專利名稱：：齊考諾肽的固相合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬生物化學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種齊考諾肽的固相合成方法。
背景技術(shù)：
：齊考諾肽化學(xué)名L-半胱酰胺-L-賴氨酰-L-甘氨酰-L-賴氨酰-L-甘氨酰-L-丙氨酰-L-賴氨酰-L-半胱氨酰-L-絲氨酰-L-精氨酰-L-亮氨酰-L-蛋氨酰-L-酪氨酰-L-天冬氨酰-L-半胱氨酰-L-半胱氨酰-L-蘇氨酰-L-甘氨酰-L-絲氨酰-L-半胱氨酰-L-精氨酰-L-絲氨酰-L-甘氨酰-L-賴氨酰-L-半胱氨酰胺(1—16)(8—20)(15—25)三環(huán)二硫化物?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)式為分子式C1Q2H172N36032S7分子量2639.13齊考諾肽系從南太平洋海洋蝸牛Conusmagus提取的包含25個(gè)氨基酸、3個(gè)二硫鍵肽類毒素合成物?？蛇x擇性作用于樹突和軸突終末支N型電敏鈣通道，從而抑制最初的傷害刺激傳入。一系列的臨床實(shí)驗(yàn)己經(jīng)證明鞘內(nèi)注射齊考諾肽可以治療帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛、幻肢痛、HIV相關(guān)神經(jīng)病理性疼痛、難治性癌痛、手術(shù)后疼痛。其鞘內(nèi)注射較嗎啡更具潛力而不必?fù)?dān)心藥物的耐受及成癮性。目前多對(duì)二硫鍵多肽的合成方法，一類是基于生物提取技術(shù)，另外一類是使用單一的半胱氨酸保護(hù)基，脫除后再通過低溫下控制其在自然條件下反應(yīng)組構(gòu)成環(huán)。生物提取受到現(xiàn)有有限生物資源的影響，提取過程較繁瑣，效率低，且比較難得到高純度的產(chǎn)物；低溫自然成環(huán)反應(yīng)屬于熱力學(xué)控制，環(huán)化過程慢，過程控制較復(fù)雜，反應(yīng)收率低。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是提供一種過程簡單、效率高、收率高的齊考諾肽的固相合成方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種齊考諾肽的固相合成方法，所述方法包括如下順序步驟-(1)以Fmoc-RinkAmide-MBHA樹脂為固相載體，進(jìn)行程序反應(yīng)，依次進(jìn)行縮合反應(yīng)連接25個(gè)保護(hù)基氨基酸，得到25個(gè)氨基酸的線性肽全保護(hù)樹脂；其中，形成二硫鍵的三組Cys(1—16、8—20、15—25)中，同組的Cys同時(shí)連接Trt、Acm或Mob保護(hù)基中的一種，且不同組的Cys所連接保護(hù)基各不相同；，(2)依次脫除3組Cys的保護(hù)基、并進(jìn)行環(huán)化反應(yīng)形成二硫環(huán)鍵，脫除側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)并切割樹脂，得到含有3個(gè)二硫環(huán)的齊考諾肽。本發(fā)明針對(duì)多對(duì)二硫鍵多肽的特點(diǎn)，結(jié)合半胱氨酸側(cè)鏈巰基的化學(xué)反應(yīng)特性，通過使用多種的不同保護(hù)強(qiáng)度的巰基暫時(shí)性保護(hù)基，來依次脫除，依次成環(huán)，這樣可以將環(huán)化過程由熱力學(xué)控制改為動(dòng)力學(xué)控制方法，提高環(huán)化速度，反應(yīng)效率，并且得到較滿意的收率。所接入的其他氨基酸的保護(hù)基，可根據(jù)嘗試設(shè)計(jì)。所述及的Fmoc-RinkAmide-AM樹脂的化學(xué)結(jié)構(gòu)為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>可采用市售產(chǎn)品，如可采用天津南開和成科技公司生產(chǎn)的規(guī)格為SUbst.0.5mmol/g，DVB:l%,Mesh100~200的Fmoc-RinkAmide-AM樹脂。具體的，所述方法包括如下順序步驟(1)以Fmoc-RinkAmide-MBHA樹脂為固相載體，進(jìn)行程序反應(yīng)，依次連接以下保護(hù)基Fmoc-Cys(Mob)-OH，F(xiàn)moc陽Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Gly畫OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)畫OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Cys(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Cys(Acm)-OH，F(xiàn)moc畫Cys(Mob)畫OH，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Tyr(tBu)-OH，F(xiàn)moc隱Met-OH，F(xiàn)moc匿Leu誦OH，F(xiàn)moce-Arg(Pbf)誦OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Cys(Trt)陽OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Cys(Acm)-OH,得到H2N-Cys(Acm)-Lys(Boc)-Gly-Lys(Boc)-Gly-Ala-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Leu-Met畫Tyr(tBu)-Asp(OtBu)-Cys(Mob)-Cys(Acm)-Thr(tBu)-Gly-Ser(tBu)陽Cys(Trt)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Mob)-NH-RinkAmideAM樹脂；其中Fmoc=莉甲氧羰基，丁《=三苯甲基，Acm-乙酰胺甲基，Mob-對(duì)甲氧基芐基，tBi^叔丁基，Boc—叔丁氧羰基，Mtr=4-甲氧基-2,3，6-三甲基芐基磺?；琍bf=2,2,4,6,7-五甲二氫苯并呋哺-5-磺?；?；(2)脫除Cys(Trt)的Trt保護(hù)基，得到H2N-Cys(Acm)-Lys(Boc)-Gly-Lys(Boc)-Gly-Ala-Lys(Boc)-Cys(H)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Leu-Met-Tyr(tBu)-Asp(OtBu)-Cys(Mob)-Cys(Acm)-Thr(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Cys(H)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Mob)-NH-RinkAmideAM樹脂，再進(jìn)行第一次環(huán)化反應(yīng)，得到一環(huán)肽樹脂H2N-Cys(Acm)-Lys(Boc)-Gly-Lys(Boc)-Gly-Ala-Lys(Boc)-Cys-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Leu-Met-Tyr(tBu)-Asp(OtBu)-Cys(Mob)-Cys(Acm)-Thr(tIBu)-Gly-Ser(舊u)-Cys-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Gly-Lys(已oc)-Cys(Mob)-NH-RinkAmideAM樹脂(3)脫除Cys(Acm)的Acm保護(hù)基、同時(shí)進(jìn)行第二次環(huán)化反應(yīng)，得到二環(huán)肽匕曰sH2N-Cys-Lys(Boc)-Gly-Lys(Boc)-Gly-Ala-Lys(Boc)-Cys-Ser(tI!Bu)-Arg(Pbf)-Leu-Met-Tyr(舊u)-Asp(OtBu)-Cys(Mob)-Cys-Thr(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Cys-Arg(Pbf)-Ser(舊u)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Mob)-NH-RinkAmideAM(4)脫除Cys(Mob)的Mob保護(hù)基和剩余側(cè)鏈保護(hù)基，并切割樹脂，得到二環(huán)肽IIH2N-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys-Thri-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2(5)進(jìn)行第三次環(huán)化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)C,8填料的反相高效液相色譜柱純化，洗脫、濃縮、干燥，得到所述齊考諾肽IIH2N陽Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys陽Cys陽Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2步驟(2)中脫除Trt保護(hù)基反應(yīng)條件為1%的TFA(三氟醋酸)/DCM(二氯甲烷)溶液中、室溫反應(yīng)20分鐘。步驟(2)中環(huán)化反應(yīng)條件為水、乙腈、DMS0體積比15:10:1的混合溶液中，pH8，室溫反應(yīng)4小時(shí)。步驟(3)的反應(yīng)條件為碘濃度為0.4mmol/ml的碘/甲醇溶液中，室溫反應(yīng)1~2小時(shí)。步驟(4)的反應(yīng)條件為三氟醋酸、三氟甲磺酸、硫代苯甲醚、乙二硫醇體積比80:8:8:4的混合溶液中，室溫反應(yīng)3小時(shí)。步驟(5)的反應(yīng)條件為二環(huán)肽溶于水中，調(diào)pH8，雙氧水存在下，室溫反應(yīng)1小時(shí)。(6)如權(quán)利要求1或2所述的齊考諾肽的固相合成方法，其特征在于所述程序反應(yīng)步驟如下先用20。/。的哌啶/DMF溶液室溫處理脫去Fmoc-保護(hù)基；再加入15當(dāng)量的Fmoc-保護(hù)氨基酸、1~5當(dāng)量的HOBt和15當(dāng)量的N，N-二異丙基碳二亞胺，攪拌，室溫反應(yīng)25小時(shí)，連接Fmoc-保護(hù)氨基酸；所迷HOBt用二氯甲垸或二氯甲垸與N,N-二甲基甲酰胺的混合溶液溶解后加入。(7)如權(quán)利要求1或2所述的齊考諾肽的固相合成方法，其特征在于所述程序反應(yīng)步驟如下①洗滌用二氯甲烷和乙醇交替洗滌23次，二氯甲烷用量為5~7mL/g樹脂，乙醇用量為57mL/g樹脂；②脫保護(hù)基用20。/。的哌啶/DMF溶液室溫下處理23次，每次20min，脫去Fmoc-保護(hù)基；③洗滌用二氯甲烷和乙醇交替洗滌2~3次，二氯甲垸用量為57mL/g樹脂，乙醇用量為57mL/g樹脂；④連接保護(hù)基加入1~5當(dāng)量的Fmoc-保護(hù)氨基酸，15當(dāng)量的HOBt，所述HOBt用二氯甲烷或二氯甲烷與N,N-二甲基甲酰胺的混合溶液溶解，然后加入l5當(dāng)量的N，N-二異丙基碳二亞胺，攪拌，室溫反應(yīng)25小時(shí)；洗滌用二氯甲烷和乙醇交替洗滌2~3次，二氯甲烷用量為57mL/g樹脂，乙醇用量為57mL/g樹脂。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在副產(chǎn)物少，定向效率高、方法簡便，有利于產(chǎn)品純化，產(chǎn)物收率高。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例l:齊考諾肽線形肽樹脂的制備操作(1)將Fmoc-RinkAmide-AM樹脂50g(25mmo1)放于多肽合成反應(yīng)器中，用二氯甲烷、乙醇各300ml交替洗2次，2分鐘/次，抽干。加入20%")的哌啶/DMF溶液500ml，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)20分鐘，抽干。樹脂用二氯甲垸、乙醇300ml交替洗3次，2分鐘/次，抽干。(2)將Fmoc保護(hù)氨基酸及HOBt16.9g用500ml二氯甲垸/DMF(體積比1:1)溶液溶解后，加入樹脂中，再滴加N,N-二異丙基碳二亞胺19ml，滴畢后室溫?cái)嚢?小時(shí)。(3)抽干。樹脂用二氯甲垸、乙醇各300ml交替洗3次，每次2分鐘，抽干。(4)重復(fù)步驟(1)(3)至偶聯(lián)完畢所有的氨基酸。(5)甲醇洗滌樹脂后干燥得齊考諾肽線形肽樹脂135.8g，收率72%。氨基酸用量如表l:表l:各氨基酸用量<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實(shí)施例2:齊考諾肽一環(huán)肽樹脂的制備操作將實(shí)施例1制得齊考諾肽線形肽樹脂加入至2000ml圓底燒瓶中，加入1%(v/v)三氟醋酸/二氯甲浣溶液1300ml，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)20分鐘，過濾，用二氯甲垸，甲醇交替洗滌樹脂后，加入1200ml水/乙腈(體積比6:4)和DMSO(二甲基亞砜)48ml，用稀氨水調(diào)節(jié)pH8,室溫下攪拌反應(yīng)4小時(shí)。得到齊考諾肽一環(huán)肽樹脂。實(shí)施例3:齊考諾肽二環(huán)肽樹脂的制備操作將實(shí)施例2制得齊考諾肽一環(huán)肽樹脂加入至2000ml圓底燒瓶中，加入碘/甲醇溶液1300ml(128g碘溶于1300ml甲醇中)，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2小時(shí)，過濾，用DMF(N,N-二甲基甲酰胺)，甲醇，1M的抗壞血酸DMF溶液交替洗滌樹脂，千燥得到齊考諾肽二環(huán)肽樹脂126.1g。實(shí)施例4:齊考諾肽二環(huán)粗肽的制備操作齊考諾肽二環(huán)肽樹脂126.1g加入到2000ml圓底燒瓶中，量取苯甲硫醚96ml、乙二硫醇48ml，加入樹脂中，冰水浴攪拌下加入三氟醋酸960ml，反應(yīng)10分鐘后，緩慢滴加96ml三氟甲磺酸，滴加完畢后室溫反應(yīng)3小時(shí)，過濾，濾除樹脂，用60ml三氟醋酸洗滌樹脂，濾液濃縮后，加入10L冷乙醚，即析出大量的白色固體，過濾，收集白色固體，干燥,得齊考諾肽二環(huán)粗肽43.2§。收率65.5%。實(shí)施例5:齊考諾肽三環(huán)肽粗品的制備將齊考諾肽二環(huán)粗肽溶于25L水制備成lmmol/L的稀溶液，用稀氨水調(diào)節(jié)pH至8，緩慢滴加30。/。(m/m)的過氧化氫水溶液(雙氧水)50ml，滴加完畢后，室溫反應(yīng)1小時(shí)，得到齊考諾肽三環(huán)肽粗品的水溶液。實(shí)施例6齊考諾肽粗制品純化裝置Q8制備柱(100x800mm)洗脫液A:0.1%(v/v)TFA/H20洗脫液B:乙腈流速200ml/min紫外檢測波長230nm操作(1)齊考諾肽三環(huán)肽粗品的水溶液用0.45pm微孔濾膜過濾；(2)濾液直接上樣；(3)18~23%(v/v)乙腈-水流動(dòng)相梯度洗脫；(4)收集目的肽餾分；(5)濃縮，冷凍干燥；(6)得齊考諾肽白色固體28.4g。產(chǎn)物經(jīng)MS質(zhì)譜確認(rèn)，總收率43%。權(quán)利要求1、一種齊考諾肽的固相合成方法，其特征在于所述方法包括如下順序步驟(1).以Fmoc-RinkAmide-MBHA樹脂為固相載體，進(jìn)行程序反應(yīng)，依次進(jìn)行縮合反應(yīng)連接25個(gè)保護(hù)基氨基酸，得到25個(gè)氨基酸的線性肽全保護(hù)樹脂；其中，形成二硫鍵的三組Cys中，同組的Cys同時(shí)連接Trt、Acm或Mob保護(hù)基中的一種，且不同組的Cys所連接保護(hù)基各不相同；(2).依次脫除3組Cys的保護(hù)基、并進(jìn)行環(huán)化反應(yīng)形成二硫環(huán)鍵，脫除側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)并切割樹脂，得到含有3個(gè)二硫環(huán)的齊考諾肽。2、如權(quán)利要求l所述的齊考諾肽的固相合成方法，其特征在于所述方法包括如下順序步驟(1).以Fmoc-RinkAmide-MBHA樹脂為固相載體，進(jìn)行程序反應(yīng)，依次連接以下保護(hù)基Fmoc-Cys(Mob)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Cys(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Cys(Acm)-OH，F(xiàn)moc-Cys(Mob)-OH，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Tyr(tBu)畫OH，F(xiàn)moc-Met-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moce-Arg(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Cys(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)畫OH，F(xiàn)moc-Gly-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Cys(Acm)-OH，得到H2N-Cys(Acm)-Lys(Boc)畫Gly-Lys(Boc)畫Gly-Ala-Lys(Boc)-Cys(Trt)畫Ser(tBu)-Arg(Pbf)匿Leu-Met匿Tyr(tBu)-Asp(OtBu)-Cys(Mob)-Cys(Acm)-Thr(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Cys(Trt)畫Arg(Pbf)-Ser(tBu)畫Gly-Lys(Boc)-Cys(Mob)-NH-RinkAmideAM樹脂；(2).脫除Cys(Trt)的Trt保護(hù)基，進(jìn)行第一次環(huán)化反應(yīng)，得到一環(huán)肽樹脂;(3).脫除Cys(Acm)的Acm保護(hù)基、同時(shí)進(jìn)行第二次環(huán)化反應(yīng)，得到二環(huán)肽樹脂；(4).脫除Cys(Mob)的Mob保護(hù)基和剩余側(cè)鏈保護(hù)基，并切割樹脂，得到二環(huán)肽；(5).進(jìn)行第三次環(huán)化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)C18填料的反相高效液相色譜柱純化，洗脫、濃縮、干燥，得到所述齊考諾肽。3、如權(quán)利要求2所述的齊考諾肽的固相合成方法，其特征在于步驟(2)中脫除Trt保護(hù)基反應(yīng)條件為1%的TFA/DCM溶液中、室溫反應(yīng)20分鐘。4、如權(quán)利要求2所述的齊考諾肽的固相合成方法，其特征在于步驟(2)中環(huán)化反應(yīng)條件為水、乙腈、DMS0體積比15:10:l的混合溶液中，pH8，室溫反應(yīng)4小時(shí)。5、如權(quán)利要求2所述的齊考諾肽的固相合成方法，其特征在于步驟(3)的反應(yīng)條件為碘濃度為0.4mmol/ml的碘/甲醇溶液中，室溫反應(yīng)1~2小時(shí)。6、如權(quán)利要求2所述的齊考諾肽的固相合成方法，其特征在于步驟(4)的反應(yīng)條件為三氟醋酸、三氟甲磺酸、硫代苯甲醚、乙二硫醇體積比80:8:8:4的混合溶液中，室溫反應(yīng)3小時(shí)。7、如權(quán)利要求2所述的齊考諾肽的固相合成方法，其特征在于步驟(5)的反應(yīng)條件為二環(huán)肽溶于水中，調(diào)pH8，雙氧水存在下，室溫反應(yīng)l小時(shí)。8、如權(quán)利要求1或2所述的齊考諾肽的固相合成方法，其特征在于所述程序反應(yīng)步驟如下先用20Q/。的哌啶/DMF溶液室溫處理脫去Fmoc-保護(hù)基；再加入1~5當(dāng)量的Fmoc-保護(hù)氨基酸、15當(dāng)量的HOBt和15當(dāng)量的N,N-二異丙基碳二亞胺，攪拌，室溫反應(yīng)25小時(shí)，連接Fmoc-保護(hù)氨基酸；所述HOBt用二氯甲烷或二氯甲垸與N,N-二甲基甲酰胺的混合溶液溶解后加入。9、如權(quán)利要求1或2所述的齊考諾肽的固相合成方法，其特征在于所述程序反應(yīng)步驟如下①洗滌用二氯甲烷和乙醇交替洗滌23次，二氯甲烷用量為57mL/g樹②脫保護(hù)基用20。/。的哌啶/DMF溶液室溫下處理23次，每次20min，脫去Fmoc-保護(hù)基；③洗滌用二氯甲烷和乙醇交替洗滌23次，二氯甲烷用量為57mL/g樹脂，乙醇用量為57mL/g樹脂；④連接保護(hù)基加入1~5當(dāng)量的Fmoc-保護(hù)氨基酸，15當(dāng)量的H0Bt，所述HOBt用二氯甲烷或二氯甲烷與N,N-二甲基甲酰胺的混合溶液溶解，然后加入15當(dāng)量的N,N-二異丙基碳二亞胺，攪拌，室溫反應(yīng)25小時(shí)；⑤洗滌用二氯甲烷和乙醇交替洗滌23次，二氯甲烷用量為57mL/g樹脂，乙醇用量為57mL/g樹脂。全文摘要本發(fā)明涉及一種齊考諾肽的固相合成方法，所述方法包括如下順序步驟以Fmoc-RinkAmide-MBHA樹脂為固相載體，進(jìn)行程序反應(yīng)，依次進(jìn)行縮合反應(yīng)連接25個(gè)保護(hù)基氨基酸，得到25個(gè)氨基酸的線性肽全保護(hù)樹脂；其中，形成二硫鍵的三組Cys中，同組的Cys同時(shí)連接Trt、Acm或Mob保護(hù)基中的一種，且不同組的Cys所連接保護(hù)基各不相同；依次脫除3組Cys的保護(hù)基、并進(jìn)行環(huán)化反應(yīng)形成二硫環(huán)鍵，脫除側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)并切割樹脂，得到含有3個(gè)二硫環(huán)的齊考諾肽。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在副產(chǎn)物少，定向效率高、方法簡便，有利于產(chǎn)品純化，產(chǎn)物收率高。文檔編號(hào)C07K1/00GK101412752SQ200710301598公開日2009年4月22日申請(qǐng)日期2007年12月26日優(yōu)先權(quán)日2007年12月26日發(fā)明者李新宇,楊路申請(qǐng)人:杭州諾泰制藥技術(shù)有限公司