過蛋白質(zhì)水解從白纟田月包表面脫落(Astier等，1994),將三聚體、四聚體和更大的多聚體的蛋白質(zhì)水解最小化的一種策略是消除或者更優(yōu)選地，替換連接Fc7RIIa細(xì)胞外區(qū)的膜近端莖(membraneproximalstalk)連4妻子序列。例如，膜近端莖連接子序列的蛋白質(zhì)水解易感性可以通過一或多個(gè)氨基酸修飾(例如一或多個(gè)氨基酸取代、刪除和/或添加)或通過用合成的連接子序列例如對(duì)蛋白質(zhì)水解具有低易感性的GGGGSGGGGS(SEQIDNO:4)替換那個(gè)連接子序列來降低。成功制備三聚體、四聚體和更大多聚體的另一種策略是通過化學(xué)交聯(lián)將已表達(dá)的二聚體多肽連接到一或多個(gè)單體或其它二聚體多肽。FcyRIIa二聚體的多聚體也可以通過將二聚體多肽表達(dá)為一種具有Fc結(jié)構(gòu)域(例如，IgGFc結(jié)構(gòu)域)的融合蛋白質(zhì)來制備，此融合蛋白質(zhì)本身是二聚的，因此可以和任一融合伴侶發(fā)生二聚化。來々f^#乙動(dòng)參勿/敏的^Pry///a##;^二菜謬>妖的《這純化的rsFc^RIIa單體的蛋白質(zhì)產(chǎn)率是3mg/1(pBAR426構(gòu)建體)，rsF(ryRIIa二聚體的產(chǎn)率是0.5mg/1(pBAR427構(gòu)建體)。圖3示出收集自rsF(ryRIIa單體和二聚體純化物的部分的考馬斯染色的SDS-PAGE(12%丙烯酰胺凝膠，在非還原的條件下)。rsFc^RIIa單體具有30kDa(a)的期望大小，rsFcryRIIa二聚體具有60kDa(b)的期望大小。^Fryi//a卓體f口二菜傳,炎^和'/^承y量的^凝測定的結(jié)果示于圖4和圖5中。所述測定表明rsFc7RIIa單體具有單結(jié)合性位點(diǎn)，其對(duì)人類IgG單體的親和離解常數(shù)(Ko)為1.7iuM,對(duì)HAGG為1.05pM。在rsFc7RIIa二聚體的情況中，結(jié)合數(shù)據(jù)很好地符合了兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)模型，其對(duì)固定的人類IgG單體的親和離解常數(shù)(Kd)為3.2nM(Km)和100nM(KD2);對(duì)HAGG為2.73nM(KD1;比單聚rsFc7RIIaKD小將近300倍)和99nM(KD2)。^Fc^//fl卓謬和二果沐/應(yīng)"/伊斜活嫂的化較所進(jìn)行的比4交rsFcryRIIa單體和二聚體多肽抑制活性的實(shí)-瞼顯示，在溶液中rsFc7RIIa單體(圖6a)并不區(qū)分人類IgG單體和小免疫復(fù)合物(即由二聚體-IgG為代表的)。相比之下，rsFc7RIIa二聚體(圖6b)在溶液中選擇性地與小免疫復(fù)合物(也就是二聚體-IgG)而不是人類IgG單體結(jié)合。/xFc^//a卓##口二菜#/妖^t^瘦復(fù)合參與人類細(xì)i^潛合的^尸劍抑制測定的結(jié)果示于圖7a和圖7b中，其表明rsFcryRIIa二聚體27(IC5。=1.1pg/ml)在抑制小免疫復(fù)合物(也就是二聚體-IgG)與人類嗜中性粒細(xì)胞結(jié)合方面比rsFcryRIIa單體(ICs『10.5pg/ml)的活性高十倍。結(jié)果還顯示rsFcryRIIa二聚體對(duì)小免疫復(fù)合物(二聚體-IgG)與人類嗜中'性粒細(xì)胞結(jié)合的抑制在來自于兩個(gè)不同個(gè)體的嗜中性粒細(xì)胞上是可復(fù)制的，其ICs。值為0.9-1.1|ig/ml。mFc^//"卓謬和二,舉,應(yīng),^求々；fA瘦復(fù)合參冉激的MDM^卓核的^勿應(yīng))的為\必的#尸*結(jié)果示于圖8a和圖8b中。rsF(ryRIIa二聚體看起來抑制了TNF從免疫復(fù)合物(也就是二聚體-IgG)刺激的分化24小時(shí)的人類MDMs中的分泌。raFryi//fl二菜伴多戚^A血V、^的^^€復(fù)合#活化的押劍洗過的人類血小板在30pg/ml的rsFcryRIIa二聚體存在和不存在時(shí)，用HAGG(IOpg/ml)孵育30分鐘。如圖9所示，發(fā)現(xiàn)在rsFcyRIIa二聚體存在時(shí)血小板的活化被抑制，如P-選擇素(CD62P)的較少表達(dá)所iiL明的。討論以單聚(rsFc7RIIa單體)和二聚(rsFcryRIIa二聚體)形式的重組可溶性Fc7RIIa在HEK293E細(xì)胞中成功表達(dá)。BIAcore平衡結(jié)合測定表明rsFc7RIIa二聚體對(duì)固定的IgG(Sandoglobulin)具有強(qiáng)于單聚受體~300倍的親和力(也就是在與固定的IgG作用中，rsFc7RIIa單體具有1pM的KD，rsFcryRIIa二聚體具有3nM的KD)。用BIAcore的竟?fàn)帉?shí)驗(yàn)還表明所述rsFcr/RIIa二聚體選擇性地與結(jié)合小免疫復(fù)合物，且選擇性抑制活性用來自于兩個(gè)捐獻(xiàn)者的嗜中性粒細(xì)胞在基于細(xì)胞的測定中得到證實(shí)。所述rsFc^RIIa二聚體還^皮證明作為小IgG免疫復(fù)合物結(jié)合的抑制劑比rsFc7RIIa單體強(qiáng)約10倍，且在標(biāo)準(zhǔn)血小板測定中，所述rsFcRIIa二聚體被觀察到完全抑制血小板的免疫復(fù)合物活化(也就是rsFcryRIIa二聚體是細(xì)胞活化的強(qiáng)有力抑制劑)。因此本發(fā)明所述的rsFc^RIIa二聚體和其它可溶的多聚蛋白質(zhì)和多肽被認(rèn)為對(duì)IC-介導(dǎo)的炎癥性疾病如RA和SLE的治療顯示出可觀的前景。實(shí)施例2rsFc7RIIa二聚體多肽的制備、純化和表征材料和方法aFc7i//a二果沐>I的*務(wù)如實(shí)施例1中所述的Fc7RIIa二聚體構(gòu)建體在經(jīng)修飾的CMV啟動(dòng)子的調(diào)控下被克隆入哺乳動(dòng)物表達(dá)載體。然后穩(wěn)定的CHO-S轉(zhuǎn)染物通過如下方式建立收集90%匯合的CHO-S細(xì)胞，洗滌三次，將15ml培養(yǎng)基中的2xl0個(gè)細(xì)胞分散至10cm培養(yǎng)皿(petridishes)。然后將線性化DNA-陽離子脂質(zhì)體2000(LinearisedDNA-lipofectamine2000)復(fù)合物(1:2.5比例)在室溫下孵育5分鐘，逐滴加入到細(xì)胞中。隨后，細(xì)胞在37°C孵育48小時(shí)，然后以在CD-CHO培養(yǎng)基中的有限稀釋鋪于96-孔板中，所述培養(yǎng)基補(bǔ)充有600pg/ml潮霉素B、8mML-谷氨酸、lxHT添加物和50pg/ml葡聚糖碌lJ吏醋。細(xì)胞用標(biāo)準(zhǔn)ELISA法篩選以檢測可溶的FcryRIIa蛋白，最高表達(dá)株通過有限稀釋再次亞克隆。一個(gè)克隆(#6)分泌約40mg/L的FcryRIIa二聚體，于30°C下在振蕩燒瓶中孵育進(jìn)行最優(yōu)化的蛋白表達(dá)。包含rsF(yyRIIa二聚體的上清通過正切流動(dòng)過濾(Tangentialflowfiltration)濃縮，在20mMpH為7.4的磷酸鈉緩沖液中^皮交換。然后所述樣品在20mM磷酸鈉和0,5M氯化鈉中稀釋4倍，通過HisTrapFF2x5ml柱(GEHealthcare),在20mM磷酸鈉、0.5MpH為7.4的氯化鈉和100mM咪唑中洗脫來純化。透析洗脫的物質(zhì)并通過采用25mlQFF柱(GEHealthcare)、150mM氯化鈉洗脫的離子交換色譜來純化。然后純化的物質(zhì)在磷酸緩沖鹽中透析。^Fc7i/7a二果伴/戚/,/^(GG與Fc7///6潛合的逸錄純化的rsFc7RIIa二聚體阻斷免疫復(fù)合物與細(xì)胞表面FcyyRIIb結(jié)合的能力通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)測定來評(píng)估。熱聚集的IgG(HAGG)與不同濃度的rsFcyRIIa二聚體或rsFc7RIIa單體(R&DSystems,Cat存1330-CD/CF)在4°C孵育1小時(shí)。然后將這些混合物加入到包含105個(gè)用人類Fcr/RIIb轉(zhuǎn)染的IIA1.6細(xì)胞的96-孔板中(IIA1.6是缺乏內(nèi)源Fc7R表達(dá)的小鼠B淋巴瘤株)。所述板在4。C孵育1小時(shí)，洗滌，然后用抗hlgG-FITC偶聯(lián)物著色以檢測已結(jié)合的HAGG。洗滌后，細(xì)胞用標(biāo)準(zhǔn)方法在FACS掃描流式細(xì)胞儀上分析。/xPc^//a二,謬/應(yīng)對(duì)/^GG-漆發(fā)的AV、^活化的膽?zhàn)N血小板與HAGG的接觸導(dǎo)致了通過FcryRIIa的活化，引起P-選擇素(CD62P)的上調(diào)。rsFc7RIIa二聚體或rsFc7RIIa單體阻斷這種激活的能力通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)測定來評(píng)估。熱聚集IgG(HAGG)與不同濃度的rsFc7RIIa二聚體或rsFcryRIIa單體(R&DSystems,Cat弁1330-CD/CF)在4。C孵育1小時(shí)。然后將所述混合物加入到包含3xl0個(gè)人類血小板的96-孔板中，所述血小板事先洗滌過且重懸在添加有1mMEDTA的Tyrodes/Hepes緩沖液中。在室溫下孵育30分鐘后，將所述細(xì)胞洗滌、固定且用標(biāo)準(zhǔn)方法著色以進(jìn)行CD62P和GPIIb(CD41)表達(dá)的檢測，在FACS掃描流式細(xì)胞儀上分析。aFc7i//a二,^,應(yīng)逸辟義瘦復(fù)合4^資發(fā)'的MG9法化MC/9是Fc7R-陽性的鼠肥大細(xì)胞系，其接觸免疫復(fù)合物后，會(huì)活化且釋放TNF-a。使用由卵白蛋白和抗卵白蛋白抗體(OVAICs)組成的作為刺激物的免疫復(fù)合物來評(píng)價(jià)rsFcr/RIIa二聚體或rsFcryRIIa單體阻斷這種活化的能力。OVAICs(10!ig)與不同濃度的rsFcryRIIa二聚體或rsFc7RIIa單體(R&DSystems，Cat弁1330-CD/CF)在室溫下孵育1小時(shí)。然后將所述混合物加入到包含2xl()S個(gè)MC/9細(xì)胞的96-孔板中，在37。C孵育過夜。收集上清，使用商業(yè)ELISA試劑盒(BDBiosciences)測量TNF-a的量。MFryi//"二,傳^入類Fc7///a脊染的V、處模型哞#刺謬發(fā)#^，^使用人類FcryRIIa轉(zhuǎn)基因小鼠的關(guān)節(jié)炎模型來評(píng)估rsFcryRIIa二聚體的活性，所述轉(zhuǎn)基因小鼠在已公布的PCT申請(qǐng)WO03/104459中被30描述，通過引用的方式將該申請(qǐng)并入本文。這些小鼠表達(dá)編碼人類Fc7RIIa的轉(zhuǎn)基因。直到溶于PBS中的單克'隆抗體M2139的單次2mg劑量給藥后的至少第四天才引起這些小鼠發(fā)生臨床明顯的關(guān)節(jié)炎疾病(用標(biāo)準(zhǔn)關(guān)節(jié)炎指數(shù)確定)，所述溶于PBS中的M2139是與膠原II的Jl表位，氨基酸551-564特異性結(jié)合的IgG2a。所述單克隆抗體是由被證明為致關(guān)節(jié)炎的雜交瘤纟田月包來制備的(Amirahmadi等，爿W力n7/sawJi/zewma"sm(關(guān)節(jié)炎和風(fēng)濕病)，2005年6月；Nandak腿ar等，A,Anto7e廳rc/z朋d772era"(關(guān)節(jié)炎研究和治療)，2004年5月)。所述小鼠是使用如圖1所示的可溶性FcryRIIa二聚體以如下步驟處理的四只Fcr/RIIaTg小鼠用0.5mg可溶性Fc7RIIa二聚體注射，四只小鼠的對(duì)照組則經(jīng)腹腔注射給予PBS。兩小時(shí)后，兩組均注射2mgM2139(經(jīng)腹腔注射)和1mg快速注射劑量(bolusdose)的二聚體或PBS。在注射M2139后的24小時(shí)和48小時(shí)再次給予二聚體(0.5mg/劑量)。關(guān)節(jié)炎被常規(guī)評(píng)分，最大可能分值是12。四個(gè)腳爪評(píng)分的和，每一個(gè)為0-3分(0=正常；1=一個(gè)受累的關(guān)節(jié)，紅斑，輕微腫脹；2=兩個(gè)或更多受累的關(guān)節(jié)，踝/腕腫脹；3=所有關(guān)節(jié)均受累，喪失活動(dòng)性/關(guān)節(jié)強(qiáng)硬，深度紅斑和水腫)。結(jié)果^Fc^//a二果傳/農(nóng)的*務(wù)圖10示出純化的rsFqRIIa物質(zhì)的分析，包括SDS-PAGE(在還原和非還原的條件下)、用抗Fc7RIIa抗體(R&DSystems,目錄號(hào)AF1875)和作為才企測抗體的兔抗山羊IgG過氧化物酶的蛋白質(zhì)印跡，以及HPLC。所述多肽在期望的分子量(50kD)處遷移出單帶，與抗FcryRIIa抗體反應(yīng)，且通過HPLC確定純度大于96%。^Fc^/Az二菜伴/應(yīng)逸辨/ZJGG與Fryi/仏的潛合HAGG結(jié)合測定的結(jié)果示于圖11中。rsFc7Rna二聚體和rsF(ryRIIa單體均能夠完全阻斷HAGG與細(xì)胞表面FcryRIIb的結(jié)合。然而，rsFcyyRIIa二聚體(IC5。二3.9ng/ml)的效力比單體蛋白質(zhì)(IC5o二2082ng/ml)的效力超過500倍。^Fr^Z/a二,舉/炎逸辟/^GG滲爭的iV、我活化血小板活化測定的結(jié)果示于圖12中。用HAGG單獨(dú)處理后活化的血小板的百分比定義為100%。rsF(ryRIIa二聚體和rsFc7RIIa單體均能夠顯著降低HAGG誘導(dǎo)的CD62P的上調(diào)。滴定法顯示rsFcryRIIa二聚體(ICs『3.9/ig/ml)比rsFc7RIIa單體(ICs『20.9Mg/ml)強(qiáng)5倍。二菜伴/戚膽?zhàn)N名瘦f合參謬爭的MC/9話/AMC/9活化測定結(jié)果示于圖13中。用OVAICs單獨(dú)孵育后TNF-ce的釋放量定義為100%。rsFc7RIIa二聚體和rsFc7RIIa單體均能夠完全抑制免疫復(fù)合物誘導(dǎo)的TNF-ce釋放。滴定法顯示rsFc7RIIa二聚體(IC50=2.1/ig/ml)比rsFc7RIIa單體(1(]50=17.7/ig/ml)強(qiáng)8倍。二,謬^乂類Fc7i//a脊差^的V、處模型#浙劍滲發(fā)#^貫義如圖18中所示，rsF(ryRIIa二聚體的給藥提供了關(guān)節(jié)炎分值顯著的下降。另一個(gè)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了二聚體介導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎分值的下降，雖然以不太顯著的方式。討論所述rsFcryRIIa二聚體在CHO-S細(xì)胞中成功地表達(dá)。還原條件下和非還原條件下的SDS-PAGE顯示純化的rsFcryRIIa二聚體大小接近50kDa,蛋白質(zhì)印跡顯示二聚體被抗Fc7RIIa抗體特異性地結(jié)合。rsFcryRIIa二聚體通過HPLC確定的純度為96%。rsFcr/RIIa二聚體和rsFc7RIIa單體均完全阻斷HAGG與細(xì)胞表面FcryRIIb的結(jié)合，且rsFc7RIIa二聚體具有比rsFc7RIIa單體高將近500倍的阻斷效率。類似地，rsFcyRIIa二聚體和rsFc7RIIa單體均顯著降低了HAGG誘導(dǎo)的血小板活化，且二聚體顯示出比rsFc7RIIa單體高將近5倍的效率。進(jìn)一步地，通過TNF-O!釋放測量，rsFqRIIa二聚體和rsFc7RIIa單體均抑制了小鼠肥大細(xì)胞系(MC/9)活化，且二聚體顯示出比單體強(qiáng)8倍的效率。重要的是，rsFc7RIIa二聚體在誘發(fā)性關(guān)節(jié)炎的小鼠模型中減輕了關(guān)節(jié)炎，表明了其在體內(nèi)的功效。實(shí)施例3包含衍生自IgG,的Fc結(jié)構(gòu)域的rsFc7RIIa融合多肽的設(shè)計(jì)和表達(dá)材料和方法"Fr/i//"融合錄4這裁體的一々建編碼可溶性單體FcryRIIa或可溶性二聚體FcryRIIa的多肽獨(dú)立地融合于編碼IgG廣Fc7l(L234A，L235A)的多聚核芬酸。在共價(jià)連接兩個(gè)Fc部分下絞鏈區(qū)的鏈間二硫鍵N-末端側(cè)的位置，將可溶性單體Fc7RIIa多肽的C-末端可操作地融合于人類IgGi多肽。這個(gè)位置的融合形成單聚的Fc7RIIa-IgG廣Fc7l(L234A，L235A)融合蛋白，所述蛋白由于共價(jià)連接的Fc結(jié)構(gòu)域之間的相互作用會(huì)與另一個(gè)Fc結(jié)構(gòu)域二聚化。所述IgG絞鏈區(qū)以其柔性而出名，包含F(xiàn)c結(jié)合區(qū)的多肽與下絞鏈區(qū)鏈間二硫鍵的N-端側(cè)的融合允許Fc結(jié)合區(qū)進(jìn)行相當(dāng)自由的運(yùn)動(dòng)。相似地，在共價(jià)連接兩個(gè)Fc部分的下絞鏈區(qū)的鏈間二石克4建N-末端側(cè)的位置，將可溶性二聚體Fc7RIIa多肽的C-末端可操作地融合于人類IgG,多肽。編碼可溶性單體FcryRIIa或可溶性二聚體Fc7RIIa的多聚核香酸以與先前在國際專利說明書第WO96/08512號(hào)中描述的方式等同的方式獨(dú)立地融合于編碼人類血清蛋白(HSA)的多聚核苷酸。如上述專利說明書所公開的，HSA融合于rsFc^RIIa單體的N-末端。以相似的方式，所述HSA融合于rsFcryRIIa二聚體的N-末端。編碼不同融合多肽或蛋白質(zhì)的多聚核苷酸用標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)可操作地4吞入到Papex3P-xDEST。raFcy7/a卓沐和,？Fcy^/a二,'體/融》#的賴備rsFcryRIIa單體和二聚體融合物表達(dá)載體用標(biāo)準(zhǔn)方法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到CHOP細(xì)胞中、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到293E細(xì)胞中。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的CHOP細(xì)胞上清用抗Fc7RIIa抗體8.2(Powell等，1999)進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)，免疫沉淀物進(jìn)行非還原的SDS-PAGE(12%)。然后用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析，兔抗FcryRIIa抗體(Maxwell等，1999)作為一抗且抗兔Ig-HRP作為二抗。合參進(jìn)行HAGG-捕獲ELISA以測量rsFc7RIIa融合物的Fc結(jié)合活性。為檢測rsFc7RIIa單體融合物的結(jié)合活性，滴定已知的FcyRIIa單體標(biāo)準(zhǔn)品(Powell等，1999)(以0.75|ig起始)和來自于rsFc7RIIa單體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的蛋白(轉(zhuǎn)染426)，與來自于用融合于IgG-Fcyl(L234A，L235A)的rsFcyRIIa單體(單體-Fc)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的蛋白和來自于用融合于HSA的rsFc7RIIa單體(HSA-單體)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的蛋白進(jìn)行結(jié)合性比較。為檢測rsFcryRIIa二聚體融合物的結(jié)合活性，滴定已知的Fc7RIIa二聚體標(biāo)準(zhǔn)品(以0.5i!g/ml起始)和來自于rsFcryRIIa二聚體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(轉(zhuǎn)染427)的蛋白，并與來自于用融合于IgG-Fql(L234A，L235A)的rsFcryRIIa二聚體(二聚體-Fc)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的蛋白和來自于用融合于HSA的rsFc7RIIa二聚體(HSA-二聚體)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的蛋白進(jìn)行結(jié)合性比較。#獲標(biāo)蕃￡"丄/&4fa^we-JVzg五ZJ&4)^fy會(huì)烤脊染的C/ZO尸勿應(yīng)J:清的raFqi^/a融合錄采用標(biāo)準(zhǔn)ELISA方法，板用抗FcryRIIa抗體8.2包被。將所述rsFc7RIIa融合物加入到孔中，且與所述8.2抗體接觸。二抗為抗FcryRIIa抗體8.7-HRP(Powell等，1999;Ierino等,1993a),其與抗體8.2特異于不同的FqRIIa抗原表位。所測試的單聚rsFcryRIIa樣品包括已知的rsF(ryRIIa單體.(以0.75pg/ml起始的單體標(biāo)準(zhǔn)物)、來自于rsFc7RIIa單體轉(zhuǎn)染細(xì)胞(轉(zhuǎn)染426)的上清、來自于用融合于IgG-Fcyl(L234A，L235A)的rsFc，IIa單體(單體-Fc)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的上清和來自于用融合于HSA的rsFc7RIIa單體(HSA-單體)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的上清。所測試的二聚rsFcr/RIIa樣品包括已知的rsFc7RIIa二聚體(以0.5Hg/ml起始的二聚體標(biāo)準(zhǔn)品)、來自于rsFcryRIIa二聚體轉(zhuǎn)染細(xì)胞(轉(zhuǎn)染427)的上清、來自于用融合于IgG-Fcryl(L234A,L235A)的rsF(ryRIIa二聚體(單體-Fc)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的上清和來自于用融合于HSA的rsFc7RIIa二聚體(HSA-單體)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的上清。結(jié)果^Pc^/7a卓沐和二,舉廚合的表這才艮據(jù)純化的rsFcyRIIa單體和rsF(ryRIIa二聚體的活性，分泌的所述rsFc7RIIa單體-IgG-Fcryl(L234A，L235A)融合物的水平(在293E細(xì)胞中約為12pg/ml)高于所述rsF(ryRIIa二聚體-IgG-Fcryl(L234A,L235A)融合物的水平(在293E細(xì)胞中約4|ng/ml)。如圖14所示，蛋白質(zhì)印跡分析表明所述融合蛋白以期望的分子量大小在上清中存在，且它們可以被成功制備為無降解產(chǎn)物跡象的獨(dú)特蛋白。合參如圖15(a)中所示，融合于IgG-Fc7l(L234A，L235A)的rsFc7RIIa單體在測定中出現(xiàn)可4全測地結(jié)合，融合于HSA的rsFcr/RIIa單體(HSA-單體)則被觀察到結(jié)合很弱。此結(jié)果可以通過下述事實(shí)加以解釋通過融合的Fc結(jié)構(gòu)域重鏈間的二聚化導(dǎo)致融合于IgG-Fcryl(L234A,L235A)的rsFcryRIIa單體為二聚體，而融合于HSA的rsFc7RIIa單體對(duì)Fc結(jié)合區(qū)而言仍然是單體的。如圖15(b)中所示，融合于IgG-F(yyl(L234A,L235A)的純化的rsFc7RIIa二聚體(二聚體-Fc)顯示出與二聚體標(biāo)準(zhǔn)品相似的結(jié)合活性，融合于HSA的rsFc7RIIa二聚體(HSA-二聚體)具有可檢測的但較低的結(jié)合活性。在此實(shí)施例中，由于融合的Fc結(jié)構(gòu)域重鏈間的二聚化，融合于IgG-Fcryl(L234A,L235A)的rsFc7RIIa二聚體對(duì)于Fc結(jié)合區(qū)是四聚的(或者"四價(jià)的，，)，而融合于HSA的rsFc^RIIa二聚體對(duì)Fc結(jié)合區(qū)仍然是二聚的。(T印^"e-tog￡X/&4」^7f脊染的勿應(yīng)丄清^融合參的趁都如圖16(a)中所示，融合于IgG-Fc71(L234A，L235A)的rsFryRIIa單體和融合于HSA的rsFcryRIIa單體在該測定中均被捕獲并是可檢測的。如圖16(b)中所示，融合于IgG-Fcryl(L234A，L235A)的rsFcryRIIa二聚體和融合于HSA的rsFcryRIIa二聚體在該測定中也都被捕獲并是可檢測的。明顯地，用于捕獲這些受體的8.2抗原表位和用于檢測捕獲的受體的8.7抗原表位都是完整的，表明了融合物的正確折疊。討論所述rsFcryRIIa單體和rsFc7RIIa二聚體融合構(gòu)建體從載體p-APEX3P-xDST中表達(dá)，在CHOP細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)以及在293E細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。所表達(dá)的融合物在蛋白質(zhì)印跡上沒有降解產(chǎn)物的跡象，呈現(xiàn)為清晰蛋白條帶。融合于IgG-Fcryl(L234A,L235A)的rsFc7RIIa二聚體可以顯示出比其單體對(duì)應(yīng)物較低的表達(dá)水平。然而，如蛋白質(zhì)印跡(圖14)所確定的，融合于HSA的rsFc7RIIa二聚體的表達(dá)水平與融合于HSA的rsFc7RIIa單體的表達(dá)水平近似等同，因此作為大量制備rsFc7RIIa二聚體的方式顯示出可觀的前景。令人感興趣的是，rsFc7RIIa二聚體融合物顯示出比其單體對(duì)應(yīng)物更高的HAGG和抗FcryRIIa抗體8.2結(jié)合活性。如上所述，這可以通過下述事實(shí)加以解釋rsFc^RIIa二聚體融合物對(duì)Fc結(jié)合區(qū)為二聚的或四聚的(在融合于IgG-Fc71(L234A,L235A)的rsFc7RIIa二聚體的例子中)，因此rsFc7RIIa二聚體融合物由于這種多價(jià)性具有較高的表觀結(jié)合親和性(親和力)。四聚的分子被預(yù)期可以以結(jié)合基本上為不可逆的這種親和性與免疫復(fù)合物結(jié)合。實(shí)施例4包含衍生自IgG2a的Fc結(jié)構(gòu)域的rsFr/RIIa融合多肽的設(shè)計(jì)和表達(dá)在此實(shí)施例中，使用修飾的鼠IgG2a的Fc結(jié)構(gòu)域?yàn)槿诤习閭H制備rsFc7RIIa二聚體融合蛋白。所述二聚體融合蛋白被指定為D2。將此蛋白的活性與缺乏融合伴侶的rsFcryRIIa二聚體(如實(shí)施例1和實(shí)施例2所描述的)進(jìn)行比較，且與rsFc7RIIa單體融合蛋白比較，其中所述融合伴侶為修飾的鼠IgG2aFc結(jié)構(gòu)域。,逾T溶'/4"^FcY^Z/aFcP"蛋^|的沒D2蛋白翻譯后的氨基酸序列(SEQIDNO:8)和核苷酸序列分別示于圖19和圖20中。所述D2蛋白包括由天然Fcr/RIIa信號(hào)序歹'j(氨基酸l-31)、Fcr/RIIa蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(氨基酸32-205)、對(duì)應(yīng)于Fcr/RIIa膜近端莖的短連接子加上另外的纈氨酸殘基(殘基206-214)、另一個(gè)FcryRIIa蛋白(殘基215-385)、膜近端莖連接子的重復(fù)(殘基386-393)和小鼠IgG2aFc結(jié)構(gòu)域(絞鏈-CH2-CH3)區(qū)(殘基394-625)組成的多肽的二聚體。所述IgG2aFc結(jié)構(gòu)域包含下列四種突變，其^皮引入以減少Fc受體結(jié)合和補(bǔ)體結(jié)合亮氨酸-413突變?yōu)楣劝彼?對(duì)應(yīng)于EU編碼系統(tǒng)中的235位)、谷氨酸-496突變?yōu)楸彼?對(duì)應(yīng)于EU318位)、賴氨酸-498突變?yōu)楸彼?對(duì)應(yīng)于EU320位)及賴氨酸-500突變?yōu)楸彼?對(duì)應(yīng)于EU322位)。/^^迷我'謬的#建編碼人類Fc7RIIa的信號(hào)肽和細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的cDNA通過PCR擴(kuò)增，使用先前構(gòu)建的質(zhì)粒(Fc7RIIa-d/pAPEX-dest)為模板并使用如表1所示的引物1和引物4。突變的小鼠IgG2aFc區(qū)通過PCR擴(kuò)增，使用先前構(gòu)建的質(zhì)粒(CD200IgG2aFc-d)為模板、如表2所示的引物2和引物3。表2用于質(zhì)粒構(gòu)建的引物(限制酶位點(diǎn)加下劃線)<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>然后通過4吏用引物1和引物2的重疊PCR(overlappingPCR)擴(kuò)增Fc7RIIa和修飾的小鼠IgG2aFcPCR產(chǎn)物。在1mMMgS04、0.4mM的每種dNTP、20pM每種引物和100ng模板DNA中，使用白金牌(platinum)尸/xDNA聚合酶(Invitrogen)在下列條件下進(jìn)行擴(kuò)增在94°C起始熔解(initialmelting)5分鐘，接著進(jìn)行30個(gè)由94。C1.5分鐘、然后65。C2分鐘，然后72。C3分鐘組成的循環(huán)。隨后將此反應(yīng)在72°C保持10分鐘，冷卻到4°C。反應(yīng)產(chǎn)物通過0.7%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，用溴化乙4走顯影。通過采用QIAquick凝月交提取試劑盒(Qiagen)，將感興趣的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切除并純化。此純化的PCR產(chǎn)物用A^e/和爿ge/限制酶消化，用QiaquickPCR純化試劑盒(Qiagen)純化。然后通過T4DNA連接酶將所述片段連接到已被用iWe/和爿ge/進(jìn)行了相似消化的pMPG表達(dá)質(zhì)粒中。然后根據(jù)生產(chǎn)商的說明，將連接反應(yīng)物(ligationreaction)(5pl)轉(zhuǎn)化入50|il感受態(tài)大腸桿菌C&c/^n'c/^(3co/z〕D/Z5a纟田胞(Invitrogen)中。將轉(zhuǎn)化物鋪于含有100iug/ml氨比西林的LB-瓊脂板中，接著在37。C孵育16小時(shí)。通過小量制備法(mini-prep)從小量大腸桿菌(E.co")培養(yǎng)物中純化質(zhì)粒DNA，并證實(shí)DNA序列。得到的表達(dá)質(zhì)粒pMPG-D2FqRnA-IgG2aFc的示意圖顯示于圖21中。4這"2^C//6>^謦的y^^:使用質(zhì)粒Maxi試劑盒(Qiagen)，從大腸桿菌的大量培養(yǎng)物中分離pMPG-D2Fc7RIIa-IgG2aFc質(zhì)粒DNA,用la/使其線性化，并通過使用QIAGENTips純化所述質(zhì)粒DNA。使用陽離子脂質(zhì)體(Lipofectamine2000)試劑用線性化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染在無血清的化學(xué)成分明確的培養(yǎng)基中生長的CHO-S細(xì)胞。48小時(shí)后，所述細(xì)胞在包含600pg/ml潮霉素B的培養(yǎng)基中在不同濃度(10000、5000或2000細(xì)胞/孔)下轉(zhuǎn)移到96-孔板中?？顾幍墓芽寺⊥ㄟ^ELISA用如下步驟篩選96-孔板用100pl山羊抗小鼠IgGFc(Sigma)包被，在4。C孵育過夜。洗滌所述孔，用200pl溶于PBST中的2%BSA在室溫下封閉1小時(shí)。洗滌后，將100pl樣品用溶于PBST中的1。/。BSA稀釋，加入到孔中，孵育1小時(shí)，洗滌，然后用HRP-偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG(Fc特異性)(Sigma)在室溫下孵育1小時(shí)。洗滌所述孔，加入TMB底物，在室溫下孵育3至5分鐘。在450nm處測量吸光度，用已知量的純化的小鼠IgG或D2Fc7RIIa-IgG2aFc構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。上清樣品還通過SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行分析。對(duì)于SDS-PAGE,樣品重懸于有或沒有2-ME的樣品M^沖液中，并在95。C加熱IO分鐘，在冰上冷卻。然后在8%SDS-PAGE凝膠中分離所述樣品。隨后根據(jù)生產(chǎn)商的說明用考馬斯亮藍(lán)(CoomassieBlue)染所述凝膠。對(duì)于蛋白質(zhì)印跡，如上所述制備樣品并在SDS-PAGE上分離樣品，然后在100V下轉(zhuǎn)膜1小時(shí)，將樣品轉(zhuǎn)移到ImmunoBlotPVDF膜(Bio-Rad)上。將所述膜在溶于PBS/0.1%吐溫-20中的5%脫脂奶粉中封閉1小時(shí)，用0.2嗎/ml山羊抗人的FcryRIIa抗體(R&DSystems)孵育1小時(shí)，并用HRP-偶聯(lián)的兔抗山羊IgG(來自Sigma的完整分子)孵育1小時(shí)，然后用TMB底物(VectorLaboratoriesInc)顯色。另一個(gè)有限稀釋在含有600pg/ml潮霉素B的培養(yǎng)基中以較低的不同濃度(0.25和0.5細(xì)胞/孔)進(jìn)行。2至3周后，抗藥的克隆再次通過ELISA進(jìn)行重組蛋白產(chǎn)量的評(píng)價(jià)，并且通過蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行檢驗(yàn)。蛋^的遂化39CHO轉(zhuǎn)染物在37°C下生長于振蕩燒瓶中。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到1.5xl06至2xl()G個(gè)細(xì)胞/ml的濃度時(shí)，在不斷的攪拌下將它們在30。C孵育7至10天。收集上清，在4°C以3000xg離心30分鐘，通過一系列不同的高壓滅菌的膜過濾器孔徑(5.0至0.2iim)過濾。采用BioMaxlO膜的正切流動(dòng)過濾(Millipore)用于濃縮上清，并在pH為7.8的20mMNa-P/148mMNaCl中進(jìn)行緩沖液交換。然后將所述物質(zhì)用結(jié)合緩沖液(20mMNa-P&3MNaCl,pH7.8)稀釋9倍，以4ml/min加載到蛋白A柱(ProteinAcolumn,GEHeathcare)上，4°C過夜。所述柱用結(jié)合緩沖液(20體積，5ml/min)洗滌，且用0.1MpH為4.0的檸檬酸以2ml/min洗脫蛋白質(zhì)。將洗脫的物質(zhì)的pH調(diào)節(jié)至中性，在4LpH為6.0的10mM的Na-P中于4°C透析過夜。然后將其加載到大量制備(macro-prep)的40iim陶瓷羥磷灰石II型(CHTII)柱(Bio-Rad)上。用結(jié)合緩沖液洗滌柱后，將所述蛋白用pH為6.0的10mMNa-P、500mMNaCl洗脫(所有操作均在5ml/min的流速下)。然后在4°C下將洗脫的物質(zhì)在3X4LpH為7.4的PBS中透析。蛋白濃度通過280nM(1.34消光系數(shù)(extinctioncoefficient)))處的吸光度確定。圖22A顯示了最終純化的物質(zhì)的SDS-PAGE分析。蛋白質(zhì)印跡分析示于圖22B中。蛋^膽銀龍瘦復(fù)合務(wù)漆發(fā)的MC/9應(yīng)義勿應(yīng)活^在MC/9肥大細(xì)胞測定中，檢測了D2蛋白阻斷免疫復(fù)合物介導(dǎo)的Fcry受體活化的能力。MC/9是FcryR-陽性的鼠肥大細(xì)胞系，其暴露于免疫復(fù)合物后會(huì)活化且釋放TNF-a。10pg卵白蛋白-抗卵白蛋白免疫復(fù)合物(OVAICs)在室溫下用純化的D2孵育1小時(shí)。OVAICs也用純化的BIF(如實(shí)施例1和實(shí)施例2中所述的缺少Fc標(biāo)簽的D2的變體)和純化的M2蛋白(僅包含融合于修飾的IgG2aFc結(jié)構(gòu)域的單F(ryRIIa亞基的D2的變體)孵育。然后將所述混合物加入到包含2xl()S個(gè)MC/9細(xì)胞的96-孔板中，在37。C孵育過夜。收集上清，用商業(yè)ELISA試劑盒測量TNF-a量。結(jié)果示于圖23中，其中將無處理時(shí)釋放的TNF-a量定義為100%。所述D2和M2蛋白及rsFcryRIIa二聚體多肽完全抑制了OVAIC介導(dǎo)的活化。然而所述D2蛋白比非-Fc標(biāo)記的(non-Fctagged)二聚體強(qiáng)3倍，比Fc-標(biāo)記的單體(M2)強(qiáng)12倍。蛋冷^嗜哞^在勿/敏法化溯/;t^逸錄A^復(fù)合錄介導(dǎo)^Fr^的活化還在嗜中性粒細(xì)胞活化測定中，檢測了D2蛋白阻斷免疫復(fù)合物介導(dǎo)的Fc7R受體的活化的能力。靜止的人嗜中性粒細(xì)胞表達(dá)FcryRIIa和FcryRHb，且被免疫復(fù)合物活化時(shí)，快速失去L-選擇素(CD62L)的細(xì)胞表面表達(dá)。將OVAICs(100pg/ml)單獨(dú)或者與滴定量的純化的D2、M2或BIF在水上孵育1小時(shí)。然后將所述混合物加入到每孔包含2x105個(gè)人嗜中性粒細(xì)胞的96-孔^f反中，所述嗜中性粒細(xì)胞通過右旋糖酐沉降法和Ficoll密度梯度離心法從外周血液中純化。所述板在37°C孵育15分鐘，通過加入等體積的冰冷的緩沖液終止反應(yīng)，接著在冰上孵育5分鐘。然后通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法確定嗜中性粒細(xì)胞細(xì)胞表面的CD62L水平。結(jié)果示于圖24中，其中在OVAIC單獨(dú)存在時(shí)，表達(dá)CD62L的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)定義為100%活化，表達(dá)CD62L的未處理細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)定義為0%活化。BIF和M2蛋白顯示了相似的抑制活性，然而D2蛋白的抑制活性強(qiáng)將近6倍。蛋冷4^V、^活化溯0C哞逸錄^^復(fù)合游介^的Fryi的活必此外，還在血小板活化測定中，檢測了D2蛋白阻斷免疫復(fù)合物介導(dǎo)的Fc7R受體的活化的能力。血小板暴露于熱聚集的IgG(HAGG)時(shí)會(huì)通過FcryRHa活化，引起P-選擇素(CD62P)的上調(diào)，所述HAGG是一種典型的免疫復(fù)合物。熱聚集的IgG(HAGG)在4'C用不同濃度的D2蛋白(或M2或BIF)孵育1小時(shí)。然后將所述混合物加入到包含3x107個(gè)人血小板的96-孔板中，所述血小板事先洗滌過且重懸在添加有l(wèi)mMEDTA的Tyrodes/Hepes緩沖液中。在室溫下孵育30分鐘后，通過標(biāo)準(zhǔn)4支術(shù)將細(xì)胞洗滌、固定和染色以4全測CD62P和GPIIb(CD41)的表達(dá)，并且在FACS掃描流式細(xì)胞儀上進(jìn)行分析。活化測定的結(jié)果示于圖25中。HAGG單獨(dú)處理后，活化的血小板(CD41和CD62P均為陽性)的百分比定義為100%。BIF和M2蛋白顯示了相似的抑制活性。然而D2蛋白的抑制活性強(qiáng)將近3倍。討論D2蛋白包含融合于鼠科IgG2aFc結(jié)構(gòu)域的兩個(gè)首對(duì)尾的FcryRIIa蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，其有四個(gè)氨基酸突變以降低Fc受體結(jié)合和補(bǔ)體結(jié)合。所述D2蛋白有效地阻斷了免疫復(fù)合物介導(dǎo)的MC/9肥大細(xì)胞的活化，且在嗜中性粒細(xì)胞活化測定及血小板活化測定中阻斷了免疫復(fù)合物介導(dǎo)的FqR的活化。因此這種Fc結(jié)合二聚體融合蛋白可以成為體內(nèi)免疫復(fù)合物介導(dǎo)的疾病的有效抑制劑。實(shí)施例5異源二聚Fc受體多肽的設(shè)計(jì)和表達(dá)材料和方法Fryi//a-Fc7i///岸源二菜衷這裁脊的一々建Fc7RIIa和Fc7RIH的Fc結(jié)合區(qū)可以各自采用如實(shí)施例1中所述的合適的引物從cDNA模板中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增的區(qū)域包括Fc結(jié)合區(qū)的已知特性的殘基和基序(motifs)例如外結(jié)構(gòu)域1和外結(jié)構(gòu)域2連接子殘基(也就是Dl/D2連接)以及BC、C，E和FG環(huán)。作為這些Fc結(jié)合區(qū)的多聚核苷酸序列是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。可以用T4DNA連接酶將平端PCR產(chǎn)物在用DNA聚合酶I的片段補(bǔ)平的五coRI位點(diǎn)處，連接到載體pPIC9(Invitrogen,LifeTechnologies)中?？梢允褂门c實(shí)施例1中所述的方法相似的PCR和克隆技術(shù)，從這些擴(kuò)增產(chǎn)物中產(chǎn)生可操作的融合的Fc7RHa-FcyRIII異源二聚多核苷酸?？梢酝ㄟ^分析性限制酶消化或DNA測序證實(shí)插入物的大小和取向。可操作地融合的Fc7RIIa-Fc7Rin異源二聚多核苷酸可以克隆到各種表達(dá)載體中。例如，F(xiàn)tryRIIa-FcryRni異源二聚多核苷酸可以連接到修飾的pBACPAK9(InvitrogenLifeTech)的￡coRIZ%aI位點(diǎn)中，其中通過用5a附HI消化首先消除多克隆位點(diǎn)中的5amffl位點(diǎn)，使用DNA聚合酶尺/e朋w片4爻補(bǔ)平，而后再連接?？梢酝ㄟ^五coRIZW"I消化來確定插入物的大小，多聚的SamHI片段的正確取向可以采用標(biāo)準(zhǔn)方法通過消化來篩選。可選4奪地，所述Fc7Rna-Fc7Rm異源二聚多肽可以克隆到哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中。例如，GatewayLR克隆酶反應(yīng)(Invitrogen，LifeTechnologies)可以用于將可操作地融合的多聚Fc受體多核芬酸片段轉(zhuǎn)移到GatewayTM閱讀框架-A盒(Invitrogen,LifeTechnologies)適合的表達(dá)載體pAPEX3P(Evans等，1995及Christiansen等，1996)中，以提供表達(dá)融合的Fc受體多聚體的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體。同樣地，所述GatewayLR克隆酶反應(yīng)可以用于將可操作地融合的多聚Fc受體多核苷酸片段轉(zhuǎn)移到GatewayTM閱讀框架-A盒(Invitrogen,LifeTechnologies)適合的表達(dá)載體pIRESneo(Clontech)中。討論Fc結(jié)合區(qū)的多聚化產(chǎn)生了與Fc結(jié)構(gòu)域具有較高親和力的相互作用的分子。多聚體中的每一單體能夠單獨(dú)地與免疫球蛋白的Fc結(jié)構(gòu)域相互作用以產(chǎn)生較高親和力?？梢援a(chǎn)生包含衍生自不同F(xiàn)c受體的Fc結(jié)合區(qū)域的多聚體。例如，多聚體可以從Fc7RI、Fc7RIIa、FcryRIIb、Fc7RIIIa、FcryRIIIb、FcoRI和F"RI的Fc結(jié)合區(qū)域的組合中形成。異源二聚體也可以從這些Fc結(jié)合區(qū)域的組合中形成。例如，可以形成Fc7RIIa-FcryRni、Fc7RIIa-Fc7RI和Fc7RI-Fc7Rin異源二聚體，及由Fc結(jié)合區(qū)的其它組合組成的異源二聚體。眾多Fc受體的Fc結(jié)合域通過誘變或結(jié)晶學(xué)已經(jīng)確定(IgG和Fc7R:Maxwell等，1999;Radaev等,2001;Sondermann等,2000;Hulett等，1988;Hulett等，1991;Hulett等，1994;Hulett等，1995;IgE和FceRI:Garman等，2000;IgAandFccxRIinteractions(IgA和FcoRI相互作用):Wines等，2001;Herr等，2003)。此外，也進(jìn)行了相似FcR序列的比較和Fc受體結(jié)構(gòu)的比較分析(Sondermann等，2001)。這些分析表明相關(guān)的、清楚限定的不同F(xiàn)c受體的片段能與它們的配體相互作用。而且，與Fc7RIH和IgG的結(jié)晶學(xué)分析相比較(RadaevWa/.2001,Sonderman&a/.2001)，對(duì)國際專利第WO2006/133486號(hào)說明書中F(ryRIIa與IgG相互作用的結(jié)晶學(xué)分析清楚地證實(shí)了這一點(diǎn)。顯然，這些數(shù)據(jù)連同其它Fc受體的誘變實(shí)驗(yàn)表明來自這些相關(guān)FC受體的外結(jié)構(gòu)域1和外結(jié)構(gòu)域2之間的連接區(qū)域的片段，以及來自不同受體第二結(jié)構(gòu)域的BC、C，E和FG環(huán)的片段與它們各自的配體相互作用。將這些Fc結(jié)合區(qū)并入其它多肽能夠賦予新多肽對(duì)那種免疫球蛋白類型的特異性。為了這一目的，Hulett等，1991，Hulett等，1995和Maxwell等，1999表明將IgG結(jié)合區(qū)添加到否則不能與IgG結(jié)合的蛋白中使蛋白獲得了對(duì)IgG的特異性。相似地，還觀察到一系列IgE結(jié)合序列插入到不能與IgE結(jié)合的蛋白中產(chǎn)生了具有IgE特異性的蛋白嵌合體，如先前在國際專利說明書第WO96/08512中所述。因此可以預(yù)測以相似的方式，^!爭能與來自于FcryRI或Fc7RIH的IgG相互作用的Fc結(jié)合區(qū)包括在多肽或蛋白中可以賦予該多肽或蛋白質(zhì)結(jié)合IgG的功能，或類似地，將能與來自于CD89或FccxRI的IgA相互作用的Fc結(jié)合區(qū)包括在多肽或蛋白中可以U武予該多肽或蛋白結(jié)合IgA的功能。這種序列可以包括已知能與IgA相互作用的CD89的FcoRI的第一細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的環(huán)，這樣的環(huán)可以包括結(jié)構(gòu)域1的BC、C，E和FG環(huán)。重要的殘基包括氨基酸35、52和81-86(Wines等，2001;Herr等，2003)。這樣，包含能與不同種類的免疫球蛋白相互作用的片段的受體多肽和蛋白質(zhì)是可能的。本說明書中術(shù)語"包含(comprise)"，或其變體諸如"包含(comprises)"或"包含(comprising)"，應(yīng)該被理解為意指包含所述的元素、整體(integer)或步驟，或元素、整體或步驟的組，但是并不排除任一其它的元素、整體或步驟，或元素、整體或步驟的組。本說明書提及的所有出版物通過引用并入本文。包括在本說明書中的文件、法令(acts)、材料、裝置、文章或類似物的任何討論完全用于為本發(fā)明提供背景的目的。不應(yīng)將其視為承認(rèn)這些材料的任一或全部構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)的一部分或?yàn)楸景l(fā)明相關(guān)領(lǐng)域的公眾常識(shí)，因其在本申請(qǐng)任一權(quán)利要求的優(yōu)先權(quán)日之前即已存在于澳大利亞或其它地方。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，在不偏離廣泛描述的本發(fā)明的精神或范圍的前提下，可以對(duì)具體的實(shí)施方案中所示的本發(fā)明做出許多變化和/或修飾。因此無i侖從哪方面現(xiàn)有的實(shí)施方案都應(yīng)該被看作是說明性的而非限制性的。參考文獻(xiàn)1.AmirahmadiSFetal.&RowleyMJ.2005.Arthritogenicanti-typeIIcollagenantibodiesarepathogenicforcartilage-derivedchondrocytesindependentofinflammatorycells(致關(guān)節(jié)炎性抗II型膠原抗體對(duì)于獨(dú)立于炎癥細(xì)胞的4欠骨源性軟骨細(xì)胞是致病的).JW/zn'to52(6):1897-906.2.ArmourKLetal.&ClarkMR.2003.DifferentialbindingtohumanFcgammaRIIaandFcgammaRIIbreceptorsbyhumanIgGwildtypeandmutantantibodies(人類IgG野生型和突變抗體與人類Fc7RIIa和FcryRIIb受體的差異結(jié)合).Afo//m附w"o/.40(9):585-93.3.ArmourKLetal.&ClarkMR.2002.ThecontrastingIgG-bindinginteractionsofhumanandherpessimplexvirusFcreceptors(人類和單純皰滲病毒Fc受體的對(duì)比IgG結(jié)合相互作用).Soc7V朋s.30(4):495-500.4.AstierAetal.&DHanau.1994.HumanepidermalLangerhanscellssecreteasolublereceptorforIgG(FcgammaRII/CD32)thatinhibitsthebindingofimmunecomplexestoFC7R+cells(人類表皮朗才各漢,斤細(xì)月包細(xì)胞分泌抑制免疫復(fù)合物與FcgammaR+纟田胞結(jié)合的IgG(Fc7RII/CD32)的可溶性受體).//m附w"o/.152(1):201.5.BrooksDetal.&RavetchJ.1989.StructureandexpressionofhumanIgGFcRII(CD32).Functionalheterogeneityisencodedbythealternativelysplicedproductsofmultiplegenes(人類IgGFcRII(CD32)的結(jié)構(gòu)和表達(dá)。功能異質(zhì)性通過多基因可選擇地剪切的產(chǎn)物編碼).J~M^/.170:1369-1385.6.ChristiansenDetal.&BELoveland.1996.EngineeringofrecombinantsolubleCD46:aninhibitorofcomplementactivation(重組可溶性CD46的設(shè)計(jì)一種補(bǔ)體活化的抑制劑)./附m,o/ogy.87:348.7.EmeryPetal&GSeydoux.2001.朋隱m油gyf^W」40:699.8.EvansMJetal.&SPSquinto.1995.Rapidexpressionofananti-humanC5chimericFabutilizingavectorthatreplicatesinCOSand293cells(抗人類C5嵌合Fab利用在COS和293細(xì)胞里復(fù)制的載體快速表達(dá)).//聽,/M^/zo血1995184:123.9.GarmanSCetal,2000.StructureoftheFcfragmentofhumanIgEboundtoitshigh-affmityreceptorFcepsilonRIalpha(結(jié)合于其高親和性受體FceRIa的人類IgEFc片段的結(jié)構(gòu)).A^we406(6793):259-66.10.HerrABetal,2003.InsightsintoIgA-mediatedimmuneresponsesfromthecrystalstructuresofhumanFcalphaRIanditscomplexwithIgAl-Fc(從人類FcaRI和其與IgAl-Fc的復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)看IgA介導(dǎo)的免疫反應(yīng)).A^^/m423(6940):614-20.11.HibbsMLetal.&PMHogarth.1988.MolecularcloningofahumanimmunoglobulinGFcreceptor(人類免疫J求蛋白GFc受體的分子克隆).脂/顛dW，85(7)，2240,12.HulettMDetal.&PMHogarth.1991.ChimericFcreceptorsidentifyfunctionaldomainsofthemurinehighaffinityreceptorforIgG沐合的Fc受體識(shí)別IgG的鼠科高親和性受體的功能結(jié)構(gòu)域).《//附mwwo/.47(6):1863-8.13.HulettMDetal.&PMHogarth.1994.IdentificationoftheIgGbindingsiteofthehumanlowaffinityreceptorforIgGFcgammaRII.Enhancementandablationofbindingbysite-directedmutagenesis(IgGFc7RH的人類低親和性受體的IgG結(jié)合位點(diǎn)的識(shí)別。通過位點(diǎn)定向誘變增強(qiáng)和消除結(jié)合)./說o/C/^m.269(21):15287.14.HulettMDetal.&PMHogarth.1995.MultipleregionsofhumanFcgammaRII(CD32)contributetothebindingofIgG(人類Fc7RH(CD32)的多個(gè)區(qū)域有助于IgG的結(jié)合).J5/o/CAe附.270(36).-21188.15.HulettMD&PMHogarth.1998.ThesecondandthirdextracellulardomainsofFcgammaRI(CD64)confertheuniquehighaffinitybindingofIgG2a(FcryRI(CD64)的第二和第三細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域賦予IgG2a的獨(dú)特高46親和性結(jié)合).淑/畫磨/.35(14-15):989.16.IerinoFLetal.&PMHogarth.1993a.Rec.solublehumanFcryRII:prodn,characterization,andinhibitionoftheArthusreaction(可溶性人類FcryRII:制備、表征和Arthus反應(yīng)的抑制)./178:1617.17.IerinoFLetal,&PMHogarth.1993b.MappingepitopesofhumanFcgammaRII(CDw32)withmonoclonalantibodiesandrecombinantreceptors(用單克隆抗體和重組受體定位人類FcryRII(CDw32)的抗原表4立)./wwwwo/.150:1794-803.18.LauLMetal.&DEJackson.2004.ThetetraspaninsuperfamilymemberCDl51regulatesoutside-inintegrinalphallbbeta3signalingandplateletfunction(Tetraspanin超家族成員CD151調(diào)節(jié)外壓式整合素cdIb/33信號(hào)和血小板功能).104(8):2368.19.MaxwellKFetal.&PMHogarth.1999.CrystalstructureofthehumanleukocyteFcreceptor,FcgammaRIIa(人類白纟田月包Fc受體、Fc7RIIa的晶體結(jié)構(gòu)).5/0/6:437.20.NabbeKCetal.&WBvandenBerg.2003.CoordinateexpressionofactivatingFcgammareceptorsIandIIIandinhibitingFcgammareceptortypeIIinthedeterminationofjointinflammationandcartilagedestructionduringimmunecomplex-mediatedarthritis(免疫復(fù)合4勿介導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎期間在關(guān)節(jié)炎癥和軟骨破壞的測定中活化的Fcry受體I和III及抑制Fcry受體II型的協(xié)調(diào)表達(dá)).」W/^to7/^wm48:255.21.NandakumarKSetal.&HolmdahlR.2004.CollagentypeII(CII)-specificantibodiesinducearthritisintheabsenceofTorBcellsbutthearthritisprogressionisenhancedbyCll-reactiveTcells(II型膠原(CII)特異性抗體在T或B細(xì)胞不存在時(shí)誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎，但CII反應(yīng)性的T細(xì)胞加快了關(guān)節(jié)炎的進(jìn)程).77^r.6(6):R544-50.22.PflumLR&MLGraeme.1979.TheArthusreactioninrats,apossibletestforanti-inflammatoryandanti-rheumaticdrugs(大鼠中的Arthus反應(yīng)，抗炎癥和抗風(fēng)濕藥物可能的測試).9:184.23.PowellMSetal.&PMHogarth.1999.analysisandcrystallisationofFcgammaRlla,thelowaffinityreceptorforIgG(IgG的低親和性受體FcyRIIa的生化分析和結(jié)晶)./7w簡"0/丄e"68(1):17.24.RadaevSetal.，2001.ThestructureofahumantypeIIIFcgammareceptorincomplexwithFc(與Fc復(fù)合的人類III型Fcry受體的結(jié)構(gòu)).C/zem.276(19):16469-77.25.SondermannPetal,2000.The3.2-AcrystalstructureofthehumanIgGlFcfragment-FcgammaRIIIcomplex(人類IgGlFc片l爻-Fc7RIII復(fù)合物的3.2-A晶體結(jié)構(gòu)).Mz^re406(6793):267-73.26.SondermannPetal,2001.Molecularbasisforimmunecomplexrecognition:acomparisonofFc-receptorstructures(免疫復(fù)合4勿i口、另'J6勺分子基礎(chǔ)Fc受體結(jié)構(gòu)的比較).,Mo/309(3):737-49.27.SekiT.1989.Identificationofmultipleisoformsofthelow-affinityhumanIgGFcreceptor(低親和性人類IgGFc受體的多亞型的識(shí)別).Tmmimogewe^s.30:5-12.28.StuartSetal.&VauxD.1987.IsolationandexpressionofcDNAclonesencodingahumanreceptorforIgG(Fc-RII)(編碼IgG的人類受體(Fc-RII)的cDNA克隆的分離和表達(dá)).J五jcpMW.166:1668-1684.29.TakaiT.2002.RolesofFcreceptorsinautoimmunity(自體免疫中Fc受體的作用)〗VWiev/mww"o/.2(8):580.30.TammAetal.&RESchmidtRE.1996.TheIgGbindingsiteofhumanFcgammaRIIIBreceptorinvolvesCCandFGloopsofthemembrane-proximaldomain(人類Fc7RIIIB受體的IgG結(jié)合位點(diǎn)包含膜近端結(jié)構(gòu)域的CC，和FG環(huán))./5/o/CAe附.271(7):3659.31.ThaiLeMetal.&DEJackson.2003.PhysicalproximityandfunctionalinterplayofPECAM-IwiththeFcreceptorFcgammaRllaontheplateletplasmamembrane(PECAM隱l與Fc受體F(ryRlla在血小板質(zhì)膜上的物理鄰近和功能相互影響).102(10):3637.32.WinesBD&SBEasterbrook-Smith.1988.EnhancementofthebindingofClqtoimmunecomplexesbypolyethyleneglycol(聚乙二酉孚對(duì)Clq與免疫復(fù)合物結(jié)合的提高).Mo/7附w麗o/.25(3):263.33.WinesBDetal.&PMHogarth.2000.TheIgGFccontainsdistinctFcreceptor(FcR)bindingsites:theleukocytereceptorsFcgammaRIandFcgammaRIIabindtoaregionintheFcdistinctfromthatrecognizedbyneonatalFcRandproteinA(IgGFc包含獨(dú)特的Fc受體(FcR)結(jié)合位點(diǎn)白細(xì)胞受體Fc7RI和FcryRIIa結(jié)合于不同于被初生FcR和蛋白A識(shí)別的Fc的Fc區(qū)).丄7mm畫/.164:5313-834.WinesBDetal.&PMHogarth.2001.TheinteractionofFcalphaRIwithIgAanditsimplicationsforligandbindingbyimmunoreceptorsoftheleukocytereceptorcluster(FcoRI與IgA的相互作用及通過白纟田月包受體簇的免疫受體對(duì)配體結(jié)合的意義).《//7wm/"o/.166(3):1781.35.WinesBDetal.&PMHogarth.2003.SolubleFcgammaRIIainhibitsrheumatoidfactorbindingtoimmunecomplexes(可溶性Fc7RIIa承卩制類風(fēng)濕因子與免疫復(fù)合物結(jié)合)./mm""o/ogy.109(2):246.36.WrightJKetal.&JCJaton.1980.PreparationandcharacterizationofchemicallydefinedoligomersofrabbitimmunoglobulinGmoleculesforthecomplementbindingstudies(用于4卜體結(jié)合研究的兔免疫3求蛋白G分子的化學(xué)定義的低聚體的制備和表征).所oc/em丄187(3):767.權(quán)利要求1.能抑制白細(xì)胞Fcγ受體(FcγR)與免疫球蛋白G(IgG)相互作用的可溶性多聚多肽，所述多肽包含兩個(gè)或更多以首對(duì)尾排列方式連接的Fc結(jié)合區(qū)和經(jīng)修飾的Fc結(jié)構(gòu)域，其中至少一個(gè)Fc結(jié)合區(qū)衍生自FcγR型受體，所述Fc結(jié)構(gòu)域基本上不能與所述Fc結(jié)合區(qū)結(jié)合，并且允許所述多肽的二聚化。2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述多肽僅包含兩個(gè)連接的Fc結(jié)合區(qū)，其中至少一個(gè)Fc結(jié)合區(qū)衍生自Fc7R型受體。3.如權(quán)利要求1或2所述的多肽，其中所述至少一個(gè)衍生自Fc7R型受體的Fc結(jié)合區(qū)衍生自Fc7RJI型受體。4.如權(quán)利要求3所述的多肽，其中所述至少一個(gè)Fc結(jié)合區(qū)衍生自FcryRIIa。5.如權(quán)利要求1至4中任一權(quán)利要求所述的多肽，其中所述連接的Fc結(jié)合區(qū)的每一個(gè)均彩f生自Fc7R型受體。6.如權(quán)利要求5所述的多肽，其中所述連接的Fc結(jié)合區(qū)的每一個(gè)均衍生自相同的FcryRII型受體。7.如權(quán)利要求1至6中任一權(quán)利要求所述的多肽，其中所述Fc結(jié)合區(qū)通過包含1至20個(gè)氨基酸的連接子連接。8.如權(quán)利要求1至7中任一權(quán)利要求所述的多肽，其中所述經(jīng)修飾的Fc結(jié)構(gòu)域顯示改變的效應(yīng)器功能。9.如權(quán)利要求1至8中任一權(quán)利要求所述的多肽，其中所述Fc結(jié)構(gòu)域衍生自IgG,且已通過Leu^和/或Leu235的取代進(jìn)行過修飾。10.如權(quán)利要求1至8中任一權(quán)利要求所述的多肽，其中所述Fc結(jié)構(gòu)域衍生自IgG2a且已通過Leu235，GIu318,Lys，和Lys322中的任一個(gè)或多個(gè)的耳又代進(jìn)行過修飾。11.如權(quán)利要求1至8中任一權(quán)利要求所述的多肽，其中所述Fc結(jié)構(gòu)域衍生自IgG4且已通過228、233、234、235和236位的氨基酸的任一個(gè)或多個(gè)的氨基酸修飾進(jìn)行過修飾。12.如權(quán)利要求1至11中任一權(quán)利要求所述的多肽，還包含載體蛋白質(zhì)。13.如權(quán)利要求12所述的多肽，其中所述載體蛋白質(zhì)是人類血清白蛋白(HSA)。14.包含如權(quán)利要求1至13中任一權(quán)利要求所述的多肽的二聚體的可溶性多聚蛋白質(zhì)。15.如權(quán)利要求14所述的蛋白質(zhì)，其為Fc融合二聚體蛋白質(zhì)的形式，其中所述Fc融合二聚體蛋白質(zhì)包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，每個(gè)多肽鏈包括(i)兩個(gè)以首對(duì)尾排列方式連接的衍生自FcryRIIa的Fc結(jié)合區(qū)和(ii)基本上沒有Fc7RIIa結(jié)合能力且允許第一和第二多肽鏈二聚化的經(jīng)修飾的Fc結(jié)構(gòu)域。16.包含核苷酸序列的多聚核苷酸分子，所述序列編碼如權(quán)利要求1至13中任一權(quán)利要求所述的多肽或如權(quán)利要求14或15所述的蛋白質(zhì)。17.如權(quán)利要求16所述的多聚核苦酸分子，其中所述多聚核苷酸分子存在于表達(dá)盒或表達(dá)載體中。18.包含如權(quán)利要求16或17所述的多聚核苷酸分子的重組宿主細(xì)胞。19.制備多肽或蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括如下步驟(i)提供包含如權(quán)利要求16或17所述的多聚核苷酸分子的重組宿主細(xì)胞，(ii)在合適的培養(yǎng)基中和適合于所述多肽或蛋白質(zhì)表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，及(iii)從培養(yǎng)物，和任選地從培養(yǎng)基中，分離所述多肽或蛋白質(zhì)。20.治療個(gè)體炎癥疾病的方法，所述方法包括將如權(quán)利要求1至12中任一權(quán)利要求所述的多肽或如權(quán)利要求14或15所述的蛋白質(zhì)給予所述個(gè)體，所述多肽或蛋白質(zhì)任選地與藥學(xué)上可接受的或獸醫(yī)可接受的載體或賦形劑結(jié)合。21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述炎癥疾病是免疫復(fù)合物(IC)介導(dǎo)的炎癥疾病。22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述IC介導(dǎo)的炎癥疾病選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、免疫性血小板減少性紫瘋(ITP)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、腎小球性腎炎和肝素誘導(dǎo)的血小板減少伴血栓形成綜合征(HITTS)。23.將循環(huán)免疫復(fù)合物(IC)從患免疫復(fù)合物介導(dǎo)的炎癥疾病的個(gè)體中移除的方法，所述方法包括如下步驟(i)提供結(jié)合于合適基質(zhì)的如權(quán)利要求1至13中任一權(quán)利要求所述的多肽或如權(quán)利要求14或15所述的蛋白質(zhì)，(ii)通過在體外使血液與所述結(jié)合于基質(zhì)的多肽或蛋白質(zhì)接觸來處理從所述個(gè)體中移除的血液，以使在所述血液中存在的IC通過所述多肽或蛋白質(zhì)結(jié)合于基質(zhì)，(iii)將處理的血液從基質(zhì)分離，和(iv)其后將處理的血液返回至個(gè)體。全文摘要本發(fā)明公開了能夠抑制白細(xì)胞Fcγ受體(FcγR)和免疫球蛋白G(IgG)相互作用的可溶性多聚多肽或蛋白質(zhì)。所述蛋白質(zhì)或多肽包含兩個(gè)或更多以首對(duì)尾排列方式相連的Fc結(jié)合區(qū)，和經(jīng)修飾以降低或防止與所述Fc結(jié)合區(qū)結(jié)合和/或改變效應(yīng)器功能的免疫球蛋白的Fc結(jié)構(gòu)域，其中至少一個(gè)Fc結(jié)合區(qū)衍生自FcγR型受體。本發(fā)明還描述了編碼所述多肽或蛋白質(zhì)的多聚核苷酸分子和其在治療個(gè)體的免疫復(fù)合物(IC)介導(dǎo)的炎癥疾病的方法中的用途。文檔編號(hào)C07K14/47GK101611052SQ200780044460公開日2009年12月23日申請(qǐng)日期2007年12月13日優(yōu)先權(quán)日2006年12月13日發(fā)明者布魯斯·大衛(wèi)·萊恩斯,菲利普·馬克·賀加斯申請(qǐng)人:蘇伯利莫爾公司