專利名稱：：制備抗獨特型抗體的方法制備抗獨特型抗體的方法單克隆抗體(MAb)治療在癌癥、自身免疫疾病、移植排斥和其他病癥治療中的應(yīng)用在最近幾年日益廣泛。特別是分子工程技術(shù)可將鼠類MAb轉(zhuǎn)變?yōu)槿嗽椿蛲耆娜祟惙肿?，由此在患者治療中減少針對該治療劑的不良免疫反應(yīng)(人抗人抗體-HAHA)。因此，用治療性MAb的成功治療事件顯著增加，這主要是因為治療性MAb減少或消除了免疫原性，增加了血清半衰期，并且提高了效應(yīng)子功能。在這種情況下，開發(fā)出易于從所治療患者血清中的內(nèi)源IgG分子庫中鑒別出治療性免疫球蛋白(IgG)的合適分析方法顯得極為關(guān)鍵。因此，需要對臨床給予治療性MAb進行藥物代謝動力學(xué)分析、藥物動力學(xué)分析、生物分布分析以及免疫應(yīng)答誘導(dǎo)分析的工具?？躬毺匦涂贵w(抗-ID抗體)特異性結(jié)合其他抗體的可變區(qū)，因此可用于在藥物代謝動力學(xué)研究中檢測治療性MAb，并且在治療個體中有助于定量人抗人抗體(HAHA)反應(yīng)。目前，這類抗獨特性抗體是通過用目的治療性抗體免疫實驗動物，然后對獨特型結(jié)合MAb的存在進行篩選而制備的。遺憾地是，治療性MAb在實驗動物中引發(fā)的免疫應(yīng)答主要針對人抗體Fc部分，由此抗獨特型抗體稀少且難以獲得。而且，通過多克隆血清的親和純化方法從動物產(chǎn)生抗獨特型抗體有許多不足，例如高百分比非獨特型結(jié)合抗體、對正常免疫球蛋白低產(chǎn)量免疫吸附，以及每批制備物質(zhì)量存在差異。因此，本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因非人動物在制備目的抗體的抗獨特型抗體中的應(yīng)用，其中該非人動物為外源抗體轉(zhuǎn)基因動物，其中該目的抗體與該外源抗體具有相同同種型。這類外源抗體轉(zhuǎn)基因動物表現(xiàn)出對與該外源抗體所有相同的同種型抗體Fc部分的耐受性，由此允許對該外源抗體相同同種型抗體的可變區(qū)進行免疫應(yīng)答，從而產(chǎn)生不同的獨特型抗體。EP05105946.7中已記載外源抗體非人轉(zhuǎn)基因動物。然而，其沒有公開本文中記載的應(yīng)用。具體地，本發(fā)明提供了一種制備抗獨特型抗體的方法，其包括a)產(chǎn)生外源抗體的轉(zhuǎn)基因非人動物，b)利用該轉(zhuǎn)基因非人動物誘導(dǎo)針對目的抗體的免疫應(yīng)答，目的抗體借此與外源抗體具有相同種類的特異性同種型，以及e)由此產(chǎn)生直接針對目的抗體獨特型部分的抗體。優(yōu)選地，該方法進一步包括另一步驟d)分離該抗獨特型抗體。分離抗體的方法，特別是分離來自體液(例如血液)的抗體的方法為本領(lǐng)域已知。更優(yōu)選地，純化抗獨特型抗體。合適的純化方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。本文所用的術(shù)語"外源抗體"是指含有源自來源生物(例如人類)恒定區(qū)的抗體，將該抗體的編碼DNA導(dǎo)入宿主生物(例如小鼠)，由此該宿主生物表達(dá)該抗體。來源生物與宿主生物不屬于林奈分類系統(tǒng)同一物種。物種為一組實質(zhì)或潛在的遠(yuǎn)交種群(interbreedingpopulation)。外源抗體可以為治療性抗體。優(yōu)選地，外源抗體為人類、人源化或嵌合抗體，其中至少嵌合抗體恒定區(qū)為人源的。更優(yōu)選地，外源抗體為免疫球蛋白G(IgG)。進一步優(yōu)選地，抗體為抗人淀粉狀蛋白p肽或其變體的抗體。最優(yōu)選，抗體為抗A卩IgGl?？笰pigGl在專利申請WO03/070760中有詳細(xì)記載，其內(nèi)容在此整體并入作為參考。本文所用的術(shù)語"變體"或"抗體變體"是指結(jié)構(gòu)特性、制備方法、配制或存儲條件與標(biāo)準(zhǔn)抗體不同的抗體。結(jié)構(gòu)變體可包括一級蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、二級蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和三級蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變(即構(gòu)象改變)，糖基化改變以及氨基酸化學(xué)修飾的改變。進一步地，結(jié)構(gòu)變體為改變的結(jié)構(gòu)域間構(gòu)建體(VL/VL，VH/VH)、二聚體、寡聚體以及較大的聚集體。本文所用的術(shù)語"目的抗體"是指其恒定區(qū)與外源抗體恒定區(qū)屬于相同同種型的抗體?？贵w為"Y"形分子，其由兩條重鏈和兩條輕鏈組成。重鏈與輕鏈都有不同的型和亞型。每重鏈和每輕鏈都有恒定區(qū)和可變區(qū)，其中重鏈恒定區(qū)體積較大。術(shù)語"恒定區(qū)"或"C區(qū)"是指這樣的抗體分子區(qū)，該區(qū)域與相同物種生物產(chǎn)生的不同特異性抗體的相應(yīng)區(qū)域幾乎完全相同。恒定區(qū)在相同種類抗體(同種型)中恒定，其負(fù)責(zé)特定免疫球蛋白亞類的效應(yīng)子功能。Fc片段是指木瓜蛋白酶裂解抗體所產(chǎn)生的抗體片段，其包括大部分的恒定區(qū)。本文所用的術(shù)語"可變區(qū)"是指抗體分子結(jié)合特異性抗原的區(qū)域。它由重鏈和輕鏈的抗原結(jié)合位點組成。可變區(qū)在不同B細(xì)胞免疫球蛋白之間是不同的，但是在同一B細(xì)胞所產(chǎn)生的所有免疫球蛋白之間是相同的?？勺儏^(qū)通過B細(xì)胞成熟期間發(fā)生的基因重組過程由體細(xì)胞產(chǎn)生。該過程為重排過程，該重排過程產(chǎn)生大量可結(jié)合任意給定抗原的多樣性，由此能使免疫系統(tǒng)識別并中和外源和病原結(jié)構(gòu)所導(dǎo)致的大量抗原負(fù)載(antigenicburden)。因此，抗體庫由具有不同V區(qū)的豐富免疫球蛋白所組成，但該免疫球蛋白具有相同的Fc部分。術(shù)語"結(jié)合抗原片段"或"Fab片段"為含有可變抗原結(jié)合區(qū)的抗體片段，其通過木瓜蛋白酶裂解抗體產(chǎn)生。本文所用的術(shù)語"獨特型區(qū)，，是指每類抗體特異的抗體可變區(qū)部分。本文所用的術(shù)語"抗獨特型抗體"是指結(jié)合另一抗體獨特型區(qū)的抗體。本文所用的術(shù)語"免疫應(yīng)答"是指免疫系統(tǒng)對出現(xiàn)的抗原的反應(yīng)。其涉及能結(jié)合抗原的抗體的產(chǎn)生。術(shù)語"同種型"是指抗原決定區(qū)，其區(qū)別在于重鏈的類和亞類、輕鏈的型和亞型。不同同種型抗體不僅可變區(qū)不同，而且恒定區(qū)也不同。因此例如，同物種IgG和IgM抗體屬于不同同種型。導(dǎo)入另一物種的某物種抗體將優(yōu)選^"導(dǎo)主要針對同種型免疫原性區(qū)域(同種型決定區(qū))的抗異種抗體的產(chǎn)生。本發(fā)明的優(yōu)選實施方案是制備抗人治療性抗體的抗獨特型抗體的方法，其包括a)產(chǎn)生人IgG抗體的轉(zhuǎn)基因非人動物；b)在該轉(zhuǎn)基因動物中誘導(dǎo)針對該治療性抗體的免疫應(yīng)答，以及c)產(chǎn)生對該治療性抗體獨特型區(qū)特異的抗獨特型抗體。優(yōu)選地，該方法進一步包括另一步驟d)分離抗獨特型抗體。轉(zhuǎn)基因非人動物可為任何非人動物。優(yōu)選的非人動物為哺乳動物。更優(yōu)選地，非人動物為嚙齒類，如小鼠或大鼠。產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因非人動物的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。合適的方法在HoganB.，BeddingtonR.，CostantiniF.&LacyE.Manipulatingthemouseembryo.Alaboratorymanual.第2版(1994).ColdSpringHarborLaboratoryPress中有記載。制備表達(dá)外源抗體的非人轉(zhuǎn)基因動物的優(yōu)選方法包括a)將包含編碼外源抗體的DNA的基因構(gòu)建體導(dǎo)入非人受精卵或非人胚胎干細(xì)胞，b)從該受精卵或胚胎干細(xì)胞構(gòu)建轉(zhuǎn)基因非人動物，從而c)產(chǎn)生表達(dá)外源抗體的轉(zhuǎn)基因非人動物。例如，轉(zhuǎn)基因動物可通過下列步驟產(chǎn)生將上述DNA構(gòu)建體注射至受精卵前核，轉(zhuǎn)移該已注射的受精卵至假孕代孕母體，將卵母細(xì)胞所產(chǎn)生起始動物伺養(yǎng)至野生型動物，檢測這些飼養(yǎng)動物后代是否存在合成的DNA轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體，飼養(yǎng)半合子動物，任選構(gòu)建純合轉(zhuǎn)基因動物。備選地，轉(zhuǎn)基因動物可通過下列方法構(gòu)建將上述基因構(gòu)建體導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞，然后篩選基因組中存在轉(zhuǎn)基因的胚胎干細(xì)胞克隆，確認(rèn)轉(zhuǎn)化的胚胎干細(xì)胞克隆存在轉(zhuǎn)基因，將確認(rèn)的重組胚胎干細(xì)胞注射至野生型動物胚泡，將這些注射的胚泡轉(zhuǎn)移至假孕代孕母體，祠養(yǎng)胚泡所產(chǎn)生的嵌合體至野生型，檢測該飼養(yǎng)動物后代是否存在轉(zhuǎn)基因，祠養(yǎng)半合子動物，任選構(gòu)建純合轉(zhuǎn)基因動物。本發(fā)明中所用的非人轉(zhuǎn)基因動物也可為上述方法之一所產(chǎn)生的非人轉(zhuǎn)基因動物子代。子代可從飼養(yǎng)該非人轉(zhuǎn)基因動物獲得，其中該子代保留了該轉(zhuǎn)基因動物的相同表現(xiàn)型。受精卵或胚胎干細(xì)胞可來自任何非人動物。優(yōu)選地，受精卵或胚胎干細(xì)胞來自嚙齒類。更優(yōu)選地，受精卵或胚胎干細(xì)胞來自小鼠。為了構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠，受精卵或胚胎干細(xì)胞包括但不限于來自C57BL/6J、CBA/、BALB/c、DBA/2和SV129受精卵或胚胎干細(xì)胞(Seong，E等人(2004)TrendsGenet.20,59-62;Wolfer，D.P.等人，TrendsNeurosci.25(2002):336-340)。轉(zhuǎn)基因非人動物中抗體的表達(dá)可以是組成型或誘導(dǎo)型。優(yōu)選地，抗體表達(dá)為組成型?？赏ㄟ^下列方法誘導(dǎo)動物針對抗體的免疫應(yīng)答，例如包括將該抗原皮下、靜脈、損傷區(qū)、肌內(nèi)或腹膜內(nèi)(i.p.)注射或?qū)⒃摽乖诜o藥(p.o.)。為了處理轉(zhuǎn)基因非人動物，目的抗體可稀釋或乳化于適于給予轉(zhuǎn)基因非人動物的藥學(xué)上可接受的載體。載體可為液體載體。合適的載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，例如，鹽溶液。優(yōu)選地，載體為復(fù)水凝膠(Rehydrage)國HPAo分離所產(chǎn)生的抗獨特型抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。優(yōu)選的方法包括a)從免疫外源抗體轉(zhuǎn)基因非人動物獲取血液樣品，b)制備血清，例如通過凝固，和c)分離和純化抗獨特型抗體，通過層析法，例如親和層析、離子交換層析和/或分子大小排阻層析。本文記載的非人轉(zhuǎn)基因動物也可用于制備針對目的抗體的抗獨特型單克隆抗體。制備單克隆抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的。該方法例如可為下列方法，其包括a)分離外源抗體轉(zhuǎn)基因非人動物的脾細(xì)胞，b)制備骨髓瘤細(xì)胞，和c)將該脾細(xì)胞與該骨髓瘤細(xì)胞融合。由此產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞可產(chǎn)生單克隆抗獨特型抗體。表達(dá)外源抗體的轉(zhuǎn)基因動物獲得對該特定抗體的免疫耐受性。給定的轉(zhuǎn)基因抗體，例如人抗ApigGl，可傳遞對相同同種型所有抗體Fc部分的耐受性，因而允許針對其他抗體V區(qū)的免疫應(yīng)答。本發(fā)明方法可用于制備特異性識別治療性抗體的抗體。這類抗獨特型抗體在藥物動力學(xué)研究中，以及在用相應(yīng)治療性單克隆抗體治療個體的臨床人抗人抗體(HAHA)反應(yīng)研究中相當(dāng)有用。此外，如上所述轉(zhuǎn)基因小鼠所產(chǎn)生的抗獨特型抗體可模擬抗原決定區(qū)，因此可作為替代抗原用于診斷目的，例如在抗原4吏用,皮限制的情況下應(yīng)用。該應(yīng)用包括竟?fàn)幮悦庖叻治龌蛑苯友鍖W(xué)分析。用"內(nèi)影"抗獨特型抗體替代傳統(tǒng)抗原的優(yōu)點包括易于制備、在抗原有毒或因其他原因有危險情況下可安全使用、易于純化、標(biāo)記連接方法成熟、以及可能連接至固相而沒有免疫反應(yīng)損失。多種自身免疫疾病特征在于存在自身抗體。在確定自身抗體具有的獨特型之后，上述轉(zhuǎn)基因小鼠可用于制備抗獨特型抗體，以診斷抗體介導(dǎo)的和自身抗體相關(guān)的自身免疫疾病。已證明在諸如重癥肌無力、橋本甲狀腺炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及系統(tǒng)性紅斑狼瘡的疾病中出現(xiàn)特異性ID表達(dá)升高(IsenbergDA,WilliamsW，AxfordJ，等人，"ComparisonofAnti-DNAAntibodyIdiotypesinHumanSera,"JAutoimmunity,3:393-414，1990)。用作替代抗原以診斷人類傳染病是抗獨特型抗體的另一有用應(yīng)用?，F(xiàn)在本發(fā)明中概括記載的內(nèi)容結(jié)合特定實施例和下列附圖將能更容易理解，該實施例包含在本文中只是為了說明本發(fā)明，而不期望對本發(fā)明構(gòu)成任何限制，除非本文另有說明。附圖l顯示了本方法的示意圖。用例如單克隆人IgG抗體免疫的野生型小鼠將產(chǎn)生主要針對該單克隆抗體同種型部分的抗體。這些抗體可交叉識別所有人IgG。用例如單克隆人IgG抗體免疫的單克隆人IgG抗體轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生主要針對免疫IgG可變區(qū)(抗體獨特型部分)的抗體，由此降低與其他人IgG的交叉識別。1)=免疫；2)=免疫應(yīng)答；A)=單克隆人IgG抗體；8)=野生型小鼠，C)=所產(chǎn)生的主要針對單克隆抗體(A)同種型部分的抗體，CI)=所產(chǎn)生抗體(C)的識別位點位于單克隆人抗體(A)的同種型部分；D)=單克隆人IgG抗體(A)轉(zhuǎn)基因小鼠；E)=所產(chǎn)生主要針對單克隆抗體(A)獨特型部分的抗體，El)=所產(chǎn)生抗體(E)的識別位點位于單克隆人抗體(A)的獨特型部分。圖2顯示了克隆至表達(dá)載體pHSE3，用于轉(zhuǎn)基因表達(dá)的人AP特異性人Igyl基因的編碼序列。PCR擴增所用引物位置和名稱顯示在相應(yīng)序列上方或下方。前導(dǎo)序列以斜體顯示。終止密碼子以粗體顯示。圖3顯示了克隆至表達(dá)載體pHSE3，用于轉(zhuǎn)基因表達(dá)的人A卩特異性人IgK基因的編碼序列。PCR擴增所用引物位置和名稱顯示在相應(yīng)序列上方或下方。前導(dǎo)序列以斜體顯示。終止密碼子以粗體顯示。圖4顯示了抗A卩IgGl(-Mab-ll)轉(zhuǎn)基因小鼠的血清分析示意圖。對人K輕鏈和人y重鏈進行特異性的夾心ELISA檢測。MS:鼠血清、hlgGl:重組人免疫球蛋白yl同種型、F2F:起始小鼠2F、Neg:PCR陰性同步(littermate)對照、Tg5M+:轉(zhuǎn)基因小鼠5M+、Tg7M+:轉(zhuǎn)基因小鼠7M+。轉(zhuǎn)基因小鼠表達(dá)同一分子的兩條抗體鏈。圖5顯示了分子大小排阻層析圖鐠A)分子量標(biāo)準(zhǔn)、B)Mab-ll安慰劑、C)Mab-ll。沒有檢測到聚集體或片段。裝置、工作條件和方法記載在實施例3中。圖6顯示了離子交換層析圖語Mab-ll安慰劑(左邊)，Mab-ll(右邊)。裝置、工作條件和方法記載在實施例3中。圖7顯示了Mab-ll和還原性/羧甲基化Mab-ll(RAMab-ll)在2-4%Bis-Tris凝膠上、非還原條件(A)和還原條件(B)下SDS-PAGE分析的示意圖。染色用考馬斯亮藍(lán)染料。M:標(biāo)準(zhǔn)參照物、泳道1-3:Mab-ll、泳道4-7:RA畫Mab國ll。圖8顯示了還原性/烷基化Mab-ll(RAMab-ll)LC/MS分析示意圖。A)HPLC層析鐠(C8RP-HPLC，UV-示蹤，214nm)，峰代表輕鏈和重鏈；B)去疊加質(zhì)^脊；C)B)中高分子量(HMW)質(zhì)i普峰放大區(qū)。所檢測質(zhì)量顯示在表3中。圖9顯示了如實施例5中所記載制備和分離的全長抗體、純化Fab和Fc片段的SDS-PAGE圖。左邊數(shù)字表示分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物條帶的位置(單位kDa)。用考馬斯亮藍(lán)染料染色。SDS-PAGE在非還原條件下進行。M:分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物、1:Humira，全長抗體、2:Humira,Fab國片段、3:Humira，F(xiàn)c片段、4:Synagis，全長抗體、5:Synagis，F(xiàn)ab國片段、6:Synagis，F(xiàn)c片段、7:Mab國ll，全長抗體、8:Mab國ll，F(xiàn)ab-片段、9:Mab-ll，F(xiàn)c片段。將抗體和片段稀釋于MES緩沖液，每種樣品上樣量為2嗎。圖10顯示了第0天用Mab-ll免疫的野生型(WT)和Mab-ll轉(zhuǎn)基因(TG)動物血清中第7天、12天、21天和35天的抗Mab-ll反應(yīng)的ELISA示意圖。該圖分別顯示了5WT和5TG小鼠免疫的平均值。該結(jié)果以免疫前血清O.D.的倍數(shù)表示。圖11顯示了(A)野生型小鼠和(B)Mab-ll轉(zhuǎn)基因小鼠血清抗Humira反應(yīng)的ELISA示意圖，該圖以免疫前血清O.D.的倍數(shù)表示。5只野生型(WT)和5只轉(zhuǎn)基因(TG)小鼠在第0天用Humira免疫。在第7天、12天和21天檢測抗Humira抗體滴度。圖12顯示了用Humira免疫21天后，5只野生型小鼠血清庫中Humira、Synagis和Mab-ll的Fab-和Fc-片段血清反應(yīng)性的ELISA示意圖。結(jié)合以對照(免疫前的野生型)血清O.D.的倍數(shù)表示。圖13顯示了用Humira免疫21天后，5只Mab-ll轉(zhuǎn)基因小鼠血清庫中Humira、Synagis和Mab-ll的Fab-和Fc-片段血清反應(yīng)性的ELISA示意圖。結(jié)合(免疫前的野生型)以對照血清O.D.的倍數(shù)表示。實施例實施例中所涉及市售試劑按制造商使用說明使用，除非另有說明。實施例l:產(chǎn)生人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠構(gòu)建Mab-ll構(gòu)建體使用免疫球蛋白(Ig)重鏈(H)同種型編碼cDNA(SEQ.ID.NO:l)和人A卩肽特異性輕鏈(L)同種型k編碼cDNA(SED.ID.NO:2)[Bardroff,M.e.a.，Anti-amyloidbetaantibodiesandtheiruse.EP03001759EP，2003。該抗ApIgGl抗體也稱為Mab-ll。用表1中的引物在PCR反應(yīng)中擴增cDNA。5'引物含有Sall(或相容的Xhol)位點，3，引物含有BamHI(或相容的BglII)位點，其可定向插入pHSE3"載體[Pircher，H.，等人，TcelltolerancetoMlsaencodedantigensinTcellreceptorVbeta8.1chaintransgenicmice.EmboJ，1989.8(3》第719-27頁。PCR擴增的cDNA先用兩種限制酶Sail和BamHI酶切，然后將其分別插入載體pHSE3，的相應(yīng)位點。IgcDNA在pHSE3，中表達(dá)由鼠MHCI類基因H-2k的啟動子驅(qū)動，并由位于克隆基因3，端的鼠IgH基因增強子增強[Pircher，H.，等人，TcelltolerancetoMlsaencodedantigensinTcellreceptorVbeta8.1chaintransgenicmice.EmboJ，1989.8(3》第719-27頁。該表達(dá)載體可確保在轉(zhuǎn)基因小鼠T和B'淋巴細(xì)胞中高水平產(chǎn)生相應(yīng)插入基因產(chǎn)物([Pircher，H"等人，TcelltolerancetoMlsaencodedantigensinTcellreceptorVbeta8.1chaintransgenicmice.EmboJ，1989.8(3):笫719-27頁]，結(jié)果未公布)。然后將包含(從5，至3，)H-2k啟動子、插入的cDNA、poly-A、剪接位點以及IgH基因增強元件的全長表達(dá)框用限制酶Xhol從載體剪切，并瓊脂凝膠純化，制成合適濃度，以微注射受精的小鼠卵母細(xì)月包(2ng/ml于10mMTrisHCl/0.1mMEDTA，pH7)。cDNA的編碼能力可通過抗ApIgH和L基因的全長編碼cDNA的測序進行確認(rèn)(參見圖2和3)。引物名稱序列限制位點(粗體)SEQ.IDGl,llSalfor(5，刷5，-ACGTGTCGACGCCGCCACCATGAAACACCTG-3'Sail(GTCGAC)3Gl.llBamreV(3，鵬5，國ACGTGGATCCTCATTTACCCGGAGACAG-3'Bamffl(GGATCC)4K.llXhofor(5，IgL)5，-ACGTCTCGAGGCCGCCACCATGGTGTTGCAG-3"XholCCTCGAG)K.llBglrev(3,IgL)5，-ACGTAGATCTCTAACACTCTCCCCTGTTG國3'BglII(AGATCT)6表l:克隆引物的序列。產(chǎn)生抗ApIgGl轉(zhuǎn)基因小鼠用1:1混合的純化IgH和L基因(上述部分記載的)編碼Xhol片段對C57BL/6雌性供體受精卵母細(xì)胞進行微注射以獲得雙轉(zhuǎn)基因動物。用特異性引物擴增尾部活組織檢查制備的基因組DNA，以從這些微注射胚胎所產(chǎn)生的幼仔中篩選轉(zhuǎn)基因的存在。所用引物示于表2中。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表2:檢測轉(zhuǎn)基因的引物序列。用1pl(約100ng)尾活組織檢查總DNA進行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)在下列條件下進行卯。C1分鐘，30x[94'C10秒；64tl30秒；72'C90秒，72C7分鐘。約660bpPCR擴增DNA片段，最后在1.5%瓊脂凝膠中可見，其分別對應(yīng)于轉(zhuǎn)基因IgH基因和轉(zhuǎn)基因IgL基因。實施例2:轉(zhuǎn)基因小鼠的表現(xiàn)型特征血清分析尾靜脈穿刺Wi。室溫過夜凝固。500xg離心IO分鐘分離血清，20'C冷凍至下一步分析。為確定轉(zhuǎn)基因小鼠是否表達(dá)全長人抗體，建立ELISA系統(tǒng)。用多克隆山羊抗人k鏈特異性抗體(SigmaK3502)俘獲人抗體。用偶聯(lián)過氧化物酶的單克隆小鼠抗人Y鏈特異性抗體(POD,SigmaA0170)進行檢測。如圖4所示，轉(zhuǎn)基因鼠表達(dá)全長人免疫球蛋白。用人IgGl抗體HUMIRA(Abbott)免疫分析抗近緣抗原的反應(yīng)。10jigHUMIRA用200jil復(fù)水凝膠HPA(Reheis)乳化。第0天腹膜(i.p.)免疫動物，第7天、12天、21天和35天尾靜脈穿刺^U6l,制備血清，ELISA分析抗HUMIRA滴度，該ELISA用HUMIRA包被maxisorp平板(Nunc)俘獲抗HUMIRA抗體并用小鼠抗IgG(BDPharmigen)檢測該抗體。如圖11所示，野生型和轉(zhuǎn)基因小鼠都顯示出抗近緣人IgGl抗體HUMIRA的反應(yīng)。實施例3:Mab-ll(也稱為抗A卩IgGl)的制備、純化和表征用實施例1該轉(zhuǎn)基因相同序列IgGl的編碼cDNA轉(zhuǎn)染的中國倉鼠卵巢細(xì)胞在無血清條件下產(chǎn)生Mab-ll。Mab-ll從培養(yǎng)上清液的分離和純化所有步驟僅用鋼化玻璃器皿在無內(nèi)毒素條件下進行，包括柱在內(nèi)的所有裝置用0.5MNaOH進行滅菌處理，無菌過濾(0.22)所有緩沖液。僅使用新鮮的凝膠材料。作為第一個純化步驟，用MabSelect凝膠(Amersham)進行A蛋白親和層析。預(yù)電泳之后，將柱用25mMTris/HCl、25mMNaCl、5mMEDTA，pH7.1平衡，并將CHO細(xì)胞培養(yǎng)物的濾過上清液上樣至凝膠。用100mMHAc,pH2.9洗脫A蛋白結(jié)合的抗體。為滅活病毒，用HAc調(diào)整洗脫液至pH^3.6，然后室溫下溫育15分鐘，然后用1MTris調(diào)整pH至pH4.0。作為第二個純化步驟，用SP-Toyopearl650M(Tosoh)為基質(zhì)進行離子交換層析(陽離子交換層析)。預(yù)電泳后，將步驟1的洗脫級分上樣至凝膠，用緩沖液A平衡(50mMHAc，pH5.0)，然后用0-100%緩沖液B(50mMHAc，1MNaCl，pH5.0)梯度洗脫。收集洗脫的蛋白質(zhì)級分，超濾濃縮，并調(diào)整至pH7.5,用IEX和SECHPLC進行分析。作為第三個純化步驟，用Q-SepharoseFF凝膠(Biorad)作為固定相，用25mMTris/HCl、80mM乙酸鈉，pH7.5作為流動相，進行分子大小排阻層析(流通陰離子交換層析)。按UV信號分離流出級分。緩沖液至Mab-ll安慰劑(不含Mab-ll的緩沖液)的轉(zhuǎn)換以及濃度調(diào)整用10kDa膜在Amicon攪拌杯(Amicon)中進行，其中該Mab-ll安慰劑含有20mM組氨l140mMNaCl，pH5.5。最后，將溶液用0.22jimMillex-GV無菌濾膜(Millipore)過濾，于-80'C等份儲藏?？笰pIgGl(Mab-ll)的表征用SDS-PAGE、大小排阻層析、離子交換層析檢測所純化Mab-llIgGl蛋白的完整性和異質(zhì)性，用下述還原性和羧甲基化Mab-ll抗體的LC/MS分析進行一級序列的確認(rèn)。大小排阻層析用JascoPU-980HPLC系統(tǒng)的大小排阻層析分析純化的Mab-ll樣品。在以0.2MK2HP04、0.25MKC1，pH7.0作為流動相的TSK-GelG3000SWXL，7.8x300mm，5jim柱(ToshoBiosciences)中進行樣品層析。流速i更置為0.5ml/分鐘。用與Merck-HitachiD-2500記錄系統(tǒng)相連的JascoUV-975檢測儀在220nm處監(jiān)測吸光度。平衡柱直至獲得穩(wěn)定基線。按凝膠過濾標(biāo)準(zhǔn)物(BioRad，151-1卯1，包括670kD牛甲狀腺球蛋白、158kD牛IgG、44kDOVA、17kD馬(eq.)肌紅蛋白以及1.35kD維他命B12)、Mab-ll安慰劑(陰性對照無Mab-ll的緩沖液)、Mab-ll樣品順序注射。注射量對應(yīng)約50嗎樣品。示意性大小排阻層析圖譜如圖5所示。滯留時間對稱J^相應(yīng)于155-160kba。沒有檢出聚集體或片段。離子交換層析用JascoPU-980HPLC系統(tǒng)的離子交換層析分析純化的Mab-ll樣品。20分鐘內(nèi)用0%B-52%B梯度在MonoS5/50GL柱(AmershamBiosciences)上對樣品進行層析(固定相A:50mM丙二^/丙二鹽于水中，pH5.3;流動相B:1M乙酸鈉于固定相A中，pH5.3)。流速設(shè)為1ml/min。用與Merck-HitachiD-2500記錄系統(tǒng)相連的JascoUV-975檢測儀在280nm處監(jiān)測吸光度。將柱用固定相A平衡直至獲得穩(wěn)定基線。按Mab-ll安慰劑、Mab-ll樣品順序注射。Mab-ll注射量大約為50fig。示意性離子交換層析圖鐠(IEC)如圖6所示。結(jié)果>95%Mab-ll樣品在高滯留時間、以沒有可分辨肩峰的單峰洗脫。約5。/。在短滯留時間洗脫。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳將純化的Mab-ll和還原性/羧甲基化Mab-ll(RAMab-ll，制備參見下文)樣品用XcellMini-cellIIGel系統(tǒng)(Invitrogen)進行SDS國PAGE分析。將預(yù)稀釋樣品與還原性或非還原性樣品緩沖液混合至2-8jig/20jil濃度。還原性樣品緩沖液按制造商建議將NuPAGELDS樣品緩沖液(Invitrogen)與NuPAGE還原劑(Invitrogen)混合而制備。樣品在還原性樣品緩沖液中70'C溫育10分鐘。樣品和標(biāo)準(zhǔn)物上樣至10孔梳、1.0mm厚的NuPAGE4-12%Bis-Tris凝膠(Invitrogen，弁NP0301BOX)上。使用覆蓋范圍200-2.5kDa的Mark12TM分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物(Invitrogen,弁LC5677)作為標(biāo)準(zhǔn)物。用NuPAGEMOPSSDS電泳緩沖液(Invitrogen)在200V凝膠電泳l小時。凝膠用StainEaseGel染色盤(Invitrogen)染色過夜，用光密度測定法掃描并分析。根據(jù)同一凝膠上標(biāo)準(zhǔn)參考物的標(biāo)準(zhǔn)樣品線計算蛋白濃度。結(jié)果非還原條件下SDS-PAGE:全長Mab-11,條帶對應(yīng)于IgG的期望分子量；RAMab-ll，兩條帶對應(yīng)于IgGlH-和IgGlL-鏈分子量。未檢出全長或部分還原性Mab-ll。還原條件下SDS-PAGE:全長Mab-11和RAMab-ll兩者都有，兩條帶對應(yīng)于IgGlH-和IgGlL-鏈分子量。未檢出聚集體或片段(參見圖7)。質(zhì)譜用LC/MS分析確定一級結(jié)構(gòu).還原性和羧甲基化Mab-11抗體以Lundell和Schreitmfiller所記栽方法(Samplepreparationforpeptidemapping—Apharmaceuticalquality-controlperspective.AnalBiochem.1999年1月1日；266(1):31-47)進行制備。使用梯度系統(tǒng)(A:水0.1%甲酸、B:乙腈0.1%甲酸)在AgilentPoroshellC8-反相柱(0.5x75mm)上進行分析性RP-HPLC分析。接著將層析流以正態(tài)、鎖閉噴射質(zhì)量校正(lockspraymasscorrection)狀態(tài)進入ESI畫Q畫TOF質(zhì)i普(Micromass/WatersQ-TOFUltima,Manchester,UK)的ESI離子源。蛋白圖語用MasslynxMaxEntl模塊去疊加。RA-Mab-11的LC/MS分析示于圖8中，觀測質(zhì)量和計算質(zhì)量如表3所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>M+H十23845DaMab-ll;L鏈，還原性和羧曱基化的(23844Da)51770DaMab-ll;H鏈-G。，Pyro-Glu，-Lys，還原性和羧甲基化的(51770Da)51932DaMab國ll;H鏈國G!，Pyro-Glu，畫Lys，還原性和羧甲基化的(51932Da)52094DaMab-ll;HM-G2，Pyro-Glu,-Lys，還原性和羧曱基化的(52094Da)表3:RA-Mab-11的LC/MS分析;Sjt見測質(zhì)量的分布(參見圖8)。L-鏈=輕鏈，H-鏈-重鏈，Go，Gi，G2-H鏈糖基化，Pyro-Glu=含焦谷氨酸的M酸序列，-Lys=H鏈氨基酸序列上1個賴氨酸缺失。檢測質(zhì)量與H鏈有一個Pyro-Glu和一個Lys缺失的Mab-ll—級序列抗體的還原性/羧甲基化H-和L-鏈理論期望質(zhì)量相匹配。H-鏈以G。，&糖基化為主，G2糖基化僅占小部分。實施例4:耐受性免疫分析將轉(zhuǎn)基因和野生型同窩對照小鼠(N-5/每實驗)用乳化于200pl復(fù)水凝膠-HPA(Reheis)的10jig重組Mab誦ll進行腹膜(i.p.)免疫。第7、12、21和35天，尾靜脈穿刺取血。血清通過如上所述凝固制備，用ELISA檢測血清抗Mab-ll滴度。室溫下將Mab-ll以0.2嗎/孔包#7不包被maxisorp平板(Nunc)。洗滌后，將孔用PBS/0.1。/。(v/v)Tween-20/0.1。/。(w/v)BSA封閉，然后加入1:100稀釋血清在定軌搖床上振蕩溫育1小時。按制造商建議用1:100稀釋的APK-標(biāo)記的抗小鼠IgG(BDPharmingen)檢測抗體結(jié)合。ELISA分析顯示野生型動物中可產(chǎn)生抗Mab-ll強免疫應(yīng)答，而hlgGl-轉(zhuǎn)基因動物不能對重組Mab-ll產(chǎn)生強免疫應(yīng)答(圖10)。因此，Mab-ll轉(zhuǎn)基因小鼠可耐受以外源方式提供的轉(zhuǎn)入其的抗體轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物。實施例5:Humira、Synagis和Mab-ll的Fab-和Fc-片段的產(chǎn)生和分離將單克隆抗體Humira、Synagis⑧(Palivizumab，ABBOTTAG，存2422260A)和Mab-ll用木瓜蛋白酶消化，產(chǎn)生Fab-和Fc-片段，該片段用離子交換層析(IEC)分離。簡而言之，用葡聚糖凝膠TMG-25MPD10柱(AmershamBioscience)將抗體制劑緩沖液轉(zhuǎn)換為0.1MTris，4mMEDTA，1mM半胱氨酸，pH7.4，然后稀釋至濃度為3-5mg/ml。加入木瓜蛋白酶(RocheDiagnostics)至0.01mg/ml的終濃度。37。C溫育2小時后，用Amicon超離心過濾設(shè)備(MiIlipore)lOkDa超濾，將緩沖液轉(zhuǎn)換為20mML-組氨酸，pH5.5。用PL國SCX1000A，8um,4.6x150mm(PolymerLabs)或MonoSTM5/50GL柱(AmershamBiosciences),分別以50mM3-(N誦嗎啉代)丙磺酸(MOPS)(Applichem)pH6.7至50mMMOPS中的1M乙酸鈉，pH7.0的梯度，或10mM2-(N-嗎啉)乙磺酸(MES)pH6.0至10mMMES、0.2MNaCl，pH6.0的梯度，用制備性IEC進行Fab-和Fc-片段分離。收集含有蛋白質(zhì)的級分，用10kDa超濾(AmiconUltra,參見上文)將緩沖液轉(zhuǎn)換為20mML畫組氨酸、140mMNaCl、0.01%Tween,pH5.5。用實施例3所述的非還原條件SDS-PAGE鑒定所濃縮的級分。結(jié)果如圖9所示。實施例6:產(chǎn)生抗獨特型抗體將Humira(Adaliinumab，ABBOTTAG,#04H-640-E694-l)用作Mab-ll相同同種型的獨特型抗體的實例。Humira為治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的TNF特異性治療單克隆人抗體。Mab-ll和Humira都是IgGl抗體，它們Fc部分和Fab恒定區(qū)的一級序列相同或幾乎相同。將IO嗎HUMIRA乳化于200jil復(fù)水凝膠HPA(Reheis)。第0天腹膜(i.p.)免疫動物，第7、12、21天尾靜脈穿刺取血，制備血清，ELISA檢測抗HUMIRA滴度。用HUMIRA包被maxisorp平板(Nunc)用以俘獲,用上述抗小鼠IgG(BDPharmigen)進行檢測。如圖11所示，野生型(A)和轉(zhuǎn)基因小鼠(B)都對HUMIRA產(chǎn)生強免疫應(yīng)答。實施例7:評測抗Humira血清對獨特型抗體的交叉反應(yīng)性為評測Humira免疫的WT和TG小鼠血清中抗Humira抗體的特異性，用Fc部分和Fab恒定區(qū)一級序列相同或幾乎相同的Humira、Mab-11和Synagis作為獨特型人IgGl的實例，進行ELISA。Synagis(Palivizumab，ABBOTTAG，#2422260A)是用于治療RSV感染的單克隆人源化IgGl。Humira,Mab-11和Synagis的Fab和Fc片段按實施例5記載的方法制備并分離，并在室溫下以0.2照/孔包被maxisorp平板(Nunc)。洗涂后，將小孔用PBS/0.1%(v/v)Tween-20/0.1%(w/v)BSA封閉。加入用Humira免疫的五只轉(zhuǎn)基因小鼠和五只野生型小鼠的1:100稀釋血清庫，在定軌搖床上振蕩溫育l小時。按制造商建議，用1:100稀釋的APK-標(biāo)記抗小鼠IgG(BDPharmingen)檢測抗體的結(jié)合。ELISA分析顯示，血清抗體與測試抗原的結(jié)合存在顯著差異。對于野生型動物，觀察到對所有測試抗體的Fab-和Fc-片段均產(chǎn)生強免疫應(yīng)答。因此，野生型動物中所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答主要針對人IgGl恒定區(qū)，這解釋了觀察到的對所有測試抗體Fab和Fc部分的強烈交叉識別(圖12)。相反地，對于Humira免疫的Mab-11轉(zhuǎn)基因小鼠，檢測到針對HumiraFab部分的強抗體應(yīng)答，而對Humira的Fc和Fab以及所有其他測試獨特型抗體Fc部分的結(jié)合僅為背景水平(圖13)。因此，可以得出結(jié)論人抗體Mab-11轉(zhuǎn)基因動物可產(chǎn)生主要針對免疫獨特型抗體的可變、獨特型特異區(qū)的免疫應(yīng)答。本文也顯示，本發(fā)明的IgGl轉(zhuǎn)基因鼠對轉(zhuǎn)基因表達(dá)的IgGl抗體耐受，而當(dāng)用相同IgGl同種型的不同人抗體^b^時，可產(chǎn)生強免疫應(yīng)答。產(chǎn)生的免疫應(yīng)答僅針對用于激發(fā)的人IgGl分子的V區(qū)，而Fc區(qū)被巧妙忽略。人抗ApigGl轉(zhuǎn)基因小鼠的特性可使其成為迅速、有效產(chǎn)生抗獨特型單克隆抗體的有價值的工具。序列表〈110〉弗哈夫曼-拉羅切有限公司〈120〉制備抗獨特型抗體的方法〈130〉23856<160〉10<170〉Patentln版本3.3〈210〉1<211>1562〈212〉DNA〈213〉人(Homosapiens)〈400〉1gcgccaccatgaaacacctgtggttcttcctcctgctggtggcagctcccagatgggtcc60tgtcccaggtggaattggtggaaagcggcggcggcctggtgcaaccgggcggcagcctgc120gtctgagctgcgcggcctccggatttacctttagcagctatgcgatgagctgggtgcgcc180aagcccctgggaagggtctagagtgggtgagcggtattaatgctgctggttttcgtactt240attatgctgattctgttaagggtcgttttaccatttcacgtgataattcgaaaaacaccc300tgtatctgcaaatgaacagcctgcgtgcggaagatacggccgtgtattattgcgcgcgtg360gtaagggtaatactcataagccttatggttatgttcgttattttgatgtttggggccaag420gcaccctggtgacggttagctcagcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcac480cctcctccaagagcacctctgggggcacagcagccctgggctgcctggtcaaggactact540tccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacacct600tcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccct660ccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacacca720aggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcc780cagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggaca840ccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaag900accctgaggtcaagttcaacagccgcgggaggagcagtacaccaggactggctgaatggccccccatcgagaaaaccatcccctgcccccatcccgggataaggcttctatcccagcgacactacaagaccacgcctccctcaccgtggacaagagcaggaggctctgcacaaccactaccacggccggcaagcccccgcaccccgtgtacatacttcccgg<210〉2〈211〉715〈212〉DNA〈213〉人〈400〉2cgccaccatggtgttgcagactacggggatatcgtgctgatgcgaccctgagctgcagaggcagaaaccaggtcaagcacggtcccggcgcgttttagcgcctggaacctgaagactttgctttggccagggtacgaaagcttcccgccatctgatgagctaacttctatcccagagaggtaactcccaggagagtgtcatggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaa%0aacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgc1020aaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccag1080tccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtaca1140gagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtca1200atcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaaca1260gtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagc1320tggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatg1380acacagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgagtgc1440tccccaggctctcggggtcgcgcgaggatgcttggcacgt1500aggcacccagcatggaaata犯gcacccagcgcttccctg15601562cccaggtcttcatttctctgttgctctggatctctggtgc60cccagagcccggcgaccctgagcctgtctccgggcgaacg120cgagccagtatgttgatcgtacttatctggcgtggtacca180cgcgtctattaatttatggcgcgagcagccgtgcaactgg240gctctggatccggcacggattttaccctgaccattagcag!300cgacttattattgccagcagatttattcttttcctcatac360ttgaaattaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcat420agttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaa480ccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcggg540cagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcag600caccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcac660cca/tcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttc犯caggggagagtgttag715<210>3<211>31<212>腿<213>人工的<220><223〉人工序列的描述Gl.llSalfor,人抗AeIgGl重鏈5'末端引物〈400>3acgtgtcgacgccgccaccatgaaacacctg31<210>4<211>28<212>DNA<213>人工的<220><223>人工序列的描述Gl.11Ba虹ev，人抗APIgGl重鏈3'末端引物〈400>4acgtggatcctcatttacccggagacag28<210>5<211〉31<212>DNA〈213〉人工的〈220><223>人工序列的描述K.11Xhofor,人抗APIgGl輕鏈5'末端引物〈400>5acgtctcgaggccgccaccatggtgttgcag31<210〉6〈211〉29<212>腿〈213>人工的<220>〈223>人工序列的描述K.11Bglrev,人抗APIgGl輕鏈3'末端引物<400>6acgtagatctctaacactctcccctgttg29<210〉7〈211〉27<212〉DNA<213>人工的<220><223>人工序列的描述5H2KP，人抗APIgGl重鏈基因PCR引物<400〉7atgaattcacagtttcacttctgcacc27〈210>8<211>20<212>腿<213>人工的〈220><223>人工序列的描述G1.0501,人抗IgGl重鏈基因PCR引物<■>8tgtactccttgccattcagc20<210>9<211>27<212>薩<213>人工的〈220〉<223>人工序列的描述5H2KP,人抗APIgGl輕鏈基因PCR引物<400>9atgaattcacagtttcacttctgcacc27<210>10<211>20〈212>醒<213>人工的<220><223>人工序列的描述K.44,人抗AeIgGl輕鏈基因PCR引物〈400>10gctcatcagatggcgggaag20權(quán)利要求1、轉(zhuǎn)基因非人動物在制備針對目的抗體的抗獨特型抗體中的應(yīng)用，其中所述非人動物為外源抗體轉(zhuǎn)基因動物，并且其中所述目的抗體與所述外源抗體具有相同同種型。2、權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述外源抗體和目的抗體為人抗體或人源化抗體。3、權(quán)利要求1或2的應(yīng)用，其中所述外源抗體和目的抗體為IgG抗體。4、制備針對目的抗體的抗獨特型抗體的方法，其包括a)產(chǎn)生外源抗體轉(zhuǎn)基因非人動物，b)在所述轉(zhuǎn)基因非人動物中誘導(dǎo)針對目的抗體的免疫應(yīng)答，其中目的抗體與外源抗體具有相同同種型，以及c)制備直接針對目的抗體獨特型部分的抗體。5、權(quán)利要求4的方法，其中所述方法包括另一步驟d)分離抗獨特型抗體。6、權(quán)利要求4或5的方法，其中所述外源抗體和目的抗體為人抗體或人源化抗體。7、權(quán)利要求4-6中任一項的方法，其中所述外源抗體和目的抗體為IgG抗體。8、與本文前述記載實質(zhì)上相同、特別是參考前述實施例的方法和應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及外源抗體轉(zhuǎn)基因非人動物在制備抗獨特型抗體中的應(yīng)用，以及制備抗獨特型抗體方法，該方法包括a)產(chǎn)生外源抗體轉(zhuǎn)基因非人動物，b)在該轉(zhuǎn)基因非人動物中誘導(dǎo)針對目的抗體的免疫應(yīng)答，其中目的抗體含有與外源抗體相同種類的特異性同種型，以及c)制備針對目的抗體獨特型部分的抗體。文檔編號C07K16/18GK101186651SQ200710194470公開日2008年5月28日申請日期2007年11月6日優(yōu)先權(quán)日2006年11月6日發(fā)明者A·伊格萊希亞斯,H·貝克,M·措赫爾,T·施萊特米勒申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司