專利名稱：：新多肽及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及新多肽以及它們在治療與補體C5a受體和/或曱?；氖荏w的活化相關(guān)的癥狀與疾病中的用途。本發(fā)明特別提供金黃色葡萄球菌趨化抑制蛋白(ChemotaxisInhibitoryProteinofStop/^/ococcM^m/廠ew力('CHIPS，)的變體形式以及它們在治療急性和慢性炎性病癥中的用途。必-冃-景技術(shù)金黃色葡萄球菌CStop/^/ococcw""^w)是導致多種疾病的常見人類病原體。金黃色葡萄球菌導致疾病的機理是多因素的。除了由特殊毒素引起的葡萄球菌病之外，例如引起中毒性休克綜合征的中毒性休克綜合征毒素(TSST-1)或腸毒素，金黃色葡萄球菌感染的致病性是不依賴于單一因素的。金黃色葡萄球菌擁有大量不同的"工具，，來引發(fā)疾病。這些不同因素的整體組合共同作用于促進其在宿主內(nèi)的定植(colonization)、生長和擴散。吞噬細胞對于葡萄球菌的吞噬和殺傷是最重要的宿主防御機制。吞噬細胞通過入侵者(例如曱酰化如補體系統(tǒng)活化時被吸引至感染部位。;放這些化學引誘物所產(chǎn)生的梯度，將吞噬細胞吸引至炎癥部位。Veldkamp等研究了生長中的金黃色葡萄球菌上清液與吞噬細胞的相互作用。他們發(fā)現(xiàn)，盡管葡萄球菌上清液能夠刺激吞噬細胞，但如通過單克隆抗體檢測，還存在一種能夠特異性下調(diào)補體C5a受體(C5aR)和曱?；氖荏w(FPR)表達的因子(見Veldkamp等，2000,InfectImmun68(10):5908-13;Veldkamp等，1997,Inflammation21(5):541-51)。他們從金黃色葡萄球菌的上清液中分離出了導致該作用的14.1kDa的蛋白；該蛋白被命名為CHIPS,即金黃色葡萄球菌趨化抑制蛋白。CHIPS能夠抑制嗜中性粒細胞的趨化性以及由C5a和fMLP引起的嗜中性粒細胞的活化。此外，還發(fā)現(xiàn)CHIPS非常具有選擇性，因為它不影響廣泛選擇的其他受體，包括存在于嗜中性粒細胞的其他化學引誘物受體，例如FPR-樣1、C3aR、IL-8RA和IL-8RB、LTB4受體和PAF受體。這表明CHIPS特異地抑制G-蛋白偶聯(lián)受體家族中的兩個成員，C5aR和FPR。CHIPS對細胞沒有毒性，并且還抑制其他細胞例如單核細胞和肥大細胞上的C5aR。Postma等發(fā)現(xiàn)，CHIPS以不依賴于能量的方式直接同C5aR和FPR結(jié)合。此外，CHIPS在同其受體結(jié)合時不發(fā)生內(nèi)化。CHIPS分別以1.1和35.4nM的顯著Kd值同C5aR和FPR兩個受體結(jié)合(見Postma等，2004,JImmunol172(11):6994-7001)。這些Kd值的范圍與對它們的天然配體所記錄的范圍相同(見VanEpps等，1993，JImmunol150(1):246-252;Falk等，1982,InfectImmun36(2):450~454;Huey&Hugli,1985,Immunol.135(3):2063-8;Pike等,1980,JExpMed152(1):31~40)。CHIPS中用于結(jié)合曱酰化肽受體和C5a受體的活性部位位于CHIPS分子的不同區(qū)域。N-末端和C-末端并且特別是第一個和第三個氨基酸參與了CHIPS對曱?；氖荏w的活性(見Haas等，2004,JImmunol173(9):5704-11)。至少前30個N-末端氨基酸不參與CHIPS同C5aR的結(jié)合和對C5aR的阻斷。因此，不含前30個氨基酸的CHIPS蛋白，CHIPS31—121，顯示出對C5aR阻斷活性的完整保留，但完全失去了對FPR的活性(見Haas等，2005,JMolBiol353(4):859-872)。在過去的幾年里人們已經(jīng)清楚，僅次于宿主防御，趨化因子受體，例如FPR和C5aR，也參與了多種其他炎性過程。近來鑒定的多種新型和源于宿主的FPR激動劑，擴展了FPR在疾病過程中的功能意義(見Le等，2002,TrendsImmunol23(11):541-8)。對C5aR在多種不同疾病過程中的顯著作用，人們開展了許多研究，所述疾病過程包括膿毒癥、缺血-再灌注損傷、類風濕性關(guān)節(jié)炎、詳喘和免疫復(fù)合物疾病。多種使用動物模型的實驗研究證明了在這些疾病過程中將C5aR作為目標帶來的有益效果(見Guo等，2004，Shock21(1):1—7;Huber-Lang等，2001，JImmunol166(2):1193—1199;Heller等，1999，JImmunol163(2):985-94)。CHIPS特異性抑制FPR和C5aR的獨特性質(zhì)，使該蛋白成為了一些疾病的抗炎藥物中的有力候選者，在所述疾病中FPR或C5aR的激活起重要作用。使用分離的人類和小鼠嗜中性粒細胞的實驗表明，CHIPS對于小鼠C5aR的活性不到其對于人類受體的活性的30分之一。這種在與小鼠細胞比較時針對人細胞的活性方面存在的30倍差距表明了CHIPS的人特異性，其阻礙了CHIPS在小鼠感染模型或其他動物模型中的測試。金黃色葡萄球菌是人類皮膚的正常共生物，由金黃色葡萄球菌引起的輕微皮膚或傷口感染一般而言是自我限制性(self-limiting)的。金黃色葡萄球能夠潛在地感染人體的任何組織，并偶爾由最初(primary)感染部位擴散而導致威脅生病的疾病，例如骨髓炎、心內(nèi)膜炎、肺炎和敗血癥。CHIPS基因存在于大部分的臨床金黃色葡萄球菌的菌抹和來自健康攜帶者的菌抹中，體內(nèi)CHIPS的生成如由Haas等利用小鼠感染模型所描述(見Haas等，2004，JExpMed199(5):687-95)。由于金黃色葡萄球菌是非常常見的細菌，大多數(shù)個體很有可能在生命的早期接觸金黃色葡萄球菌和CHIPS蛋白，并導致了抗CHIPS抗體的產(chǎn)生。本發(fā)明探索的是提供基于CHIPS蛋白的新變體形式的藥物，其顯示出改進的性質(zhì)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的第一個方面提供了具有金黃色葡萄球菌趨化抑制蛋白("CHIPS")生物活性的多肽，該多肽包含SEQIDNO:1的氨基酸序列的變體。野生型CHIPS蛋白的氨基酸序列表示如下FTFEPFPTNEEIESNKKMLEKEKAYKESFKNSGLPTTLGKLDERLRNYLKKKGESKSSYVINGPGKTNEYAYSEQIDNO:1野生型CHIPS蛋白的氨基酸序列還以數(shù)據(jù)庫登記號AAQ14339、CAG41022和YP—041409進行了公開。術(shù)語"變體，，表示與野生型CHIPS蛋白并非享有100%氨基酸序列同一性的多肽，即必須對野生型CHIPS蛋白的氨基酸進行修飾。例如，該多肽可以包含與SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少60%同一性的序列，更優(yōu)選與上述序列具有至少70%或80%或85%或90%同一性的序列，最優(yōu)選與上述氨基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列。同一性百分比能夠通過本領(lǐng)域已知方法確定，例如使用在Expasy工具網(wǎng)站(http:〃www.ch.embnet.org/software/LALIGNform.html)上的LALIGN程序(Huang和Miller,Adv.AppLMath.(1991)12:337-357)，利用全局比對選項、評分矩陣BLOSUM62、開啟缺口罰分(openinggappenalty)-14、延伸缺口罰分(extendinggappenalty)-4作為參數(shù)?；蛘撸瑑蓚€多肽的序列同一性百分比可以利用適當?shù)碾娔X程序測定，例如威斯康辛大學遺傳計算組(UniversityofWisconsinGeneticComputingGroup)的GAP程序，并且應(yīng)了解(itwillbeappreciatedthat)同一性百分比的計算是相對于其序列已進行了最優(yōu)比對排列的多肽而進行的。在一個實施方式中，變體包含在暴露于多肽表面的一個或多個氨基酸處的修飾。暴露于表面的氨基酸可以利用本領(lǐng)域已知方法測定(見實施例E)。然而，應(yīng)了解的是，非暴露于表面的氨基酸的修飾也可以造成變體多肽表面的結(jié)構(gòu)變化(相對于野生型CHIPS蛋白而言)。在另一實施方式中，對野生型CHIPS蛋白內(nèi)的下列氨基酸中的一個或多個進行了修飾N31,S32,G33,L34,P35，K40，D42,R46，Y48,K50，G52,T53，K54,N55,S56，A57,。58，K61,E67,K69,L76,N77,P79，D83，L90，K92,K100,K101,S104，K105,S107,Y108,N111和G112。"修飾"表示的是在特定位置的氨基酸與野生型CHIPS蛋白的天然氨基酸相比有變化。例如，特定位置的氨基酸可以為非天然的、缺失的或取代的，或可以是一個或多個氨基酸插入/添加的位點。氨基酸分子還可以以其他方式進行修飾，例如通過化學修飾。因此，本發(fā)明的多肽可以由通過肽鍵或經(jīng)過修飾的肽鍵而彼此相連的氨基酸組成，例如肽酯，并包含除基因編碼的20個氨基酸之外的氨基酸。例如，多肽可以包含L-氨基酸和/或D-氨基酸，以及經(jīng)修飾的氨基酸比如羥脯氨酸、Y-羧基谷氨酸、O-磷酸絲氨酸和O-磷酸酪氨酸。多肽可以通過自然方法來修飾，例如翻譯后修飾，或通過本領(lǐng)域已知的化學修飾來修飾。修飾能夠在變體CHIPS多肽氨基酸序列內(nèi)的任何位置，包括肽骨架、氨基酸側(cè)鏈和氨基端或羧基端。然而，在一個實施方式中，本發(fā)明的多肽包含天然L-氨基酸或由天然L-氨基酸組成。已知多肽的修飾型(modifiedform)或變體型能夠使用本領(lǐng)域已知技術(shù)生成(見Sambrook&Russell,2000，MolecularCloning,ALaboratoryManual,ThirdEdition,ColdSpringHarbor,NewYork,(分子克隆，實驗手冊，第三版，冷泉港，紐約)其以引用的方式并入本文中)。例如，點突變可以通過定點誘變技術(shù)而引入到特定的氨基酸殘基(見Sambrook&Russell,同上，第13章)。生成親本多核苷酸的變體的其他方法描述如下。"生物活性，，用于此處表示野生型CHIPS蛋白對于活體、組織或細胞的作游事件，引起對活體的直接或間接的作用。因此，CHIPS蛋白的"生物活性"包括對趨化作用的抑制和/或?qū)τ裳a體成分C5a和/或N-曱酰肽fMLP誘導的嗜中性粒細胞活化的抑制。例如，保持的活性可以包含對C5a受體(C5aR)的拮抗和/或?qū)貂；氖荏w(FPR)的拮抗。然而，在一個實施方式中，本發(fā)明的變體CHIPS多肽缺乏FPR結(jié)合位點。在另一實施方式中，本發(fā)明的多肽顯示出CHIPS蛋白在體內(nèi)的一種或多種生物活性。測定野生型CHIPS蛋白及其變體的生物活性與結(jié)合特性的檢測方式是本領(lǐng)域已知的(見實施例)。當然，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明第一方面的多肽相對于野生型CHIPS蛋白顯示出的水平可以顯示出更低、相等或更高水平的生物活性。優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽顯示出相當于野生型CHIPS蛋白顯示出的水平的至少10%水平的生物活性，例如至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或更高。更優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽相對于野生型CHIPS蛋白顯示出的生物活性顯示出相等水平或更高的生物活性。最優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽顯示出相對于野生型CHIPS蛋白更高水平的生物活性(即更有活性)。例如，本發(fā)明的多肽可以顯示出相當于野生型CHIPS蛋白顯示出的水平的至少110%水平的生物活性，例如至少120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、250%、300%、500%或更高。在另一實施方式中，本發(fā)明的多肽對于C5aR和/或FRP具有特異結(jié)合活性，該活性等同于或大于野生型CHIPS蛋白顯示的相應(yīng)活性。因此，本發(fā)明的多肽僅顯示出CHIPS蛋白的生物活性，即該多肽的活性具有選擇性。例如，本發(fā)明的多肽可以選擇性地抑制趨化性和/或由補體成分C5a和/或由N-曱酰化肽fMLP誘導的嗜中性粒細胞的活化。"選擇性"表示與對細胞中其他蛋白活性的調(diào)控相比，該多肽在更大程度上抑制了所述生物活性。因此，該多肽優(yōu)選地僅抑制野生型CHIPS蛋白的生物活性，然而應(yīng)該了解，細胞中其他蛋白的表達和活性可以作為所述選擇性抑制的下游后果而發(fā)生改變。因此，我們排除了對細胞過程具有非特異性作用的作用物(agents)。在本發(fā)明第一方面的另一實施方式中，所述多肽是野生型CHIPS蛋白的變體，其中的一個或多個表面表位是經(jīng)過修飾的。這樣的修飾或是直接的(即表位自身內(nèi)氨基酸的修飾)或是間接的(即修飾的氨基酸不在表位中，但是當其被修飾時，導致表位內(nèi)氨基酸或該表位結(jié)構(gòu)的修飾)。"表面表位"表示野生型CHIPS蛋白表面暴露的氨基酸殘基的構(gòu)象，所述構(gòu)象由以下抗體識別-響應(yīng)于CHIPS抗原攻擊(challenge)而產(chǎn)生的抗CHIPS抗體和/或響應(yīng)于金黃色葡萄球菌攻擊而產(chǎn)生的抗體。例如，表面表位可以選自下組的表位線性表面表位:<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>示例突變KA，NDN-表位K69L卯P35K92E67示例突變A,QE，KAEK表位G39K40L34P35K92E67示例突變-ESAEK表位P79L76R46A57S56Q58示例突變EK一-DNGK表位G35L34K92G33S32N31示例突變ASESKK為免除懷^:,上述示例突變?yōu)榉窍拗菩缘摹?yīng)理解，上述列表中的表位未必為窮舉(notnecessarilyexhaustive),其他表位也可存在于野生型CHIPS蛋白的表面。例如，以下氨基酸可以形成一個或多個另外的表面表位的一部分N31，S32,G33，K50，K61,S104,N111和G112;N55,K100，S107,S108;K69,L34,P35，K92和E67;和K69，L34，L90,P35，K92和E67。技術(shù)人員應(yīng)進一步理解，其中一個或多個上述表面表位發(fā)生了突變的"親本，，CHIPS多肽，可以為SEQIDNO:1的野生型CHIPS序列，或其片段或變體(例如，SEQIDNO:1的第1至112位氨基酸，第1至114位氨基酸或第31至113位氨基酸)。本發(fā)明第一方面的另一實施方式中，所述多肽在以下氨基酸中的一個或多個處相對于SEQIDNO:1包含氨基酸取代N31,S32，G33,L34,P35，K40,D42，R46,Y48,K50,G52，T53,K54，N55，S56，A57,Q58,K61,E67,K69，L76，N77,P79,D83，L90,K92，K100,KlOl，S104,K105，S107,Y108,N111和G112。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，取代可以為保守或非保守的。"保守取代"意指以Gly、Ala;Val、Ile、Leu;Asp、Glu;Asn、Gin;Ser、Thr;Lys、Arg;和Phe、Tyr為例的組合。例如，該多肽相對于野生型序列可以包含以下氨基酸突變中的一種或多種N31A,S32A,G33A，L34A,P35A,Y48A,Y48H,K50N，G52A,T53A，N55A,S56A，K61A，K69A，P79A,L90A,L90P,K92R，K100R,S104Y,S107A，Y108,N111I,N111K和G112V。在本發(fā)明第一方面的一個特殊實施方式中，所述多肽在人體中相對于野生型CHIPS蛋白具有更低的免疫原性。"免疫原性"表示多肽在宿主生物體內(nèi)誘導免疫應(yīng)答(即產(chǎn)生抗多肽的抗體)的能力。優(yōu)選地，該多肽在人體內(nèi)相對于野生型CHIPS蛋白具有更低的免疫原性。免疫原性可以通過本領(lǐng)域已知的方法測定。例如，家兔或其他動物種類(例如小鼠、大鼠、豚鼠、狗等)可以通過本發(fā)明的多肽進行免疫，并測定免疫復(fù)合物的形成。理想情況下，在幾種不同物種中研究免疫應(yīng)答，以排除物種特異性的影響。一種合適的評估人體內(nèi)可能存在的免疫原性的方法包括純化人抗CHIPSIgG并測定變體多肽對這些抗體的親和力，例如4吏用ELISA(見以下實施例)。在另一實施方式中，本發(fā)明的多肽能夠抑制嗜中性粒細胞的C5a誘導的活化和抑制嗜中性粒細胞的fMLP誘導的活化。該抑制可以為部分的或完全的。因此，與缺乏該多肽時的活化相比，響應(yīng)于本發(fā)明的多肽可將嗜中性粒細胞的C5a誘導的活化和/或嗜中性粒細胞的fMLP誘導的活化抑制至少10%,例如至少20%,30%，40%,50%,60%，70%,80%，90%,95%且優(yōu)選100%。野生型CHIPS蛋白包含121個氨基酸(在從c/z6基因產(chǎn)物上切割出28-氨基酸的信號肽之后)。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽可以為任意長度。例如，該多肽可以包含大約120個氨基酸或由大約120個氨基酸組成，或可以包含精確的121個氨基酸或由精確的121個氨基酸組成。優(yōu)選地，該多肽的長度少于500個氨基酸，例如在長度上少于400，300，200,150,140,130，125,121，120，119,118,117，116，115，114，113，112，111,110,109,108，107，106，105，104,103，102,101，100,95，90,85，80,75，70，65，60,55,50,40，30個或更少的氨基酸。例如，該多肽的長度可以是110-130個氨基酸，例如長度是110-120個氨基酸，例如lll，112,113，114，115，116，117,118或119個氨基酸。在一個實施方式中，該多肽的長度為112個氨基酸。在本發(fā)明第一方面的另一實施方式中，所述多肽包含SEQIDNO:1的氨基酸序列的片段或其變異體，或由SEQIDNO:1的氨基酸序列的片段或其變異體組成。"片段"包括SEQIDNO:1的氨基酸序列中的至少10,20,30,40，50,60,70，80，90，100,105，110,111，112,113，114，115,116，117,118，119或120個連續(xù)氨基酸。例如，該多肽可以包含以下序列或由以下序列組成SEQIDNO:1中第l-114位氨基酸、第31至112位氨基酸、第31至113位氨基酸或第31至121位氨基酸的變體序列。本發(fā)明第一方面的一個示范性實施方式中，所述多肽包含SEQIDNO:1中的第1至H2位氨基酸或由SEQIDNO:1中的第1至U2位氨基酸組成，所述氨基酸片段具有以下修飾或以下修飾的組合(a)K40E，K69A,N111K和G112V;(b)G112V;(c)K54R,K69R，K100R和K105R;(d)K40N和K92R;(e)S104Y和NlllI;(f)K69A和G112V;(g)K69T;(h)Y48H,D83G和L90P;(i)K50N;(j)K69A,K100R和K101R;(k)K69A;(1)N31A;(m)S32A;(n)G33A;(。)L34A;(p)P35A;(q)Y48A;(r)G52A;(s)T53A;(t)N55A;(u)S56A;(v)E67A;(w)P79A;(x)L90A;(y)S107A;和(z)Y雨A在另一實施方式中，所述多肽包含一個或多個附加的氨基酸或由一個或多個附加的氨基酸組成，所述附加氨基酸在N-或C-末端或于內(nèi)部插入到SEQIDN0:1的氨基酸序列中。例如，該多肽可以包含至少2，3，4,5，6，7,8，9,10,15或20個附加氨基酸或由至少2，3,4,5,6,7，8,9，10，15或20個附加氨基酸組成。有利的是，所述附加的氨基酸位于SEQIDNO:1的氨基酸序列的C-末端。本發(fā)明這樣的實施方式中的一個實例是這樣的多肽，所述多肽包含具有以下修飾的SEQIDNO:1第1至112位氨基酸或由其組成K40E,K69A，N111K和G112V在另一實施方式中，本發(fā)明的多肽相對于野生型序列(即SEQIDNO:1)包含以下氨基酸突變中的一個或多個K40,D42,K50,K69,N77，D83,L90,K92,KIOO，K105,Nlll和G112。例如，該多肽可以包含以下相對于野生型序列的氨基酸突變中一個或多個或由其組成K40E,K40N,D42V,K50N，K69R,N77Y，D83G,L90P，K92R，K100R,K105R，N111K,N111I和G112V。因此，所述多肽可以選自下組由SEQIDNO:1的第1至112位氨基酸組成并具有以下修飾或其組合的多肽(a)K50N，K69R,N77Y，K92R,N111K和G112V;(b)K40E,D42V,N77Y，K100R,K105R，N111K和G112V;(c)K50N，N77Y,K92R,皿1K和G112V;(d)K40E,D42V，N77Y,N111K和G112V;(e)K40E，D42V，N77Y,K92R,N111K和G112V;(f)K50N，N77Y，皿1K和G112V;(g)K40E,D42V,K50N,N77Y,K92R，N111K和G112V;(h)K機，K50N，N77Y,K92R和皿1I;(i)K40N,N77Y,D83G,L90P,N111K和G112V;和(j)K50N，N77Y,K92R,K腦R和NlllI。在另一實施方式中，上述(a)至(j)定義的多肽可以在C末端包含兩個附力'的氨基端，例如在第113位氨基酸上的"R，，以及在第114位氨基酸上的"S"。本發(fā)明的多肽可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法制備(例如，見Sambrook&Russell,2000,MolecularCloning,ALaboratoryManual,ThirdEdition,ColdSpringHarbor,NewYork,其以引用的方式并入本文中)。筒言之，構(gòu)建的表達載體可以包含核酸分子，所述核酸分子能夠在合適的宿主中表達其編碼的多肽。已經(jīng)發(fā)展出了許多將核酸分子特別是DNA可操作地連接到載體上的方法，例如通過互補粘性末端。例如，互補均聚物束(complementaryhomopolymertracts)可以加至將要插入載體DNA中的DNA片段。然后將該載體和DNA片l殳通過互補均聚物尾部(complementaryhomopolymertails)之間的氬4定連才妻而結(jié)合形成重組DNA分子。具有一個或多個限制性位點的合成接頭為DNA片段與載體的連接提供了另一種方法。將DNA片段，例如由內(nèi)切酶的限制性消化而產(chǎn)生的DNA片段，用噬菌體T4DNA聚合酶或大腸桿菌(E.coli)DNA聚合酶I處理，所述酶通過其3，-5，外切核酸酶活性除去了突出的、3，-單《連末端，并以其聚合或性對凹陷的3，-末端進行填充。因此，這些活性結(jié)合起來產(chǎn)生了平末端的DNA片段。然后將該平末端片段與較大量摩爾過量(alargermolarexcess)的接頭分子在酶的存在下溫育，所述酶能夠催化平末端DNA分子的連接，例如噬菌體T4DNA連接酶。因此，反應(yīng)的產(chǎn)物為末端具有聚合接頭序列的DNA片段。然后將這些DNA片段用合適的限制性酶切割，并連接到表達載體中，所述表達載體已經(jīng)經(jīng)過酶切產(chǎn)生了能與上述DNA片段相容(compatiblew池)的末端。含有各種限制性內(nèi)切酶位點的合成接頭可從多種來源以商業(yè)方法得到，包4舌,人InternationalBiotechnologiesInc.,NewHaven,CN，USA。對編碼本發(fā)明多肽的DNA的理想修飾方法是利用PCR。該方法可以用于將DNA引入合適的載體，例如通過工程構(gòu)建到合適的限制性位點中，或可以用于在本領(lǐng)域已知的其它有效方法中修飾DNA。在本方法中，將要進行酶擴增的DNA兩側(cè)是兩個特異性引物，該引物本身將成為擴增出的DNA中的一部分。所述特異性引物可以包含限制性內(nèi)切酶識別位點，該位點能夠以本領(lǐng)域已知方法用于向載體中的克隆。然后，將該DNA(或者當載體為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體時的RNA)在合適的宿主中表達，生成包含本發(fā)明化合物的多肽。因此，可以根據(jù)已知技術(shù)，再按照包含于本文的教導進行適當?shù)男揎梺硎褂镁幋a所述多肽的DNA,以構(gòu)建表達載體，然后將該表達載體用于轉(zhuǎn)化合適的宿主細胞以表達和生成本發(fā)明的化合物。此類技術(shù)包括在以下文件中公開的那些1984年4月3日頒發(fā)給Rutter等人的美國專利第4440859號，1985年7月23日頒發(fā)給Weissman的美國專利第4530901號，1986年4月15日頒發(fā)給Crowl的美國專利第4582800號，1987年6月30日頒發(fā)給Mark等人的美國專利第4677063號，1987年7月7曰頒發(fā)給Goeddel的美國專利第4678751號，1987年11月3日頒發(fā)給Itakura等人的美國專利第4704362號，1987年12月1日頒發(fā)給Murray的美國專利第4710463號，1988年7月12日頒發(fā)給Toole，Jr.等人的美國專利第4757006號，1988年8月23日頒發(fā)給Goeddel等人的美國專利第4766075號，和1989年3月7日頒發(fā)給Stalker的美國專利第4810648號(將它們以引用的方式并入本文中)。編碼組成本發(fā)明化合物的多肽的DNA(或者當載體為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體時的RNA)可以與多種其他DNA序列結(jié)合以引入合適的宿主。該伴隨DNA(companionDNA)將依賴于宿主的性質(zhì)、將DNA1入宿主的方式以及是否希望保留或整合附加體。通常來講，DNA以正確的方向和正確的閱讀框插入至表達載體中例如質(zhì)粒中以作表達。如必要的話，DNA可以連接于由預(yù)期的宿主識別的適當?shù)霓D(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)節(jié)控制核香酸序列，雖然這樣的控制通常在表達載體中也可以實現(xiàn)。然后將該載體通過標準技術(shù)引入宿主。通常來講，不是所有的宿主都會受到載體的轉(zhuǎn)化。因此，有必要選擇轉(zhuǎn)化了的宿主細胞。一種選擇技術(shù)包括將一個DNA序列連同任何必需的控制元件？I入該表達載體，所述DNA序列編碼在轉(zhuǎn)化細胞中的可選擇特性(trait)，例如抗生素抗性。或者，這種選擇特性的DNA可以在另一個載體上，使用該載體共轉(zhuǎn)化預(yù)期的宿主細胞。然后將用本發(fā)明表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞在本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的合適的條件下參考包含于本文的教導培養(yǎng)的足夠時間，以使該多肽表達，其后可以回收所述多肽。許多表達系統(tǒng)為已知的，包括細菌(例如，大腸桿菌和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis))、酵母(例如酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae))、絲狀真菌(例如曲霉屬(Aspergillus))、才直物細刀包、動物細^^和昆蟲細月包。載體通常包括原核復(fù)制子，例如ColElon',以用于在原核細胞中的增殖，即使該載體是用于其他非原核生物細胞類型中的表達。載體還可以包含合適的啟動子，例如原核生物啟動子，其能夠指導基因在受其轉(zhuǎn)化的細菌宿主細胞例如大腸桿菌中的表達(轉(zhuǎn)錄和翻譯)。啟動子是一種表達控制元件，由DNA序列組成，其使RNA聚合酶能夠結(jié)合并使轉(zhuǎn)錄起始。與示范性細菌宿主兼容的啟動子序列通常由質(zhì)粒載體提供，所述載體包含方便的限制性位點以插入本發(fā)明的DNA片段。典型的原核載體質(zhì)粒為可從BioradLaboratories(Richmond,CA，USA)獲得的pUC18、pUC19、pBR322和pBR329,以及可從Pharmacia,Piscataway,NJ,USA獲得的pKK223-3。特別優(yōu)選的原核質(zhì)粒載體包括pRSET和pHIP(Invitrogen,California,USA)。典型的哺乳動物細胞栽體質(zhì)粒是可從Pharmacia,Piscataway，NJ，USA獲得的pSVL。該載體利用SV40晚期啟動子以驅(qū)動克隆基因的表達，其中最高水平的表達發(fā)現(xiàn)于T抗原生成細胞，例如COS-l細胞?？烧T導性哺乳動物表達載體的例子是pMSG，同樣可從Pharmacia獲得。該載體利用源于小鼠乳瘤病毒長末端重復(fù)序列的糖皮質(zhì)激素誘導啟動子，以驅(qū)動克隆基因的表達?？衫玫慕湍纲|(zhì)粒載體為pRS403-406和pRS413-416,其通常可從StratageneCloningSystems,LaJolla,CA92037,USA獲得。質(zhì)粒pRS403、pRS404、pRS405和pRS406為酵母整合型質(zhì)粒(YeastIntegratingplasmid;Yips),并合并了酵母選擇標記//753、7T尸7、丄五t/2和IT/L43。質(zhì)粒pRS413-416為酵母著絲粒質(zhì)粒(Ycps)。其他載體和表達系統(tǒng)均為本領(lǐng)域已知的，并用于多種宿主細胞。宿主細胞可以為原核或真核的。細菌細胞為優(yōu)選的原核宿主細^^，并通常是大腸4干菌的菌才朱，比方il，例長口可乂人BethesdaResearchLaboratoriesInc.，Bethesda,MD,USA獲得的大腸桿菌菌林DH5和可從Rockville,MD，USA的美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection(ATCC》獲得的RR1(編號ATCC31343)。優(yōu)選的真核宿主細胞包括酵母、昆蟲和哺乳動物細胞，優(yōu)選脊推動物細胞，比如來自小鼠、大鼠、猴類或人類成纖維細胞系和腎細胞系。酵母宿主細胞包括YPH499、YPH500和YPH501，其通?？蓮腟tratageneCloningSystems,LaJolla，CA92037，USA獲得。優(yōu)選的哺乳動物宿主細胞包括可從ATCC作為CRL1658獲得的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、293細胞即人胚腎細胞和NS0細胞。優(yōu)選的昆蟲細胞為可用桿狀病毒表達載體轉(zhuǎn)染的Sf9細胞。以本發(fā)明的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化合適的細胞宿主，是通過已知方法完成的，并通常依賴于所用載體的類型。關(guān)于原核宿主細胞的轉(zhuǎn)化，參見例如Cohen等(1972)尸rac.Ato/.爿cad69,2110和Sambrook等(1989)Mo/ecw/wC7om'"g,^Z^6or<2tor_yAf(3wwa/，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY。酵母細胞的轉(zhuǎn)化描述于Sherman等(1986)Me^zo^FeaWGe"e"cs,^丄a6oratoo;Marn/a/，ColdSpringHarbor,NY。Beggs(1978)7Vaf臟275，104-109中描述的方法也可適用。關(guān)于脊推動物細胞，用于轉(zhuǎn)染這些細胞的試劑例如磷酸鈣和DEAE-葡聚糖或脂質(zhì)體制劑，可由StratageneCloningSystems或LifeTechnologiesInc.,Gaithersburg，MD20877,USA才是供。電穿孔法也可以用于轉(zhuǎn)化和/或轉(zhuǎn)染細胞，并已知在本領(lǐng)域中能夠用于轉(zhuǎn)化酵母細胞、細菌細胞、昆蟲細胞和脊推動物細胞。例如，許多細菌種類可以通過Luchansky等(1988)Mo/.M/mh'o/.2，637-646中描述的方法進行轉(zhuǎn)化，其以引用的方式并入本文中。最大數(shù)量的轉(zhuǎn)化體在DNA-細胞混合物的電穿孔之后持續(xù)(consistently)獲得，所述DNA-細胞混合物懸浮于2.5PEB中，電穿孔在25jiFD以6250V每cm進行。以電穿孔轉(zhuǎn)化酵母的方法公開于Becker&Guarente(1990)MeZ/^A五wzymo/.194,182中。成功轉(zhuǎn)化的細胞，即含有本發(fā)明DNA構(gòu)建體的細胞，可通過已知技術(shù)鑒定。例如，可以培養(yǎng)在引入本發(fā)明表達構(gòu)建體后產(chǎn)生的細胞來產(chǎn)生本發(fā)明的多肽?？梢允斋@并裂解細胞，并可以使用由Southern(1975)■/Mo/.歷o/.98,503或Berent等(1985)所ofec/z.3,208描述的方法檢驗它們的DNA內(nèi)容物中所述DNA的存在。或者，上清液中存在的蛋白可以通過下面描述的抗體來檢測。除了直接檢測存在的重組DNA之外，當重組DNA能夠指導蛋白表達時，成功的轉(zhuǎn)化還能夠通過已知的免疫學方法而確定。例如，表達載體成功轉(zhuǎn)化的細胞生成具有適當抗原性的蛋白。收獲疑似轉(zhuǎn)化成功的細胞樣品，并利用合適的抗體檢測其蛋白。宿主細胞可以是非人動物體內(nèi)的宿主細胞。因此，依靠轉(zhuǎn)基因的存在而表達本發(fā)明第一方面的化合物(或其結(jié)合部分(bindingmoiety))的轉(zhuǎn)基因非人動物也包含于此。優(yōu)選地，該轉(zhuǎn)基因非人動物為嚙齒動物例如小鼠。轉(zhuǎn)基因非人動物可以通過本領(lǐng)域已知方法獲得。培養(yǎng)宿主細胞和分離重組蛋白的方法為本領(lǐng)域熟知的。應(yīng)理解，依賴于宿主細胞，生成的本發(fā)明化合物(或其結(jié)合部分(bindingmoiety))可以是不同的。例如，特定的宿主細胞，例如酵母或細菌細胞，可以不含，也可以包含不同的翻譯后修飾系統(tǒng)，所述系統(tǒng)可以產(chǎn)生以不同方式進行翻譯后修飾的多種形式的本發(fā)明化合物(或其結(jié)合部分(bindingmoiety))。優(yōu)選地，本發(fā)明的化合物(或其結(jié)合部分(bindingmoiety))在真核系統(tǒng)中產(chǎn)生，例如哺乳動物細月包。根據(jù)次優(yōu)選的實施方式，本發(fā)明的化合物(或其結(jié)合部分(bindingmoiety))可利用商業(yè)上可以獲得的體外翻譯系統(tǒng)而在體外生成，例如家兔網(wǎng)織紅細胞裂解液或麥胚裂解液(可從Promega獲得)。優(yōu)選地，該翻譯系統(tǒng)為兔網(wǎng)織紅細胞裂解液。方便地，該翻譯系統(tǒng)可以耦合至轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，例如TNT轉(zhuǎn)錄-翻譯系統(tǒng)(Promega)。本系統(tǒng)具有以下優(yōu)點，即在與翻譯相同的反應(yīng)中從編碼DNA多核苷酸產(chǎn)生合適的mRNA轉(zhuǎn)錄物。因此，本發(fā)明的第二方面提供編碼本發(fā)明第一方面的多肽的核酸分子。在一個實施方式中，該核酸分子為DNA分子。有利的是，該核酸分子進一步包含宿主細胞可識別的信號肽，所述宿主細胞即為在其中表達本發(fā)明多肽的細胞。本發(fā)明的第三方面提供包含本發(fā)明第二方面的核酸分子的載體。在一個實施方式中，該載體為表達載體(例如pRSET和pHIP)。本發(fā)明的第四方面提供包含本發(fā)明第二方面的核酸分子或包含本發(fā)明第23三方面的載體的宿主細胞。在一個實施方式中，所述宿主細胞為大腸桿菌細胞。本發(fā)明的第五方面提供生成本發(fā)明第一方面多肽的方法，其包括在該多肽表達的條件下，培養(yǎng)含有本發(fā)明第二方面的核酸分子或本發(fā)明第三方面的載體的宿主細胞群體，并從中分離所述多肽。表達多肽的"分離"包括從培養(yǎng)基中去除一部分或全部的雜質(zhì)，例如細胞碎片。在一個實施方式中，所述多肽是基本上(substantially)純的。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽優(yōu)選地以藥物組合物的形式提供，該藥物組合物包含所述化合物和可藥用的載體。因此，本發(fā)明的第六方面提供包含本發(fā)明第一方面的多肽的藥理組合物。"可藥用的"包括無菌且不含熱原(pyrogenfree)的制劑。合適的藥物載體為制藥領(lǐng)域熟知的。載體必須為"可用的(acceptable)"，即在某種意義上與本發(fā)明的化合物相兼容，且對其受體無害。通常的載體為無菌且不含熱原的水或生理鹽水；然而，也可以利用其他可用的載體。因此，"可藥用的載體"和"可藥用的賦形劑"包括用于形成該制劑一部分的任何化合物，其旨在僅產(chǎn)生載體的作用，即本身不具有生物活性?？伤幱玫妮d體或賦形劑通常為安全的、無毒的，且不會在生物學或其他方面產(chǎn)生不良影響。用于此處的可藥用的載體或賦形劑同時包括一種和多于一種的此類載體或賦形劑的情況。本發(fā)明的多肽可以制成不同濃度，其依賴于所用化合物的效力/毒性。優(yōu)選地，該制劑包含濃度為0.1jiM至1mM的本發(fā)明的作用物，更優(yōu)選1jaM至100i^M,5fiM至50jiiM，10inM至50)iM，20pM至40pM且最優(yōu)選約30pM。對于體外應(yīng)用，該制劑可以包含更低濃度的本發(fā)明化合物，例如0.0025nM至1(xM。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，所述藥物和作用物(即多肽)通常將與根據(jù)計劃的施用途徑和標準藥物實踐而選擇的合適的藥物賦形劑、稀釋劑或載體混合施用(例3口，見7em/wgtow:JTzeSc/ewceawd/Vac"ceo/_P/w;rwac_y,19thedition,1995,Ed.AlfonsoGennaro，MackPublishingCompany,Pennsylvania,USA,其以引用的方式并入本文中)。例如，所述藥物和作用物可以以片劑、膠嚢、胚珠制劑(ovule)、酏劑、溶液或懸浮液的形式進行口服、口腔或舌下給藥，其可以包含調(diào)味劑或著色劑，用于立即釋放的、延遲釋放的或控制釋放的應(yīng)用。該藥物和作用物還可24以通過海綿體內(nèi)注射(intracavemosalinjection)的方式給藥。此類片劑可以包含以微晶纖維素、乳糖、檸檬酸鈉、碳酸鈣、磷酸氫鈣和甘氨酸為例的賦形劑，以淀粉(優(yōu)選玉米、馬鈴薯或木薯(tapioca)淀粉)、乙醇酸淀粉鈉、交聯(lián)羧曱基纖維素鈉和特定的復(fù)合硅酸鹽為例的崩解劑，以及以聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基曱基纖維素(HPMC)、羥丙基纖維素(HPC)、蔗糖、明膠和阿拉伯膠為例的造粒粘合劑(granulationbinder)。此外，以硬脂酸鎂、硬脂酸、甘油二十二烷酸酯和滑石為例的潤滑劑也可以包含在內(nèi)。相似種類的固體組合物也可以用作膠嚢的填充劑。就這點而言優(yōu)選的賦形劑包括乳糖(lactose)、淀粉、纖維素、乳糖(milksugar)或高分子量聚乙二醇。對于水懸浮液和/或酏劑，本發(fā)明的化合物可以與以下物質(zhì)組合各種不同的甜味劑或調(diào)味劑，色素或染料，乳化劑和/或懸浮劑，以水、乙醇、丙二醇和甘油為例的稀釋劑，以及它們的組合。本發(fā)明的藥物和作用物還可以以胃腸外方式給藥，例如靜脈內(nèi)用藥、關(guān)節(jié)內(nèi)用藥、動脈內(nèi)給藥、腹膜內(nèi)用藥、鞘內(nèi)給藥、心室內(nèi)給藥、胸骨內(nèi)給藥、顱內(nèi)給藥、肌內(nèi)給藥、皮下給藥，或者可以通過灌注技術(shù)給藥。它們的最佳應(yīng)用形式是無菌水溶液，其可以包含其他物質(zhì)，例如足夠的鹽或葡萄糖以使該溶液與血液等滲。如必要的話，水溶液應(yīng)該進行適當?shù)鼐彌_(優(yōu)選緩沖至pH3-9)。無菌條件下合適的胃腸外制劑的制備，可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標準臨床技術(shù)很容易地完成。適合胃腸外給藥的制劑包括水性和非水性的無菌注射溶液，其可以包含抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑和能夠使溶液與目標受體血液等滲的溶質(zhì)；以及水性和非水性的無菌懸浮液，其可以包含懸浮劑和增稠劑。該制劑可以保存在單位劑量或多劑量容器中，例如密封安瓿和小瓶，并可以在冷凍干燥(凍干)的條件下貯存并只需要在使用前即刻加入無菌液體載體，例如在注射前加入水。臨時調(diào)配的(extemporaneous)注射溶液和懸浮液可以用上文描述的類型的無菌粉末、顆粒和片劑制備。對于人類患者的口服和胃腸外給藥，所述藥物和作用物的每日劑量通常介于每位成人l至1000mg(即大約0.015至15mg/kg),以單獨或分開劑量給藥。所述藥物和作用物還可以通過鼻內(nèi)或吸入給藥，并方便地以干粉吸入劑或氣溶膠噴霧劑的形式遞送，所述干粉吸入劑或氣霧噴劑是來自于加壓容器、泵、噴霧器或利用合適推進劑的霧化器，該推進劑的例子有二氯二氟曱烷、三氯氟曱烷、二氯四氟乙烷、以1，1,1,2-四氟乙烷(HFA134A3)或U,1,2,3,3,3-七氟丙烷(HFA227EA3)為例的氫氟烷烴、二氧化碳或其他合適的氣體。在加壓氣溶膠的情況下，其劑量單位可以通過能夠定量釋放的閥門而測定。該加壓容器、泵、噴霧器或霧化器可以包含活性化合物的溶液或懸浮液，例如利用乙醇和推進劑的混合物作為溶劑，其可以附加地包含潤滑劑，例如三油酸山梨坦。用于吸入器或吹入器的膠嚢和藥筒(例如以明膠制成)可以配置成包含本發(fā)明化合物和合適的粉末基底例如乳糖或淀粉的粉末混合。優(yōu)選使用氣溶膠或干粉劑型，從而使每計量藥劑或"噴氣"包含至少lmg的本發(fā)明化合物以遞送給患者。應(yīng)理解，氣溶膠的每日總劑量因患者而異，且可以以單劑量的形式用藥，或者更通常的情況是，在一天中以分開的多劑量形式用藥。或者，所述藥物和作用物可以以栓劑或陰道栓的形式給藥，或者它們可以以洗劑(lotion)、溶液、乳霜(cream)、藥膏或撒布粉(dustingpowder)的形式給藥。本發(fā)明的化合物還可經(jīng)皮給藥，例如，通過利用皮膚貼片(skinpatch)。它們還可以通過眼的途徑給藥。對于皮膚局部用藥，所述藥物和作用物可以制成包含活性化合物的合適的藥膏形式，所述活性化合物懸浮或溶解于例如以下物質(zhì)中的一種或多種的混合物礦物油、液體石蠟、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯化合物(polyoxyethylenepolyoxypropylenecompound)、乳"f匕蟲昔和？K?；蛘?它們可以制成合適的洗劑或乳霜，其懸浮或溶解于例如以下物質(zhì)中的一種或多種的混合物礦物油、硬脂山梨坦、聚乙二醇、液體石蠟、聚山梨酯60、十六烷基酯蠟、鯨蠟硬脂醇(cetearylalcohol)、2-辛基十二醇、苯曱醇和水。適合口腔部局部用藥的劑型包括錠劑(lozenges),其包含的活性成分存在于加香基料(flavouredbasis)中，所述基料通常為蔗糖和阿拉伯膠或西黃蓍芪膠(tragacanth);錠片(pastilles),其包含的活性成分存在于惰性基料中，例如明膠和甘油，或蔗糖與阿拉伯膠；以及漱口劑，其包含的活性成分存在于合適的液體載體中。當藥物或租用無為多肽時，可優(yōu)選利用緩釋(sustained-release)藥物遞送系統(tǒng)，例如微球。它們是為了減少注射的頻率而特別設(shè)計的。該系統(tǒng)的一個例子是NutropinDepot(重組生長激素緩釋劑)，其將重組人生長激素(rhGH)包裹于可生物降解的微球中，一旦注射，其將在一段時間內(nèi)持續(xù)緩慢釋放rhGH。緩釋免疫球蛋白組合物還包括脂質(zhì)體包裹的免疫球蛋白。含有免疫球蛋白的脂質(zhì)體由本身已知的方法制備。例如，參見Epstein等，尸rac.Ato/.^cad82:3688-92(1985);Hwang等，A^/.爿cad77:4030-4(1980);美國專利第4485045、4544545、6139869和6027726號。普通情況下，脂質(zhì)體為小型(約200至800埃)、單層型的，其中脂質(zhì)含量大于約30摩爾百分數(shù)(mol.%)膽固醇；選擇的比例是為了最佳的免疫球蛋白治療而調(diào)整的?；蛘?，多肽藥物和作用物可以通過外科手術(shù)植入的設(shè)備而給藥，其將藥物直接釋放于所需部位。電穿孔治療(EPT)系統(tǒng)也可以用于該蛋白和多肽的給藥。對細胞釋放脈沖電場的設(shè)備增加細胞膜對藥物的通透性，極大地改善細胞內(nèi)藥物遞送。蛋白和多肽還可以以電摻入(electroincorporation;EI)的方式遞送。當皮膚表面直徑達到30微米的小顆粒經(jīng)受與電穿孔相同或類似的電脈沖時，EI就會發(fā)生。在EI中，這些顆粒受到驅(qū)動而穿透角質(zhì)層并進入皮膚的更深層。該顆?？梢杂盟幬锘蚧蚣虞d或包裹，或可以簡單地像"子彈"一樣在皮膚上產(chǎn)生小孔，藥物能夠通過這種小孔進入。另外一種遞送蛋白和多肽的方法是熱敏感ReGel可注射劑(thermo-sensitiveReGelinjectable),4氐于體溫時，ReGel為可注射的液體，而它在體溫時會迅速形成凝膠狀貯存器，其緩慢消蝕并溶解成已知的、安全的、可生物降解的聚合物?；钚运幬镫S著該生物聚合物的溶解而進行遞送。蛋白和多肽藥物還可以進行口服遞送。一種這樣的系統(tǒng)利用了口服攝入維生素B12在體內(nèi)的天然過程來共同遞送蛋白和多肽。通過搭載于該維生素B12的攝入系統(tǒng)，該蛋白或多肽能夠移動穿透腸壁。維生素B12的類似物和藥物形成復(fù)合物，所述復(fù)合物同時保留其維生素B12部分對于內(nèi)因子(IF)的高親和力以及其藥物部分的高生物活性。因此，本發(fā)明的一個方面提供本發(fā)明第一方面的多肽以用于醫(yī)藥領(lǐng)域。本發(fā)明的另一個方面提供本發(fā)明第一方面的多肽在制備藥物中的用途，所述藥物用以抑制補體5a(C5a)和/或N-曱酰肽fMLP的生物活性。過敏毒素C5a介導多種炎性反應(yīng)。通過作用于C5aR,其在活化和募集吞噬細胞中起了重要作用，并對入侵微生物的有效清除是至關(guān)重要的。近年來，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，C5a還在破壞性炎性過程中起重要作用，例如組織損傷和導致器官壞死的嚴重炎性癥狀。此外，C5a還與其他幾種生物過程相關(guān)，所述過程影響正常的器官發(fā)育、多種細胞譜系的早期分化以及保護細胞免受程序性死亡(見表1)。表lC5a-相關(guān)的生物過程MAPK的活化內(nèi)皮細胞活化單核細胞活化血管生成嗜伊紅粒細胞趨化髓鞘化細月包凋亡胞吐作用嗜中性粒細胞活化花生四烯酸代謝受精作用嗜中性粒細胞趨化星形膠質(zhì)細胞活化纖維蛋白溶解磷脂酶C活化嗜堿性粒細胞活化葡萄糖代謝磷脂代謝凝血糖酵解血小板活化骨重建己糖轉(zhuǎn)運蛋白激酶C活化骨吸收高度磷酸化肌動蛋白聚合的調(diào)控兒茶酚胺生物合成脂代謝呼吸爆發(fā)細胞黏附酯加氣酶途徑平滑肌收縮細胞周期淋巴細胞活化精子發(fā)生細胞分化淋巴細胞趨化超氧化物釋放細胞生長淋巴細胞增殖T細胞增殖細胞入侵巨噬細胞活化血管收縮細胞遷移巨噬細胞趨化血管舒張環(huán)氧合酶通路巨噬細胞分化病毒進入類花生酸生物合成肥大細胞活化傷口愈合胞吞作用微管聚合人曱酰肽受體(FPR)以及它的變體FPRL-1(FPR-樣l)和FPRL-2(FPR-樣2)均屬于七跨膜區(qū)的Gi-蛋白偶聯(lián)受體。兩種受體均以高水平存在于嗜中性粒細胞和單核細胞中。FPR定義為高親和力曱酰肽受體，而FPRL-1基于其僅由高濃度fMLP活化而定義為低親和力受體。由于自然中曱酰肽的唯一來源是細菌和線粒體蛋白合成，人們認為，這些受體的功能是作為傳遞者(mediator)將吞噬細胞募集至細菌入侵或組織損傷部位。該觀點由以下觀察到的事實所支持，即FPR敲除小鼠更容易受到單核細胞增生利斯特桿菌(丄Wen'flmomcytoge"e》的感染。同樣，功能失常的FPR等位基因與局限型青少年牙周炎相關(guān)。在過去的幾年中，鑒定了這些受體的大量非曱?；呐潴w(見表2)。這些配體起源于不同來源，包括隨機肽庫、內(nèi)生性來源和病原體。它們中的一些與包括阿爾茨海默病、淀粉樣變性病和朊病毒病在內(nèi)的人類疾病相關(guān)。因此，將曱酰肽受體在不同炎性過程的治療中作為目標。表2FPR和FPRL-1激動劑和拮抗劑<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>因此，該多肽用于制備作為C5aR和/或FRP的拮抗劑發(fā)揮功能的藥物。方便地，該多肽能夠與以上受體中的一種或兩種直接結(jié)合。在一個實施方式中，該藥物用于抑制C5a受體的整體或部分功能。在另一個實施方式中，該藥物用于抑制曱?；氖荏w的整體或部分功能。在一個進一步的實施方式中，C5a受體和/或曱?；氖荏w位于嗜中性粒細胞、單核細胞和/或內(nèi)皮細胞上。因此，該藥物可以用于抑制由補體5a(C5a)和/或N-曱酰肽fMLP誘導的嗜中性粒細胞的活化。在一個實施方式中，該藥物用于治療炎癥，例如急性或慢性炎性反應(yīng)。術(shù)語"治療，，以及類似用語，用于此處通常表示取得希望的藥理學和生理學效果。此外，它表示任何過程、作用、應(yīng)用、治療或者諸如此類的意思，其中哺乳動物，包括人類，出于改善其狀況的目的而受到直接或非直接地醫(yī)治(medicalaid)。因此，治療包括治療性和預(yù)防性的用途。在另一個實施方式中，該藥物用于治療選自下組的疾病或癥狀急性反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、急性移植排斥、成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)、酒精性肝炎、同種異體移植、阿爾茨海默病、動脈硬化、阿爾圖斯反應(yīng)、哮喘、動脈粥樣硬化、特應(yīng)性皮炎、纟田菌性腦膜炎、支氣管月巿癌(bronchogeniccarcinoma)、大皰性類天皰齊(bullouspemphigoid)、燒傷(burn)、心肺分流術(shù)(cardiopulmonarybypass)、心血管疾病、慢性支氣管炎、慢性淋巴白血病、慢性阻塞性肺病(COPD)、接觸性皮炎、克羅恩病(Crohn，sdisease)、皮膚D2D388—274LXA4SAAA(3242PrP106-1262拮抗劑Boc孔FLF環(huán)孢菌素HDCACDCASpinorphiiiuPAR(aa88-274)FRPL1脂質(zhì)代謝產(chǎn)物FPRL1急性期反應(yīng)蛋白FPRL-1mFPR隱2APP(aal-42)FPRL-1mFPR-2朊病毒(aal06-126)FPRL-1FPRFPRFPRFPRFPRL-1FPR的酸酸月鹵脊液5pM1.0nM2520.5100pM175300,50成菌汁汁合真膽膽3-MMM;J112T細胞淋巴瘤、嚢性纖維化、皮膚病(dermatoses)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis)、實驗性變應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)、實驗性變應(yīng)性神經(jīng)炎(EAN)、凍傷、胃癌、腸胃病、泌尿生殖疾病、痛風、幽門螺桿菌胃炎(7/e"co6a"^"py/ohgastritis)、血液透析、遺傳性血管性水腫、超敏性肺炎、特發(fā)性肺纖維化(idiopathicpulmonaryfibrosis)、免疫復(fù)合物(IC)誘發(fā)性血管炎、缺血性休克、缺血再灌注發(fā)作、缺血再灌注損傷、關(guān)節(jié)疾病、(大)血管夕卜牙+手術(shù)((large)vesselsurgery)、金屬》因，在(metalfumefever)、多發(fā)性硬化、多系統(tǒng)器官衰竭、重癥肌無力、心肌梗死、胰腺炎、腹膜炎、胸膜氣腫(pleuralemphesema)、心肺分流術(shù)后(CPB)炎癥、銀屑病(psoriasis)、重復(fù)性勞損(repetitivestraininjury)(RSI)、呼口及系統(tǒng)疾病(respiratorydisease)、類風濕性關(guān)節(jié)炎、膿毒癥(sepsis)、敗血性休克、鼻竇炎、皮膚病(skindisease),中風、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、移植、(創(chuàng)傷性)腦損傷((traumatic)braininjury)、潰瘍性結(jié)腸炎、尿路感染、血管滲漏綜合征、血管炎和異種移植。在一個實施方式中，該藥物用于治療再灌注損傷。例如，再灌注損傷可以與急性心肌梗死(AMI)、冠狀動脈旁路移植術(shù)(CABG)、中風和/或器官移植相關(guān)。在另一個實施方式中，該藥物用于治療急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)。因此，本發(fā)明進一步提供治療受試者的方法，該受試者需要使用補體5a(C5a)和/或N-曱酰肽fMLP的生物活性抑制劑的治療，該方法包括向受試者施用本發(fā)明第一方面的多肽或本發(fā)明第六方面的藥物組合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，所述受試者為人。將本發(fā)明的多肽或藥物組合物以有效量對患者給藥。"治療有效量"或"有效量"或"治療有效"，用于此處表示對補體5a(C5a)和/或N-曱酰肽fMLP的生物活性產(chǎn)生抑制的量。這是經(jīng)計算能產(chǎn)生預(yù)期治療效果的活性物質(zhì)的預(yù)定量。此外，還旨在表示該量足夠減少且最優(yōu)選防止宿主的活性、功能和反應(yīng)上的臨床顯著性缺陷。或者，治療有效量是足夠?qū)λ拗鞯呐R床顯著癥狀產(chǎn)生改善作用的。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，化合物的量可以根據(jù)其比活性而改變。聯(lián)系到所需的稀釋劑，合適的劑量可以包含經(jīng)計算能產(chǎn)生預(yù)期治療效果的預(yù)定量的活性組合物。在制備本發(fā)明組合物的方法和用途中，提供活性化合物的治療有效量。治療有效量可以由醫(yī)藥或獸醫(yī)領(lǐng)域的普通工作人員運用此領(lǐng)域的已知方法根據(jù)患者的特性，例如年齡、重量、性別、癥狀、并發(fā)癥、其他疾病等確定。因此，在一個實施方式中，該方法包括對個體施用足以發(fā)揮C5aR和/或FPR拮抗劑作用的量的所述化合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，所述有效量的化合物或其制劑可以以單一大丸劑(singlebolusdose)遞送(即急性給藥)，或者，更優(yōu)選地，在一段時間內(nèi)以多劑量遞送(即慢性給藥)。本發(fā)明的變體CHIPS蛋白可以通過定向進化技術(shù)制備，例如由AlligatorBioscienceAB開發(fā)的Fragment-InducedNucleotideDiversity('FIND，)(片^殳引發(fā)的核苷酸多樣性)方法。該FIND方法在WO98/58080，WO02/48351和WO03/97834中有詳細描述。因此，本發(fā)明的另一方面提供用于生成本發(fā)明第一方面的多肽的方法，該方法包括以下步驟(a)提供一種或多種編碼野生型CHIPS蛋白或其變體的親本多核苷酸分子；(b)以核酸酶(例如外切核酸酶)消化所述一種或多種親本多核苷酸分子以產(chǎn)生多核苷酸片段；(c)將步驟(b)產(chǎn)生的所述多核苷酸片段彼此接觸；和(d)擴增彼此退火的片段以產(chǎn)生至少一種編碼變體CHIPS多肽的多核苷酸序列，所述變體CHIPS多肽與所述一種或多種親本多核苷酸分子編碼的那些多肽相比具有改變的氨基酸序列。技術(shù)人員應(yīng)理解，步驟(a)提供的親本多核苷酸可以為雙鏈或單鏈的。然而步驟(a)中的親本多核苷酸分子優(yōu)選為單鏈的。在一個實施方式中，步驟(d)包括添加具有預(yù)定變異性的寡核苷酸，以控制引入親本多核苷酸確定區(qū)域的變異性程度。在另一個實施方式中，該方法另外包括步驟(e)，即表達步驟(d)中產(chǎn)生的至少一種多核苷酸序列并篩選出所得多肽中具有野生型CHIPS蛋白生物活性的多肽，所述生物活性例如能夠抑制嗜中性粒細胞的C5a誘導的活化和/或嗜中性粒細胞的fMLP誘導的活化。步驟(e)還可以包括檢測產(chǎn)生的多肽同C5aR和/或FPR的結(jié)合能力。該結(jié)合特性可以通過本領(lǐng)域的已知方法評估，例如親和層析和噬菌體展示。更優(yōu)選地，本發(fā)明進一步包括步驟(f),即篩選出所得多肽中相對于野生型CHIPS蛋白具有降低的免疫原性的多肽。例如，步驟(e)可以包含以下篩選過程中的一種或多種(i)變體CHIPS多肽結(jié)合C5aR能力的檢測。例如，噬菌體選擇可以用于篩選變體多肽與對應(yīng)于C5aR的N-末端部分的肽的結(jié)合。第一輪陽性篩選之后，可以將洗脫出的噬菌體擴增，并進行下一輪陽性篩選。在第二輪陽性篩選中，可以加入人抗CHIPS抗體，以吸附多余的CHIPS分子，所述多余CHIPS分子保留有結(jié)合抗CHIPS抗體的能力；該方法能夠增加鑒定具有較低免疫原性的克隆的可能性。第二輪陽性篩選之后，立即將洗脫出的噬菌體與包裹于磁珠的人抗CHIPS抗體進行溫育。然后收集洗脫液的混合組分(pool),如下(l)不與抗體結(jié)合的噬菌體，(2)清洗步驟后，洗脫出的噬菌體，(3)以低濃度CHIPS洗脫出的噬菌體或(4)以高濃度CHIPS洗脫出的噬菌體?？梢詫碜曰旌辖M分(1)和(2)中的克隆優(yōu)先用于進一步篩選。來自所選突變體的混合組分(pool)中的基因可以克隆至pRSET載體，且蛋白以HT形式生成。(ii)通過表達ELISA檢測每種變體CHIPS多肽的濃度。(iii)檢測變體CHIPS多肽與抗CHIPS抗體的結(jié)合活性，例如通過抑制性ELISA(inhibitionELISA)和/或人抗CHIPS抗體ELISA。(iv)選擇的變體CHIPS多肽還可以重新表達，并以表達ELISA和肽ELISA進行分析。示范性篩選過程的進一步細節(jié)在實施例中有所提供(見下文)。應(yīng)理解，能夠高通量操作的篩選檢測是特別優(yōu)選的。實例可以包括基于細胞的檢測和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合檢測?？梢赃\用基于SPA(閃爍親近測定法；AmershamInternational)的系統(tǒng)。其他檢測多肽/多肽相互作用的方法包括超濾與離子噴射質(zhì)語/HPLC方法或者其他物理方法和分析方法。例如，可以運用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的焚光共振能量轉(zhuǎn)移(FluorescenceEnergyResonanceTransfer)(FRET)方法,其中兩個熒光標記實體的結(jié)合可以通過測量熒光標記彼此靠近時的相互作用而得出。檢測多肽與大分子例如DNA、RNA、蛋白和磷脂的結(jié)合的其他方法，包4舌表面等離才展子共才展沖全觀'J法(surfaceplasmonresonanceassay),例如由Plant等(1995)J"a/W所oc/zem226(2)，342-348描述的方法(其以引用的方式并入本文中)。這些方法可以利用經(jīng)過標記的多肽，例如用放射性或熒光標記標記的多肽。能夠結(jié)合目標大分子(例如C5aR或FPR)的多肽的其它鑒定方法為這樣一種方法，即當目標大分子暴露于多肽時，多肽與所述大分子的任何結(jié)合都會被檢測和/或測量。多肽與大分子結(jié)合的結(jié)合常數(shù)可以確定。多肽和大分子結(jié)合的合適的檢測和/或測量(量化)方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，且可以利用例如能夠進行高通量操作的方法進行，例如基于芯片的方法。名為VLSIPSTM的新技術(shù)，能夠產(chǎn)生包含數(shù)以十萬計或更多的不同分子探針的極小型芯片。這些生物芯片或陣列具有成列的探針；每個探針都分配有特定的位點。產(chǎn)生的生物芯片其每個位點均有例如IO微米的尺寸。所述芯片可以用于確定目標分子是否與芯片上的任何探針有相互作用。在選定的測試條件下，將陣列暴露于目標分子后，掃描設(shè)備可以檢測陣列的每個位點并確定目標分子是否與該位點的探針具有相互作用。生物芯片或陣列能夠應(yīng)用在多種篩選技術(shù)中以獲得有關(guān)探針或目標分子的信息。例如，可以利用肽庫用作探針以篩選藥物。所述肽可以暴露于受體，其中結(jié)合于受體的探針可以得到鑒定。參見1999年2月23號頒發(fā)給Rava等人的美國專利第5874219號。應(yīng)理解，鑒定可在體內(nèi)阻斷C5aR和/或FPR的多肽將是理想的。因此，應(yīng)理解，所述方法中應(yīng)用的試劑和條件的選擇，應(yīng)當使所述多肽和與其相互作用的多肽間的相互作用，與體內(nèi)天然存在的所述多肽和與其相互作用的多肽間的相互作用基本相同。示圖1-健康人類供體(11=168)中IgG抗CHIPS效價的頻率分布。效價定義為減去背景值后吸光值為0.300的稀釋度的對數(shù)。平均效價為3.62,標準差(SD)為0.72。插入值表示研究開始前的6個受試者的抗CHIPS效價(每次ELISA中以匯集(pooled)人血清為參照進行了校正的3個值的平均值(meanof3valuescorrectedforhumanpooledserumasreferenceineveryELISA))。圖2-志愿者血清中檢測出的CHIPS的藥效學。CHIPS是通過靜脈內(nèi)注射(ivinjection)CHIPS后在不同時間點以特異性捕獲ELISA而測定的。空心的標志代表安慰劑，實心標志代表CHIPS接收體(receiver)。圖3-人抗CHIPSIgG抑制了通過捕獲ELISA完成的CHIPS的檢測。將回收的2.5ngmL—^HIPS加入(spikeinto)不同濃度的匯集的人血清中并由捕獲ELISA(a)進行測量。通過蛋白-G-S印harose(瓊脂糖凝膠)消耗的人血清IgG,消除對CHIPS捕獲ELISA(b)的抑制作用。將不同濃度的CHIPS與緩沖液O)、1%人血清(來自單一供體，▲)、或經(jīng)過蛋白-G-瓊脂糖凝膠后的1。/。的血清(T)溫育。數(shù)據(jù)顯示的是一個典型實驗。圖4-CHIPS于外周血嗜中性粒細胞的表面回收。在靜脈內(nèi)注射CHIPS后的不同時間點，結(jié)合于嗜中性粒細胞表面的CHIPS的存在性通過兔抗CHIPS抗體進行檢測。每個受試者都有所顯示；白色柱代表安慰劑，黑色柱代表CHIPS接收體。數(shù)值表示在不同時間點(丁=0、15、60、240分鐘和24小時之后)EDTA全血樣品中門控的嗜中性粒細胞(gatedneutrophils)的平均熒MFL值為6。圖5-人外周血嗜中性粒細胞上FPR(a)和C5aR(b)的表達。在靜脈內(nèi)注射CHIPS后的不同時間點，嗜中性粒細胞表面上存在的FPR通過FITC標記的fMLP來檢測，而存在的C5aR通過FITC標記的抗CD88mAb(單克隆抗體)來檢測。白色柱代表安慰劑，黑色柱代表CHIPS接收體。數(shù)值表示門控的嗜中性粒細胞(gatedneutrophils)的平均熒光(MFL)。圖6-活體外(exWvo)全血fMLP刺激后外周血嗜中性粒細胞的抑制指數(shù)。在靜脈內(nèi)注射CHIPS后的不同時間點，將EDTA抗凝血與緩沖液和fMLP于37°C溫育30分鐘，并分析其中CDllb和CD62L二者的表達。在每個時間點，將CDllb和CD62L的表達表示為相對于經(jīng)緩沖液處理的對照樣品的表達(CDllb相對增高而CD62L表達相對降低)。這些數(shù)值用于計算在每個時間點每個受試者的活化指數(shù)(CD62L的相對值/CDllb的相對值)。數(shù)值以平均值士SD(標準差)的形式表示了安慰劑(o)、血清和嗜中性粒細胞CHIPS陰性(-)受試者O)和CHIPS陽性(+)受試者o)。圖7-循環(huán)外周血白細胞(a)和血清炎癥標記物CRP(b)的水平。在靜脈內(nèi)注射CHIPS后的不同時間點，進行WBC的計數(shù)和CRP的測量。(1.1和1.6分別表示1天零1個小時和一天零6個小時)。將WBC的數(shù)據(jù)相對于T=0時的數(shù)值表示，以mg.L—'表示DRP的數(shù)據(jù)。數(shù)值為安慰劑—)和CHIPS接收體(A)的平均值士SD(標準差)。圖8-以循環(huán)免疫復(fù)合物(CIC;(a))和肥大細胞標志類胰蛋白酶(b)的水平量度的CHIPS的不良反應(yīng)。靜脈內(nèi)注射CHIPS后的不同時間點，對兩種標記物進行了特異性檢測。將數(shù)據(jù)相對于IM)時的數(shù)值表示，并顯示為安慰劑O)和CHIPS接收體(A)的平均值士SD(標準差)。圖9-靜脈內(nèi)注射CHIPS后不同時間點的循環(huán)外周血嗜中性粒細胞上CDllb和CD62L的表達指數(shù)。對于每個受試者，將在每個時間點上CDllb和CD62L的表達都相對于T=0時的起始表達水平進行標準化。這些數(shù)值用于計算每個受試者在每個時間點的活化指數(shù)(CDllb的相對值/CD62L的相對值)。圖10-健康人受試者中CHIPS的免疫原性。在實驗開始前和實驗結(jié)束后7天和42天時在全部受試者中測定針對CHIPS的特異性IgG效價。數(shù)值為安慰劑(*)和CHIPS接收體O)的平均值士SD(標準差)。圖11-體外CHIPS-IgG復(fù)合物誘導的嗜中性粒細胞上CDllb的相對表達。從健康志愿者中分離的嗜中性粒細胞以濃度漸增的CHIPS連同O)或不連同()20|ig.mL—1親和純化的人抗CHIPSIgG進行攻擊(challenge)。為了確定FcyR的功能，將細胞用封閉mAb抗FcRII(IV-3)和F(ab，)2抗FcRIII(3G8)預(yù)處理，清洗并用緩沖液中的CHIPS(口)刺激或用抗CHIPSIgG(o)刺激。攻擊之后，將細胞與熒光標記的抗CDllbmAb進行水浴，以測定細胞活化的水平。將數(shù)據(jù)相對于緩沖液中(不含CHIPS也不含IgG)細胞的CDllb表達來表示，并顯示為平均值士SEM(r^3)。，圖12-活體外CHIPS和丙氨酸取代突變體誘導的全血嗜中性粒細胞上CDllb的相對表達。以濃度漸增的野生型CHIPS(CHIPSwt)、取代了46位精氨酸的丙氨酸取代突變體(CHIPSR46A)和取代了69位賴氨酸的丙氨酸取代突變體(CHIPSK69A)對來自健康志愿者中的EDTA血進行攻擊。CDllb的表達通過特異性mAb于水上確定，將數(shù)據(jù)相對于單獨緩沖液中的細胞表示，表示為平均值土SEM(n^3)。圖13-特異性抗CHIPSIgG效價和活體外全血嗜中性粒細胞的最大刺激所需的CHIPS量之間的關(guān)系。以濃度漸增的CHIPS攻擊來自健康志愿者的EDTA血，并測量CD1lb的表達作為細胞活化的指征。IgG抗CHIPS效價通過ELISA測定，且定義為產(chǎn)生吸光值為0.300的血清稀釋度的對數(shù)。回歸分析應(yīng)用以下公式進行y=減_距+辨孕x/w^圖14-CHIPS3卜u3抑制C5a誘導的細胞活化。Fluo-3標記的U937/C5aR細胞與緩沖液或1嗎.mL—1CHIPS(CHIPS一或截短的CHIPS(CHIPS"—121和CHIPS3H,3)—起進行溫育。以不同濃度的C5a刺激細胞，且代表細胞活化的熒光的增長以流式細胞儀進行測量。圖15-親和純化的抗CHIPS抗體同CHIPS衍生肽的結(jié)合能力的檢測。以50|LiLCHIPS(1fig'mL—"或CHIPS衍生肽(IOiliM)包被96-孔微量滴定板。滴定板以5。/。BSA進行封閉，并與親和純化的抗CHIPS抗體進行溫育。以結(jié)合有過氧化物酶的山羊抗人IgG和TMB作為底物檢測結(jié)合的抗體。圖16-不同的親和純化抗CHIPS抗體在ELISA中的與CHIPS或截短CHIPS變體相互作用能力的檢測。以1|ig.mL—1CHIPS或截短CHIPS包被96-孔微量滴定板。清洗各孔并與不同濃度的親和純化抗體一起溫育。以結(jié)合有過氧化物酶的物種特異性山羊IgG和TMB檢測結(jié)合的抗體。以CHIPS特異性小鼠單克隆抗體(2G8)作為對照。圖17-人親和純化抗CHIPS3卜nrlgG的抗噬菌體反應(yīng)性。以表達CHIPS的M13噬菌體、野生型噬菌體或緩沖液包被maxisorb96孔板，以檢測人親和純化抗CHIPS31—1I3-IgG的反應(yīng)性。數(shù)據(jù)表明，抗體制備物僅與表達的CHIPS蛋白反應(yīng)，而不與野生型噬菌體反應(yīng)。圖18-定位(mapped)于CHIPS分子表面的構(gòu)型表位。圖19-所選噬菌體的表征。檢測了8種不同的噬菌體與親和純化抗CHIPS3!-n3lgG結(jié)合的能力。以100|ig'mL—'親和純化抗CHIPS3卜"3lgG(a)或BSA(b)包被96孑LELISA板。以不同稀釋度的擴增噬菌體保存液(amplifiedphagestocks)與包被的反應(yīng)板一起進行溫育。以抗M13mAb4全測結(jié)合的噬菌體。選擇的噬菌體能夠結(jié)合親和純化抗CHIPS3i—113IgG，而不結(jié)合BSA。圖20-親和純化抗體及IVIgG同CHIPS蛋白及合成肽的結(jié)合。將包含圖示定位的(mapped)表位序列并包含附加的GGGC[SEQIDNO:3]間隔區(qū)和源自CHIPSN-末端(肽l-38)的合成肽的7聚體肽(7-merpeptide)用于人IgG的親和純化。檢測親和純化的a-肽抗體制備物(10嗎.mL")與共軛結(jié)合于CM5傳感芯片表面的各個肽和野生型CHIPS的結(jié)合能力。將SPR響應(yīng)按照固定的配體的量和大小進行了修正。黑色柱代表與不同親和純化抗體的結(jié)合。白色柱表示與經(jīng)過1mg.mi;1CHIPS預(yù)溫育后的抗體的結(jié)合,圖21-CHIPS肽ELISA:標準曲線圖22-抗CHIPSELISA圖23-抗CHIPSELISA圖24-抗CHIPSELISACHIPSwt標準曲線CHIPSK69A的吸光度CHIPSk69a的結(jié)合圖25-表達ELISA:CHIPSwt標準曲線圖26-示范性CHIPS突變體與人抗CHIPS抗體的結(jié)合，由抗CHIPSELISA測定(詳細序列參見實施例E)。圖27-示范性CHIPS突變體在野生型CHIPS蛋白的竟爭性存在下與人抗CHIPS抗體的結(jié)合，由抑制性ELISA測定(詳細序列參見實施例E)。圖28-基于SEQIDNO:1的第31至113位氨基酸的示范性CHIPS突變體對U937細胞(a)和嗜中性粒細胞(b)中C5aR的抑制。乂力錄CHIPS野生型1-121=SEQIDNO:1的野生型CHIPS多肽CHIPS野生型31-113=由SEQIDNO:1的第31至113位氨基酸組成的多肽N111K,G112V="CHIPS野生型31-113A"的突變型，其中第111和112位氨基酸發(fā)生了所示突變(詳細序列參見實施例E)(詳細序列參見實施例E)(詳細序列參見實施例E)陰形對照，未檢測出抗體(Ab)(即100%"抑制")陽性對照，對所有C5aR檢出最大信號(未受CHIPS抑制)用第二抗體無背景信號顯示的對照(即100%"抑制")F.3.0831-113=R3.3931-113=R3,5031-113=細月包=細月包+abl+2二細胞+ab2=實施例實施例A-體內(nèi)CHIPS活性材:枓和方法哞C////^的鉉^進行了不同的臨床前毒理學研究以研究CHIPS的安全性。其包括(i)在一組由3只組成的麻醉小獵犬(beagledog)中CHIPS對于不同心血管和呼吸參數(shù)的作用。對這些狗通過歷時1分鐘的靜脈內(nèi)灌注分別給藥0.2、2.0、20mg■kg—1的遞增劑量的CHIPS,兩次間的間隔大約30分鐘。(ii)小鼠的行為("Irwin"(歐文行為計分法))測試將CHIPS以單次靜脈內(nèi)注射7.5、25和75mg.kg^劑量的方式對雄性ICRCD-I小鼠(每組3只)用藥，以檢測其對一般行為的影響。另一附加組接受了同樣體積(10mL'kg—"的運載體(vehicle)(0.9。/。w/v無菌鹽水)。(iii)大鼠中急性靜脈內(nèi)毒性研究將96.1mg.kg—1CHIPS以單劑量(基于體積考量的最大可實現(xiàn)量(themaximumpracticallyachievableduetovolumeconsiderations))對5只雄性和5只雌性大鼠靜脈內(nèi)給藥。(iv)小鼠中急性靜脈內(nèi)毒性研究將96.1mg.kg—1CHIPS以單劑量對5只雄性和5只雌性小鼠靜脈內(nèi)給藥。(v)大鼠中7天靜脈內(nèi)推注的初步(preliminary)毒性研究(24只雄性和24只雌性，最大劑量lOmg.kg—"。(vi)大鼠中7天靜脈內(nèi)推注的毒性研究(76只雄性和76只雌性，最大劑量lOmg.kg—"。(vii)狗中7天靜脈內(nèi)推注的劑量范圍探測的研究(2只雄性和2只雌性，最大劑量20mgkg—"。(viii)狗中7天靜脈內(nèi)推注的毒性研究(12只雄性和12只雌性，最大劑量20mg.kg—"。6括乂類,悉^f者健康志愿者的納入標準如下(i)受試者應(yīng)為男性。(ii)受試者應(yīng)滿足以下體重指數(shù)(BMI)范圍18-30(kg.m2)和年齡范圍18-50周歲，兩者的端值均包含在內(nèi)(bothinclusive)。(iii)醫(yī)學篩選分為兩部分。受試者以抗CHIPS抗體水平進行預(yù)篩選。只有具有低效價的受試者能在用藥之前的3周內(nèi)進行第二部分篩選，其包括病史，體檢，血壓、心率、呼吸和體溫的檢測，呼氣酒精測試(alcoholbreathtest)，血液尿液檢查，心電圖(ECG)和藥物篩選。入虎和經(jīng)訪(Wm/加'o"朋c//。〃ow，」將選擇的6位受試者(4位接受CHIPS,2位為對照)在用藥的前一天收至ClinicalPharmacologyUnit(臨床藥學單位)(Kendle,Utrecht,TheNetherlands)。進行了基線測定，包括為保證安全性的血樣(bloodsamplesforsafety)、尿液分析、暫時性病史(interimmedicalhistory)、體檢、生命體征和ECG(心電圖)。給藥當日，將野生型CHIPS(0.1mg.kg—1以單劑量的無菌冷凍等滲鹽水溶液給藥，其中含有濃度為5mgmL—1的CHIPS)或安慰劑(0.9。/。NaCl)進行為時5分鐘的靜脈輸液。將受試者與遙測系統(tǒng)相連，從給藥前30分鐘開始進行心臟監(jiān)測，并持續(xù)至給藥后4小時。用Finapres血壓檢測儀持續(xù)測量個體的血壓，從給藥前5分鐘開始，持續(xù)至給藥后30分鐘。進行生命體征的測量，并在入院期間特定的時間點進行心電圖測量。為安全起見，對所有受試者進行臨床狀態(tài)和實驗室數(shù)據(jù)(血液學、生物化學、凝血和尿液分析)的監(jiān)控。對不良事件，根據(jù)其嚴重程度及與CHIPS或安慰劑的關(guān)系而進行記錄和表征。給藥后24小時停止對受試者的監(jiān)控。用藥兩周后，受試者重返該單位對生命體征、ECG、血和尿以及抗CHIPS抗體水平進行評估。隨訪安排在給藥6周后。CWS的乂發(fā)和4這CHIPS的克隆和表達如Haas等(2004)J!/mwimo/.173:5704-11所述。簡言之，將不含信號序列的基因通過重疊延伸PCR克隆至pRSET載體，其直才妄^f立于腸;敫酶切"t'M立點的下游(directlydownstreamoftheenterokinasecleavagesite)及EcoRI限制4立點之前。以CelLyticBBacterialCelllysis/ExtractionReagent(CelLyticB細菌細胞裂解/提取試劑)(Sigma)和溶菌酶按廠商說明對細菌進行裂解。組氨酸標記的蛋白以鎳柱(HiTrapChelatingHP，5mL，AmershamBiosciences)才艮據(jù)廠商說明進行純化，其后以腸激酶(Invitrogen)進行切割。檢測樣品的純度，并以15%SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳，MiniProtean3系統(tǒng)，Bio-Rad)和考馬斯亮藍(CoomassieBrilliantBlue)(Merck)檢測蛋白的存在。全長CHIPS在含有CHIPS編碼序列的大腸桿菌菌抹中表達，所述CHIPS編碼序列直接位于Pe舊編碼序列的下游，將所述菌抹在由大豆蛋白胨和酵母提取物組成的8L發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)。利用兩階段陽離子交換純化過程和隨后的脫鹽步驟從培養(yǎng)基和細胞中分離CHIPS。將細菌細胞團(cellpellet)重懸于包含NaCl(10mM)和DTT(10mM)的磷酸鹽緩沖液(30mM;pH7.0)并冷凍。其后于37。C解凍，冰浴并進行超聲處理。于15,000rpm離心后，回收了琥珀色的"細胞，，上清液。將該上清液以30mM磷酸鹽緩沖液稀釋4倍，并過SourceS-30柱。以磷酸鹽緩沖液鹽梯度洗脫材料，將包含CHIPS的級分合并，并進一步利用具有小落差的鹽梯度(shallowsaltgradient)的精制柱(polishingcolumn)進行純化。將包含CHIPS且純度高于97%(由HPLC測定)的級分合并，并過SephadexG25脫鹽柱以除去磷酸鹽和過量的氯化鈉。通過在Affimix樹脂(Biorad)上輕輕地搖動除去內(nèi)毒素，并以超濾法對制劑進行殺菌。通過HPLC-MS在MicrobondapacCN-RP柱上測定純度，該柱具有由水-TFA至曱醇-TFA組成的梯度流動相。CHIPS—般于大約13分鐘時被洗脫出來。該產(chǎn)物以無菌鹽水稀釋至所需濃度，并貯存于-20。C。我Offl^拔謬利用弗氏完全佐劑(Freund，sCompleteAdjuvants)以重組CHIPS免疫兔子，并以弗氏不完全佐劑加強免疫(boost)。用ELISA按前述方法(見Haas等，2004,//mmww/173(9):5704-ll)檢測其出血對于CHIPS的反應(yīng)性。從最后的出血(finalbleeding)中以標準Protein-G(Pharmacia)親和層析法按照廠商說明純化IgG。對于CHIPS的特異性小鼠單克隆抗體按所述方法生成，以Protein-GSepharose(瓊脂糖凝膠)柱純化IgG(見Haas等，2004,//mmw"o/173(9):5704-11)。^;^^化的乂我C/Z/尸S/gGW為、,利用CNBR-活化Sepharose4B(Pharmacia,GE)按照廠商的通用說明將CHIPSh21結(jié)合于(coupleto)固體基質(zhì)上。將大約8mg的純化CHIPS結(jié)合于1克Sepharose(瓊脂糖凝膠)上。將該材料裝入一個小型柱(士lmL)，以PBS平衡并緩慢灌入稀釋于PBS的靜脈用人IgG(IgG-IV;Sanquin，Amsterdam,TheNetherlands)。以PBS充分洗柱，并隨后以pH3的0.1MGlycineHC1(鹽酸甘氨酸)緩沖液洗脫。將0.5mL的級分收集至含有501MTris/HClpH8的試管，作為中和。合并具有最高OD28o值的級分，并相對于PBS透析。以ELISA分析最終制備物的IgG含量。因此用包含2嗎.mL—1羊抗人IgG(ICN)的PBS包被反應(yīng)板，以5。/。BSA封閉，并同標準IgG制備物(參考血清；Boehringer)和未知抗體的連續(xù)稀釋一起進行溫育。捕獲的IgG以過氧化物酶標記的山羊抗人IgG(Southem)檢測，并以TMB作為底物。IgG的濃度由參考曲線計算而得。微量滴定板(Greiner)以每孔50|iL包含1|igmL—'CHIPS的PBS包被，并于4。C過夜。所有清洗步驟均以PBS-0.05%Tween-20進行3次，隨后于37°C溫育1小時。滴定板以PBS-0.05%Tween-204%BSA封閉，清洗并與稀釋于PBS-0.05%Tween-201。/。BSA的血清和抗體一起進行溫育。結(jié)合的抗體以結(jié)合了過氧化物酶的物種特異性山羊抗IgG(全部來自Southern,Birmingham,USA)檢測，并以TMB作為底物。以H2S04終止反應(yīng)，并以BioRadELISA-分析儀(ELISA-reader)測量450nm的吸光度。#獲法五U卩Co^廳五丄卿微量滴定板以50|aL的包含3昭mL—1抗CHIPSmAb2G8的PBS包被，并于4。C過夜。滴定板以包含4%BSA和0.05%Tween-20的PBS封閉，清洗，并與在含1%BSA的PBS/Tween中稀釋的樣品及作為標準品的2倍稀釋范圍的CHIPS—起進行溫育。隨后，滴定板與0.33嗎mL—1兔抗CHIPSIgG和1:5000稀釋的結(jié)合有過氧化物酶的羊抗兔IgG(Southern)—起進行溫育。結(jié)合的抗體以TMB作為底物進行定量測量，以1NH2S04終止反應(yīng)，并以BioRadELISA-分析儀測量450nm的吸光度。乂尸層的#,將獲得自健康志愿者的血液收集至含有肝素鈉(GreinerBio-One)作為抗凝血劑的試管中。以PBS按1/1(v/v)稀釋肝素化血，并以10mLFicoll(聚蔗糖)(AmershamBiosciences,Uppsala,Sweden)和12mLHistopaque(密度1.119g.mL—、Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)進行密度梯度分離(layerontoagradientof10mLFicolland12mLHistopaque)。離心(320xg20分鐘，于22°C)后，從Histopaque相收集嗜中性粒細胞，以含有25mMHEPES緩沖液、L-谷氨酰胺(InvitrogenLifeTechnologies)和0.05%HSA(Sanguin)的冷RPMI1640培養(yǎng)液清洗。剩余的紅細胞以冰冷的水(ice-coldwater)裂解30秒，之后加入濃縮PBS(10xPBS)以恢復(fù)等滲。清洗后，對細胞計數(shù)并按照每毫升107個嗜中性粒細胞的濃度重懸于RPMI-1640/0.05%HSA。嗜f^在勿/g我^4迷將全血收集至K3-EDTA試管，置于冰上。將熒光標記的mAb的最優(yōu)稀釋等量分裝至Falcon試管，并與50pL血液在冰上混合30分鐘，并伴有溫和攪拌。以FACS-Lysingsolution(FACS-裂解溶液)(BD)裂解紅細胞，隨后以緩沖液清洗并將細胞團重懸于含0.5%多聚曱醛和0.1%疊氮化合物的PBS。以基于正向和橫向散射作為門控(basedonforwardandsidewardscattersforgating)的FACsCalibur分析嗜中性粒細胞表面抗原的表達。用校準珠(Calibrationbeads)(Calibrite;BD)和同型匹配對照(isotypematchedcontrols)設(shè)置合適的背景值及電子補償。應(yīng)用的mAb及探針如下APC標記的抗CDllb(CR3)(克隆44;BD);PE標記的抗CD62L(L-選擇素)(克隆Dreg56BD);FITC標記的抗CD88(C5aR)(克隆W17/1;Serotec);熒光素標記的曱?；?Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr隱Lys("FITC-fMLP，，；MolecularProbes);兔抗CHIPSIgG(EWI)和FITC標記的F(ab)'2羊抗兔IgG(Sigma)?；钽錨全i的?；顚⒉糠諯3-EDTA血保存于室溫下，并用于活體外嗜中性粒細胞的激活。因此，將血液與10倍濃縮的刺激物(緩沖液對照，lxl(rSMfMLP)混合，并于37。C溫育30分鐘，伴有溫和振蕩。將試管置于水上以終止反應(yīng)，并與抗CDllb和抗CD62L單克隆抗體(mAb)混合。于水上放置30分鐘后，按上述方法處理樣品。Offi^/7gG/褒活的嗜^/i在/恥敏J:CD"6的《這將不同濃度的CHIPS(最終濃度0-9jigmL力與親和純化的人抗CHIPSIgG(0-40昭.mL—')于37。C溫育30分鐘。之后，將50fxL分離的人嗜中性粒細胞(107mL力加入至CHIPS/a-CHIPS混合物并于37。C溫育30分鐘，伴有溫和振蕩。將細胞在冰上放置10分鐘，之后加入3.5pL熒光小鼠抗人CDllb(BDbiosciences,SanDiego,CA)并水浴30分鐘。以RPMI1640/0.05%HSA清洗細胞，并以200(iL0.5%多聚曱醛進行固定。全血中細胞上的CDllb表達利用從人類志愿者中收集的血液進行，并選擇不同的抗CHIPS效價。由于IgG已經(jīng)存在于全血中，于是僅將樣品(50(iL)與CHIPS(0-9嗎.mL—"于37。C溫育30分鐘。將樣品在冰上放置10分鐘，之后加入3.5|iL焚光標記的小鼠抗人CDllb并冰浴30分鐘。裂解紅細胞并加入1mLFACS裂解溶液(1:10稀釋于水)固定4分鐘。將細胞于1200rpm旋轉(zhuǎn)IO分鐘，以冰冷的RPMI1640/0.05。/。HSA清洗細胞團。最后，將細胞重懸于175(iLRPMI1640/0.05%HSA。以FACSCalibur流式細胞儀(BDBiosciences)測量代表細胞活化的受體表達。錄豕^瘦茇合#(^/0以來自Quidel(SanDiego，CA)的兩種不同ELISA測定CIC:CIC-Clq酶免疫測定法是基于補體結(jié)合性IC能夠與固定的人Clq純化蛋白結(jié)合的原理；CIC-Raji細胞取代酶免疫測定法是利用mAb檢測含有IC的C3活化片斷的，所述mAb能夠特異性結(jié)合C3的iC3b、C3dg和C3d活化片斷，其方式類似于典型的Raji細胞CR2結(jié)合反應(yīng)。合并兩種檢測方法的數(shù)據(jù)，其結(jié)果為相對于時間為0時的相對數(shù)值。i清類腐蛋^^的《產(chǎn)利用來自PharmaciaDiagnostics(Woerden,TheNetherlands)的ImmunoCAPTM技術(shù)在UniCAPR-100上測量源于血清的類胰蛋白酶(a和卩形式)。健康對照的正常幾何平均值(normalgeometricmean)為5.6昭.L—1(Pharmacia)。結(jié)果為相對于時間為0時的相對數(shù)值。研究方案及其任何修正均通過了獨立的倫理委員會(independentethicscommittee)的批準。本研究依照歐共體(EuropeanCommunity;EC)的良好藥品臨床試驗管理規(guī)范(GoodClinicalPractice)(GCP)和"赫爾辛基宣言"('DeclarationofHelsinki')(2000)的規(guī)則施行。結(jié)果C/ffi^4侈^尹^^^A效i的善#CHIPS的給藥在所有的毒理學動物實驗中，在以下方面均未引起與CHIPS相關(guān)的毒理學顯著變化臨床觀察、體重、攝食(foodconsumption)、血液學、凝血、血液化學參數(shù)、檢眼鏡檢查、心電圖、宏觀或顯微病理或行為。在麻醉小獵犬(beagkdog)中檢測了CHIPS對于各種心血管和呼吸參數(shù)的影響。對于接受低劑量CHIPS(0.02和2mg.kg—"的犬，與注射運載體(等滲鹽水)的相比時沒有顯示出對心血管和呼吸的影響。以20mg.kg—1CHIPS靜脈內(nèi)給藥后，在開始給藥后大約1分鐘時記錄到了平均動脈血壓的短暫降低(40%)。開始給藥后大約5分鐘內(nèi)，平均動脈血壓恢復(fù)至給藥前水平。對血壓的影響與心率短暫的、不一致的(inconsistent)變化相符合。在CHIPS首次給藥之后的大約30分鐘，以CHIPS(20mg.kg—"對一只犬進行重復(fù)靜脈內(nèi)給藥。記錄到的類似于首次給藥后的對心肺參數(shù)的短暫影響在該CHIPS重復(fù)給藥后不是很顯著。然而，二次給藥產(chǎn)生了延長的平均動脈血壓降低，其在二次用藥后約30分鐘達到了最大18%的降低。僅在這只動物中，CHIPS重復(fù)給藥后的12分鐘，出現(xiàn)了與某些形式的輕微過敏反應(yīng)一致的全身性皮膚反應(yīng)。該研究結(jié)果表明在人類受試者中，在所用劑量范圍下(O.lmg.kg力不太可能出現(xiàn)對心肺的影響。此外，可能發(fā)生的任何影響都預(yù)計為短暫和可逆的。拔C77/i^在#放/介的為、布由于金黃色葡萄球菌是一種普通的細菌且CHIPS基因存在于大多數(shù)的金黃色葡萄球菌菌林中，因此我們假定所有個體均具有循環(huán)抗CHIPS抗體。因此，我們檢測了健康志愿者血清中的抗CHIPSIgG含量。圖1表示了一組168名健康人類志愿者中抗CHIPSIgG效價的分布。在檢測的這組樣品中，沒有效價是低于所用ELISA的檢測下限的。認為研究的群體能夠代表一般人群。從該數(shù)據(jù)得出的結(jié)論是，一般人群中超過99%的人具有可檢測出的抗CHIPSIgG血清水平。圖l還顯示了實驗中包括的受試者的效價。的秀參A謝動力夢在CHIPS給藥后的四個不同時間點，以ELISA測定了CHIPS血清效價(圖2)。僅在具有低效價抗CHIPS抗體且接受了CHIPS的個體中(個體104和105)觀察到了CHIPS效價的增加。我們確定了人血清對CHIPSELISA的影響。將CHIPS加入不同濃度的混合人血清，由捕獲法ELISA進行4全測。圖3a表示，血清抑制了捕獲法ELISA。利用蛋白G-瓊脂糖凝膠(proteinG-sepharose)柱消耗IgG消除了抑制作用(圖3b)。#力a//PS和C5ai的潛合CHIPS以高親和力同嗜中性粒細胞上的FPR和C5aR結(jié)合，且可以由抗CHIPS抗體按照前文描述的小鼠mAb的方法4全測。CHIPS給藥后的不同時間點，存在于嗜中性粒細胞表面的CHIPS量通過兔抗CHIPS抗體檢測，如圖4。只有在具有低效價抗CHIPS抗體的受試者中(受試者#104和#105)，檢測到了嗜中性細胞表面的CHIPS。此外，在這兩個受試者中，檢測到的CHIPS與抗CHIPS抗體效價呈負相關(guān)。由于存在于血清中的抗CHIPS抗體阻礙了(interferew池)CHIPS的直接檢測，因此，該直接檢測的陰性結(jié)果并不能排除CHIPS結(jié)合受體的可能性。然而，結(jié)合于FPR和C5aR的CHIPS阻礙了通過抗FPR和抗C5aR抗體對這些受體的檢測，如前文所述(見Veldkamp等，2000,/"/e"/mm,68(10):5908-13)。圖5表示了通過FITC-fMLP和抗C5aR抗體結(jié)合而測定的FPR和C5a受體的表達。在具有低效價抗CHIPS抗體的受試者中，表現(xiàn)出了降低的FPR和C5aR表達，這表明CHIPS已經(jīng)占據(jù)了所述受體。在具有高效價抗CHIPS抗體的受試者中(103和106)，F(xiàn)PR和C5aR的表達未發(fā)生變化，這表明抗CHIPS抗體阻礙了CHIPS與受體的結(jié)合。f在O///^戎伴放,的C7///^#f嗜尹^在勿/《^^/MZ尸謬尋^活^的活沐##賴細胞活化時，出現(xiàn)了CD62L表達的降低和CDllb表達的增高。為了檢測靜脈內(nèi)CHIPS對于嗜中性粒細胞活化的影響，我們測量了活體外由fMLP誘導的CD62L和CDllb的表達。在全血檢測中，嗜中性粒細胞在活體外由fMLP所活化。如圖6所示，靜脈內(nèi)給藥的CHIPS能夠在活體外抑制由fMLP誘導活化的嗜中性粒細胞。該抑制作用僅在具有可檢測到的CHIPS血清濃度的受試者中(受試者104和105)存在。OZ/尸S^7發(fā)的,處《^"在CHIPS給藥后立即觀察到了嚴重的不良反應(yīng)。大部分不良反應(yīng)事件于受試者106中觀察到，其包括肌肉疼痛、呼吸困難、腹痛、嘔吐、肌肉痙攣、寒戰(zhàn)、出汗、眼眶水肺(edemaorbita)和眩暈。這些癥狀最終診斷為類過敏性反應(yīng)。該受試者以氯馬斯汀(clemastine)、IV液(IVfluids)、曲馬多(tramadol)和強的+^龍(prednisolone)進^亍治療。報道的其他不良反應(yīng)包括心悸、發(fā)熱(feelingwarm)、胸痛、面紅(flushing),發(fā)寒、腿部疲勞、體位性頭暈、發(fā)燒、頭痛、惡心、視力模糊。除了受試者106的嚴重背痛之外，受試者103與105報道有輕微背痛。受試者104報道有肌肉痙攣。受試者104和105在用藥后大約4小時觀察到高達38.6。C的發(fā)燒癥狀，并在用藥第一天晚間消退。血壓沒有變化，ECG未見異常。除了受試者106(89%氧飽和)在上述不良反應(yīng)期間的間歇性低讀數(shù)，未觀察到氧飽和的異常。接受安慰劑的受試者未報道有不良反應(yīng)。殺脈力C////^f/發(fā)'7^紐應(yīng)減少^C7尸^乎并/^如圖7所示，我們測量了給藥前和給藥后的白細胞計數(shù)(WBC)和C反應(yīng)性蛋白濃度(CRP)。在接受了CHIPS的受試者中，CHIPS引發(fā)了短暫的白細胞減少癥，其在2天內(nèi)消退。此外，用藥后的第一天開始產(chǎn)生CRP濃度的升高，其在第15天受試者隨訪做篩選時恢復(fù)到了正常水平(圖7b)。箱尿i^茇合務(wù)和并^的A清類應(yīng)蛋冷傘4^類^敏^^j我們測量了循環(huán)免疫復(fù)合物的量和血清類胰蛋白酶濃度。靜脈內(nèi)給藥的CHIPS誘導了接受CHIPS的受試者體內(nèi)免疫復(fù)合物的形成(圖8a)。我們還觀察到了類胰蛋白酶血清濃度的升高，其于給藥后大約IO分鐘時達到了最高值(圖8b)。謬,r舉力勿/^活化為了研究CHIPS對于細胞活化的直接作用，我們測定了嗜中性粒細胞上CD62L和CDllb受體的表達。受體表達的測量于收集血樣后立刻進行，而無需任何進一步的細胞激活。受試者104、105和106出現(xiàn)了嗜中性粒細胞上CD62L表達的減低和CDllb表達的升高，其代表了體內(nèi)細胞活化(圖9)。C7Z/i^^給秀#我C////^戎沐妓/介的并吝蛋白的免疫原性的特點是具有引發(fā)抗體的能力。我們測定了健康人類受試者中CHIPS的免疫原性。接受靜脈內(nèi)CHIPS的受試者表現(xiàn)出了抗CHIPSIgG的增加(圖10)。OZ/i^對f嗜,/4在勿應(yīng)W活必該^于我謬^,我們研究了體外CHIPS-IgG復(fù)合物對于嗜中性粒細胞的活化。不同濃度的CHIPS與20嗎.mL—1人親和純化抗CHIPSIgG—起預(yù)溫育，并用于激活分離的嗜中性粒細胞，如圖11所示。親和純化抗CHIPSIgG在缺乏CHIPS的情況下不能活化嗜中性粒細胞(未顯示數(shù)據(jù))。CHIPS-IgG復(fù)合物能夠以依賴劑量的方式激活嗜中性粒細胞。圖5.11還顯示，細胞的最大活化是需要最優(yōu)CHIPS濃度。CHIPS-IgG誘導的細胞活化由FcR封閉抗體完全抑制。因此，結(jié)論是，此檢測中CHIPS-IgG誘導的細胞活化是由Fc受體介導的。CHIPSR46A(^46位精氨酸用丙氨酸取代)和CHIPSk69a(第96位賴氨酸用丙氨酸取代)為兩種單氨基酸取代的CHIPS突變體，如先前所述(見Haas等,2005，JMo/所o/353(4):859—872)。通過ELISA^r測，這些CHIPS突變體顯示出了對純化抗CHIPSIgG的降低的親和力(未顯示數(shù)據(jù))。當用于全血細胞活化檢測時，這些突變體與野生型CHIPS相比具有較低的細胞活化潛能(圖12)。對于CHIPSR46A和CHIPSK69A,與野生型CHIPS相比需要其10倍濃度才能達到相同的細胞活化。這表明，僅次于抗體效價，與抗原的反應(yīng)性水平?jīng)Q定了細胞活化的程度(amount)。話沐#C7fflW#f嗜哞^在敘敏的活化化汆，f在C7fflW/gG,產(chǎn)我們以全血活體外檢測法檢測了CHIPS對于嗜中性粒細胞活化的作用。由于抗CHIPS抗體已經(jīng)存在于全血中，因此并未將CHIPS與親和純化抗CHIPSIgG—起預(yù)溫育。將不同濃度的CHIPS加入人類志愿者的血液中，并檢測代表細胞活化的CDllb的表達。圖13表明了通過在8名具有不同抗CHIPSIgG效價的健康志愿者全血中的CDllb表達，測得了嗜中性粒細胞最大激活所需的CHIPS濃度。如體外實驗所示，嗜中性粒細胞的最大激活依賴于CHIPS/抗CHIPS的比率。此現(xiàn)象同樣發(fā)現(xiàn)于該活體外檢測中。當存在更高的抗CHIPS濃度時，嗜中性粒細胞的最大激活需要更高的CHIPS濃度。討論金黃色葡萄球菌的趨化抑制蛋白是人C5a受體和曱酰肽受體非常有力的抑制劑。兩種受體，尤其是C5aR，均在多種不同炎性疾病的治療中被描述為重要靶物。CHIPS有效抑制C5aR和FPR的能力，使該蛋白成為這些疾病治療中的候選治療劑。此外，針對C5aR和FPR的活性位于CHIPS分子不同區(qū)48域的事實，使得靶向特定受體成為可能(見Haas等，2004,//附/m/"o/173(9):5704-11)。CHIPS蛋白的人類特異性，從對人類細胞的活性是對小鼠細胞活性的30倍中顯而易見，這阻礙了動物模型中CHIPS活性的體內(nèi)評估(見deHaas等，2004，J五;c;Afed199(5):687—95)。我們研究了一組包括6位健康人類受試者中金黃色葡萄球菌的趨化抑制蛋白的活性、藥物代謝動力學和毒性。在不同動物模型中給藥高濃度CHIPS(小鼠中高至96.1mg.kg—的單次靜脈內(nèi)給藥)的臨床前毒性研究，未顯示顯著的毒性跡象。因此，以0.1mg'kg_1的起始劑量靜脈內(nèi)給藥5分鐘被認為是安全的。由于金黃色葡萄球菌是一種普通的細菌且CHIPS蛋白在大多數(shù)金黃色葡萄球菌菌林中均有表達，因此我們猜測，所有個體均具有抗CHIPS抗體。對168位隨機采集的健康志愿者的血清池(pool)中抗CHIPSIgG效價的篩選證實了這個猜想。小鼠單克隆抗體的實驗表明，這些單克隆抗體可以在體外千擾CHIPS的活性(見Haas等，2004,J7mm朋o/173(9):5704—11)。因此，有理由猜測，接受CHIPS蛋白的健康受試者體內(nèi)存在的抗CHIPS抗體同樣干擾其活性。CHIPS對人受試者的給藥，是研究體內(nèi)活性和藥物代謝動力學的獨特機會。以0.1mg.kg—1CHIPS靜脈內(nèi)給藥后，我們測量了CHIPS的血清濃度。圖2表示了給藥后不同時間點的CHIPS血清濃度。在接受了CHIPS蛋白的四名受試者中，4又有兩名測量到了增加的CHIPS血清濃度(受試者104和105)。有趣的觀察現(xiàn)象是，該兩名受試者同時具有最低的抗CHIPSIgG效價。這表明，抗CHIPS抗體干擾了CHIPS的檢測。因此，由于該干擾現(xiàn)象的存在，受試者104和105中測量到的CHIPS血清濃度是被低估了的?；谶@些數(shù)據(jù)，我們計算出CHIPS在體內(nèi)的預(yù)測半衰期為至少1.5小時。當檢測嗜中性粒細胞膜表面存在的CHIPS量時，我們觀察到，其與抗CHIPSIgG效價之間具有相同的關(guān)系。僅在來自受試者104和105的嗜中性粒細胞表面能夠檢測到CHIPS。此外，實驗還顯示這些CHIPS分子占據(jù)了FPR和C5aR，其原因是，在這些個體中通過抗FPR和抗C5aR抗體對上述兩種受體進行檢測時存在下調(diào)。同樣，以fMLP激活時，只有受試者104和105的嗜中性粒細胞表現(xiàn)出了降低的活化。不幸的是，由C5a激活的實驗因技術(shù)原因失敗了。然而，這些實驗清晰地表明，靜脈內(nèi)給藥的CHIPS對于活體外嗜中性粒細胞的活化具有抑制作用，且該作用由抗CHIPS抗體所抑制。在臨床前動物毒性研究中，未發(fā)現(xiàn)相關(guān)的不良反應(yīng)。在人類受試者中給藥0.1mg.kg^的CHIPS,2個受試者(受試者103和104)對所述給藥耐受，受試者105中度耐受，而受試者106在CHIPS灌注后立即產(chǎn)生了嚴重的癥狀，其診斷為類過敏性反應(yīng)。我們檢測了所有受試者的嗜中性粒細胞CDllb表面表達以研究CHIPS誘導的細胞活化。受試者104、105和106中觀察到了細胞活化。在接受CHIPS的一組受試者中，給藥后第2天時C反應(yīng)性蛋白相對于對照有所增長。肥大細胞，即存在于外周組織的白細胞，在炎癥和速發(fā)型過每文反應(yīng)中具有核心作用。分泌顆粒釋放的類胰蛋白酶是肥大細胞脫粒的代表性特征。血清肥大細胞類胰蛋白酶濃度在過敏性反應(yīng)和其他變應(yīng)性癥狀中是增長的(見Payne&Kam,2004，^"aeW/zew'a59(7):695-703)。CHIPS給藥后觀察到的類過敏性反應(yīng)，由代表了肥大細胞活化的類胰蛋白酶水平的增長所證實。在類胰蛋白酶水平的升高之前是循環(huán)免疫復(fù)合物的增長。免疫復(fù)合物能夠通過FcyR交聯(lián)和通過補體激活以及C5a的生成而激活肥大細胞(見Jancar&Crespo,2005,rm^s/麵,/26(1):48—55)。體外實驗確認了在抗CHIPS抗體存在的情況下CHIPS的細胞激活特性。CHIPS誘導的嗜中性粒細胞活化，通過阻斷FcyRII和FcyRIII封閉抗體而受到抑制。這表明，CHIPS誘導的這些細胞的活化，最有可能是由CHIPS/a-CHIPS免疫復(fù)合物引起的。當我們在檢驗的受試者中尋找循環(huán)免疫復(fù)合物時，在接受靜脈內(nèi)CHIPS的受試者中還發(fā)現(xiàn)了免疫復(fù)合物的增長?？笴HIPS抗體效價和CHIPS誘導的細胞活化間的關(guān)系在體外和活體外實驗中均很清晰。這與受試者103中觀察到的現(xiàn)象形成對比，所述受試者103具有最高的抗CHIPS抗體效價，但卻只有輕微的不良反應(yīng)。當然，研究的群體僅限于4個受試者，且有許多不同因素影響著個體內(nèi)不良反應(yīng)的發(fā)生和感知(perception)。此外，體外實驗證實了誘導細胞活化的最優(yōu)抗體濃度的存在。非常高的抗CHIPS抗體效價很有可能減少了類過敏性反應(yīng)的發(fā)生。早期研究表明，CHIPS不與除表達C5aR和FPR的細胞外的其他細胞結(jié)合，且沒有證據(jù)顯示CHIPS能夠直接激活細胞。雖然抗體在細胞活化中發(fā)揮了明顯的作用，但少數(shù)觀察結(jié)果和體外研究的復(fù)雜性均阻礙了對這些數(shù)據(jù)的解釋。我們證實了對于抗CHIPSIgG具有降^f氐的親和性的兩個CHIPS突變體(CHIPSR46A和CHIPSK69A)在體外顯示出了降低的細胞活化潛能。盡管抗CHIPS抗體具有中和效應(yīng)，我們依然能夠檢測出CHIPS蛋白顯著的血清濃度。此外，在循環(huán)嗜中性粒細胞上檢測出了靜脈內(nèi)給藥的CHIPS,其結(jié)合于FPR和C5aR，并能夠在活體外用fMLP刺激時抑制嗜中性粒細胞響應(yīng)。這表明，CHIPS蛋白能夠在體內(nèi)找到它的目標，即FPR和C5aR。我們發(fā)現(xiàn)，CHIPS蛋白在血清中的半衰期為大約1.5小時。此外，還發(fā)現(xiàn)在細胞表面結(jié)合于其受體的CHIPS具有相同的半衰期，這表明其具有相同數(shù)量級的功能半衰期。這表明，CHIPS蛋白不是立即從血液中清除的。通過引入點突變有可能延長CHIPS蛋白半衰期，例如鏈激酶中的情形，其為一種在急性心肌梗死中用于溶栓的蛋白藥物(見Wu等，1998，五"v/ra"^fora&o/64(3):824-829)。然而，1.5小時的半衰期意味著一旦用藥結(jié)束，任何(免疫抑制)效果都將迅速消失。這相對于以Infliximab為例的具有較長半衰期的抗體藥物而言可以是一個優(yōu)點，所述具有較長半衰期的抗體藥物與升高的感染發(fā)生率相關(guān)(見Listing等，2005,爿W/zn'他i/^ww52(11):3403-3412;Cmm等，2005,MeWc/"efBa/"mwe」84(5):291-302)。實施例B—利用隨機肽噬菌體展示文庫鑒定金黃色葡萄球菌趨化抑制蛋白上對于人類IgG的構(gòu)型表位才才津牛和方法重遂蛋冷的義鏖，襲這和遂必CHIPS、CHIPS31—121(不含前30個氨基酸的CHIPS)和CHIPS3卜n3(不含前30個和最后8個氨基酸的CHIPS)的創(chuàng)建如前所述(見deHaas等，2004,JExpMed199(5):687—95;Haas等，2004,J7mmw"o/173(9):5704—11)。利用重疊延伸PCR將基因克隆至pRSET-B載體，直接位于腸激酶切割位點的下游及EcoRI限制位點之前(見Ho等，1989,77(1):51-59)。CHIPS基因最初是從金黃色葡萄球菌的染色體DNA擴增的。以該產(chǎn)物為模版進行進一步的克隆。利用PfuTurboDNA聚合酶(Stratagene，CedarCreek,TX)進行擴增反應(yīng)。以PCRPurificationKit(PCR純化試劑盒)(Qiaquick,Qiagen)純化PCR終產(chǎn)物，克隆至pRSET-B載體的EcoRI和Xbal位點間，并按照廠商說明于TOP10F，大腸桿菌(Invitrogen)中進行增殖。以ABIPrism377(AppliedBiosystems)確認序列正確后，將重組蛋白通過1mMIPTG(異丙基(3-D-硫代半乳糖苷，Invitrogen)的誘導在Rosetta-Gami大腸桿菌(Novagen，MERCKBiosciences)中表達。以CelLyticBBacterialCelllysis/ExtractionReagent(CelLyticB細菌細月包裂解/提取試劑)(Sigma)和溶菌酶按廠商說明對細菌進行裂解。組氨酸標記的蛋白以鎳柱(HiTrapChelatingHP，5mL,AmershamBiosciences)根據(jù)廠商的"i兌明進行純化，其后以腸激酶(Invitrogen)進行切割。檢測樣品的純度，并以15%SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳，MiniProtean3系統(tǒng)，Bio-Rad)和考馬斯亮藍(Merck)染色檢測蛋白的存在。通過測定280nm處的吸光度確定蛋白濃度。經(jīng)C5aR(U937/C5aR)轉(zhuǎn)染的U937細胞(人幼單核細胞系)由DrProssnitz(UniversityofNewMexico,Albuquerque,NM)友情提供。或者，可以使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)生成所述細胞。細月包在具有2)iL通氣孔道(ventcap)的75cm2細月包培養(yǎng)瓶(Coming，Acton,MA)中且置于含有5%(302的37。C培養(yǎng)箱培養(yǎng)。將細胞保持在含有L-谷氨酰胺的RPMI1640培養(yǎng)基(InvitrogenLifeTechnologies)中，所述培養(yǎng)基包括ImM丙酉同酸鈉(InvitrogenLifeTechnologies)、2.5mgmL一1葡萄糖(Sigma-Aldrich)、10^>FCS(InvitrogenLifeTechnologies)禾口10(igmL—1慶大霉素(InvitrogenLifeTechnologies)。每周兩次以1/10(v/v)稀釋細胞(見Haas等，2004,J7mww"o/173(9):5704-11)。由化學引誘物引發(fā)的活化啟動了細胞內(nèi)游離鈣濃度的迅速和短暫的上升。U937/C5aR細胞的鈣動員的檢測如前所述(見Haas等，2004，J7mmw"o/173(9):5704-11)。筒言之，檢測了野生型CHIPS和截短CHIPS變體(CHIPS3H21和CHIPS3卜H3)對于C5a-引發(fā)的鈣動員的抑制能力。將細胞(5xio6mL—1于RPMI1640/0.05%HSA)與2x10—6MFluo-3誦AM(MolecularProbes,Eugene,OR)于室溫溫育20分鐘，清洗兩次，重懸于RPMI1640/0.05%HSA(106mL—、。細胞與緩沖液或與1|ig.m匸1CHIPS或CHIPS變體于室溫預(yù)溫育30分鐘。將與緩沖液的溫育作為空白對照。以濃度漸增的C5a(Sigma-Aldrich)刺激細胞。以FACSCalibur流式細胞儀測量代表細胞活化的熒光的增加。微量滴定板(Greiner)以每孔50|iL的包含1嗎.mL—'CHIPS的PBS包被，并于4。C過夜。所有清洗步驟均以PBS-0.05%Tween-20進行3次，隨后于37。C溫育1小時。滴定板以PBS-0.05%Tween-204%BSA封閉，清洗并與稀釋于PBS-0.05°/。Tween-201%BSA的抗體一起溫育。結(jié)合的抗體以結(jié)合有過氧化物酶的物種特異性山羊抗IgG(全部來自Southern,Birmingham,USA)檢測，并以TMB作為底物。以H2S04終止反應(yīng)，并以BioRadELISA-分析儀測量450nm的吸光度。對于肽實驗，將反應(yīng)板以包含士10^M25-聚體肽的PBS(DepartmentofPharmaceuticalChemistry,Utrecht,TheNetherlands;見Haas等,2004,J/附m柳o/173(9):5704-ll)包被，4。C放置過夜，并按上述對CHIPS的方法進行處理。人^C/f/尸S/gG的^;^銷化將CHIPS或截短CHIPS變體與CNBr-活化的瓊脂糖4B(AmershamBiosciences,Uppsala,Sweden)結(jié)合并按廠商說明填入Tricon5/20柱(AmershamBiosciences)。將人IgG(60mg'mL—!)(Sanquin，Amsterdam,TheNetherlands)以PBS稀釋三倍，并通過0.2|am濾器過濾。親和純化按照廠商的實-驗方法于AKTAPrime系統(tǒng)上利用50mL環(huán)(loop)(AmershamBiosciences)進行。筒言之，以10倍柱床體積的PBS洗柱，然后以0.5mL■min—1的流速使總量為1g的人IgG(20mg.mL—^通過柱。以10倍柱床體積的PBS洗柱，并以pH3.0的0.1M甘氨酸洗脫結(jié)合的人IgG。在含有50|iLpH8.0的lMTris的試管中收集0.5mL級分。將包含蛋白的洗脫級分(由測量OD28Q而得)混合，并利用AmiconUltra155000MWCO旋轉(zhuǎn)柱(spincolumn)將緩沖液換為PBS。加入疊氮化鈉至最終濃度為0.02%，并將親和純化的人抗CHIPSIgG貯存于4°C。^這C/ffl^7-7〃f^的噬,謬的斜務(wù)按標準實驗方法制備噬菌體原種，其中利用VSCM13(Stratagene，LaJolla，Ca，USA)作為輔助噬菌體。簡言之，將CHIPS3卜,13基因克隆至pFAB75載體(見Engberg等，1996，Mo/所otec/7"0/6(3):287—310)PIII基因的直接上游(directlyupstream),并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TOPIOF，(Invitrogen,Carlsbad,CA，USA)。將細菌培養(yǎng)至對數(shù)期并以輔助噬菌體感染(感染復(fù)數(shù)20)。將超感染的細菌于5337。C溫育30分鐘，無需搖動。離心收集細菌細胞，并用于接種含有氨芐青霉素(50iig'mL—"、卡那霉素(10嗎.mL—')、四環(huán)素(IO嗎.mL—1)和異丙基-a-D-硫代半乳糖苦(IPTG)(1mM)的LB培養(yǎng)基。將該培養(yǎng)物在30。C在劇烈搖動的條件下溫育15小時。通過離心收集上清液，并通過加入1/6培養(yǎng)物體積的25%PEG6000(Fluka)和3MNaCl使噬菌體沉淀。將沉淀的噬菌體重懸于PBS1%BSA并通過0.45濾器進行無菌過濾。乂^和磁化在0//尸&7—將兩個Maxisorb96孔板(Nunc,Rochester,NY，USA)與含有1嗎mL-l'J、H4元Ml3單克隆^t體(AmershamPharmaciaBiotechInc.,Piscataway，NJ,USA)的PBS—起于4。C溫育過夜。將反應(yīng)板以PBS-0.05%Tween-20清洗3次，并用200pLPBS-0.05%Tween-205%BSA于37。C封閉1小時。將反應(yīng)板以PBS-0.05%Tween-20清洗，并加入100PBS、M13噬菌體或表達CHIPS3卜n3蛋白的M13噬菌體(2x10"cfumL—"，并于37。C溫育1小時。清洗后，將反應(yīng)板與不同濃度的100(iL人親和純化抗CHIPS31—113-IgG或兔抗CHIPSIgG于37。C溫育1小時。接下來，清洗反應(yīng)板，并加入優(yōu)化濃度的100(iL山羊抗人IgG-HRP(JacksonImmunoResearch,WestGrove，PA，USA)或山羊抗兔IgG-HRP(SouthernBiotech,Birmingham,AL，USA)。將反應(yīng)板清洗3次，加入底物(0.67mg.mL—i鄰苯二胺、35mM檸檬酸鈉、67mMNaP03,pH5和0.012%H202)。以100nL1MH2S04終止反應(yīng)，并于490nm測量吸光度。經(jīng)農(nóng)l噬,謬X岸;^^,雄謬逸噬菌體文庫購于NewEnglandBiolabs(Ipswich,MA)。該Ph.D,7噬菌體展示肽文庫由7聚體隨機肽組成，所述7聚體肽通過接頭序列(Gly-Gly-Gly-Ser)與噬菌體M13主要外殼蛋白pIII的N-末端融合。該文庫由2.8x109的電轉(zhuǎn)化序列(相對于207=1.28x109的可能的7-殘基序列)組成，以在10^L噬菌體原種中產(chǎn)生每個序列的70個拷貝。該Ph.D.-C7CTM文庫的隨機化片段的兩端由一對半胱氨酸殘基側(cè)翼包圍，其在噬菌體裝配過程中氧化為二硫鍵，導致展示的肽以環(huán)形呈現(xiàn)給目標。該Ph.D,7TM和Ph.D,C7CTM文庫用于在CHIPS蛋白表面上定位對人IgG的表位。將100nL蛋白-G包被的磁珠(Dynal)以1mLPBS-0.05%Tween-20清洗3次。將洗好的磁珠以1mLPBS-0.05%Tween-205%BSA于22°C封閉1小時。將磁珠清洗4次，并重懸于1mLPBS-0.05%Tween-20。將所述封閉磁珠的一半用于噬菌體原種的預(yù)清除(preclearing)。因此，將10pLPh.D,7TM和10pLPh.D,C7CTM重懸于包含封閉磁珠的180(iLPBS-0.05%Tween-20，并在持續(xù)攪拌的條件下于22。C溫育30分鐘。將1|iL親和純化人抗CHIPS3Hi3-IgG(300昭.mL—、終濃度約10nM)加入經(jīng)預(yù)清除的噬菌體，并于22。C溫育30分鐘。將噬菌體/IgG懸浮液加入至剩余的封閉磁珠，并于22。C溫育30分鐘。將磁珠以PBS-0.05%Tween-20清洗10次以洗掉未結(jié)合的噬菌體。將清洗步驟中的Tween濃度連續(xù)每輪逐步升高至0.5%以增加嚴緊性。結(jié)合的噬菌體以125jiL0.2M甘氨酸，pH2.2，0.1%BSA洗脫8分鐘，其后立即將洗脫液以15|iL1MTris-HCL,pH8中和。擴增洗脫液，且取用10(iL擴增的噬菌體用作下一輪篩選的輸入料(input)。為了進一步增加噬菌體篩選的特異性，將第四輪結(jié)合的噬菌體通過利用CHIPS蛋白的竟爭性洗脫來洗脫。結(jié)合的噬菌體在與1.8mg.mL一1CHIPS溫育過夜后洗脫。錄體諒定和^^#由于文庫噬菌體來源于帶有/acZa基因的普通克隆載體M13mp19,所以當平板接種至含有Xgal和IPTG的培養(yǎng)基時噬菌斑顯示為藍色。將環(huán)境絲狀噬菌體平板接種至同樣的培養(yǎng)基時通常產(chǎn)生白色菌斑。以單菌落ER2738大腸桿菌接種10mLLB培養(yǎng)基，并于37。C劇烈震蕩培養(yǎng)至對數(shù)中期(mid-logphase)(OD6。o0.5)。熔化頂層瓊脂(50。/。LB-瓊脂，50%LB-培養(yǎng)基)并冷卻至約45°C。將3mL熔化的頂層瓊脂加入至200pLER2738大腸桿菌并傾倒至LB/IPTG/Xgal平板(包含0.5mMIPTG和80嗎.mL—1Xgal的LB-瓊脂平板)的頂部。將1jiL噬菌體洗脫液進行10倍連續(xù)稀釋。將10nLLB培養(yǎng)基中的每種稀釋液點樣到準備好的培養(yǎng)板上，并于37。C溫育過夜。第二天對噬菌斑進行計數(shù)以計算噬菌體滴度。將剩余的噬菌體洗脫液于對數(shù)早期(OD,0.4-0.5)加入至20mLER2738大腸桿菌培養(yǎng)物，并于37。C劇烈震蕩培養(yǎng)4.5小時。將培養(yǎng)的細胞于4。C以10000rpm離心10分鐘。將上清液傾注至新的試管，加入1/6體積的25%PEG6000(Fluka)、3MNaCl，并將噬菌體于4。C沉淀過夜。將沉淀的噬菌體于4。C以10000rpm離心15分鐘。將包含擴增噬菌體的塊狀沉淀(pellet)重懸于200^LPBS并按上述方法進行滴度測定。四輪篩選過后，不再進行噬菌體擴增，而是直接用DNA測序法對噬菌體進行表征。潛合^,謬的襲在將ER2738大腸桿菌的過夜培養(yǎng)物以LB培養(yǎng)基進行1:100稀釋。以移液器吸頭挑取(stab)來自滴定板的48個不同的噬菌斑，并移至1mL稀釋培養(yǎng)物中。將感染的培養(yǎng)物于37。C溫育4.55小時。將培養(yǎng)物以13600rpm離心30秒，并將500iiL的上清液轉(zhuǎn)移至新的微量離心管中。加入200[iLPEG6000、3MNaCl，并將噬菌體于22。C沉淀IO分鐘。該樣品以13600rpm離心10分鐘。將塊狀沉淀重懸于100jaL硤化物緩沖液(Iodidebuffer)(4MNal,10mMEDTA，pH8)，加入250|iL95%EtOH并于22。C溫育10分鐘以優(yōu)先沉淀單鏈噬菌體DNA。樣品以13600rpm離心10分鐘，將塊狀沉淀以70%EtOH清洗、干燥并利用"-96PIII測序"引物(5，-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3',[SEQIDNO:2]，NewEnglandBiolabs)對其進行測序。襲在的定在將所選噬菌體的氨基酸序列使用Clustal-W(見Aiyar，2000,MeAo血Mo/,祝o/.132:221-41)進行比對。利用CHIPS31—121PDB文件(PDB登陸碼1XEE)和PyMol分子圖形禾呈序(見DeLano,2002,ThePyMolMolecularGraphicsSystem.DelanoScientific,SanCarlos)將共有序列手動地定位到CHIPS蛋白的表面。摩遂^潛合掙^^'使用噬菌體ELISA檢測所選噬菌體對于親和純化人抗CHIPS31—113-IgG的結(jié)合特異性。將96孔Maxisorb板以PBS中100嗎.mL—4勺親和純化人抗CHIPS3—113IgG于4°C包被過夜。將反應(yīng)板以PBS-0.05%Tween-20清洗4次，以300PBS-0.05%Tween-205%BSA于37。C封閉1小時。同時，另一塊Maxisorb板以PBS-0.05%Tween-205%BSA進行封閉，作為與BSA包被塑料結(jié)合的只寸照(serveascontrolforbindingtoBSAcoatedplastic)。將反應(yīng)斗反清洗4次，并與PBS-0.05°/。Tween-201°/。BSA中不同稀釋度的純化噬菌體原種一起于37。C溫育1小時。將反應(yīng)板清洗4次，并與50^L含有小鼠抗M13-mAb(1fig-mL—!)(Amersham)的PBS-0.05%Tween-201%BSA—起于37。C溫育1小時。清洗反應(yīng)板，并與50|iL兔抗鼠IgG-HRP(1:2000于PBS-0.05%Tween-201%BSA中)一起于37。C溫育1小時。清洗后，加入100(iL底物，并以150(iL1MHC1終止反應(yīng)。在ELISA反應(yīng)板分析儀上測量492nm的吸光度。人友應(yīng)/gG的者;f。銷化包含(compromising)源于噬菌體的序列的7個氨基酸的肽的合成，出于高效偶聯(lián)的目的而使用了具有3個甘氨酸和1個半胱氨酸的附加C-末端間隔區(qū)(IsogenLifeScience;IJsselstein,TheNetherlandsandBio-Synthesis;Lewisville,Tx)。兩個對照肽也包含在內(nèi)，一個具有由針對人C5a受體(Bio-Synthesis)的mAb(克隆S5/l)識別的最低限度(minimal)的7聚體序列(加上GGGC[SEQIDNO:3]用于偶聯(lián))，一個是具有(compromise)CHIPSN-末端部分的38聚體肽(前37個氨基酸加上一個附加的半胱氨酸；PepscanSystems;Lelystad，theNetherlands),將肽溶于H20并于-20。C貯存。對于ELISA,將肽在pH8的0.1MTris/HCl中稀釋至25(ig,mL-l,并對NuncCovalinkNH板進行90分鐘包被，所述反應(yīng)板已經(jīng)用10mMN-琥珀酰亞胺-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(succinimidyl3-(2-pyridyldithio)propionate;SPDP)處理了30分鐘以引入游離氨基，最后以水清洗。其后，按照與其它ELISA法相同的方法處理該反應(yīng)板。為將肽結(jié)合至固體基質(zhì)上，先利用瓊脂糖連接的三(2-羧乙基)膦鹽(Tris(2-Carboxyethyl)Phosphine;TCEP，Pierce)將肽還原，并隨后與包含5mMEDTA的50mMTris/HCl緩沖液(pH8.3)中的Sulfo-Link瓊脂糖珠(Pierce)混合，并于室溫溫育2小時。未反應(yīng)的基團以L-半胱氨酸封閉，并將珠以偶聯(lián)緩沖液和PBS充分清洗。將1ml的小柱子按照對于CHIPS描述的方法用于從人免疫球蛋白制備物中親和純化靜脈內(nèi)注射用的IgG(Sanquin)。洗脫出的IgG與100jagmL_1純的人白蛋白混合，相對于PBS透析過夜，并由ELISA測定IgG的實際含量。面子4孩為Vf在謬力摩逸應(yīng)的潛合親和純化抗體和混合的人IgG與合成肽和CHIPS蛋白的結(jié)合通過Biacore1000儀器進行研究。將包含C-末端半胱氨酸殘基的肽偶聯(lián)于羧曱基葡聚糖傳感芯片CM5,該過程利用N-乙基-N，-(二曱胺基丙基)碳二亞胺鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)化學以及巰基偶聯(lián)試劑盒(Thiolcouplingkit)(PharmaciaBiacore)以活化CM5葡聚糖?；罨?，注入20jiL2-(2-吡啶基二硫代)乙烷胺(2-(2-pyrdinyld他io)ethaneamine)(PDEA)，隨后在7分鐘的過程中注入35(iL的1mg.mL—1的包含半胱氨酸的肽(存在于0.1MNaAc、1MNaCl中，pH4)。未反應(yīng)的基團以歷時4分鐘注入的20|iLL-半胱氨酸進行封閉。對于CHIPS偶聯(lián)，將20CHIPS(1mg,mL—"直接注入EDC/NHS活化的傳感芯片上。傳感芯片表面剩余的反應(yīng)基團通過注入50pH8.5的1M乙醇胺-HCL來進行飽和(saturate)。結(jié)合實驗在25。C且5iiL.min—1的恒定流速下進行。親和純化抗體和IV-IgG于HBS-EP緩沖液(IOmMHEPES(pH7.4)，包含150mMNaCl、3mMEDTA和0.005%表面活性劑P20)中稀釋。將抗體與固定的肽相互作用210秒，然后是為時2分鐘的分離期。此外，抗體與1mg.mL—1CHIPS蛋白進行預(yù)溫育以研究其竟爭性。親和純化的抗肽抗體于10嗎.mL^的濃度進行斗全測。通過以10mM甘氨酸-HCl(pH1.5)對芯片清洗3分鐘，而將殘留的結(jié)合抗體從傳感芯片表面除去。結(jié)論C7Z/P&7-〃3的活#此前，我們描述了CHIPS3卜m蛋白，其表現(xiàn)出對C5aR阻斷活性的完全保留(見Haas等，2005，JMo/編353(4):859-872)。為了尋找更小的活性CHIPS變體，我們?nèi)コ说鞍渍郫B核心外部的C-末端的一部分(見Haas等,2005,JM/傷o/353(4):859-872)。圖14表示了不同CHIPS變體相對于野生型CHIPS的活性。所有CHIPS變體均能夠抑制C5a誘導的U937/C5aR細胞的活化。秀和銷化拔C////^我雄乂i/V々型4在的識^/利用以固定的CHIPS樹脂裝填的柱子親和純化匯集的人IgG。我們檢測了親和純化抗CHIPS抗體與一系列源于CHIPS且跨越(span)整個CHIPS序列的25聚體肽的結(jié)合(見Haas等，2004,J7mmw"o/173(9):5704-11)。如圖15所示，只有野生型CHIPS和源于CHIPSN-末端的肽被親和純化抗CHIPS抗體所識別。這表明，這些抗CHIPS抗體不能識別殘基30和113之間的線性表位。為了確認CHIPS蛋白中構(gòu)型表位的存在，我們檢測了兩種不同的親和純化抗體制備物(抗CHIPS卜m和抗CHIPS3卜n3)與野生型CHIPS(CHIPSJ以及兩種截短CHIPS蛋白(CHIPS3H2,和CHIPS3w,3)的反應(yīng)性。圖16顯示，所有的抗體均與CHIPS蛋白反應(yīng)。盡管親和純化抗CHIPS卜m含有針對N-末端的表位(圖15),但各制備物之間在與不同CHIPS變體的反應(yīng)性方面沒有顯著性差異。這可以表明，存在相對于線性表位過量的構(gòu)型表位(Thiscouldindicateanexcessofconformationalepitopesoverlinear)。以針對構(gòu)型表位的CHIPS特異性小鼠單克隆抗體作為對照。^;^磁^AC77/尸S/gG不與野4藝iV^3遵,沐AA存在于親和純化抗CHIPS31—113IgG制備物中的人抗噬菌體IgG，能夠潛在地干擾噬菌體篩選實驗。因此，我們通過ELISA沖企測了親和純化抗CHIPS31—113IgG與空M13噬菌體(表達野生型pill表面蛋白的M13噬菌體)的結(jié)合。圖17顯示，親和純化抗CHIPS3卜u3lgG不與野生型M13噬菌體反應(yīng)，但很好地識別了表達CHIPS蛋白的M13噬菌體。應(yīng)用了高達100|igTiiL—1濃度的親和純化抗CHIPSIgG。即使在這么高的濃度下，其與空噬菌體的結(jié)合相對于背景而言仍無差異。因此，結(jié)論是，親和純化抗CHIPS3卜u3IgG制備物中不存在能夠干擾篩選實驗的大量抗噬菌體抗體。重效逸霧舉的^務(wù)謬這(^o/朋m'"gjf口4在將親和純化的抗CHIPS31—113IgG用于從兩個隨機肽噬菌體文庫中篩選噬菌體，以及用于在CHIPS蛋白表面定位對人IgG的表位。4輪生物篩選之后，隨機選取了48個重組噬菌體克隆并以DNA測序進行表征。47個克隆的序列列于表3(克隆27的測序失敗)。序歹'J"MNKTWYP"[SEQIDNO:4]在本組47個序列中發(fā)生了12次，因此它是最大量的，其次是序歹'J"MNKTFWF，[SEQIDNO:5]，其被選擇了4次。有趣的是，序列"FNKSYYG"[SEQIDNO:6]發(fā)生了3次，但這些序列的基因序列是不同的，因此它們不是一個單獨選擇的噬菌體的簡單的擴增(未顯示數(shù)據(jù))。盡管我們的實驗以兩個不同肽庫(Ph.D,7TM和Ph.D,C7CTM)的混合開始，但所選的序列均源自Ph.D.-7TM庫。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>表3:4輪篩選后47個重組噬菌體克隆的肽序列。對合并的Ph.D.-7TM和Ph.D.-C7CTM隨機肽噬菌體文庫與親和純化抗CHIPS31—113IgG的結(jié)合進行4輪連續(xù)篩選。利用與高CHIPS濃度(L7mg.mL—"的竟爭將最后一輪中的噬菌體選擇性地洗脫出來。將48個單個噬菌體擴增，對分離的單鏈DNA進行測序(克隆27的測序失敗)。數(shù)據(jù)是代表了表達的隨機肽的翻譯后序列。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage61</formula>如表4所示，所選肽能夠根據(jù)其氨基酸序列分為不同組別。此外，根據(jù)每組內(nèi)序列的相似性，我們計算了共有序列。將每組內(nèi)進行比對的序列中發(fā)生最為頻繁的氨基酸歸類為共有殘基。每組的共有序列列于表4。如圖18所示，利用PyMol分子圖形程序和CHIPS31—121PDB文件(PDB登陸碼1XEE)將所選序列手動地定位到CHIPS蛋白的表面。從所選序列中鑒定了第四個表位。盡管由噬菌體045表達的序列"PLRASQ"[SEQIDNO:55]在47個測序的重組噬菌體中僅出現(xiàn)一次，但是該序列能夠完美地定位于CHIPS分子表面。此外，噬菌體0l6表達的肽序列("ALQASRH"[SEQIDNO:56])與該"表位"顯示出非常高的相似性。表達與預(yù)測表位最相似的肽序列的8種不同重組噬菌體，進一步以ELISA進行表征(表5)。圖19a表明，這些噬菌體特異性地結(jié)合于親和純化抗CHIPS3卜mlgG而非BSA(圖19b)。我們之前曾揭示，親和純化抗CHIPS3卜n3lgG不與空噬菌體反應(yīng)(圖17)。因此，結(jié)論是，所選噬菌體與親和純化抗CHIPS31—113IgG的結(jié)合是特定于所述表達的肽而言的(specificfortheexpressedpeptide)。表4(12)[SEQIDNO:57](4)[SEQIDNO:58][SEQIDNO:59][SEQIDNO:60][SEQIDNO:61][SEQIDNO:62](3)[SEQIDNO:65](2)[SEQIDNO:66](2)[SEQIDNO:67][SEQIDNO:68]「SEOIDNO:691[SEQIDNO:72〗[SEQIDNO:73][SEQIDNO:74][SEQIDNO:75]rSEOIDNO:761pFApYDKYwsLYVwwFFYFFYTTTVTTTKKKKKKKNNNNNNNMMMMLMV尸GLMpPIGMKYITsV-YHFFF一v-ApppMEwYYFFwyIwIpKKr-sssssipppppp!SAKKKKK_ALTilT:-T-TJLwNNNNNKKKKKKMFMYYF一GGGGGG表4:肽序列的分組。將選自Ph.D.-7TM噬菌體文庫的肽序列根據(jù)其氨基酸序列分成不同組別。圓括號中的數(shù)字代表出現(xiàn)次數(shù)多于一次的序列的數(shù)目。可以分為三個不同組別。本表還顯示了每組的共有序列。將各組內(nèi)的比對序列中出現(xiàn)最頻繁的氨基酸歸類為共有殘基。合成應(yīng)^^^定在4《基于噬菌體篩選和表位定位的結(jié)果，合成了4種不同肽(圖20的插入標記(insertFigure20))。所有肽均包含一個C-末端半胱氨酸殘基，其允許通過巰基偶聯(lián)化學的固定。由于發(fā)現(xiàn)CHIPS蛋白的N-末端包含針對人IgG的表位(圖15)，因此將包含CHIPSN-末端37個CHIPS殘基以及一個附加的半胱氨酸(pepl-38)的合成肽作為陽性對照。將各種肽偶聯(lián)于巰基活化的瓊脂糖，以產(chǎn)生不同的親和柱。將這些柱子用于人IgG的親和純化。親和純化抗肽抗體與不同肽和CHIPS分子的結(jié)合通過ELISA確認(未顯示數(shù)據(jù))并于Biacore1000儀器上進行研究(圖20)。親和純化抗肽抗體與其特異性肽的結(jié)合相對于IVIgG表現(xiàn)出了增加。將親和純化抗體與1mgmL—1CHIPS預(yù)溫育并不減少這種相互作用?？?52和抗554抗體同肽552和肽554具有交叉反應(yīng)。該發(fā)現(xiàn)不足為奇，因為這些肽具有很高的序列相似性(圖20插入標記(insertFigure20))親和純化抗肽抗體與CHIPS蛋白的結(jié)合相對于IVIgG表現(xiàn)出了增加。該相互作用被親和純化抗肽抗體與1mgmL-1CHIPS的預(yù)溫育所破壞。表5克隆序列'029012013016020030033045MNKSYTIVNKTYWKALQASRHMNKTWYPMNKTFFSGKLPKESFNKSYYGMPLRASQ[SEQIDNO:79][SEQIDNO:80][SEQIDNO:81][SEQIDNO:82][SEQIDNO:83][SEQIDNO:84][SEQIDNO:85]表5:為進一步表征選擇的序列。根據(jù)定位的表位，我們選擇了8個表達不同肽的噬菌體，用于以ELISA進行進一步的表征。討論抗體表位通常由蛋白一級序列中遠離彼此的氨基酸所形成，但它們作為折疊分子表面的反應(yīng)位點而聚集到了一起。我們揭示了該現(xiàn)象尤其對于CHIPS而言是正確的，因為親和純化抗CHIPS抗體不能識別CHIPS蛋白殘基31至113之間的線性部分。因此，截短分子在表位定位中的作用是有限的，原因是即使小的缺失和取代都能夠?qū)Ψ肿咏Y(jié)構(gòu)產(chǎn)生較大的影響。隨機肽文庫的運用克服了截短分子在表位定位中的局限性。早期研究表明了噬菌體隨機肽噬菌體文庫在鑒定單克隆抗體的線性表位(見Yang等，2005,J/附ww"o/MeAoA304(1-2):15—29)和構(gòu)型表位(見Cook等,1998,J爿"to/mm柳11(3):205—211;Myers等，2000，《//mmw"o/165(7):3830—3838;Shaw等，2002，5/oc/^w/363(Pt1):137—145)中的潛能。這些研究表明，由噬菌體展示表達的肽能夠采取一種模仿構(gòu)型表位的構(gòu)型，并允許親和純化。在本研究中，利用隨機肽噬菌體展示文庫進行CHIPS上表位的定位。據(jù)我們所知，本研究是第一個在多克隆抗體制備物中對構(gòu)型表位進行定位的報道。我們選擇了與親和純化抗CHIPS3hi3IgG結(jié)合的噬菌體。Schluederberg等(1980,Mm^283(5749》792-4)證明，難以與Ml3區(qū)分的噬菌體能夠從人類糞便中分離。盡管M13噬菌體大量存在于環(huán)境中，但是我們證明了本發(fā)明的親和純化抗體制備物不含任何可檢出的抗M13噬菌體抗體水平。然而，為了增強所選噬菌體與抗CHIPS抗體的結(jié)合的特異性，我們利用了使用高濃度CHIPS的竟爭洗脫。四輪篩選之后，對47個克隆進行了測序。噬菌體篩選依賴于大量不同因素。例如，展示的肽序列中的精氨酸干擾了pIII的分泌；因此，其肽包含精氛酉交的克隆具有強選擇十生(cloneswithpeptidescontainingArgarestronglyselectedagainst)(見Peters等，1994,J"Bac&Wo/176(14):4296—4305)。同樣，清洗步驟的嚴緊性和性質(zhì)能夠利于某些特定噬菌體(見Smith&Petrenko,1997,C72emiev97(2):391-410)。因此，盡管序列"MNKTWMP，，[SEQIDNO:86]為分離中出現(xiàn)頻率最高的，但該現(xiàn)象不能推出任何進一步的結(jié)論。Ph.D,7TM和Ph.D,C7CTM文庫均由2.8x109的電轉(zhuǎn)化序列(相對于207=1.28x109的可能的7-殘基序列)組成，并包含很多種沒有顯著位置偏好性(positionalbias)的序列。從這個龐大的文庫中，我們選出了4個能夠定位于CHIPS分子表面的序列。這些相似性不能由巧合來解釋，因此，我們總結(jié)，這些序列代表了構(gòu)型表位。用ELISA對8個噬菌體進行了進一步的表征，所述每個噬菌體均表達了一個不同的與預(yù)測表位最相似的序列。這些噬菌體顯示與親和純化抗CHIPSIgG結(jié)合。我們先前曾證明，親和純化抗CHIPSIgG不含任何可檢出量的抗M13噬菌體抗體。因此，我們總結(jié)，該相互作用是特定于所述表達的肽而言的。為了確認表達的肽能夠模擬CHIPS蛋白的構(gòu)型表位，進行了附加的實驗。利用類似于選自噬菌體文庫中的肽的合成肽，我們從IgG混合中親和純化了特異性識別CHIPS蛋白的抗體。這些親和純化抗體與它們的特異性肽相互作用。該相互作用不與CHIPS蛋白竟爭。從這些觀察現(xiàn)象中，我們總結(jié)，抗肽抗體存在于IV-IgG混合中，其能夠識別合成肽的不同構(gòu)型。這些構(gòu)型中的大多數(shù)與CHIPS構(gòu)型表位不同并因此不與CHIPS蛋白竟爭。由于合成肽包含間隔區(qū)(Gly-Gly-Gly-Cys[SEQIDNO:87]),因此純化的抗體制備物有可能包含抗間隔區(qū)(a-spacer)或抗間隔區(qū)-肽(a-spacer-peptide)抗體。親和純化抗肽抗體同CHIPS蛋白的結(jié)合研究解釋了一個特異性識別CHIPS蛋白的亞組。由這些抗體識別的CHIPS蛋白表面上表位的構(gòu)型是受約束的，因此，不存在與其他識別不同肽構(gòu)型的抗肽抗體的竟爭。盡管CHIPS是小型、緊密折疊的蛋白，但估算存在的表位總數(shù)是困難的。我們應(yīng)用的Ph.D.-7TM和Ph.D,C7CTM文庫僅限于大小為7個殘基的表達肽，因此它限制了模擬表位的大小。我們在CHIPS分子表面定位了4個表位。利用表達更大肽的文庫的附加篩選，能夠用于鑒定更多的表位。我們集中研究了CHIPS3卜n3分子，即CHIPS中負責阻斷C5aR的部分。有趣的是，我們沒有分離出模擬線性表位的肽噬菌體。這與肽掃描ELISA^(pepscanELISA)的結(jié)果相一致，在所述肽掃描ELISA中，我們沒有觀察到親和純化抗CHIPS抗體與源于CHIPS的肽的相互作用。我們從獲得自大量供體的IgG混合開始了抗CHIPSIgG的親和純化。最有可能的是，不同的個體僅識別一個亞組的表位。在未來的研究中應(yīng)用所述的篩選技術(shù)，能夠幫助我們更好地理解不同個體中表位識別的分布。實施例C-示范性變體CHIPS多肽ICHIPS肽ELISA:文庫的單點檢測《的,檢測粗細胞裂解液中CHIPS突變體同肽的結(jié)合能力摘要對串聯(lián)夾心ELISA(tandemsandwichELISA)按以下進行優(yōu)化，以鏈霉親和素(Streptavidin)包被，隨后是生物素化的C5aR肽，CHIPS與其的結(jié)合由單克隆抗體mAb2H7所檢測，隨后是結(jié)合有HRP的多克隆二抗以及底物。對每個ELISA板制作純化的重組CHIPSwt的標準曲線。^r測492nm的吸光度，并相對標準濃度作圖，并利用4-參數(shù)曲線擬合模型進行分析，從中可以計算突變體與肽的結(jié)合并將其作為比活性與表達的濃度相關(guān)聯(lián)。10xPBS(BioWhittaker#BE17-517Q,批號4MB0102)PBSTween20(0,05%)(Medicago#09-8410-100，批號113303)BSA(Merck#1.12018.0100，批號K54593318527)CellyticB(Sigma#B-3553，批號114K65156)SigmafastOPD(Sigma快速鄰苯二胺)(Sigma#P9186,批號055K8204)F96Maxisorp(Nunc#442404,批號079027)96孔U形PP板鏈霉親和素lmg/ml(Sigma,批號120K1249)CD88-N-末端肽ABCF-l，6.3mg/ml(批號050805KaB)mAb2H7單克隆抗體，lmg/ml(Utrecht,批號2004-12)兔抗小鼠Ig-HRP(Dako#P0260，批號00006983)rCHIPSwt,1,8mg/ml(Utrecht,批號2004-12-02)CHIPS對照(裂解液)CHIPSwt,K69A,2mut.(2突變)CHIPS庫:儀器ELISA洗板機ELx405(BioTekInstruments)才吝動平臺Titramax1000(HeidolphInstruments)FLUOstarOptima(BMG)軟件ExcdGraphPadSigma緩沖液包被緩沖液lxPBS:將100ml10xPBS加入至900ml去離子水中。清洗緩沖液PBS+0.05%Tween20(PBST):將1個片劑加入至1000ml去離子水中。檢測緩沖液A:PBST+1%BSA(w/v)+1%Cellytic(v/v)檢測緩沖液B:PBST+1%BSA(w/v)封閉溶液PBST+4%BSA(w/v)豸驗才襲f3個匈1.包被制備鏈霉親和素，5.0嗎/ml于包被緩沖液(PBS)中。以微量移液管向96孔Maxisorp板中每孔加入100jil。于4。C溫育過夜。2.封閉每孔加入200pi封閉溶液。在室溫(RT)下置于搖動平臺以600rpm(S)溫育1小時。3.生物素化的肽CD88-N-末端肽ABCF-1:0.3叫/ml于檢測緩沖液B(PBST+1%BSA)中。按1:10稀釋貯存液=0.63mg/ml。32ml緩沖液+15.2|il肽(0.63mg/ml)。每孔加100pl。在RT以S溫育1小時。4.rCHIPSwt標準曲線在15ml試管中于檢測緩沖液A中制備3倍的系列稀釋，1000-0.42ng/ml。在檢測緩沖液A中按l:100稀釋rCHIPSwt(貯存液1.8mg/ml):5|iLCHIPS+495緩沖液=18jig/ml1000ng/ml:85piCHIPS+1445pi緩沖液333ng/ml:500jilCHIPS(1000ng/ml)+lOOOpl緩沖液丄總共8個濃度乂六裙和義岸在96孔U形PP板中制備1:300、1:900和1:2700的3倍系列稀釋。l:5稀釋150|11裂解液+600pl檢測緩沖液B(PBST+1%BSA)1:100稀釋:25pl(l:5稀釋液)+475|il檢測緩沖液A(PBST+1%BSA+1%CL)1:300稀釋150(il(1:100稀釋液)+300jil檢測緩沖液A丄1:900和1:2700。每孔加100pl，用于標準曲線的稀釋和對照為一式兩份重復(fù)(induplicate),和用于文庫的牙希釋為單點(Pipette100pl/wellinduplicateforstandardcurveandcontrolsandsinglepointforlibrary)?？瞻紫?個孔中加入100pi檢測緩沖液A。在RT以S溫育1小時。5.檢測抗體Mab2H7，ljig/ml于檢測緩沖液B(PBS+l。/oBSA)中。32jil抗體+321111緩沖液每孔加100)al。在RT以S溫育1小時。6.二抗兔抗小鼠Ig-HRP。于檢測緩沖液B中制備1:2000的稀釋液。16|^1抗體+321111緩沖液每孔加100pl。在RT以S溫育1小時。7.進一步的清洗(extendedwash):以200ml/孔加入清洗緩沖液。在RT以S溫育5分鐘。8.底物SigmafastOPD(Sigma快速鄰苯二胺)(根據(jù)說明)。將2個緩沖片劑和2個底物片劑溶解于40ml去離子水。每孔加100iil。在RT于暗室中以S溫育約3-6分鐘。通過每孔加入150pl1MHC1終止反應(yīng)。測量492nm的吸光度。****紫之河,在￡丄#3x96哞以尸^ST清遂3,義******表6<table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table>絲利用BMG分析壽欠件(BMGreadersoftware),Excel和/或SigmaGraphPad分析標準曲線(見圖21)。Excel:計算標準曲線、對照和空白的平均值。計算空白的CV(。/。)。將所有數(shù)據(jù)點扣除空白。在GraphPad中標準曲線將吸光度相對于標準濃度的Log值(對數(shù)值)作圖。符合模型的曲線擬合以可變ReportEC50值和R2-值進行的S型(Sigmoidal)曲線擬合。分析對照和文庫中的肽結(jié)合。(吸光度492作為Y值，未知數(shù)X以濃度的對數(shù)(Logconc.)的形式表示結(jié)合。再核算(recalculate):1(Ktlog濃度"濃度計算比活性(％):100*(肽結(jié)合濃度/濃度(表達))(100*(Concpeptidebinding/Cone(expression))(見表7)。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>CHIPS1004抗CHIPSELISA。第二輪篩選中以1:1000稀釋的文庫的單點斗企觀寸目的能夠在單點檢測中篩選出與人多克隆抗CHIPS具有減少的結(jié)合的克隆摘要在串聯(lián)夾心ELISA中，檢測了初篩(噬菌體展示)中篩選出的基于K69A的突變克隆與人抗CHIPS的結(jié)合。所述ELISA如下優(yōu)化將與CHIPS前30個氨基酸(N-末端)結(jié)合的單克隆抗體作為包被抗體，且以多克隆人抗CHIPSIgG作為檢測抗體。將結(jié)合有HRP的多克隆抗體用作二抗，隨后是HRP-底物。對每個ELISA板的純化重組CHIPSwt制作標準曲線作為反應(yīng)板間的對照，以系列稀釋的K69A裂解液用作文庫的計算和比較。測量492nm的吸光度，相對于濃度作圖，并利用S型(Sigmoidal)曲線擬合的不同斜率模型進行分析。按照K69A的方法計算突變體的預(yù)期結(jié)合(abs)。與預(yù)期值的偏差計算并報道測量值-預(yù)期值。材泮+和方法10xPBS(BioWhittaker#BE17-517Q，批號4MB0102)PBSTween20(0,05%)(Medicago#09-8410-100，批號113303)脫脂乳粉(Semper,批號041203)CellyticB(Sigma#B-3553，批號114K65156)SigmafastOPD(Sigma#P9186,批號055K8204)F96Maxisorp(Nunc#442404,批號079027)96孔U形PP板(Nunc#267245，批號075860)mAb2H7單克隆抗體，lmg/ml(Utrecht,批號2004-12)人抗CHIPS(31-113)IgG(HaCHIPS)，2.54mg/ml(AlligatorBioscience,050223KaB)rCHIPSwt，1，8mg/ml(Utrecht,批號2004-12-02)CHIPS突變體農(nóng)器ELISA洗板機ELx405(BioTekInstruments)4吝動平臺Titramax1000(HeidolphInstruments)MultiscanAscent(Labsystems)GraphPadSigmaExcel包被緩沖液lxPBS:將100ml10xPBS加入至900ml去離子水中。清洗緩沖液PBS+0.05%Tween20(PBST):將1個片劑加入至1000ml去離子水中。檢測緩沖液A:PBST+1%脫脂乳粉(MP)(w/v)+1%Cellytic(v/v)4全測緩沖液B:PBST+1%MP(w/v)封閉溶液PBST+3%MP(w/v)稀釋緩沖液1.25xPBS(將12.5ml10xPBS加入至87.5ml去離子水中)?！兑话l(fā)才襲(3僅顛)1.包被制備單克隆抗體mAb2H7，3.0|ig/ml于包被緩沖液中(PBS)。以微量移液管向96孔Maxisorp板中每孔加入100pl。于4。C溫育過夜。2.封閉每孔加入200^封閉溶液。在室溫(RT)下置于搖動平臺以600rpm(S)溫育1小時。3.樣品rCHIPSwt標準曲線1000-0.06ng/ml。在eppendorf管中于檢測緩沖液A(PBST+1%MP+1%Callytic)中制備四倍的系列稀釋。在檢測緩沖液A中按1:100稀釋rCHIPSwt(貯存液1.8mg/ml)。5pLCHIPS+495(iL緩沖液=18pg/ml系1000ng/ml:33)ilCHIPSwt(18|ag/ml)+651|il緩沖液70250ng/ml:150piCHIPS(1000ng/ml)+450pl緩沖液丄總共8個濃度乂力裙《砂Jr襲岸濕六從兩個克隆制備1:100-1:102400的四倍的系列稀釋。在96孔U形PP板中于1.25xPBS中按1:5稀釋60pl裂解液+240pl1.25xPBS在eppendorf管中1:10030ml裂解液+570|il檢測緩沖液B1:400150pi(1:100稀釋液)+450pl檢測緩沖液A丄總共6個濃度乂六裙野i^VCb"的/wW、2^^至Ww—卩襲庫4;和義岸在96孔U形PP板中制備于檢測緩沖液A中的1:1000稀釋。1:5稀釋于1.25xPBS:60^1裂角年液+240pl1.25xPBS1:100稀釋于檢測緩沖液A(PBST十1°/。MP+1%Cdlytic)對照野生型和2突變型(裂解液)75^(1:5稀釋液)+1425pl緩沖液文庫15(Al(l:5稀釋液)+285pl緩沖液￡￡75^農(nóng)卩旅拔我^^^):rCHIPSwt標準曲線和對照K69A:每孔加入100ml。對照野生型和2突變型(裂解液)和文庫移取90|al檢測緩沖液A+10|il樣品(1:100稀釋液)?？瞻滓迫z測緩沖液A，向3個孔中每孔加入100nl。在RT以S溫育1小時。4.檢測抗體人抗CHIPS(31-113)0.1pg/ml于檢測緩沖液B中。貯存液的1:10稀釋5|il+295pl檢測緩沖液B=254pg/ml13.4|ilHaCHIP(254|ig/ml)+34ml檢測緩沖液B每孔加入100pl。在RT以S溫育1小時。5.二抗在檢測緩沖液B中以1:12000稀釋山羊抗人IgG-HRP。3|il抗體+35ml檢測緩沖液B每孔加入100^。在RT以S溫育1小時。6.進一步清洗加入200iil清洗緩沖液。在RT以S溫育5分鐘。7.底物SigmafastOPD(Sigma快速鄰苯二胺)(根據(jù)說明)。將2個緩沖片劑和2個底物片劑溶解于40ml去離子水。每孔加100nl。在RT于暗室中以S溫育約3-6分鐘。通過每孔加入150jal1MHC1終止反應(yīng)。測量492nm的吸光度。*****^^fj,嚴之河..^五K05.#3x96#以尸B6T清遂3/義******表8<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>i,泉利用Excel和SigmaGraphPad分析CHIPSwt標準曲線。計算空白的平均值和CV(%)(Excel)將所有^據(jù)點扣除空白(Excel)CHIPSwt標準曲線將492nm的吸光度相對于標準濃度的Log值(對數(shù)值)作圖。在模型"具有不同斜率的S型(Sigmoidal)曲線擬合"中進行曲線擬合(GraphPad)。報道EC50值和R-2值。對K69A裂解液(2個樣品)進行相同的計算。測量EC50R2和吸光度最大值(Topvalue)(Abs)。以結(jié)合％(。/。Binding)對K69A重新計算數(shù)值，以最大值作為100%的結(jié)合。(Excel)計算克隆的結(jié)合％(%Binding)=結(jié)合的測量值(measuredbinding)(Excel)K69A標準曲線以結(jié)合％(%Binding)相對于K69A的濃度的對數(shù)(logconc.ofK69A)作圖。在模型"具有不同斜率的s型(Sigmoidal)曲線擬合，，(GraphPad)中進行曲線擬合。以曲線擬合模型進行人抗CHIPS與克隆的結(jié)合的計算，使用表達ELISA中測量的濃度=結(jié)合的計算值(calculatedbinding)。計算克隆結(jié)合的測量值與計算值間的偏差。如果引入的突變不影響與人抗CHIPS的結(jié)合，則突變體的結(jié)合的測量值應(yīng)該與K69A的結(jié)合的測量值相等。如果引入的突變影響了結(jié)合，則結(jié)合的測量值和計算值間會有差異。較弱的結(jié)合者(binder)將顯示低于K69A的抑制能力，并且偏差將為負數(shù)。偏差(差異)=測量值-計算值結(jié)果顯示于圖22至24及表9中。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>CHIPS1004表達ELISA。以1:100和1:500稀釋的文庫的單點檢測《標檢測CHIPS突變體在pRSET載體中表達后，其在粗細胞裂解液中的濃度。摘要如下優(yōu)化串聯(lián)夾心ELISA:將與CHIPS的前30個氨基酸(N-末端)結(jié)合的兩種多克隆抗體作為包被抗體和檢測抗體。將結(jié)合有HRP的多克隆抗體作為二抗，隨后是HRP-發(fā)光底物。對每個ELISA板的純化重組CHIPS"制作標準曲線。測量相對光單位(RelativeLightUnit;RLU)并相對于標準濃度作圖，并利用4-參數(shù)曲線擬合模型進行分析，從中計算突變體的濃度。/橫和才法10xPBS(BioWhittaker#BE17-517Q，批號4MB0102)PBSTween20(0,05%)(Medicago#09-8410-100,批號113303)BSA(Merck#1.12018.0100，批號K54593318527)CellyticB(Sigma#B-3553，批號114K65156)SuperSignalELISAPicoChemiluminescentSubstrate(超級信號ELISA微小化學發(fā)光底物)(Pierce約7069,批號FK97655)96孔平底高結(jié)合性白色LIA板(Greiner#655074，批號04410129)96孔U形PP板mAb2H7單克隆抗體，lmg/ml(Utrecht,批號2004-12)兔抗CHIPS-N-PepIgG(兔抗CHIPS-N-端肽IgG)，6mg/ml(Utrecht，批號2000-12-06)羊抗兔IgG(H+L)-HRP(SouthernBiotechnologies#40-50-05，批號C4103-S194D)rCHIPSwt，1.8mg/ml(Utrecht,批號2004-12-02)CHIPS突變體農(nóng)器；ELISA洗板機ELx楊(BioTekInstruments)搖動平臺Titramax1000(HeidolphInstruments)FLUOstarOptima(BMG)軟件ExcdGraphPadSigma包被緩沖液lxPBS:將100ml10xPBS加入至900ml去離子水中。清洗緩沖液PBS+0.05%Tween20(PBST):將1個片劑加入至1000ml去離子水中。74檢測緩沖液A:PBST+1%BSA(w/v)+1%Cellytic(v/v)檢測緩沖液B:PBST+1%BSA(w/v)封閉溶液PBST+4%BSA(w/v)美發(fā)才雞個匈1.包被制備單克隆抗體mAb2H7,3.0嗎/ml于包被緩沖液(PBS)中。以微量移液管向96孔白色高結(jié)合性平底LIA板中每孔加入100pl。于4。C溫育過夜。2.封閉每孔加入200jil封閉溶液。在室溫(RT)下置于搖動平臺以600rpm(S)溫育1小時。3.樣品rCHIPSwt標準曲線800-1.6ng/ml。在15ml試管中以10個步驟(于檢測緩沖液A中)制備2倍的系列稀釋，將其中的8個濃度用于標準曲線(見表10)。在檢測緩沖液A中按1:100稀釋rCHIPSwt(貯存液1.8mg/ml):5pLCHIPS+495pL緩沖液=18pg/ml表IO濃度ng/mlfr稀釋液標準曲線1234檢測緩沖液A(PBS,1%BSA,1%Cellytic)80033.328671500'''1500200150015001001500150050150015002515001500ni12.5150015006.2515001500K懇3.131500.'，'i柳1.5615001500按照實驗方案每孔加入100pL，一式兩4分重復(fù)。乂六,賄萄對1:100稀釋對1:500稀釋在檢測緩沖液B(PBS+1%BSA)中制備1:100稀釋液每孔加入100|il，一式兩^f分重復(fù)每孔加入20pi+80pl檢測緩沖液A，一式兩份重復(fù)C/fZPS^^謬f襲席濕力在96孔U形PP板中，在檢測緩沖液B(PBS+1%BSA)中制備1:100稀釋。對1:100稀釋在ELISA板的每孔加入100^175對1:500稀釋每孔加入20^1+80}il檢測緩沖液A(PBS+1%BSA+1%Cellytic)。單點?？瞻紫蛑辽?個孔加入100(il檢測緩沖液A。在RT以S溫育2小時。4.檢測抗體兔抗CHIPS-N-肽，3ng/ml于檢測緩沖液B(PBS+1%BSA)中31W抗體+621111緩沖液每孔加入100ml。在RT以S溫育1小時。5.二抗羊抗兔IgG(H+L)-HRP。于檢測緩沖液B中制備1:20000稀釋液。3.1(il抗體+621111緩沖液。每孔加入100|al。在RT以S溫育1小時。6進一步清洗每孔加入200ml清洗緩沖液。在RT以S溫育5分鐘。7.底物SiperSignalpico:混合等體積的溶液A和B(于暗室中)。每孔加入100pl。于600rpm搖動1分鐘(于暗室中)。測量發(fā)光值。將增益(gain)設(shè)定為標準曲線最高濃度的80%(約3000)。*****4摩有,潔之河..在五丄#_3x%哞以尸S5T清遂3/義******X^彭夕，乃(0S476表ll<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>利用BMG分析軟件、Excel和/或SigmaGraphPad分析標準曲線(見圖25)。計算空白的CV(%)將所有數(shù)據(jù)點扣除空白。標準曲線以RLU平均值相對于標準濃度的Log值(對數(shù)值)作圖。在模型"4參數(shù)擬合，，(軟件)或"具有不同斜率的S型(Sigmoidal)曲線擬合"(GraphPad)中進行曲線擬合。報道EC50值和R2值。利用曲線擬合模型計算樣品濃度。示范性克隆在抗CHIPS抗體ELISA及肽ELISA中的分析結(jié)果，匯總于表12中。表12<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>材料和方法經(jīng)在為了創(chuàng)建CHIPS變體的多種文庫，利用了不同的隨機誘變方法。按照廠商建議進行了GeneMorphII(Stratagene)。簡言之，將lng或10pgDNA(具有突變K61A、K69A或K100A的CHIPS基因)力。至PCR反應(yīng)，所述PCR反應(yīng)由50^1總體積的以下成分組成引物各250ng(正向5，-TCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCTTTACTTTTGAACCG-3，[SEQIDNO:88和反向5，-GCCTGCGGCCGCAGATCTACCATTAATTACATAAG-3，[SEQIDNO:89)、0.8mMdNTP、lxMutazyme緩沖液、2.5UMutazymeDNA聚合酶。所述PCR程序由以下步驟組成95°C變性2分鐘；40個循環(huán)的95°C1分鐘，60°C1分鐘，72。Cl分鐘；以及最終72。C延伸IO分鐘。為了制成一個具有高頻率突變的文庫以及一個具有低突變頻率的文庫，將lng的文庫再進行一輪的GenemorphII誘變。此時，PCR反應(yīng)中的DNA量為10ng。易錯PCR按前述方法進行(Leungetal,1989，歸一e1:11-15)。創(chuàng)建了一個具有高頻率突變的文庫和一個具有低頻率突變的文庫。簡言之，將10ngDNA加至PCR反應(yīng)，所述PCR反應(yīng)由50pl總體積的以下成分組成引物各20)iM的引物對(描述于上文)、0.8mMdNTP(NewEnglandBiolabs,MA，USA)、lxAmpliTaq反應(yīng)緩沖液、3.2mM額外的dGTP或dTTP(分別)、7.5mMMgCl2、0.64mMMnCl2、2.5UAmpliTaqThermostable(熱穩(wěn)定)DNA聚合酶(AppliedBiosystems,CA,USA)。所述PCR程序由以下步驟組成94°C變性5分鐘；40個循環(huán)的94°C30秒，55°C30秒，72°C40秒；以及最終72。C延伸10分鐘。才艮據(jù)廠商建議的方法將PCR產(chǎn)物亞克隆至pGEM-T載體(Promega),驗證序列并評估堿基交換。F/iVZ)⑧戎術(shù)蘭成'f體C/f/尸SX岸在一個特定實施方式中，利用AlligatorBioscienceAB的(fragmentInducedDiversity,片段引發(fā)的多樣性)技術(shù)產(chǎn)生了變體，如國際專利申請第WO2002/48351、WO03/097834和PCT/GB2006/004294號所述，其以引用的方式并入本文中。將變體CHIPS多肽文庫克隆至噬粒載體pFAB75(Engberg)的驕I和位點間，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TOP10F'(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中以在噬菌體顆粒上表達。按照標準實驗方法制備噬菌體原種，利用VSCM13(Stratagene,LaJolla,CA,USA)作為輔助噬菌體。用輔助噬菌體(感染復(fù)數(shù)~20)感染以指數(shù)生長的培養(yǎng)物，并于37。C溫育30分鐘，無需搖動。將超感染的大腸桿菌離心沉降，并用于接種添加有氨千青霉素(50|ig/mL)、卡那霉素(IO(ig/mL)、四環(huán)素(10嗎/mL)和異丙基(3-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(1mM)的LB。將該培養(yǎng)物在3(TC搖動的條件下培養(yǎng)15小時，離心成塊狀沉淀，并進行聚乙二醇/NaCl沉淀。將噬菌體重新溶解于包含1。/。牛血清白蛋白(BSA)(Sigma-Aldrich,StLouis，MO，USA)的PBS并以0.45pm濾器過濾。C5oR應(yīng)襲fp^的謬遂在由第7-28位氨基酸的生物素化的C5aR肽(AnaSpec,USA)和鏈霉親和素包被的磁性Dynabead(Dynal,Norway)上進行篩選。分離在》茲性立柱(magneticstand)上進行2分鐘。篩選之前，將鏈霉親和素珠(50|^1)在1ml篩選緩沖液(包含3%BSA和0.05%Tween-20的PBS)中清洗三次。將500pl噬菌體原種(包含1011噬菌體顆粒)與清洗過的珠在室溫旋轉(zhuǎn)(onrotation)預(yù)溫育30分鐘，以除去任何潛在的鏈霉親和素結(jié)合物。將肽加入至預(yù)清除的噬菌體至終濃度為10々M,并將該混合物于室溫下旋轉(zhuǎn)溫育1小時。同時，將50pl鏈霉親和素珠于室溫在篩選緩沖液中封閉溫育1小時。將肽/噬菌體混合物加至珠，并進一步于室溫旋轉(zhuǎn)溫育15分鐘。然后以1ml篩選緩沖液清洗珠5次，隨后以1mlPBS清洗三次。為了洗脫出肽結(jié)合物，將pH2.2的450pi0.1M甘氨酸0.1%BSA加至清洗過的珠。于室溫溫育IO分鐘后，加入pH9.0的50^1lMTris以中和洗脫液。保存幾微升洗脫出的噬菌體用于滴定產(chǎn)出噬菌體的滴度，其余用于感染指數(shù)生長的大腸桿菌TOP10F，(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)以制備新的噬菌體原種。然后將篩選按上述方法重復(fù)一次。第二輪陽性篩選之后，直接將CHIPS噬菌體原種進行一輪對人抗CHIPS31—1I3IgG親和性的陰性篩選。將人抗CHIPS31—113IgG包被的磁珠在1ml篩選緩沖液中清洗3次，并于室溫在lml篩選緩沖液中旋轉(zhuǎn)封閉1小時。將陽性篩選的洗脫液加至珠并將它們于室溫溫育15分鐘。在磁鐵上分離之后，將上清液保存作為洗脫液1。進行了四輪洗脫；將100plPBS加至珠并于室溫溫育5分鐘。在磁鐵上分離后，將該PBS保存作為洗脫液2。重復(fù)兩次(洗脫液3和4)。將洗脫液1以及洗脫液2-4的混合液用于感染指數(shù)生長的大腸桿菌TOP10F，(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)，并從該大腸桿菌中純化噬粒。義應(yīng)^^"#義岸W義/^和4這噬菌體篩選后，將篩選的CHIPS變體的混合物(pool)從pFAB75載體中切割出來并克隆至pRSET載體(Invitrogen)的和Bg/II位點間，用于大腸桿菌裂解液中的表達。以文庫轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21starDE3pLysS(Invitrogen)，平板接種至(plated)20cmQtray板，其中含有添加有50pg/ml氨芐青霉素和34/ml氯霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基，并于37。C溫育過夜。第二天，挑取大腸桿菌的菌落并利用Qpix自動裝置(Qpixrobot)接種至含有150plLB的96孔Greiner圓底板，所述LB培養(yǎng)基添加有50pg/ml氨芐青霉素和34(ig/ml氯霉素。將該培養(yǎng)物于37。C且濕度為78%的條件下在Multitron反應(yīng)板搖床(plateshaker)上以700rpm搖動著溫育過夜。通過按上述方法于37。C以5pl過夜培養(yǎng)物接種145plLB/氨千青霉素/氯霉素而制備日間培養(yǎng)物(Dayculture)。為了誘導蛋白表達，3小時后向培養(yǎng)物中加入0.5mMIPTG(異丙基(3-D-硫代半乳糖苷)，并將培養(yǎng)物繼續(xù)培養(yǎng)3小時。蛋白于大腸桿菌裂解液中表達，所述裂解液通過在90jil緩沖液中凍融大腸桿菌團塊(pellet)而制備，所述緩沖液由PBS-0.05%Tween-20、完全的不含EDTA的蛋白酶抑制劑(CompleteEDTA-freeproteaseinhibitor)(Roche)、25U/mlBenzonase(核酸酶)(Sigma)和lKU/mlr溶菌酶(rLysozyme)(Novagen)。在室溫下溫育裂解液10分鐘，伴有搖動。將裂解液的20|il組分于含有1%BSA的PBS-0.05%Tween-20中稀釋10倍。將稀釋的和未稀釋的裂解液均保存于-20°C直至用于ELISA分析。為了檢測CHIPS變異體與親和純化人抗CHIPS3,.n3的結(jié)合，將Maxisorb96或384孔板(Nunc,Rochester,NY，USA)以包含1|ag/ml小鼠抗CHIPSN-末端mAb2H7的PBS(HaasJI,2004)于4。C進行過夜包被。以清洗緩沖液(含有0.05%Tween20的PBS)清洗反應(yīng)板3次，并在室溫下以封閉緩沖液(含有3%乳粉的PBS-0.05。/。Tween-20)封閉1小時。按前述方法清洗反應(yīng)板，隨后加入來自CHIPS克隆的裂解液(按前述方法稀釋)并在室溫下溫育1小時。清洗反應(yīng)板，并進一步與包含0.1嗎/ml親和純化人抗CHIPS31_113多克隆IgG的稀釋緩沖液(含有1°/。乳粉的PBS-0.05。/。Tween-20)在室溫下溫育1小時。再次清洗反應(yīng)板，并在室溫下與1/10000稀釋于稀釋緩沖液的山羊抗人IgGHRP(JacksonlmmunoResearch,WestGrove,PA,USA)溫育1小時。將反應(yīng)板再次清;先3〉欠，力口入SuperSignalELISAPicoChemiluminescentSubstrate(超級"[言號ELISA微小化學發(fā)光底物)(Pierce)并檢測發(fā)光。為了檢測CHIPS變體在大腸桿菌裂解液中的表達水平，按上述方法進行ELISA，除了以下不同之處將3嗎/mlmAb2H7用于包被，封閉緩沖液由包含4%BSA的PBS-0.05%Tween-20組成，以及稀釋緩沖液是包含1%BSA的PBS-0.05%Tween-20。此外，將3pg/ml多克隆兔抗CHIPSN-末端IgG和以1/20000稀釋的羊抗兔IgG-HRP(SouthernBiotech)用于檢測。#額五ZJ&4為了檢測CHIPS變體在野生型CHIPS蛋白的竟爭下與親和純化人抗CHIPS31.113的結(jié)合，進行了抑制性ELISA。其清洗步驟、封閉和稀釋均按照表達ELISA進行。將50ng/ml純化野生型CHIPS用于包被。然后，將CHIPS變體的5倍稀釋系列(0.16-2500ng/ml)在Nunc聚丙烯板上與60ng/ml親和純化人抗CHIPS31.3多克隆IgG混合并于室溫溫育2小時。然后，將100pi混82步溫育2小時。以1/12000稀釋的羊抗人IgGHRP進行^r測。按上述方法使用OPD底物。為了檢測CHIPS變體對上述C5aR7-28肽的結(jié)合，按照表達ELISA進行了ELISA檢測，除了以下不同之處以5嗎/ml鏈霉親和素(Sigma)用于包被。此外，在清洗和封閉反應(yīng)板之后，將C5aR肽加至終濃度0.3叫/ml。加入xxx稀釋的CHIPS裂解液。將1pg/mlmAb2H7和以1/2000稀釋的兔抗小鼠IgG-HRP(Dako)用于檢測。加入OPD底物(l片鄰苯二胺于35ml中；34.7mM檸檬酸鈉，66.7mMNaP04,0.01%&02)用于檢測。加入1MHC1終止反應(yīng)，并記錄492nm的吸光度。同樣參見上文描述的表達ELISA。組合ELISA是抗CHIPSELISA和肽ELISA的組合。該ELISA按照上文描述的肽ELISA進行，并具有以下修改。將含有2%BSA的PBS-0.05。/。Tween-20用于封閉，0.1嗎/ml親和純化人抗CHIPS3.n3多克隆IgG/以1/6000稀釋的羊抗人IgGHRP用于檢測。將SuperSignalELISAPicoChemiluminescentSubstrate(超級信號ELISA微小化學發(fā)光底物)(Pierce)用作HRP底物并測量發(fā)光。謬逸泉略總是將突變體的結(jié)合與同野生型CHIPS與抗CHIPS抗體或肽可達到的結(jié)合作比較(計算結(jié)合的百分率)。初篩中最佳的突變體的選擇基于以下標準1.與肽至少80%的結(jié)合2.在組合ELISA中，與抗CHIPS抗體的結(jié)合低于70%。雙重ELISA(doubleELISA)中野生型結(jié)合的3%/肽ELISA結(jié)合的百分率應(yīng)該為0.05-0.6。篩選出的克隆按上述方法以包含表達ELISA和抗CHIPSELISA的第二輪篩選進行分析。優(yōu)選的克隆(與抗CHIPS抗體的結(jié)合低于40%)以抗CHIPSELISA和抑制性ELISA做進一步分析。將基于以上準則的最佳的42個克隆進行表達，并83以體內(nèi)/體外實驗分析其胞內(nèi)(incellular)結(jié)合性。為了表達高濃度的CHIPS變體，應(yīng)用了一個無纟田月包表達體系,ExpresswayCell-Free五.co//ExpressionKit(快速通道無細胞大腸桿菌表達試劑盒)(Invitrogen)。按照廠商說明進行表達。簡言之，將0.5ing質(zhì)粒DNA在微量滴定板中與大腸桿菌提取物、反應(yīng)緩沖液、氨基酸和T7酶混合物混合，并于30。C溫育30分鐘，伴有搖動。將含有氨基酸的供給緩沖液(feedingbuffer)加入至樣品中，并進一步于30。C溫育5.5小時。將反應(yīng)板離心，將含有蛋白的上清液貯存在-20。C直至用于下列檢測與U937/C5aR細胞上的C5aR的結(jié)合檢測，和與嗜中性粒細胞(天然表達C5aR和fMPL)上C5aR和fMPL的結(jié)合檢測。以體外表達的材料將所述檢測進行兩次并獨立分析，將克隆按照對C5aR的結(jié)合進行排序。將表現(xiàn)最佳的10個克隆篩選出以作進一步的分析。力C/W7/C5ai勿應(yīng)的錄合將包含7.5x104U937/C5aR細胞的25plRPMI/HAS與25|alCHIPS解裂液冰浴30分鐘。以RPMI/HAS清洗細胞一次，重懸(CellswerewashedoncewithRPMI/HASresuspended),并與50pi5嗎/ml2H7Ab冰浴30分鐘。清洗一次，重懸并與50以1/50稀釋的羊抗小鼠RPE抗體冰浴30分鐘。以RPMI/HAS清洗一次，并重懸于250pi0.5%多聚曱醛/RPMI/HAS，以漩渦混合器振蕩混合(vortex)。保存于4。C暗室中。以FACS分析，測量平均值。C7ffl^活^^游辦定雙重/MLP-F/a-C5ai-尸五〈微量諒;ty^)fC7/7PSa"z'v//y6/oawa;;t/wa/F/a匿C5a/-尸4)同時測試CHIPS(稀釋液)的多個樣品對于人嗜中性粒細胞的fMLP和C5a二者的生物活性的方法。包含CfflPS的樣品將阻止FITC-fMLP和抗C5aRmAb與細胞的結(jié)合。第二溫育步驟以PE染色(stains)mAb，以流式細胞儀分析樣品。將以上基于細胞的檢測中具有最佳結(jié)合性的10個克隆篩選出來(見以下"結(jié)果")。結(jié)果以F/A^⑧技術(shù)生成的示范性變異型CHIPS多肽公開于以下表14中(與上84述基于細胞的檢測中排序最佳的10個克隆相對應(yīng))。表14<table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table>*產(chǎn)生上述突變的"親本"多肽序列，對應(yīng)于SEQIDNO:1的第1至112位氨基酸，并于C-末端含有兩個附加的氨基酸(于第113位氨基酸的"R，，和于第114位氨基酸的S)。因此，克隆F3.03由以下氨基酸序列組成FTFEPFPTNEEIESNKKMLEKEKAYKESFKNSGLPTTLGKLDERLRNYFFKKGESKSSYVMTFRSSEQIDNO:90另一個附加的突變CHIPS多肽也用于特定的實驗中，被命名為"S3.23，，，其對應(yīng)于SEQIDNO:1的第1至112位氨基酸，并于第113和114位含有氨基酸R和S,其具有以下突變K40N，D42V，N77Y,D83G，L90P,Nl11K和Gl12V。關(guān)于上述體外表達的克隆的其它結(jié)合數(shù)據(jù)列于表15。表15多肽ELISA與U937細胞C5aR相對于抑制性Biscore雙重結(jié)(0.3ng/ml)的結(jié)合野生型1-112抗CHIPSELISAIC50合P畫相對于野生型克隆的％最大值(％)IC50(nM)(nM)(%)1-112的％F3.031134,8438265F3.081152,62762268487F3.141136,641F3.3912912561115F3.461329,3524112F3.501221367F3.571267,5428138F3.7112319349597F3.851061024wtl-112-RS1001000，4014,50100100wt1-12111228抗CHIPSELISA研究和抑制性ELISA研究的結(jié)果分別于圖26和27有詳細顯示。這些發(fā)現(xiàn)確iL了篩選方法產(chǎn)生的凄t據(jù)，即抗CHIPS抗體與CHIPS突變體的結(jié)合相對于野生型而言有所降低。在一系列附加實驗中，將以上鑒定的示范性突變體進行修飾，使N-端的前三十個氨基酸以及C-端的最后一個氨基酸缺失。因此，修飾突變體對應(yīng)于SEQIDNO:1的第31至113位氨基酸，其中包含了表14中鑒定的突變。修飾的31-113突變體對于C5aR的抑制由圖28表示。F3.08、F3.39和F3.50突變體的表達和純化以及隨后對它們與C5aR結(jié)合的分析，(其中C5aR或者作為U937細胞中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的蛋白表達，或者作為嗜中性粒細胞中天然存在的蛋白)，均確認了篩選數(shù)據(jù)，即論證了保留的結(jié)合特性。C/T/尸S我差^的4面甲及^和f"麥^rc/仍ewe^)才才泮+禾口方法利用NACCESS程序，按照Amitai等在2004,/Mo/.歷o/,344:1135-1146中描述的方法測定RSA值(另參見Hubbard,1996,NACCESS，2丄1edit"BiomolecularStructureandModellingUnit,UniversityCollege,London,UK)。簡言之，NACCESS程序計算原子可及表面，所述原子可及表面通過將特86定大小的探針圍繞范德華表面推移(roll)來限定。該程序是按照Lee&Richards(1971),Mo/.所o/.55,379-400的方法執(zhí)行的。該程序的大小多達20000原子，并允許用戶改變探針大小及原子半徑。該程序輸出3個文件(1)原子可及性文件(.asa文件)，包含為PDB文件中每個原子計算的可及表面，以及指定的范德華半徑。(2)殘基可及性(.rsa)文件，包含涵蓋每個蛋白或核酸殘基的原子可及表面區(qū)域的總和，以及每個殘基的相對可及性，其以相對于該殘基類型在延伸的ALA-x-ALA三肽的可及性的百分比來計算(對于氨基酸)。見Hubbard,Campbell&Thornton(1991)JMo/.所o/.220,507-530。(3)對數(shù)文件(.log)，包含與計算相關(guān)的信息。柳面^r及'/鄰&4」野生型CHIPS蛋白中氨基酸的相對表面可及性(RSA)由表15所示。認為RSA>30%表示暴露的殘基。表15<table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table>殘基。:、氨基酸:緊密值(Clos'ene'ssValue"相辨表g可及性88GUJ0.11469.689LEU0.8512.7卯LEU0.14159.291GLY0.1689.692LYS0.2528.093MET1.6399.894TYR1.01723.495LYS0.98334.896THR1.2260.097TYR1.33421.498PHE1.4080.099PHE0.78613.6100LYS-0.38329.0101LYS-1.21170.4102GLY-1.60698.9103GUJ-0.60637.4104SER-1.21191.0105LYS-0.69167.0106SER-0.11935.9107SER-0.54151.9108TYR0.81827.0109VAL-0.04354.3110ILE1.37115.1111ASN0.16875.1112GLY-0.28922.7113PRO-0.38356.9114GLY-0.0681.8115LYS-0.69184.2116THR-0.28912.2117ASN-0.33634.3118GUJ-1.38364.2119TYR-1.54471.9120ALA-1.51366.3121TYR-2.512123.1預(yù)測的野生型CHIPS蛋白中的功能性氨基酸殘基由表16顯示。(注意蛋白質(zhì)核心的殘基相對蛋白質(zhì)表面的殘基具有更高的緊密值89(closenessvalue)。然而，活性位點的殘基，盡管位于蛋白表面，也具有相對核心殘基更高的緊密值(closenessvalue))。域值緊密值Z值^13<=相對表面積(relativesurfacearea)<=200表16<table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table>權(quán)利要求1.一種具有金黃色葡萄球菌趨化抑制蛋白(“CHIPS”)生物活性的多肽，所述多肽包含SEQIDNO1的氨基酸序列的變體。2.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽，其中修飾了以下氨基酸中的一個或多個N31、S32、G33、L34、P35、K40、D42、R46、Y48、K50、G52、T53、K54、N55、S56、A57、Q58、K61、E67、K69、L76、N77、P79、D83、L90、K92、K100、KlOl、S104、K105、S107、Y108、N111和G112。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的多肽，其中修飾了一個或多個表面表位。4.根據(jù)權(quán)利要求3的多肽，其中所述一個或多個表面表位選自以下各組的表位(a)包含N68、K69、G70、Y71和Y72的表位;(b)包含N55、K100、T53、S107和Y108的表位；(c)包含Nlll、K95、Y94、Y97和Y71的表位；(d)包含N55、K54、T53和Y108的表位;(e)包含N55、KIOO、S107、Y108、Y48和G52的表位；①包含Nlll、K95、Y94、Y97和Y71的表位；(g)包含Q58、KIOO、S107和Y108的表位；(h)包含K69、L34和/或L90、P35、K92和E67的表位；(i)包含G39、K40、L34、P35，K92和E67的表位；①包含P79、L76、R46、A57、S56和Q58的表位；(k)包含G35、L34、K92、G33、S32和N31的表位；(1)包含N31、S32、G33、K50、K61、S104、Nlll和G112的表位；以及(m)包含N55、KIOO、S107、S108的表位。5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項的多肽，其中所述多肽包含SEQIDNO:1的氨基酸1-112或由SEQIDNO:1的氨基酸1-112組成，并相對于SEQIDNO:1在一個或多個以下氨基酸處具有氨基酸取代N31,S32,G33,L34,P35，K40,D42，R46,Y48，K50,G52,T53,K54，N55,S56,A57,Q58，K61,E67,K69，L76,N77,P79，D83，L90，K92，KIOO，K101,S104，K105，S107，Y108,N111和G112。6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的多肽，其中所述多肽相對于SEQIDNO:1包含以下氨基酸突變中的一個或多個N31A,S32A,G33A，L34A，P35A，Y48A,Y48H,K50N,G52A，T53A，N55A,S56A,K61A,K69A，P79A,L90A，L90P,K92R,K100R,S104Y，S107A,Y108，Nllll，N111K和G112V。7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的多肽，其中所述多肽相對于野生型CHIPS蛋白在人體中具有更低的免疫原性。8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的多肽，其中所述多肽的生物活性高于野生型CHIPS蛋白的生物活性。9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的多肽，其中所述多肽能夠抑制嗜中性粒細胞的C5a誘導的活化，以及抑制嗜中性粒細胞的fMLP誘導的活化。10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的多肽，其中將嗜中性粒細胞的C5a誘導的活化和/或嗜中性粒細胞的fML'P誘導的活化抑制至少10%,例如至少20%,30%,40%,50%，60%,70%，80%,90%，95%并優(yōu)選100%。11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的多肽，其中所述多肽的長度少于500個氨基酸，例如長度少于400,300，200,150，140,130，125,121，120，119，118,117,116,115,114,113，112,111,110,109,108,107，106，105,104，103,102，101,100,95，90，85，80,75，70,65，60,55，50，40,30個或更少的氨基酸。12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的多肽，其中所述多肽的長度是110-130個氨基酸，例如長度是110-120個氨基酸。13.根據(jù)權(quán)利要求12的多肽，其中所述多肽的長度為112個氨基酸。14.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的多肽，其中所述多肽包含SEQIDNO:1的氨基酸序列的片段或其變體，或由SEQIDNO:1的氨基酸序列的片段或其變體組成。15.根據(jù)權(quán)利要求14的多肽，其中所述多肽包含SEQIDNO:1的氨基酸序列的氨基酸31-113或其變體，或由SEQIDNO:1的氨基酸序列的氨基酸31-113或其變體組成。16.根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項的多肽，其中所述多肽選自下組由SEQIDNO:1的氨基酸1-112組成并具有下列修飾以及它們的組合的多肽(a)K德，K69A,N111K和G112V;(b)G112V;(c)K54R，K69R,K100R和K105R;(d)K40N和K92R;(e)S104Y和NlllI;(f)K69A和G112V;(g)K69T;(h)Y48H,D83G和L90P;(i)K50N;(j)K69A,K100R和K101R;(k)K69A;(1)N31A;(m)S32A;(n)G33A;(o)L34A;(p)P35A;(q)Y48A;(r)G52A;(s)T53A;(t)N55A;(u)S56A;(v)E67A;(w)P79A;(x)L90A;(y)S107A;和(z)Y雨A。17.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的多肽，其中所述多肽包含在SEQIDNO:1的氨基酸序列的N-末端或C-末端或內(nèi)部插入的一個或多個附加氨基酸，或由在SEQIDNO:1的氨基酸序列的N-末端或C-末端或內(nèi)部插入的一個或多個附加氨基酸組成。18.根據(jù)權(quán)利要求17的多肽，其中所述多肽包含至少2，3，4,5,6,7，8,9，10,15或20個附加氨基酸或由至少2，3，4，5，6,7,8,9，10,15或20個附加氨基酸組成。19.根據(jù)權(quán)利要求18的多肽，其中所述多肽包含6個附加氨基酸或由6個附加氨基酸組成。20.根據(jù)權(quán)利要求17，18或19的多肽，其中附加的氨基酸位于SEQIDNO:1的氨基酸序列的C-末端。21.根據(jù)權(quán)利要求17至20中任一項的多肽，其中氨基酸由具有以下修飾的SEQIDNO:1的氨基酸1-112組成K40E,K69A,皿1K和G112V。22.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的多肽，其中所述多肽相對于野生型序列包含一個或多個以下氨基酸突變K40,D42,K50，K69,N77，D83，L90，K92,K100,K105,Nlll和G112。23.根據(jù)權(quán)利要求22的多肽，其中所述多肽相對于野生型序列包含一個或多個以下氨基酸突變K40E,K40N，D42V,K50N,K69R,N77Y，D83G,L90P,K92R,K100R,K105R，N111K，N111I和G112V。24.根據(jù)權(quán)利要求22至23中任一項的多肽，其中所述多肽選自下組由SEQIDNO:1的氨基酸1-112組成并具有下列修飾以及它們的組合的多肽(a)K50N，K69R,N77Y,K92R，N111K和G112V;(b)K40E，D42V,N77Y，K100R，K105R,N111K和G112V;(c)K50N，N77Y，K92R,N111K和G112V;(d)K40E，D42V，N77Y,N111K和G112V;(e)K40E，D42V,N77Y，K92R,N111K和G112V;(f)K50N,N77Y，N111K和G112V;(g)K40E,D42V,K50N，N77Y,K92R,N111K和G112V;(h)K40N，K50N,N77Y，K92R和N111I;(i)K墨，N77Y，D83G,L90P,N111K和G112V;和(j)K50N,N77Y,K92R，K100R和Nil11。25.根據(jù)權(quán)利要求24的多肽，其中所述多肽在位置113和114分別包含氨基酸R和S。26.根據(jù)權(quán)利要求22至23中任一項的多肽，其中所述多肽選自下組由SEQIDNO:1的氨基酸31-113組成并具有下列修飾以及它們的組合的多肽(a)K50N,K69R,N77Y,K92R,N111K和G112V;(b)K40E,D42V，N77Y，K100R，K105R，N111K禾口G112V;(c)K50N,N77Y，K92R,N111K和G112V;(d)K40E,D42V,N77Y,N111K和G112V;(e)K德，D42V，N77Y，K92R，N111K和G112V;(f)K50N，N77Y,N111K和G112V;(g)K德，D42V,K50N，N77Y,K92R,N111K和G112V;(h)K墨，K50N,N77Y,K92R和N111I;(i)K40N，N77Y,D83G，L90P,N111K和G112V;和①K50N,N77Y,K92R,K100R和N1111。27.—種核酸分子，其編碼根據(jù)權(quán)利要求1至26中任一項的多肽。28.根據(jù)權(quán)利要求27的核酸分子，其中所述核酸分子為DNA分子。29.—種載體，其包含根據(jù)權(quán)利要求26或27的核酸分子。30.根據(jù)權(quán)利要求29的載體，其中所述載體為表達載體。31.根據(jù)權(quán)利要求29或30的載體，其中所述載體選自下組pRSET和pHIP。32.—種宿主細胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求27或26的核酸分子或根據(jù)權(quán)利要求29至31中任一項的載體。33.—種用于產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求1至26中任一項的多肽的方法，其包括在表達所述多肽的條件下培養(yǎng)宿主細胞群體，所述宿主細胞包含根據(jù)權(quán)利要求27或28的核酸分子或根據(jù)權(quán)利要求30或31的載體；以及從中分離該多肽。34.—種藥理組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至26中任一項的多肽。35.用于藥物的根據(jù)權(quán)利要求1至26中任一項的多肽。36.根據(jù)權(quán)利要求1至26中任一項的多肽在制備用于抑制補體5a(C5a)和/或N-曱酰肽fMLP的生物活性的藥物中的用途。37.根據(jù)權(quán)利要求36的用途，其中所述藥物用于抑制C5a受體的功能。38.根據(jù)權(quán)利要求36或37的用途，其中所述藥物用于抑制曱酰化肽受體的功能。39.根據(jù)權(quán)利要求37或38的用途，其中所述C5a受體和/或曱?；氖荏w位于嗜中性粒細胞、單核細胞和/或內(nèi)皮細胞上。40.根據(jù)權(quán)利要求36至39中任一項的用途，其中所述藥物用于抑制由補體5a(C5a)和/或N-曱?；膄MLP誘導的嗜中性粒細胞的活化。41.根據(jù)權(quán)利要求36至40中任一項的用途，其中所述藥物用于治療炎癥。42.根據(jù)權(quán)利要求36至41中任一項的用途，其中所述藥物用于治療選自下組的一種或多種疾病或癥狀急性反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、急性移植排斥、成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)、酒精性肝炎、同種異體移植、阿爾茨海默病、動脈硬化、阿爾圖斯反應(yīng)、哮喘、動脈粥樣硬化、特應(yīng)性皮炎、細菌性腦膜炎、支氣管癌、大皰性類天皰瘡、燒傷、心肺分流術(shù)、心血管疾病、慢性支氣管炎、慢性淋巴白血病、慢性阻塞性肺病(COPD)、接觸性皮炎、克羅恩病、皮膚T細胞淋巴瘤、嚢性纖維化、皮膚病(dermatose)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、子宮內(nèi)膜異位癥、實驗性變應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)、實驗性變應(yīng)性神經(jīng)炎(EAN)、凍傷、胃癌、腸胃病、泌尿生殖疾病、痛風、幽門螺桿菌胃炎、血液透析、遺傳性血管性水腫、超敏性肺炎、特發(fā)性肺纖維化、免疫復(fù)合物(IC)誘發(fā)性血管炎、缺血性休克、缺血再灌注發(fā)作、缺血再灌注損傷、關(guān)節(jié)疾病、(大)血管外科手術(shù)、金屬煙熱、多發(fā)性硬化、多系統(tǒng)器官衰竭、重癥肌無力、心肌梗死、胰腺炎、腹膜炎、胸膜氣腫、心肺分流術(shù)后(CPB)炎癥、銀屑病、重復(fù)性勞損(RSI)、呼吸系統(tǒng)疾病、類風濕性關(guān)節(jié)炎、膿毒癥、敗血性休克、鼻竇炎、皮膚病(skindisease)、中風、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、移植、(創(chuàng)傷性)腦損傷、潰癡性結(jié)腸炎、尿路感染、血管滲漏綜合征、血管炎和異種移植。43.根據(jù)權(quán)利要求42的用途，其中所述藥物用于治療再灌注損傷。44.根據(jù)權(quán)利要求43的用途，其中所述再灌注損傷與急性心肌梗死(AMI)、冠狀動脈旁路移植術(shù)(CABG)、中風和/或器官移植相關(guān)。45.根據(jù)權(quán)利要求42的用途，其中所述藥物用于治療急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)。46.—種用于產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求1至26中任一項的多肽的方法，其包括以下步驟(a)提供編碼野生型CHIPS蛋白或其變體的一種或多種親本多核苷酸分子；(b)以核酸酶消化所述一種或多種親本多核苷酸分子以產(chǎn)生多核苷酸片段；(c)將步驟(b)產(chǎn)生的所述多核苷酸片段彼此接觸；和(d)擴增彼此退火的片段以產(chǎn)生至少一種編碼變體CHIPS多肽的多核苷酸序列，所述變體CHIPS多肽如與所述一種或多種親本多核苷酸分子編碼的那些多肽相比具有改變的氨基酸序列。47.根據(jù)權(quán)利要求46的方法，其進一步包括步驟(e),即對步驟(d)中產(chǎn)生的所述至少一種多核苷酸序列進行表達并在所得多肽中篩選具有野生型CHIPS蛋白生物活性的多肽。48.根據(jù)權(quán)利要求47的方法，其中所述野生型CHIPS蛋白的生物活性是抑制嗜中性粒細胞的C5a誘導的活化和/或嗜中性粒細胞的fMLP誘導的活化的能力。49.根據(jù)權(quán)利要求46至48中任一項的方法，其進一步包括步驟(f),即在所得多肽中篩選相對于野生型CHIPS蛋白具有降低的免疫原性的多肽。50.根據(jù)權(quán)利要求46至49中任一項的方法，其中步驟(a)中所述的一種或多種親本多核苷酸分子為單鏈的。51.根據(jù)權(quán)利要求46至50中任一項的方法，其中步驟(b)中所述的核酸酶為外切核酸酶。52.根據(jù)權(quán)利要求46至51中任一項的方法，其中步驟(d)包括添加具有預(yù)定變異性的寡核苷酸。53.根據(jù)權(quán)利要求47至52中任一項的方法，其中步驟(e)包括檢測所得的多肽同C5aR和/或FPR結(jié)合的能力。54.—種基本如本文說明書所描述的多肽。55.—種基本如本文說明書所描述的核酸分子。56.—種基本如本文說明書所描述的載體。57.—種基本如本文說明書所描述的宿主細胞。58.—種基本如本文說明書所描述的產(chǎn)生多肽的方法。59.—種基本如本文說明書所描述的藥理組合物。60.—種基本如本文說明書所描述的多肽的用途。全文摘要本發(fā)明提供具有金黃色葡萄球菌趨化抑制蛋白(‘CHIPS’)生物活性的多肽，該多肽包含SEQIDNO1的氨基酸序列的變體。優(yōu)選地，該多肽為CHIPS變體，其中修飾了以下氨基酸中的一個或多個N31、S32、G33、L34、P35、K40、D42、R46、Y48、K50、G52、T53、K54、N55、S56、A57、Q58、K61、E67、K69、L76、N77、P79、D83、L90、K92、K100、K101、S104、K105、S107、Y108、N111和G112。在一個優(yōu)選實施方式中，該多肽在人體中相對于野生型CHIPS蛋白具有更低的免疫原性。本發(fā)明進一步提供制備及應(yīng)用這些變體CHIPS多肽的方法。文檔編號C07K14/31GK101472942SQ200780023183公開日2009年7月1日申請日期2007年4月20日優(yōu)先權(quán)日2006年4月20日發(fā)明者克里斯蒂娜·富雷布林,利納·舒爾茨,卡林·哈拉爾德森,埃里卡·古斯塔夫森,安娜·羅森,彼得勒斯·J·A·哈斯,科內(nèi)利斯·范凱塞爾,約翰尼斯·范斯特里杰普申請人:鱷魚生物科學公司