專利名稱：高細胞毒性靶向融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物基因工程中的導(dǎo)向融合蛋白領(lǐng)域，目前癌癥仍然是死亡率位居第二的疾 病，目前人們還沒有特別有效的手段來進行治療，化療仍然是目前最常用的治療方法，雖然 有一定的療效，但是其副作用大，治療效果只有部分理想，治療時容易產(chǎn)生耐藥林細胞等缺 點影響了這種方法的療效和有效率。
導(dǎo)向治療是一種有望代替化療的新的治療手段，有多篇文獻和專利(中國專利應(yīng)用 嵌合毒素診斷癌癥的方法，99806580.3;中國專利 一種能特異殺死腫瘤細胞的基因工程重 組蛋白，03137587.1;中國專利高效低毒的系列功能蛋白，200410033621. 6 )報道了關(guān)于 使用人促黃體激素釋放因子(GnRH)及其衍生物與假單胞桿菌外毒素A (PE)構(gòu)建乾向融合 蛋白，可以用于腫瘤的乾向治療；另有文獻(Mol Microbiol. 1999 Mar; 31 (5): 1385-93. A deletion within the translocation domain of Pseudomonas exotoxin A enhances translocation efficiency and cytotoxicity concomitantly)報道了將 PE 毒素的 359-365位氨基酸缺失后，PE毒素的活性會大幅度提高；還有文獻(US Patent 5602095, Recombinant pseudomonas exotoxin with increased activity)報道將PE末端5個#^ 酸REDLK突變?yōu)镵DEL后，PE的活性也會大幅度提高?；诖瞬⒔Y(jié)合蛋白質(zhì)三維分析，本發(fā) 明為了得到活性更高的靶向融合蛋白，針對靶向融合蛋白GnRH-PE40 ( SEQ ID NO: 1)進行了 如下改構(gòu)
1將PE40的359-365位氨基酸進行了缺失(即為PE39 )。
2將PE39的末端5個氨基酸REDLK突變?yōu)镵DEL (即為PE39KDEL )。
最終我們得到了高活性的靶向融合蛋白GnRH-PE39KDEL，在腫瘤治療方舒有很高的應(yīng)用 價值。二.
背景技術(shù)：
目前癌癥的治療仍然是一個難題，人們應(yīng)用的主要的治療手段仍然是手術(shù)，放療和化療， 傳統(tǒng)的治療法在帶來療效的同時，副作用也往往很大，并且對于復(fù)發(fā)的腫瘤治療效果更加有 限。傳統(tǒng)的療法的缺點主要在于其在殺死腫瘤細胞的同時也大量地殺死了正常細胞，導(dǎo)向治 療的出現(xiàn)使我們有可能對腫瘤細胞實現(xiàn)導(dǎo)向治療，即藥品分子可以導(dǎo)向地到達腫瘤細胞并發(fā) 揮作用，達到導(dǎo)向治療的效果。目前免疫毒素或?qū)蚨舅厥沁_到導(dǎo)向治療的一個重要的發(fā)展 方向，通過特異性抗體或細胞因子、激素等與毒素連接，前者作為導(dǎo)向部分，即配體，可以 引導(dǎo)分子到達腫瘤部位并與腫瘤細胞表面的過量表達的該種受體結(jié)合，后者作為毒素部分， 即殺滅腫瘤細胞的部分。目前以GnRH或其衍生物為導(dǎo)向部分，以PE毒素的截短形式PE40 及PE40衍生物為毒素部分的靶向治療劑已經(jīng)有報道(中國專利應(yīng)用嵌合毒素診斷癌癥的 方法，99806580.3;中國專利 一種能特異殺死腫瘤細胞的基因工程重組蛋白，03137587. 1; 中國專利高效低毒的系列功能蛋白，20(M10033621. 6 )，這些融合蛋白的靶向型已得到廣 泛驗證，能特異性地識別目的細胞并將其殺死，但目前在應(yīng)用中還存在一個很大的問題，那 就是由于實體瘤的結(jié)構(gòu)問題，目前的靶向毒性蛋白中PE衍生物對于動物模型中生長旺盛的 實體瘤起效不大，于是如何增強靶向毒性蛋白中PE部分的細胞毒性就成了一個急待解決的 問題。
三.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種GnRH-PE衍生物，為了進一步提高靶向融合蛋白的生物活性，增強其對 生長旺盛的腫瘤細胞的殺傷力，從而更好地將靶向融合蛋白應(yīng)用于治療領(lǐng)域，本發(fā)明人通過 對已知GnRH-PE融合蛋白進行蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)分析，結(jié)合文獻，采用基因工程方法對所述融 合蛋白的毒素部分進行缺失和突變，通過大量的篩選，獲得了在活性方面明顯優(yōu)于現(xiàn)有 GnRH-PE衍生物的新的GnRH-PE衍生物。
本發(fā)明中的GnRH-PE衍生物包括將PE40的359-365位氨基酸進行了缺失(即為PE39)，并
將PE40的末端5個氨基酸REDLK突變?yōu)镵DEL，最終我們得到了高活性的靶向融合蛋白
4GnRH-PE39KDEL。
通過上述發(fā)明得到的靶向融合蛋白具有高活性的特點，對腫瘤細胞具有很強的特異性殺 傷作用，是潛在的肺瘤治療藥物。
本發(fā)明的一個方面，涉及一種GnRH-PE衍生物GnRH-PE39KDEL,為SEQ ID NO: 2所示的 氨基餅列。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知曉，所述上述融合蛋白可以通過基因重組表達的方法或者化學(xué)合 成的方法制備。在本發(fā)明中，所述的GnRH-PE39KDEL是通過基因工程重組表達的方法獲得的。 在本發(fā)明的一個實施方案中，通過如下方法獲得GnRH-PE39KDEL,包括如下步驟
1) 表達載體的構(gòu)建
依據(jù)已知氨基酸序列(SEQ ID N0:1)，選用大腸桿菌偏好密碼子全基因合成基因序列， 同時在相應(yīng)于所編碼的氨基酸序列之N末端和C末端加上限制性酶切位點。
應(yīng)用PCR的方法對SEQ ID NO: 1的基因序列進行操作，達到將PE40的359-365位氨基酸 進行了缺失(即為PE39 ),并將PE40的末端5個氨基酸REDLK突變?yōu)镵DEL的目的，得到編 碼SEQ ID NO: 2的融合蛋白的核酸序列。
將如上述制備的GnRH-PE衍生物基因序列以及篩選質(zhì)粒pBSK用限制性內(nèi)切酶處理好，經(jīng) 計算各樣品濃度后按一定摩爾比加入T4連接體系。經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選成功的重組子。
用限制性酶切下融合蛋白基因，再將該基因與用限制性酶處理好的NOVAGEN公司質(zhì)粒 pET21b連接，經(jīng)篩選得到正確地重組子。
2) 重組耙向融合蛋白的表達及分離純化
將如上述所得重組子轉(zhuǎn)化到表達宿主菌，經(jīng)表達篩選出高表達基因工程菌，然后經(jīng)發(fā)酵， 得到目的蛋白高表達的工程菌。使用滲透壓方法破碎細菌，然后經(jīng)過離心、澄清的步驟，通 過一系列常用的層析方法，如離子交換，凝膠過濾和疏水層析等，純化最終得到純度大于95% 的目的蛋白。
3) 目的蛋白生物活性的測定用MTT法，首先對Hela細胞進行消化和收集，將細胞用RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋成6-8 x 104個/毫升的細胞懸液，接種于M孔板，lOOul/孔，"度培養(yǎng) 4小時。對照加入lOOul培養(yǎng)液。樣品先用RPMI 1M0培養(yǎng)液稀釋成100ul/mL,作為起始孔， 然后按每孔與上孔2. 5倍的關(guān)系稀釋樣品，各加入稀釋的樣品每孔lOOul, 37度，培養(yǎng)24
5小時，取出，用MTT法染色，用酶標儀570nm進行測定并計算IC50值。
本發(fā)明的另一方面，涉及一種藥物組合物，其含有本發(fā)明所述的GnRH-PE39KDEL,以及 任選的藥物上可接受的載體。
在本發(fā)明知，術(shù)語"藥物上可接受的"意味著制藥領(lǐng)域公認的可用于動物，更特別的 是可用于人的。術(shù)語"栽體"指稀釋劑、佐劑(例如(完全或不完全)弗氏佐劑)、賦形劑、 或用于容納或施用治療劑的介質(zhì)。
這些藥用栽體可以是無菌液體，諸如水和油，包括源自石油、動物、植物、或合成的 油，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油、諸如此類。靜脈內(nèi)施用藥用組合物時，水是優(yōu) 選的載體。鹽水溶液以及水性右旋糖和甘油溶液也可用作液態(tài)載體，特別是用于可注射溶液。 合適的藥用賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、面粉、白堊、硅膠、 硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油、滑石、氯化鈉、奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇、諸如此 類。如果需要，組合物還可以包含較少數(shù)量的潤濕或乳化劑如透明質(zhì)酸鈉，或是pH緩沖劑。 這些組合物可以采取溶液、懸浮液、乳狀液、片劑、丸劑、膠嚢粉劑、緩釋配方、諸如此類 的形式。
在本發(fā)明的一個實施方案中，所述藥物組合物為凍干注射劑形式，其中含有0. 01°/廣0. 2% 的GnRH-PE39KDEL,以及5%的甘露醇，以及藥物上可接受的載體。
將本發(fā)明的藥用組合物配制成與其意向施用路徑相容。施用路徑的實例包括但不限于 腸胃外，例如靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、口腔、鼻內(nèi)(例如吸入)、經(jīng)皮(例如局部)、經(jīng)粘膜、 和直腸施用。在一個具體實施方案中，依照常規(guī)流程將組合物配制成適合靜脈內(nèi)、皮下、肌 肉內(nèi)、口腔、鼻內(nèi)、或局部施用于人類的藥用組合物。通常，用于靜脈內(nèi)施用的組合物是無 菌等滲水性緩沖液中的溶液。如果需要，組合物還可以包含增溶劑和局部麻醉劑諸如麥角胺 以減輕注射部位的疼痛。
若要局部施用本發(fā)明的組合物，則可以將組合物配制成軟膏、乳膏、皮膚貼、洗劑、 凝膠、洗發(fā)劑、噴霧劑、氣霧劑、溶液、乳液的形式或是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的其它形 式。參閱例如《雷明頓氏藥物科學(xué)和藥物劑型導(dǎo)論》(Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms), 第19版，Mack出版公司，伊斯頓， 賓夕法尼亞，1995年。 -
對于非可噴霧局部劑量形式，通常采用包含與局部應(yīng)用相容的載體或一種或多種賦形 劑且具有優(yōu)選大于水的動態(tài)粘滯度的粘性至半固體或固體形式。合適的配方包括但不限于溶液、懸浮液、乳狀液、乳膏、軟膏、粉劑、搽劑、藥膏、諸如此類，如果需要，是無菌的或 與輔助試劑(例如防腐劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑緩沖劑、或鹽)混和以改變各種特性，諸如例如 滲透壓。其它合適的局部劑量形式包括可噴霧氣霧劑制劑，其中優(yōu)選聯(lián)合固相或液相惰性栽 體的活性成分包裝在含有增壓揮發(fā)物(例如壓縮氣體，諸如氟利昂)的混合物或是擠瓶中。 如果需要，還可以向藥物組合物和劑量形式中添加增濕劑或濕潤劑。這些額外成分的實例在 本領(lǐng)域是眾所周知的。
在本發(fā)明的又一實施方案中，所述藥物組合物為軟膏形式，其中含有0. 01°/ -0. 2%的 GnRH-PE39KDEL,和藥物上可接受的賦形劑如凡士林。
若本發(fā)明的方法包括組合物的鼻內(nèi)施用，則組合物可以配制成氣霧劑、噴霧劑、輕霧 劑、或滴劑的形式。具體而言，依照本發(fā)明使用的預(yù)防性或治療性試劑可以使用合適的推進 劑(例如二氯二氟曱烷、三氯單氟曱烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳、或其它合適其它)以氣 霧劑噴霧呈現(xiàn)的形式由增壓包裝或噴霧器進行方便的投遞。在增壓氣霧劑的情況中，可以通 過提供閥門來確定劑量單位，以投遞計量數(shù)量。吸入器或吹入器中所使用的膠嚢和藥筒(由 例如明膠構(gòu)成)可以配制成含有化合物及合適粉末基質(zhì)諸如乳糖或淀粉的粉末混合物。
本發(fā)明的方法還包括配制用于通過注射(例如通過推注或連續(xù)輸液)腸胃外施用的組 合物的施用。用于注射的配方可以以含有額外防腐劑的單位劑量形式(例如在安瓿中或在多 劑量容器中)存在。組合物可以采取諸如油性或水性介質(zhì)中的懸浮液、溶液、或乳狀液等形 式，而且可以含有配制劑，諸如懸浮劑、穩(wěn)定劑、和/或分散劑。或者，活性成分可以是粉 末形式，在使用前用合適介質(zhì)(例如無菌、無熱原水)溶解。
可用于提供本發(fā)明腸胃外劑量形式的合適介質(zhì)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是眾所周知 的。在某些實施方案中，適于腸胃外劑量形式的介質(zhì)包括但不限于注射用水USP;水性介質(zhì) 包括但不限于氯化鈉注射液、Ringer氏注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化鈉注射液、以 及乳酸化Ringer氏注射液；水易混介質(zhì)包括但不限于乙醇、聚乙二醇、和聚丙二醇；以及 非水性介質(zhì)包括但不限于玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸異丙酯、 和苯曱酸苯曱酯。
本發(fā)明的再一方面，涉及GnRH-PE39KDEL用于制備治療腫瘤細胞表面表達GnRH受體的癌 癥患者的藥物的用途。
通過實驗證明，在通過模型動物實驗研究對腫瘤的體內(nèi)靶向性殺傷的活性方面，本發(fā)明 的GnRH-PE39KDEL具有明顯高于目前已知的GnRH-PE40KDEL ( SEQ ID NO: 3)與GnRH-PE39(SEQ ID NO: 4)活性的特點。
本發(fā)明人研究了 GnRH-PE39KDEL對體內(nèi)腫瘤殺傷的作用。將120只棵鼠接種上A549肺癌 細胞，從而得到肺癌棵小鼠模型。隔天注射GnRH-PE39KDEL共10次的棵鼠腫瘤塊減小最明 顯，抑瘤率最高，治療效果明顯優(yōu)于GnRH-PE39以及目前已知的GnRH-PE40KDEL。
上述結(jié)果表明，本發(fā)明的GnRH-PE39KDEL在治療腫瘤方面活性明顯高于GnRH-PE39以及 目前已知的GnRH-PE40KDEL。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知曉，施用的方式、頻率和劑量將根據(jù)所治療的病癥、病況和個體 的不同而異。 一般來說，可以通過注射(例如皮內(nèi)、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下)、局部施用(例如 表皮施用)或滴加施用(例如滴眼劑)等方式施用。也可以根據(jù)患者個體的不同選擇合理的 施用途徑和施用方案。合適的劑量為當施用上述的藥物組合物后能夠有效治療腫瘤細胞表面 表達GnRH受體的癌癥患者的量。
一般來說，對于含有本發(fā)明所述的含有GnRH-PE39KDEL的藥物組合物，存在于每一個劑 量中的量大約為100pg-5rag。合適的劑量的多少將因患者病癥以及給藥方式而異，但一般大 約范圍為0. 5mg-2mg，優(yōu)選lmg。
四.
具體實施例方式
下面的實例目的在于進一步闡述本發(fā)明，而不會構(gòu)成對本發(fā)明專利待批權(quán)利要求的限制。 實例一.
根據(jù)大腸桿菌偏愛密碼子的原則，通過全基因合成的方法結(jié)合PCR的方法合成出SEQ ID NO: l所對應(yīng)的基因序列，然后通過PCR突變?nèi)笔У姆椒ǖ玫絊EQ ID NO: 2-4所對應(yīng)的基 因序列。經(jīng)過測序mt后，將目的基因連接入表達載體，將驗證后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)入到宿 主菌中，經(jīng)過表達、發(fā)酵得到目的菌體，然后通過滲透壓法破菌后，離心取上清，通過疏 水層析和離子交換層析的方法純化得到純度大于95%的4種靶向融合蛋白純品，然后分別 同時進行細胞活性試驗和體內(nèi)藥效學(xué)試驗。
實例二.
取本發(fā)明中的靶向融合蛋白以及三種對照試驗融合蛋白進行細胞活性試驗用MTT法，
8首先對Hela細胞進行消化和收集，將細胞用RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋成6 - 8 x 104個/毫升的 細胞懸液，接種于96孔板，100u1/孔，37度培養(yǎng)4小時。對照加入100ul培養(yǎng)液。11種 樣品先用RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋成100ul/mL,作為起始孔，然后按每孔與上孔2. 5倍的關(guān)系 稀釋樣品，各加入稀釋的樣品每孔100ul， 37度，培養(yǎng)24小時，取出，用MTT法染色，用 酶標儀570nm進行測定并計算IC50值。活性測定的結(jié)果見下表，
-細胞IC50A549PC國3MCF-7
融 i^~~~~ s----(ug/mL)(ug/mL)(ug/mL)
GnRH-PE40 (SEQIDNO: 1)30.253.172.12
GnRH-PE40KDEL (SEQIDNO: 3)10.230.980.68
GnRH-PE39 (SEQIDNO: 4)8.660.860.69
GnRH-PE39KDEL (SEQIDNO: 2)1.080.120.14
實例三:
體內(nèi)的藥效試驗120只雄性BALB/C棵鼠(SPF級)接種上A549肺癌細胞，從而得到 肺癌棵小鼠模型。隨機分為12組，每組10只棵鼠，分別為生理鹽水組，GnRH-PE衍生物SEQ ID NO: 1-4組，接種后7天起，隔一天靜脈注射75ug/kg，共給藥10次，每4天測瘤塊的 長徑(a )、短徑(b )，根據(jù)公式V=ab2/2計算腫瘤體積(隨3),接種后27天處死動物，解剖 取瘤塊，稱瘤重，計算抑瘤率。
試驗結(jié)果:
融合蛋白抑瘤率
GnRH-PE40 (SEQ ID NO:)30.5%
GnRH-PE40KDEL (SEQ ID NO: 3)44.7%
GnRH-PE39 (SEQ ID NO: 4)56.80/o
GnRH-PE39KDEL (SEQ ID NO: 2)81.8%
結(jié)論從以上結(jié)果可以看出，本發(fā)明中GnRH-PE39KDEL的體外細胞活性、體內(nèi)抑瘤活性都顯 著高于目前已知的GnRH-PE衍生物GnRH-PE40KDEL (SEQ ID NO: 3)和GnRH-PE39，說明本 發(fā)明通過對扭向融合蛋白的缺失和突變增強了其生物活性和體內(nèi)抑瘤作用。
920
序列表
SEQ ID NO: 1
Met-Glu-His-Trp陽Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg墨Pro-Gly-His-Met-Ala-Glu-Glu-Gly-Gly-Ser-Leu-Ala-Ala-
Leu隱Thr-Ala-His-Gln-Ala-Cys-His-Leu-Pro-Leu-Glu-Thr-Phe-Thr-Arg-His-Arg-Gln-Pro-Arg-Gly-
Trp-Glu-Gln-Leu-Glu-Gln-Cys-Gly-Tyr-Pro-Val-Gln-Arg-Leu-Val-Ala-Leu-Tyr-Leu-Ala-Ala-Arg-
Leu-Ser-Trp-Asn-Gln-Val-Asp-Gln-Val-Ile-Arg-Asn-Ala-Leu-Ala-Ser陽Pro-Gly-Ser-Gly-Gly-Asp-
Leu-Gly-Glu-AIa-Ile-Arg-Glu-Gln-Pro-Glu-Gln-Ala-Arg-Leu-Ala-Leu-Thr-Leu-Ala-Ala-Ala-Glu-
Ser-Glu-Arg-Phe-Val-Arg-Gln-Gly-Thr-Gly-Asn-Asp-Glu-Ala-Gly-Ala-Ala陽Asn-Ala國Asp-Val-Val-
Ser-Leu-Thr-Cys-Pro-Val-Ala-Ala-Gly-Glu-Cys-Ala-Gly-Pro-Ala-Asp-Ser-Gly-Asp-Ala-Leu-Leu-
Glu-Arg-Asn-Tyr-Pro-Thr-Gly-Ala-Glu-Phe陽Leu-Gly-Asp陽Gly-Gly-Asp陽Val-Ser陽Phe-Ser-Thr-Arg-
Gly-Thr-Gln-Asn-Trp-Thr-Val-Glu-Arg陽Leu-Leu-Gln-Ala-His-Arg-Gln陽Leu-Glu-Glu-Arg-Gly-Tyr-
Val-Phe-Val-GIy-Tyr-His-Gly-Thr-Phe-Leu-Glu-AIa-AIa-GIn國Ser-Ile-Val-Phe-Gly-Gly-VaI-Arg-
Ala-Arg-Ser-Gln-Asp-Leu-Asp-Ala-Ile-Trp-Arg-Gly-Phe-Tyr-Ile-Ala-Gly-Asp-Pro-Ala-Leu-Ala-
Tyr-Gly-Tyr-Ala-Gln陽Asp-Gln-Glu-Pro-Asp-Ala-Arg-Gly-Arg-Ile-Arg-Asn-Gly-Ala-Leu-Leu陽Arg國
Val-Tyr-Val-Pro-Arg-Ser-Ser-Leu-Pro-Gly-Phe-Tyr-Arg-Thr-Ser陽Leu-Thr-Leu-Ala-Ala-Pro-Glu-
Ala-Ala-Gly-Glu-Val-Glu-Arg-Leu-Ile-Gly-His-Pro-Leu-Pro-Leu-Arg-Leu-Asp-Ala-Ile-Thr-Gly-
Pro-Glu陽Glu-Glu-Gly-Gly-Arg-Leu-Glu-Thr陽Ile扁Leu-Gly-Trp-Pro-Leu-Ala-Glu-Arg-Thr-Val-Val-
Ile-Pro-Ser陽Ala-Ile-Pro-Thr-Asp-Pro-Arg-Asn-Val-Gly-Gly-Asp-Leu-Asp-Pro-Ser-Ser-Ile-Pro-Asp
-Lys-Glu-Gln-Ala-Ile-Ser-Ala-Leu-Pro-Asp-Tyr墨Ala-Ser-Gln-Pro-Gly-Lys-Pro-Pro-Arg-Glu陽Asp-
Ixu-Lys
SEQ ID NO: 2
Met-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly陽Leu-Arg陽Pro-Gly-His-Met-Ala-Glu-Glu-Gly-Gly-Ser陽Leu-Ala陽Ala-
Leu-Thr-Ala-His-Gln-Ala-Cys-His-Leu-Pro-Leu-Glu-Thr-Phe-Thr-Arg-His-Arg-Gln隱Pro-Arg-Gly-
Trp-Glu-Gln-Leu-Glu-Gln-Cys-Gly-Tyr-Pro-Val-Gln-Arg-Leu-Val-Ala-Leu-Tyr-Leu-Ala-Ala-Arg-
Leu陽Ser-Trp-Asn-Gln-Val-Asp-Gln-Val-Ile-Arg-Asn-Ala-Leu-Ala-Ser-Pro-Gly-Ser-Gly-Gly-Asp-
Leu-Gly-Glu-Ala陽Ile隱Arg-Glu-Gln-Pro-Glu-Gln-Ala-Arg-Leu-Ala陽Leu-Thr-Leu陽Ala國Ala-Ala-Glu國
Ser-Glu-Arg-Phe-Val-Arg-Gln-Gly-Thr-Gly-Asn-Asp-Asp-Val-Val-Ser-Leu-Thr陽Cys-Pro-Val-Ala國
Ala-Gly-Glu-Cys-Ala-Gly-Pro-Ala-Asp-Ser墨Gly-Asp-Ala-Leu-Leu-Glu-Arg-Asn-Tyr-Pro-Thr-Gly-
Ala-Glu-Phe-Leu陽Gly-Asp-Gly-Gly-Asp-Val扁Ser-Phe-Ser-Thr-Arg-Gly-Thr-Gln-Asn-Trp,-Thr-Val-
Glu-Arg-Leu隱Leu國Gln-Ala-His-Arg-Gln-Leu-Glu-Glu-Arg-Gly-Tyr-Val-Phe-Val-Gly-Tyr-His-Gly-
Thr-Phe-Leu-Glu-Ala-Ala隱Gln-Ser-Ile-Val-Phe-Gly-Gly-Val-Arg-Ala-Arg-Ser-Gln-Asp隱Leu-Asp-
Ala-Ile-Trp-Arg-Gly-Phe-Tyr-Ile-Ala-Gly-Asp-Pro-Ala-Leu-Ala-Tyr-Gly-Tyr-Ala陽Gln-Asp-Gln-
10Glu-pro-ASP-Ala-Arg-Gly-A.rg-Ile-A.rg-Asn-Gly-Ala-Leu-Leu-Arg-val-Tyr-val-pro-Arg-ser-ser-
Leu-pro-Gly-phe-Tyr-Arg-Thr-ser-Leu-Thr-Leu-Ala-Ala-pro-Glu-Ala-Ala-Gly-Glu-val-Glu-Arg-
Leu-Ile-Gly-His-pro-Leu-pro-Leu-Arg-Leu-ASP-Ala-Ile-ThT-Gly-pro-Glu,Glu-Glu-Gly-Gly-Arg-
Leu-Glu-Thr-Ile-Leu,Gly-Trp-pro-Leu-Ala-Glu-Arg-Thr-val-val-Ile-pro-ser-Ala-Ile-pro-Thr-ASP-
pro-Arg-Asn-val-Gly-Gly-ASP-Leu-ASP-pro-ser-ser-Il pro-ASP-Lys-Glu-Gln-Ala-Ile-ser-Ala-
Leu"pro-ASP-Tyr-A.la-ser-Gln-pro-Gly-Lys-pro-pro-Lys-ASP-Glu-Leu
SEQ ID NO: 3
Met-Glu-His-Trp-ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-pr Gly-His-Met-Ala-Glu-Glu-Gly-Gly-ser-Leu-Ala-Ala-
Leu-,ThT-Ala-His-Gln-Ala-門ys-His-Leu-pro-Leu-Glu-Thr-phe-,Thr-Arg-His-Arg-Gln-pro-Arg-Gly-
Trp-Glu-Gln-Leu-Glu-Gln-Cys-Gly-Tyr-Pro-Val-Gln-Arg-Leu-Val-Ala-Leu-Tyr-Leu-Ala-Ala-Arg-
Leu-ser,Trp-Asn-Gln-val-ASJ>Gln-val-Ile-Arg-Asn-Ala-Leu-Ala-Ser-Pro-Gly-Ser-Gly-Gly-Asp-
Leu-Gly-Glu-Ala-Ile-Arg-Glu-Gln-Pro-Glu-Gln-Ala-Arg-Leu-Ala-Leu-Thr-Leu-Ala-Ala-Ala-Glu-
ser-Glu-Arg-phe,val-Arg-Gln-Gly-Thr-Gly-Asn-ASP-Glu-Ala-Gly-Ala-Ala-Asn-Ala-ASP-val-val-
ser-Leu-Thr-cys-pro-val-Ala-Ala-Gly-Glu-cys-Ala-Gly-pro-Ala-ASP-ser-Gly-ASP-Ala-Leu-Leu-
Glu-Arg-Asn-Tyr-pro-Thr,Gly-Ala-Glu-phe-Leu-Gly-ASP-Gly-Gly-ASP-val-ser-phe-ser-Thr-Arg-
Gly-Thr-Gln-Asn-Ttp-Thr-val-Glu-Arg-Leu-Leu-Gln-Ala-His-Arg-Gln-Leu曙Glu-Glu曙Arg-Gly-Tyr-
val,phe-val-Gly-Tyr-His-Gly-Thr-phe-Leu-Glu-Ala-Ala-Gln-ser-Ile-val-phe-Gly-Gly-val-Arg-
A.la曙ATg-ser-Gln-ASP-Leu-ASJP-A.la-Ile-Trp-Arg-Gly-lphe-Tyr-Ile-Ala-Gly-ASP-pro-Ala-Leu-Ala-
Tyr-Gly-Tyr-Ala-Gln-ASP-Gln-Glu-pro-ASP-Ala-Arg-Gly-Arg-Ile-Arg-Asn-Gly-Ala-Leu-ILeu-Arg-
val-Tyr-val-pro-Arg-ser-ser-Leu-pro-Gly-phe-Tyr-Arg-Thr-ser-Leu-Thr-Leu-Ala-Ala-pro-Glu-
Ala-Ala-Gly-Glu-val-Glu-Arg-Leu-Ile-Gly-His-pro-Leu-pro-Leu-Arg-Leu-ASP-Ala-Ile-Thr-G一y-
pro-Glu-Glu-Glu-Gly-Gly-Arg-Leu-Glu-Thr-Ile-Leu-Gly-Ttp-pro-Leu-Ala-Glu-Arg-Thr-val-val-
Ile-pro-ser-Ala曙Ile-pro-Thr-ASPHPro-Arg-Asn-val-Gly-Gly-ASPTLeu-ASP-pro-ser-ser-Ile-pro-ASP
-Lys-Glu-Gln-Ala-Ile-ser—Ala-Leu-pro-ASP-Tyr-Ala-ser-Gln-pro-Gly-Lys-pro-pro-Lys-ASP-Glu-
Leu
SEQ ID NO: 4
Met-Glu-His-TTP-ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-pro-Gly-His-Met-Ala-Glu-Glu-Gly曙Gly-ser-Leu-Ala-Ala-
Leu-Thr-Ala-His-Gln-Ala-cys-His-Leu-pro-Leu-Glu-Thr-phe-Thr-Arg-His-Arg-Gln-pro-Arg-Gly-
Ttp-Glu-Gln-Leu-Glu-Gln-cys-Gly-Tyr-pro-val-Gln-Arg-Leu-val-Ala-Leu-Tyr-Leu曙Ala-Ala-Arg-
Leu-ser-Trp-Asn-Gln-val-ASP-Gln-val-Ile-Arg-Asn-Ala-Leu-Ala-ser-pro-Gly-ser-GlyMGly-ASP-
Leu-Gly-Glu-Ala-Ile-Arg-Glu-Gln-pro-Glu-Gln-Ala-Arg曙L(fēng)eu-Ala-Leu-Thr-Leu-Ala-Ala-Ala-Glu-
ser-Glu-Arg-phe-val-Arg-Gln-Gly-ThT-Gly-Asn-ASP-ASP-val-val-ser-Leu-Thr-cys-pro-val-Ala-Ala-Gly-Glu-Cys-Ala-Gly-Pro-Ala-Asp-Ser-Gly-Asp-Ala-Leu-Leu-Glu-Arg-Asn-Tyr-Pro-Thr-Gly-
Ala-Glu陽Phe-Leu-Gly-Asp-Gly陽Gly-Asp陽Val-Ser陽Phe-Ser陽Thr-Arg-Gly-Thr-Gln-Asn-Trp-Thr-Val-
Glu-Arg-Leu-Leu-Gln-Ala隱His-Arg-Gln-Leu-Glu-Glu-Arg-Gly陽Tyr-Val-Phe-Val-Gly-Tyr-His-Gly陽
Thr-Phe-Leu-Glu-Ala-Ala-Gln-Ser-Ile-Val-Phe-Gly-Gly-Val-Arg-Ala-Arg-Ser-Gln-Asp-Leu-Asp-
Ala-Ile-T卬-Arg-Gly-Phe-Tyr-Ile-Ala-Gly陽Asp-Pro-Ala-Leu-Ala-Tyr-Gly陽Tyr-Ala-Gln-Asp-Gln-
Glu-Pro-Asp-Ala-Arg-Gly-Arg-IIe-Arg-Asn-Gly-Ala-Leu-Leu-Arg-Val-Tyr-Val-Pro-Arg-Ser-Ser-
Leu-Pro-Gly-Phe-Tyr-Arg-Thr-Ser-Leu-Thr-Leu-Ala-Ala曙Pro-Glu墨Ala-Ala-Gly-Glu-Val-Glu陽Arg-
Leu-Ile-Gly-His-Pro-Leu-Pro-Leu-Arg-Leu-Asp-Ala-IIe-Thr-Gly-Pro-Glu-Glu-Glu-Gly-Gly-Arg-
Leu-Glu-Thr-Ile-Leu-Gly-Trp-Pro-Leu-Ala-Glu-Arg-Thr-Val-Val-Ile-Pro-Ser-Ala-Ile-Pro-Thr-Asp-
Pro-Arg-Asn-Val-Gly-Gly-Asp-Leu-Asp-Pro-Ser-Ser-Ile-Pro-Asp-Lys-Glu-Gln-Ala-Ile-Ser-Ala-
Leu-Pro-Asp-Tyr-Ala-Ser-Gln-Pro-Gly-Lys-Pro-Pro-Arg-Glu-Asp-Leu-Lys
權(quán)利要求
1. 一種由人促黃體生成激素釋放激素衍生物GnRH與假單胞桿菌外毒素A PE衍生物組成的融合蛋白GnRH-PE39KDEL，并以該融合蛋白為藥物的主要成分用于治療細胞表面過度表達GnRH受體的腫瘤疾病。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l，所說的融合蛋白的氨基^列為Met陽Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro隱Gly陽His-Met-Ala-Glu-Glu-Gly-Gly-Ser-Leu-Ala陽Ala-Leu陽Thr-Ala-His-Gln-Ala陽Cys-His國Leu-Pro-Leu-Glu-Thr-Phe-Thr-Arg-His-Arg-Gln-Pro-Arg隱Gly-Trp-Glu-Gln-Leu-Glu-Gln-Cys-Gly-Tyr-Pro-Val-Gln-Arg-Leu-Val-Ala-Leu-Tyr-Leu-Ala-Ala-Arg-Leu-Ser-Trp-Asn-Gln-Val-Asp陽Gln陽Val-Ile-Arg-Asn-Ala-Leu-Ala-Ser-Pro-Gly-Ser-Gly-Gly-Asp-Leu陽Gly-Glu-Ala-Ile-Arg-Glu-Gln-Pro-Glu-Gln-Ala-Arg陽Leu-Ala-Leu-Thr-Leu-Ala-Ala-Ala-GIu-Ser-Glu-Arg-Phe-Val-Arg-Gln-Gly-Thr-Gly-Asn-Asp-Asp-Val-Val-Ser-Leu-Thr-Cys-Pro-Val陽Ala-Ala-Gly-Glu-Cys-Ala-Gly-Pro-Ala-Asp-Ser-Gly-Asp-Ala-Leu-Leu-Glu-Arg-Asn-Tyr-Pro-Thr-Gly-Ala-Glu-Phe-Leu-Gly-Asp-Gly-Gly-Asp-Val-Ser-Phe-Ser-Thr曙Arg-Gly-Thr-Gln-Asn-Trp-Thr-Val-Glu-Arg-Leu-Leu陽Gln-Ala-His-Arg-Gln-Leu-Glu國Glu國Arg-Gly-Tyr-Val-Phe-Val-Gly-Tyr-His-Gly-Thr-Phe-Leu-Glu-Ala-Ala-Gln-Ser-Ile-Val陽Phe-Gly陽Gly-Val-Arg-Ala-Arg-Ser-Gln-Asp陽Leu-Asp-Ala-Ile-Trp-Arg-Gly國Phe-Tyr陽Ile-Ala-Gly-Asp-Pro-Ala-Leu陽Ala-Tyr-Gly-Tyr-Ala-Gln-Asp-Gln-Glu-Pro-Asp-Ala-Arg-Gly-Arg-Ile-Arg-Asn-Gly-Ala-Leu-Leu-Arg隱Val-Tyr-Val-Pro-Arg-Ser-Ser-Leu陽Pro-Gly-Phe-Tyr-Arg-Thr-Ser-Leu-Thr-Leu-Ala-Ala-Pro-Glu-Ala-Ala-Gly-Glu-Val-Glu-Arg-Leu-Ile-Gly-His-Pro-Leu-Pro-Leu-Arg-Leu-Asp-Ala-Ile-Thr-Gly-Pro-Glu-Glu-Glu-Gly-Gly-Arg-Leu-Glu陽Thr-Ile-Leu陽Gly-Trp-Pro-Leu陽Ala-Glu-Arg-Thr-Val-Val-Ile-Pro-Ser-Ala-Ile-Pro-Thr-Asp-Pro-Arg-Asn-Val陽Gly-Gly-Asp-Leu-Asp-Pro-Ser-Ser-Ile-Pro-Asp-Lys-Glu-Gln-Ala-Ile-Ser-Ala-Leu-Pro-Asp-Tyr-Ala-Ser-Gln-Pro-Gly-Lys-Pro-Pro-Lys-Asp-Glu-Leu 。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2 ，能表達出2中氨基酸序列的所有核^列。
4. 權(quán)利要求l中的融合蛋白使用大腸桿菌、酵母或真核細胞為宿主菌，應(yīng)用基因工程的方法 進行表達、純化獲得。
全文摘要
本發(fā)明是一種高毒性靶向融合蛋白，主要是一種由GnRH與PE衍生物組成的融合蛋白GnRH-PE39KDEL，其與目前的同類靶向藥物相比，具有更高的靶向細胞毒性活性，從而在腫瘤的治療方面有潛在的應(yīng)用價值。
文檔編號C07K19/00GK101469031SQ20071030131
公開日2009年7月1日 申請日期2007年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月27日
發(fā)明者王桂有, 陸學(xué)山, 陳海軍 申請人:合肥麗湖醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司