專利名稱：抗病植物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及其基因組中整合有編碼NRC1蛋白(I型HR相關(guān)的細(xì) 胞死亡必需的NB-LRR (互B-LRR且equired for HR-associated gel 1 Death l))的基因的轉(zhuǎn)基因植物和植物細(xì)胞，以及制備這樣的植物和細(xì)胞的 方法。具體地說，提供了具有增強(qiáng)抗病性的茄科植物和植物部分(種 子、果實(shí)、葉等)。除了本發(fā)明的分離的NRC1蛋白本身以外，還提供 了編碼該NRC1蛋白的分離的核酸分子、含有這些核酸分子的載體。此 外，提供了在內(nèi)源性W"等位基因中包含一個(gè)或多個(gè)突變的植物細(xì)胞 和植物，由此所述一個(gè)或多個(gè)突變賦予所述植物和植物細(xì)胞增強(qiáng)的抗 病性。
背景技術(shù)：
在由抗性基因介導(dǎo)的對(duì)病原體無毒性因子的識(shí)別時(shí)所觸發(fā)的植物 主動(dòng)防御遵循基因-對(duì)-基因模型(gene-f or-gene model) ( Dangl and Jones, 2001， Nature 411， 826-833 )。迄今為止，已經(jīng)克隆了多個(gè)植 物抗性基因(R基因)，并且基于這些基因編碼的蛋白的結(jié)構(gòu)將它們分 成多個(gè)組(Hammond-Kosack and Jones, 1997， Annu. Rev. Plant Phys iol. PlantMolec. Biol. 48， 575-607 )。大多數(shù)的R基因編碼細(xì)胞質(zhì)NB-LRR 蛋白，該蛋白包含一個(gè)核普酸結(jié)合位點(diǎn)(NB)和富含亮氨酸的重復(fù)單元
(LRR)。該組由編碼以下兩類蛋白的基因組成含巻曲螺旋結(jié)構(gòu)域的 CC-NB-LRR蛋白，以及具有類似于哺乳動(dòng)物Toll和白細(xì)胞介素(IL )受 體的結(jié)構(gòu)域的蛋白——即所謂的TIR-NB-LRR蛋白(Hammond-Kosack and Jones, 1997，見上文)。
為了獲得持久的抗性而將這些特異性抗性基因用于育種程序中是 有問題的，這是因?yàn)椴≡w可通過其無毒性因子的突變輕易地繞過識(shí) 另'J,從而不會(huì)i秀導(dǎo)主動(dòng)防雄卩(Wester inka/. ， 2004， Mol. Microbiol. 54, 533-545 )。抗性蛋白(R蛋白)的相似性表明存在共同的抗性通路
(Shirasu and Schulze-Lefert， 2000， Plant Mol. Biol. 44，371-385 )。因此，對(duì)抗性所需的其他基因的鑒定不僅可提供關(guān)于這些 信號(hào)通路如何發(fā)揮功能的信息，而且還有可能使得我們能夠鑒定在抗 性中發(fā)揮更普遍作用的基因。例如，本生煙草(vV/co〃a/ a 6e/ "a巡/a/7a) 中的病毒誘發(fā)的基因沉默(VIGS)表明，SGT1參與多個(gè)防御通路一 _ 例如N介導(dǎo)的、Rx介導(dǎo)的和Pto介導(dǎo)的HR和抗性，以及Cf-4介導(dǎo)的和 Cf-9介導(dǎo)的HR (Peart e"/. ， 2002， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 10865-10869; Zhang a/. ， 2004， Plant J. 40, 213-224 )。 SGT1是 SKP1的相互作用子，后者是參與蛋白泛素化的SCF E3連接酶復(fù)合體的 一個(gè)組件，蛋白泛素化是一種將蛋白靶向降解的修飾(Schwechheimer and Schwager， 2004， Plant Cell Reports 23， 353-364 )。有這樣的 猜測(cè)，即將該蛋白降解系統(tǒng)的必需基因沉默會(huì)阻礙泛素化過程，從而抑 制負(fù)調(diào)節(jié)蛋白的降解一 一這是防御激活所需要的(Azevedo W W., 2002, Science 295， 2073-2076 )。
在多個(gè)抗性通路中，MAPK(絲裂原激活的蛋白激酶)被激活(Zhang andKlessig， 2001， Trends Plant Sci. 6， 520-527; Pedley and Martin, 2005， Curr. Opin. Plant Biol. 8, 541—547 )。在以j吖夕攻擊且含 的煙草植林和細(xì)胞培養(yǎng)物中，NtWIPK (損傷誘導(dǎo)的蛋白激酶)和NtSIPK (水楊酸誘導(dǎo)的蛋白激酶)被激活(Romeis a/. ， 1999, Plant Cell 11， 273-287 )。本生煙草中NtCDPK (釣依賴性蛋白激酶)的VIGS會(huì)抑 制(7/-夕/^/"夕依賴的HR和6T-4/^i^依賴的HR (Romeis W., 2001, EMBO J. 20， 5556-5567 )，并且番茄中LeACIKl ( J w/T/"誘導(dǎo)的激酶1) 的VIGS導(dǎo)致黃枝孢霉(/"/razz/)抗性的減小(Rowland W a/. ， 2005， Plant Cell 17， 295-310 )。在防雄p過程中激酶的激活以及它們的編碼基 因被"敲低(knock-down )"時(shí)抗性的減小證實(shí)了它們?cè)诜烙せ钪械淖?用。
依照有偏倚的方法(biased approach),使用21個(gè)已知參與防御 相關(guān)的信號(hào)傳遞的基因在番茄中進(jìn)行VIGS,它們中的9個(gè)被發(fā)現(xiàn)參與 戶&介導(dǎo)的抗性。其中有兩個(gè)基因編碼MAPKK(LeMEKl和LeMEK2)，并 且有兩個(gè)基因編碼MAPK ( LeNTF6和LeWIPK) ( Ekengren " , 2003， Plant J. 36， 905-917 )。在另一項(xiàng)研究中，來自本生煙草的標(biāo)準(zhǔn)cDNA 庫的超過2400條cDNA被克隆進(jìn)基于馬鈴薯X病毒的載體中，并且用 于在本生煙草中進(jìn)行VIGS。約3°/。的所述cDNA在^皮沉默時(shí)影響了依賴的HR。其中，MAPKKKa被鑒定為抗性和疾病兩者的正調(diào)節(jié)子(Del Pozo ef a/. ， 2004, EMB0 J. 23, 3072-3082 )。
Lu等人(2003， EMBO J. 22， 5690-5699 )使用來自本生煙草標(biāo)準(zhǔn) cDNA庫并且克隆進(jìn)PVX載體中的4992條cDNA進(jìn)行了 VIGS。在這些 cDNA中，有79條(1. 6%)與,"介導(dǎo)的HR必需的基因相對(duì)應(yīng)，而僅 將其中的6條沉默也破壞了 Ao介導(dǎo)的抗丁香假單胞菌(Aez^o邁^7" y/n'A^e)抗性。使用與HSP90對(duì)應(yīng)的cDNA的VIGS不但消除了 Ao介 導(dǎo)的HR，而且消除了 /Vo介導(dǎo)的、Ai介導(dǎo)的和#介導(dǎo)的抗性，這表明 HSP90在多個(gè)抗病性通路中是必需的。同一組cDNA也用于在#轉(zhuǎn)基因的 本生煙草中進(jìn)行VIGS，之后用TMV的GFP標(biāo)記植林接種所述植物。用從 編碼CC-NB-LRR的基因——稱為A^67(N必需基因l(^Requirement且ene 1))——衍生的cDNA片段沉默時(shí)最顯著地抑制了抗TMV抗性(Peart a/. ， 2005, Curr. Biol. 15， 968-973 )。已證明是#基因功能特 別必需的，這表明CC-NB-LRR蛋白不但作為參與無毒性因子識(shí)別的抗 性蛋白，而且參與由TIR-NB-LRR蛋白^啟動(dòng)的信號(hào)傳遞通路，所述通 路最終導(dǎo)致抗性(Peart W W. ， 2005，見上文)。因此，雖然所述煙 草NRG1蛋白在由抗性蛋白啟動(dòng)的植物防御信號(hào)傳遞級(jí)聯(lián)的下游起作 用，但是它有以下的缺點(diǎn)它特異性地參與Y介導(dǎo)的抗煙草花葉病毒 (TMV)抗性，并且不是一般的抗病性輔因子() i介導(dǎo)的和Ao介導(dǎo)的 抗PVX抗性和抗丁香假單胞菌抗性不受NRG1沉默的影響)，由此它可能 不適合在作物例如番茄中產(chǎn)生廣鐠的病原體抗性。
雖然關(guān)于抗病性通路的信息在不斷增加，但是仍然有鑒定這樣的 基因和蛋白的需求，即它們可以被用于產(chǎn)生具有持久的、廣譜的抗病 性的植物。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供這樣的核酸、蛋白和方法，用于 產(chǎn)生具有增強(qiáng)抗病性的植物，特別是屬于茄科的植物。
一般性定義
"HR"是指過敏反應(yīng)，即局部的植物細(xì)胞死亡，表現(xiàn)為微觀損傷 (如Rivas and Thomas, 2005， Arm Rev Phytopath 43: 395-436描述 的)和/或宏觀損傷。過敏性細(xì)胞死亡通常與其他的植物應(yīng)答相關(guān)聯(lián)一 —例如活性氧簇的產(chǎn)生和HR損傷周圍細(xì)胞中防御相關(guān)基因的激活。
"植物病原體"是指能夠引起植物疾病的生物物質(zhì)(biotic agent)例如植物病原性真菌、細(xì)菌、病毒、卵菌、支原體樣生物體、線蟲、 粉虱、蜂蟲等。通常，本文包括能夠引起宿主組織疾病的病原體種的
所有菌林、小種(race)或致病變型。
"活體營養(yǎng)性植物病原體"或"活體營養(yǎng)"是指保持宿主植物細(xì) 胞存活并且其生長(zhǎng)和組織定殖依賴于活細(xì)胞的病原體。
"半活體營養(yǎng)性植物病原體"或"半活體營養(yǎng)"是指至少在其部
分生命周期中保持宿主細(xì)胞存活的植物病原體。
"死體營養(yǎng)性植物病原體"是指通過產(chǎn)生殺死宿主細(xì)胞的有毒性 的酶、蛋白或代謝物，在組織定殖時(shí)主動(dòng)殺死植物細(xì)胞的植物病原體。
"不依賴誘導(dǎo)子的HR"是指在不存在病原體或病原體誘導(dǎo)子(例 如真菌Jk蛋白)的情況下發(fā)生的過敏反應(yīng)。
當(dāng)提及表達(dá)本發(fā)明的NRC1蛋白(例如有組成型活性的NRC1蛋白) 的植物時(shí)，還應(yīng)區(qū)分"組成型HR"和"i秀導(dǎo)型HR'，，所述"組成型HR" 指在不存在病原體或病原體誘導(dǎo)子蛋白時(shí)發(fā)生的HR損傷，所述"誘導(dǎo) 型HR"是指在誘導(dǎo)性刺激物出現(xiàn)后(例如在對(duì)驅(qū)動(dòng)編碼NRC1蛋白或 其變體的核酸序列表達(dá)的啟動(dòng)子進(jìn)行誘導(dǎo)后)發(fā)生的HR損傷。
"茄科(5V /a/7aceae)"在本文中是指屬于茄科的植物的屬、種及 其變種。它們包括下列屬的種茄屬(genus Jo/a/ 咖)(包括番茄 (5Wa/ w邁 /7Cope,"'c咖),它以前被稱為番癡 (Z7co/7em'co/ escw/e/7fw邁))、煙草(vV7cof/a/ a )屬、辣豐權(quán)(rsps/c^/iz )屬、碧冬癡 (戶"w/72.a)屬和其他屬。
"抗病性"在本文中是指植物的各種水平的抗病性或耐病性，包 括對(duì)一種或多種病原體的中抗性和高抗性或完全抗性。通過將病原體 引起的癥狀(例如HR損傷、真菌菌絲體等的頻率和/或大小)與在相 同疾病壓力下生長(zhǎng)的敏感性對(duì)照植物中出現(xiàn)的癥狀比較，可以測(cè)定并 4壬選地定量抗病性。這些疾病生物測(cè)定可以4吏用已知方法進(jìn)行。也可 以基于在疾病壓力生長(zhǎng)下時(shí)抗性植物比敏感植物高的產(chǎn)量間接地測(cè)定 抗病性。
"增強(qiáng)的抗病性"是指與合適的對(duì)照相比植物或植物組織抗病性 的任何統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的增加。本文涵蓋定性的增加(例如從敏感變成 抗性)和定量的增加。還涵蓋發(fā)病率(正在被感染植物的百分?jǐn)?shù))的 減小和/或疾病嚴(yán)重度的減輕。優(yōu)選地，對(duì)至少一種病原體具有增強(qiáng)的抗病性的植物是與對(duì)照植物相比包含至少1°/。、 2%、 5%、 10%、 15°/。、 20%、 30%、 50%、 70%、 80%、 90%或者甚至100%的更高水平的對(duì)所述病原體抗 性的植物，使用合適的生物測(cè)定和/或田間測(cè)定來評(píng)估抗病性。
"廣i普的"抗病性是指對(duì)不同病原體種的至少兩種、三種、四種 或更多種病原體有增強(qiáng)的抗性。例如，對(duì)多個(gè)活體營養(yǎng)性病原體種和/ 或半活體營養(yǎng)性病原體種和/或死體營養(yǎng)性病原體種具有增強(qiáng)的抗性 的宿主植物可以被認(rèn)為具有廣語的抗性。
"病原體引起的癥狀"包括任何的疾病癥狀——例如在所述宿主 組織上/中的菌絲體生長(zhǎng)/生物量、細(xì)菌生長(zhǎng)/生物量、在植物組織上壞 死損傷或失綠損傷的大小和/或頻度、潰瘍的大小和/或頻度等。
術(shù)語"核酸序列"(或核酸分子)是指單鏈或雙鏈形式的DNA分子 或RNA分子，特別是編碼本發(fā)明的蛋白或蛋白片段的DNA。"分離的核 酸序列，，是指不再處于可從其中分離出它的天然環(huán)境中的核酸序列， 例如在細(xì)菌宿主細(xì)胞中或者在植物細(xì)胞核基因組或質(zhì)?；蚪M中的核 酸序列。
術(shù)語"蛋白"或"多肽"可互換使用，指由氨基酸鏈組成的分子， 不涉及具體的作用模式、大小、3維結(jié)構(gòu)或來源。因此蛋白的"片段" 或"一部分"仍然可以被稱為"蛋白"。"分離的蛋白"用來指脫離其 天然環(huán)境的蛋白，例如在體外或者在重組的細(xì)菌或植物宿主細(xì)胞中的 蛋白。
"功能的"與NRC1蛋白(或者變體(例如直系同源物或突變體) 和片段)一塊使用的時(shí)候是指通過改變植物中編碼NRC1的基因的表達(dá) 水平(例如通過過表達(dá)或沉默)，(定量地和/或定性地)改變HR損傷 發(fā)生和/或抗病性水平的能力。例如，可以通過多種方法測(cè)試植物種X 的推定NRC1蛋白的功能性。如果所述蛋白是有功能的，那么使用例如 VIGS或基因沉默載體在植物種X中沉默編碼所述蛋白的W67基因?qū)p 少或抑制病原體誘導(dǎo)的或誘導(dǎo)子誘導(dǎo)的HR損傷并且/或者減少病原體 抗性(如番茄的實(shí)施例所示)。同樣，功能性NRC1蛋白的補(bǔ)充將能夠 恢復(fù)HR損傷和/或病原體抗性。或者，編碼NRC1蛋白(任選地連同轉(zhuǎn) 錄后基因沉默抑制蛋白)的基因在物種X中短暫地或穩(wěn)定地(過)表 達(dá)將導(dǎo)致不依賴于誘導(dǎo)子的HR損傷的發(fā)生和/或抗病性(尤其是抗活 體營養(yǎng)性病原體和/或半生體營養(yǎng)性病原體的抗病性)的增加。亦參見實(shí)施例。
術(shù)語"基因"意為包含在細(xì)胞中被轉(zhuǎn)錄成RNA分子(例如mRNA)的 區(qū)域(轉(zhuǎn)錄區(qū)域)的DNA序列，可操作地連接合適的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域(例如 啟動(dòng)子)。因此基因可以包含幾個(gè)可操作連接的序列，例如啟動(dòng)子、包 含例如參與翻譯起始的序列的5，前導(dǎo)序列、(蛋白)編碼區(qū)(cDNA或基 因組DNA)和包含例如轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)的3，非翻譯序列。
"嵌合基因"(或重組基因)是指不是在一個(gè)物種中正常天然存在 的任何基因，特別是其中存在的核酸序列的一個(gè)或多個(gè)部分在天然情 況下彼此沒有聯(lián)系的基因。例如，啟動(dòng)子在天然情況下與部分或全部 的轉(zhuǎn)錄區(qū)域沒有聯(lián)系，或者與另一調(diào)控區(qū)域沒有聯(lián)系。術(shù)語"嵌合基 因，，可以理解為包括表達(dá)構(gòu)建體，其中啟動(dòng)子或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列可操作 地連接至一條或多條編碼序列或者至反義序列(所述正義鏈的反向互 補(bǔ)序列)或反向重復(fù)序列(正義的和反義的，由此所述RNA轉(zhuǎn)錄物在 轉(zhuǎn)錄時(shí)形成雙鏈RNA)。
"3' UTR"或"3，非翻譯序列"(經(jīng)常也被稱為3'非翻譯區(qū)或3， 端)是指在基因的編碼序列下游存在的核酸序列，它包含例如轉(zhuǎn)錄終 止位點(diǎn)和(在大部分但非全部的真核mRNA中)多腺苷酸化信號(hào)(例如 AAUAAA或其變體等)。在轉(zhuǎn)錄終止后，可以切除所述mRNA轉(zhuǎn)錄物下游 的多腺苷酸化信號(hào)并且加上多腺苷酸的尾，該尾參與所述mRNA到細(xì)胞 質(zhì)(進(jìn)行翻譯的位置)的轉(zhuǎn)運(yùn)。
"基因的表達(dá)"所指的過程是可操作地連接有合適的調(diào)節(jié)區(qū)域(特 別是啟動(dòng)子)的DNA區(qū)域被轉(zhuǎn)錄成有生物活性的RNA，即它能夠被翻譯 成具有生物活性的蛋白或肽(或活性肽片段)或者它自身具有活性(例 如在轉(zhuǎn)錄后的基因沉默中或RNAi中)。在某些實(shí)施方案中的活性蛋白 是指具有組成型活性的蛋白。編碼序列優(yōu)選地為正義方向并且編碼所 需的、有生物活性的蛋白或肽或者活性的肽片段。在基因沉默方法中， 所述DNA序列優(yōu)選地以反義DNA或反向重復(fù)DNA的形式存在，包含所 述靶基因的反義方向的短序列或者正義和反義方向的短序列。"異位表 達(dá)，，是指在正常情況下不表達(dá)所述基因的組織中的表達(dá)。
"轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列"在本文中被定義為能夠調(diào)節(jié)與所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控序 列可操作地連接的(編碼)序列的轉(zhuǎn)錄速率的核酸序列。因此本文定 義的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列將包含啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄(啟動(dòng)子元件)、維持和調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄(包括例如弱化子或增強(qiáng)子)必需的所有序列元件。雖然提及的主要是編碼
序列的上游(5，)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，但是在編碼序列下游(3，)存在的調(diào)節(jié)序 列也嚢括在該定義中。
本文使用的術(shù)語"啟動(dòng)子"是指起到控制一個(gè)或多個(gè)基因轉(zhuǎn)錄作 用的核酸片段，它位于所述基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄方向上的上游， 并且結(jié)構(gòu)特征為存在DM依賴的RNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄起始位 點(diǎn)和任何其他的DNA序列一一包括但不限于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、阻遏 蛋白和激活蛋白結(jié)合位點(diǎn)，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的直接或間接起 到調(diào)節(jié)該啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄量的任何其他核苷酸序列。"組成型"啟動(dòng)子是在 大多數(shù)生理和發(fā)育條件下在大多數(shù)組織中有活性的啟動(dòng)子。"誘導(dǎo)型" 啟動(dòng)子是受生理調(diào)控的啟動(dòng)子(例如通過外部給予某些化合物)或者 受發(fā)育調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子。"組織特異性"啟動(dòng)子僅在特定類型的組織或細(xì) 胞中有活性。"在植物或植物細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子，，是指啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng) 在植物或植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的一般性的能力。它不涉及所述啟動(dòng)子的時(shí) 間空間的活性。
本文使用的術(shù)語"可操作地連接"是指多聚核苷酸元件之間在功 能聯(lián)系方面的連接。當(dāng) 一個(gè)核酸與另 一個(gè)核酸序列具有功能聯(lián)系時(shí)該 核酸是"可操作地連接的"。例如，若啟動(dòng)子或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列影響編碼 序列的轉(zhuǎn)錄，則它們可操作地連接至該編碼序列?？刹僮鞯剡B接的意 思是被連接的DNA序列通常是鄰接的，并且在需要把兩個(gè)蛋白編碼區(qū) 域連接時(shí)是鄰接的且在閱讀框內(nèi)的，從而產(chǎn)生"嵌合蛋白"。"嵌合蛋 白"或"雜合蛋白"是由多個(gè)蛋白"結(jié)構(gòu)域"(或基序)構(gòu)成的、其自 身在自然界中并不存在的蛋白，但是所述蛋白"結(jié)構(gòu)域"(或基序)被 連接起來會(huì)形成功能蛋白，它表現(xiàn)出被連接的結(jié)構(gòu)域(例如可以將巻 曲螺旋結(jié)構(gòu)域(CC )、核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(NB-ARC )和富含亮氨酸的重 復(fù)(LRR)區(qū)結(jié)合起來)的功能性。嵌合蛋白還可以是兩種或多種天然 存在的蛋白的融合蛋白。本文使用的術(shù)語"結(jié)構(gòu)域"意思是具有特定 結(jié)構(gòu)或功能的蛋白的任何一個(gè)或多個(gè)部分或結(jié)構(gòu)域，該蛋白的所述部 分或結(jié)構(gòu)域可以被轉(zhuǎn)移至另一種蛋白用于提供一種至少具有所述結(jié)構(gòu) 域的功能特征的新的雜合蛋白。特定的結(jié)構(gòu)域還可以用于鑒定其他的 NRC1蛋白，例如來自其他植物種的NRC1直系同源物。
術(shù)語"靶向肽"是指將蛋白或蛋白片段靶向至胞內(nèi)細(xì)胞器例如質(zhì)體(優(yōu)選葉綠體、線粒體)，或者至細(xì)胞外間隙或質(zhì)外體(分泌信號(hào)肽) 的氨基酸序列。編碼靶向肽的核酸序列可以與編碼所述蛋白或蛋白片
段的氨基末端(N-末端)的核酸序列融合(在閱讀框內(nèi))，或者可以用 于替代天然的有靶向作用的肽。
"核酸構(gòu)建體"或"載體，，在本文可理解為使用重組DNA技術(shù)產(chǎn) 生并用于把外源DNA送遞至宿主細(xì)胞內(nèi)的人造核酸分子。載體骨架可 以是例如雙元或超雙元載體(例如參見US 5591616、 US 2002138879和 WO 95/06722)、共整合載體或T-DNA載體(這是本領(lǐng)域已知的并且如本 文其他部分所述)，其中整合有嵌合基因，或者，若已存在合適的轉(zhuǎn)錄 調(diào)節(jié)序列，則僅所需核酸序列(如編碼序列、反義序列或反向重復(fù)序列) 被整合于該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列的下游。載體通常包含有利于將其用于分子 克隆的另外的遺傳元件，例如可選擇標(biāo)記、多克隆位點(diǎn)等等(見下文)。
術(shù)語"宿主細(xì)胞"或"重組宿主細(xì)胞"或"轉(zhuǎn)化的細(xì)胞"是指將 至少一種核酸分子一一特別是包含編碼所需蛋白的嵌合基因或者包含 在轉(zhuǎn)錄時(shí)可產(chǎn)生用于沉默靶基因/基因家族的反義RNA或反向重復(fù) RNA(或發(fā)夾RNA)的核酸序列——引入所述細(xì)胞而產(chǎn)生的新個(gè)體細(xì)胞 (或生物體)。所述宿主細(xì)胞優(yōu)選地是植物細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞。所述宿主 細(xì)胞可以包含作為染色體外(附加型)復(fù)制分子的核酸構(gòu)建體，或者更 優(yōu)選地包含整合進(jìn)入宿主細(xì)胞的核基因組或質(zhì)體基因組中的嵌合基 因。在本文的全文中，術(shù)語"宿主，，還可以指病原體能夠侵入或感染 的宿主植物種，但是根據(jù)上下文這種情況將會(huì)是清楚的。對(duì)于一種病 原體而言，可以將植物種分成"宿主"種或"非宿主"種。"非宿主" 種對(duì)于病原體所有的小種或菌林的病原體感染都是完全免疫的一一甚 至在疾病發(fā)生的最佳條件下。所述"宿主"種也被稱為病原體的"宿 主范圍"，并且對(duì)于病原體的某些(但非全部)小種是有免疫力的。
術(shù)語"可選擇標(biāo)記"是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟悉的術(shù)語，并且在 本文用于描述任何遺傳實(shí)體，當(dāng)其被表達(dá)的時(shí)候可以用于選擇包含所 述可選擇標(biāo)記的一種或多種細(xì)胞?？蛇x擇標(biāo)記基因產(chǎn)物賦予例如抗生 素抗性或者更優(yōu)選除草劑抗性或另一種可選擇的性狀，例如表型特征 (例如色素沉著的變化)或營養(yǎng)需求。術(shù)語"報(bào)告物(reporter)"主要 用于指可見的標(biāo)記物例如綠色熒光蛋白(GFP) 、 eGFP、螢光素酶、GUS 等等。術(shù)語基因或蛋白的"直系同源物"在本文中是指在其他物種中出 現(xiàn)的同源基因或蛋白，它與所述基因或蛋白有相同的功能，但是(通常) 從含有所述基因的物種分化的時(shí)間點(diǎn)開始出現(xiàn)序列的分化(即從共同 祖先通過物種形成演化而來的基因)。因此可以同時(shí)基于序列比較(例 如基于整條序列或特定區(qū)域的序列同一性百分比)和功能分析在其他 植物種中識(shí)別番茄Z 7"C J基因的直系同源物。
術(shù)語"同源的"和"異源的"是指核酸或氨基酸序列與其宿主細(xì) 胞或生物體之間的關(guān)系，特別是在轉(zhuǎn)基因生物體的情況下。因此同源 序列可以在宿主物種中天然存在(例如用番茄基因轉(zhuǎn)化的番茄植物)， 而異源序列不會(huì)在宿主細(xì)胞中天然存在(如用馬鈴薯植物的序列轉(zhuǎn)化 的番茄植物)。根據(jù)上下文，所述術(shù)語"同源"或"同源的"均可以指 來自共同祖先序列的序列(例如它們可以是直系同源物)。
"嚴(yán)格雜交條件，，可以用于辨別這樣核苷酸序列，該核苷酸序列 與給定核苷酸序列基本相同。嚴(yán)格條件是序列依賴的并且在不同的環(huán)
境中會(huì)有差異。通常，選擇在確定的離子強(qiáng)度和pH下較具體序列的熱 熔點(diǎn)(TJ低約5'C的嚴(yán)格條件。Tm是(在確定的離子強(qiáng)度和pH下)50% 的靶序列與完全匹配探針雜交的溫度。選擇典型的嚴(yán)格條件，其中在 pH7下鹽濃度為約0. 02摩爾，溫度不低于60。C。降低鹽濃度和/或升 高溫度可提高嚴(yán)格度。RNA-DNA雜交(使用例如100個(gè)核苦酸的探針的 RNA印跡法)的嚴(yán)格條件為例如那些包括于63t:在0. 2X SSC中至少洗滌 一次，持續(xù)20分鐘的條件或者與之等價(jià)的條件。DNA-DNA雜交(使用例
50n (通常;約55。C)的溫度下在0. 2X SSC中i滌至少一次("k常2次): 持續(xù)20分鐘的條件或者與之等價(jià)的條件。亦參見Sambrook等人(1989) 和Sambrook and Russell (2001)。
"序列同一性，，和"序列相似性"可以通過使用全局或局部比對(duì) 算法比對(duì)兩個(gè)肽或兩個(gè)核苷酸序列確定。當(dāng)序列(當(dāng)通過例如使用默認(rèn) 參數(shù)的程序GAP或BESTFIT進(jìn)行最佳比對(duì)時(shí))共有至少某一最小百分?jǐn)?shù) 的序列同一性(在下文中定義)時(shí)，那么它們可以被稱為是"大體相同 的"或"基本相似的"。GAP使用Needleman和Wunsch全局比對(duì)算法對(duì) 兩個(gè)序列進(jìn)行全長(zhǎng)比對(duì)，使匹配的數(shù)目最大化并使空位的數(shù)目最小化。 通常使用GAP的默認(rèn)參數(shù)，其空位產(chǎn)生罰分=50(核苷酸)/8(蛋白)，空位擴(kuò)展罰分=3(核苷酸)/2(蛋白)。對(duì)核苷酸而言，使用的默認(rèn)打分矩陣是 nwsgapdna,而對(duì)蛋白而言，f犬i人打分頭巨陣是Blosum62 (Henikof f & Henikoff， 1992， PNAS 89， 915-919)。序列比對(duì)和序列同 一性百分?jǐn)?shù) 得分可通過使用計(jì)算機(jī)程序例如GCG Wisconsin Package (版本IO. 3,從 Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752 USA 獲得)或版本2. 10. 0的EmbossWin U吏用考呈序"needle")確定?；蛘撸?可以通過使用FASTA、 BLAST等算法搜索公共數(shù)據(jù)庫確定相似性或同 一性 的百分?jǐn)?shù)。
在該文本及其權(quán)利要求書中，動(dòng)詞"包含，，及其變化形式使用其 非限制含義，意為包括該詞之后接著的條目，但是并不排除沒有明確 指出的條目。另外，用不定冠詞"a(—)"或"an(—種)"提及某一要 素時(shí)，并不排除存在超過一種所述要素的可能性，除非文中清楚地要 求有且僅有一種該要素。因此，不定冠詞"a(—)"或"an(—種)"通 常指"至少一種"。還需要理解，當(dāng)在本文中提及"序列，，時(shí)，通常是 指具有某條亞單元(例如氨基酸)序列的真實(shí)的實(shí)體分子(physical molecule )。
本文使用的術(shù)語"植物"包括植物細(xì)胞、植物組織或器官、植物 原生質(zhì)體、可以再生植物的植物細(xì)胞組織培養(yǎng)物、植物愈傷組織、植 物細(xì)胞簇以及植物中完整的植物細(xì)胞或植物的部分(例如胚、花粉、 胚珠、果實(shí)(例如收獲的蕃茄)、花、葉、種子、根、根尖等)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人已經(jīng)使用cDNA-AFLP分析并結(jié)合VIGS (病毒誘發(fā)的基因 沉默)，用以鑒定參與C/、/4w^依賴的HR和抗病性的基因。在這些其 中VIGS導(dǎo)致JM4誘發(fā)的HR受抑制的基因中，鑒定了一個(gè)番茄基因(在 本文中被稱作A^G),它編碼CC-NB-LRR型抗性蛋白類似物(在本文中 被稱作iWC7: I型HR相關(guān)的細(xì)胞死亡必需的NB-LRR蛋白)。番茄中 的沉默不但消弱了 J"4誘導(dǎo)的HR的發(fā)生，而且減少了對(duì)番茄病原體黃 枝孢霉("ac^s/7oW咖/"/r咖)的抗性。這說明，番茄C/"-4抗性蛋白 (一種細(xì)胞外受體樣蛋白)需要細(xì)胞質(zhì)NB-LRR蛋白來發(fā)揮功能。
此外，本發(fā)明人吃驚地發(fā)現(xiàn)參與多個(gè)HR和多個(gè)抗病性/細(xì)胞死亡信號(hào)傳遞途徑，例如C/-夕/4汀-夕啟動(dòng)的HR、 Ze^/j^/fi7^啟動(dòng)的HR、 /Vo/^r戶&啟動(dòng)的HR和i^r/( 啟動(dòng)的HR(參見實(shí)施例)。還進(jìn)行了其他 測(cè)試以確定#) ^7是否還參與其他的HR例如#/'介導(dǎo)的HR (賦予對(duì)線蟲 類、粉虱和奸蟲誘發(fā)的HR的抗性；參見US 6613962和EP0937155B1)。 因此，NRC1參與由細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)抗病性蛋白觸發(fā)的HR途徑，所述抗 病性蛋白屬于不同的類細(xì)胞外受體樣蛋白(RLP，例如Cf-4、 Cf-9和 LeEix2)、 Ser/Thr蛋白激酶(例如Pto )以及CC-NB-LRR蛋白(Rx ),它 們分別賦予對(duì)真菌(黃枝孢霉(C/adM/7oW咖/7//^/巡)和綠色木霉 (7Wc力ocfei"鵬 ))、 細(xì)菌(丁香假單胞菌番茄致病變型
(/^ei/c^/z7O0i2S 5yW/^ae pv 或病毒(PVX )的抗性。
NRC1蛋白(以及編碼它的A^7基因)可以用于賦予或增強(qiáng)植物對(duì) 多種病原體(尤其是活體營養(yǎng)性病原體和半活體營養(yǎng)性植物病原體，而 且還有死體營養(yǎng)性植物病原體例如葡萄孢(A^iT〃;？)屬)的抗性。具 體地說，膽"(或者其變體或片段，如本文其他部分所定義的)的表達(dá) 導(dǎo)致針對(duì)病原體(尤其是活體營養(yǎng)性和半活體營養(yǎng)性病原體，即所有從 活細(xì)胞獲取養(yǎng)分的病原體)的抗性的增強(qiáng)。并非限制本發(fā)明的范圍，人
基因組局^突變(tilling;)可:用于賦予i^強(qiáng)對(duì)死體營養(yǎng)性:原體 的抗性，這是因?yàn)閷?dǎo)致壞死的通路受到影響而且死體營養(yǎng)性病原體需要 該通路。因此，根據(jù)需要對(duì)其增強(qiáng)抗性的所述一種或多種病原體，可以 使用升高或降低ywG表達(dá)水平以增強(qiáng)抗性。任選地，這兩種方法均可用 于同一植林中，例如處于不同的啟動(dòng)子控制之下。例如，v儀"可以在由 (半)活體營養(yǎng)性病原體誘導(dǎo)的啟動(dòng)子控制下表達(dá)，以賦予對(duì)活體營養(yǎng) 性和/或半活體營養(yǎng)性葉病原體的抗性，而在同時(shí)內(nèi)源性；W^7基因(或 基因家族)可在某些組織中或在由死體營養(yǎng)誘導(dǎo)時(shí)被沉默，所述誘導(dǎo)可 使用可由死體營養(yǎng)性病原體或創(chuàng)傷誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。
本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)有組成型活性的NRC1蛋白(NRC1D481V )在番茄 中短暫產(chǎn)生的時(shí)候，所述植物組織出現(xiàn)不依賴于誘導(dǎo)子的細(xì)胞死亡(HR), 這表明功能性NRC1蛋白的表達(dá)可以用于在植物中賦予或增強(qiáng)抗病性。
本發(fā)明的蛋白以及核酸序列
從番茄獲得的NRC1蛋白與煙草的NRG1有很低的序列同一性(低于25%)。與NRG1相比，NRC1還包含更多的富含亮氨酸的重復(fù)單元(LRR)。 NRC1的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)在圖1和SEQ ID NO: 2中示出。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中提供了 NRC1蛋白的核酸序列和氨基酸 序列(包括直系同源物)，也提供了用于分離或鑒別其他植物種(例如其 他的茄科植物(Jo/awceae)，優(yōu)選馬鈴薯)中的NRC1直系同源物的方 法。或者說，本文提供了用于分離或鑒定其他的膽"等位基因(例如來 自其他番茄種、變種、品系或種質(zhì)的等位基因)的方法。
在一個(gè)實(shí)施方案中提供了 NRC1蛋白。"NRC1蛋白，，包括SEQIDNO: 2 (野生型)和4 (組成型突變體)中所示的蛋白，也包括它們的片段和 變體。NRC1的變體包括例如與SEQ IDNO: 2和/或4至少有30、 35、 40、 45、 50、 55、 60、 65、 70、 75、 80、 85、 90、 95、 98、 99%或更高的氨基 酸序列同一性(在全長(zhǎng)上)的蛋白。氨基酸序列的同一性通過兩兩比對(duì) 確定，使用的是上文定義的Need 1 eman和Wunsch算法以及GAP默認(rèn)參數(shù)。 NRC1的變體可以來自于多種來源例如現(xiàn)有的序列數(shù)據(jù)庫，可以來自于其 他植物種(尤其是茄科的其他成員，例如馬鈴薯)或其他變種，或者它
們可以通過從頭合成、誘變等制備。例如，SEQ ID NO: 4---種具有
組成型活性的NRC1突變體——是SEQ ID NO: 2的變體，并且是通過使 用重疊PCR的定向誘變制備的(參見實(shí)施例)。因此，本發(fā)明的NRCl蛋 白可以從天然來源中分離，通過化學(xué)合成從頭合成(使用例如由如 Applied Biosystems提供的肽合成儀)，或者由重組宿主細(xì)胞通過表達(dá) 編碼NRC1蛋白、片段或變體的核酸序列產(chǎn)生。
NRC1變體可以包含相同類的保守氨基酸的置換，即堿性的(如Arg、 His、 Lys)、酸性的(如Asp、 Glu)、非極性的(如Ala、 Val、 Trp、 Leu、 Ile、 Pro、 Met、 Phe、 Trp)或極性的(如Gly、 Ser、 Thr、 Tyr、 Cys、 Asn、 Gln)。另外，非保守氨基酸置換在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
任何NRC1蛋白、變體或片段的功能性均可以使用多種方法確定。例 如，植物細(xì)胞中的短暫或穩(wěn)定的過表達(dá)可以用于測(cè)試所述蛋白是否在植 物中(//7/7/a/7")有活性。優(yōu)選在從其中獲得所述蛋白的相同植物種中 測(cè)試功能性。因此，例如短暫或穩(wěn)定表達(dá)可以用于確定HR是否發(fā)生和/ 或抗性是否被增強(qiáng)，進(jìn)而指示功能性?；蛘?，內(nèi)源基因或基因家族的沉 默將顯示NRC1蛋白是否是有功能的。例如，VIGS可以被用于多種茄科 植物例如馬鈴薯、番茄和煙草中(參見Brigneti a/. ， 2004， PlantJournal 39: 264; Faivre—Rampant et al. Plant Physiology 134: 1308-1316; Baulcombe 1999， Curr. Opinion. Plant Biol. 2: 109-113; Lu 2003， EMB0 J. 22:5690-5699 )、模式生物例如擬南齊
(^ra6/一"、)中(T證age et al. 2002, Plant J. 30: 107-114 ) 和單子葉植物例如大麥中(Holzberg a/. 2002, Plant J. 30: 315-327 )?；蛘?，包含y^"基因的正義和/或反義片段的沉默載體可以 被用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞(見下文)，之后通過測(cè)試確定發(fā)生HR損傷的能力 和/或抗病性是否有變化。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，NRC1的變體包括在植物細(xì)胞中有組成型 活性的NRC1蛋白——例如SEQ ID NO: 4中提供的NRC1蛋白，它包括在 MHD結(jié)構(gòu)域中的單氨基酸置換(D481V)(參見圖1)?？梢酝ㄟ^在不存在 誘導(dǎo)子的情況下確定所述蛋白是否能夠誘導(dǎo)植物組織中的HR來測(cè)試所 述組成型活性。例如，35S:NRC1構(gòu)建體的農(nóng)桿菌浸潤(如實(shí)施例中的描 述)可以用于浸潤葉組織。通過隨機(jī)誘變?nèi)缓筮M(jìn)行活性測(cè)試(如 Bendahame a/. ， 2002，第196頁中的描述)或者通過在MHD結(jié)構(gòu)域 中(氨基酸VHD或VHDM中的任一個(gè)可以用另 一個(gè)氨基酸替換)、在NB-ARC 結(jié)構(gòu)域例如RNBS-D結(jié)構(gòu)域中(氨基酸FLYFGTFPRGY )或在13個(gè)LRR結(jié) 構(gòu)域之一中進(jìn)行單個(gè)氨基酸的定向誘變(見圖1),可以制備其他具有組 成型活性的NRC1蛋白?；蛘?，編碼具有組成型活性的NRC1蛋白的核酸 序列可以從植物中獲得，例如通過對(duì)種子進(jìn)行誘變處理并篩選存在自發(fā) 性損傷表型(例如微觀的損傷)的種子，參見例如Sharino "a人(2002， The Plant Cell 14: 3149-3162 )和下文。
在一個(gè)實(shí)施方案中還提供了嵌合的NRC1蛋白。這樣的蛋白至少包含 一個(gè)CC結(jié)構(gòu)域、 一個(gè)NB-ARC結(jié)構(gòu)域，并且優(yōu)選地至少13個(gè)LRR。 CC 結(jié)構(gòu)域、NB-ARC結(jié)構(gòu)域和LRR結(jié)構(gòu)域優(yōu)選地是指包含分別與SEQ ID NO: 2的第1-150位氨基酸、第151-508位氨基酸或第509-846位氨基酸有 至少30、 40、 50、 60、 70、 80、 90、 95、 98、 99%或更高的氨基酸序列 同一性的氨基酸基序。因此，可以在NRC1蛋白之間或者在NRC1蛋白和 其他的CC-NB-LRR或TIR-NB-LRR蛋白間交換結(jié)構(gòu)域(結(jié)構(gòu)域交換)，只 要產(chǎn)生的嵌合蛋白的功能性與NRC1的功能性或者優(yōu)選地與NRClD^v的 功能性基本上類似。最優(yōu)選地，當(dāng)重組植物細(xì)胞產(chǎn)生所述嵌合蛋白的時(shí) 候(如下文所述)，該蛋白保持賦予抗病性或增強(qiáng)抗病性的能力。NRC1蛋白的"片段，，和NRC1蛋白的變體的"片段"(如上文所述) 包含具有100、 150、 200、 300、 400、 500、 600、 700、 800、 850、 855 個(gè)或更多個(gè)連續(xù)氨基酸的片段。優(yōu)選地，這樣的片段在植物組織中是有 功能的，即當(dāng)它們?cè)谥参锛?xì)胞中產(chǎn)生的時(shí)候能夠賦予或增強(qiáng)病原體抗性。 片段還可以用于制備如上文所述的嵌合蛋白。
在另一個(gè)實(shí)施方案中提供了編碼任一種上述蛋白、變體或片段的分 離的核酸序列——例如cDNA、基因組DNA和RNA序列。由于遺傳密碼子 的簡(jiǎn)并性，多種核酸序列可以編碼相同的氨基酸序列。4壬何編碼NRC1 蛋白或變體的核酸序列在本文中均被稱作"y^""。所提供的核酸序列包 括天然存在的核酸序列、人工核酸序列或合成核酸序列。編碼NRC1蛋白 的核酸序列的實(shí)例在SEQ ID NO: l和3中給出。需要理解的是，當(dāng)序列 以DNA序列的形式給出而在指代RNA時(shí)，該RNA分子的實(shí)際堿基序列是 相同的，差異僅是由尿嘧啶(U)代替胸腺嘧啶(T)。
本發(fā)明還包括W"核酸序列的變體和片段，例如在所定義的嚴(yán)格雜 交條件下與膽"核酸序列雜交的核酸序列。膽"核酸序列的變體還包 括與SEQ ID NO: 1或3 (在全長(zhǎng)上)有至少50%或更高，優(yōu)選至少55%、 60%、 70%、 80%、 90%、 95%、 99%、 99.5%、 99.8%或更高的序列同一性的 核酸序列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，vW67的變體編碼所述具有組成型 活性的NRC1蛋白。很明顯，有多種方法可以用于鑒定、合成或分離 核酸序列的變體或片段，所述方法例如核酸雜交、PCR技術(shù)、計(jì)算機(jī)分 析、核酸合成等。
編碼本發(fā)明的NRC1蛋白的核酸序列，尤其DNA序列可以被插入到表 達(dá)載體中以產(chǎn)生大量的NRC1蛋白(或者例如嵌合NRC1蛋白)，如下文所 述。為了優(yōu)化在宿主中的表達(dá)，可以通過以下的方式對(duì)所述^W〃 DNA 序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化使用現(xiàn)有的密碼子選擇表，通過將密碼子選擇調(diào) 整成為植物基因(尤其是目的植物屬或種的天然基因)中最優(yōu)選的密碼 子選擇(例如，更加適應(yīng)于在棉花、大豆、玉米或稻中表達(dá))(Bennetzen &Hall， 1982， J. Biol. Chem. 257， 3026-3031; Itakura e"/. ， 1977 Science 198， 1056-1063.)。多種植物種的密碼子選擇表凈皮例如Ikemura (1993， In "Plant Molecular Biology Labfax", Croy,ed.， Bios Scientif ic Publishers Ltd.)和Nakamura e"/. ( 2000， Nucl. Acids Res. 28， 292.)公開并且在主要的DNA序列數(shù)據(jù)庫(例如位于德國海德堡的EMBL)中公開。因此，可以構(gòu)建合成的DNA序列以便產(chǎn)生相同的或 基本相同的蛋白。用于將密碼子選擇調(diào)整成宿主細(xì)胞優(yōu)選的密碼子選擇 的多種技術(shù)可以在專利文獻(xiàn)和科學(xué)文獻(xiàn)中獲得。密碼子選擇調(diào)整的確切 方法不是本發(fā)明關(guān)鍵之處。
對(duì)DNA序列的少量的修飾(例如上文描述的)可以利用常規(guī)方法進(jìn) 行，即通過PCR介導(dǎo)的諸變(Ho"a/. ， 1989， Gene 77， 51-59.， White et al.， 1989， Trends in Genet. 5， 185-189 )?？梢允褂矛F(xiàn)有技術(shù)通 過從頭DNA合成所需編碼區(qū)對(duì)DNA序列常規(guī)地進(jìn)行更深入的修飾。
再者，可以這樣修飾y^67核酸序列，即通過在NRC1蛋白的N末端 添加或刪除一個(gè)或多個(gè)氨基酸，從而使該蛋白的N末端具有最佳的翻譯 起始的前后序列。優(yōu)選地，待在植物細(xì)胞中表達(dá)的本發(fā)明的蛋白一般由 Met-Asp或Met-Ala 二肽起始以獲得最佳的翻譯起始。因此Asp密碼子 或Ala密碼子可以插入至已經(jīng)存在的Met之后，或者第二個(gè)密碼子—— Val可以,皮Asp密碼子(GAT或GAC)或Ala密碼子(GCT、 GCC、 GCA或 GCG)密碼子替換。也可以修飾DNA序列以去除不正常的剪接位點(diǎn)。
vW"核酸序列的"片段，，包括SEQIDNO: 1或3或者SEQ ID NO: 1 或3的變體的至少10、 12、 15、 16、 18、 20、 30、 40、 50、 100、 200、 500、 1000、 1500、 2000或更長(zhǎng)的連續(xù)核苷酸的片段。短片段可以用作 例如PCR引物或雜交探針。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于探測(cè)y儀"DNA或RNA序 列的PCR引物和/或探針以及試劑盒。可以根據(jù)SEQ ID NO: 1或3 (或 者其變體)合成用于從樣品中擴(kuò)增膽"DNA的簡(jiǎn)并PCR引物對(duì)或特異 PCR引物對(duì)——這是本領(lǐng)域中的現(xiàn)有才支術(shù)(參見Dieffenbach and Dveksler (1995) PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, and McPherson at al. (2000) PCR-Basics: From Background to Bench,第一版，Springer Verlag， Germany )。例 如，SEQ ID NO: 1或3 (或者互補(bǔ)鏈)的任何具有9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 18或更多個(gè)連續(xù)核苦酸的小片段可以被用作引物或探針。 與之類似，SEQ ID NO: 1或3 (或者其變體)的DNA片段可以被用作雜 交探針。順67探測(cè)試劑盒可以包含特異性引物和/或特異性 探針，以及用于使用所述引物或探針探測(cè)樣品中靨"DNA的相關(guān)方案。 宇il會(huì)"5f以刷如用千礎(chǔ)宗括物罷石Pj祐太勞曰/部分)轉(zhuǎn)化。由于遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性，某些氨基酸密碼子可以被其他 密碼子替代而不改變蛋白的氨基酸序列。
在另一個(gè)實(shí)施方案中還提供了一種用于鑒定和應(yīng)用所述番茄
基因(SEQ ID N0: l和3)的直系同源物或等位基因的方法。所述方法 包含下述步驟
a )獲得或鑒定與SEQ ID NO: 1和/或3有至少70%核酸同一性(或 者如上文所述的更高百分?jǐn)?shù)的序列同一性)的核酸序列，
b) 任選地修飾所述核酸序列以使之編碼具有組成型活性的NRC1蛋
白，以及
c) 使用a)的核酸序列產(chǎn)生表達(dá)載體和/或沉默載體，或者使用b) 的核酸序列產(chǎn)生表達(dá)載體，
d) 使用一種或多種c)的載體轉(zhuǎn)化植物或植物細(xì)胞，優(yōu)選從其中獲 得所述核酸的植物種的植物或植物細(xì)胞，
e )分析所述轉(zhuǎn)化植物/植物組織出現(xiàn)HR損傷(即HR損傷表型，任 選對(duì)其定量)的能力和/或所述轉(zhuǎn)化體的抗病性，以確定或驗(yàn)證 所述基因在植物中的功能并且/或者產(chǎn)生具有增強(qiáng)的抗病性的 轉(zhuǎn)基因植物；
f )任選地對(duì)這樣的等位基因或直系同源物進(jìn)行篩選以便在后續(xù)中繼 續(xù)使用，所述等位基因或直系同源物會(huì)賦予所述轉(zhuǎn)基因植物增 強(qiáng)的抗病性而在表達(dá)時(shí)賦予弱的HR表型(即不引起或引起減弱 的HR損傷表型)。
因此，使用該方法可鑒定7W^7等位基因或直系同源物，與SEQ ID N0: 1或3的表達(dá)相比，或者與從所要轉(zhuǎn)化的宿主物種中獲得的野生型贗" 等位基因的表達(dá)相比，所述WG等位基因或直系同源物在植物中表達(dá)時(shí) 會(huì)產(chǎn)生更少的和/或更小的HR損傷。最優(yōu)選地，鑒定出在表達(dá)時(shí)不引起 HR損傷或者至少不會(huì)導(dǎo)致宏觀可見的HR損傷而仍賦予增強(qiáng)的抗病性的 膽G等位基因或直系同源物。
通過這樣的方式可以比較不同的等位基因和/或直系同源物的 HR表型，即使用相同啟動(dòng)子制備表達(dá)載體、用它們轉(zhuǎn)化宿主植物并且比 較這些轉(zhuǎn)基因植物之間的HR損傷表型。當(dāng)比較轉(zhuǎn)基因茄科植物中不同的 等位基因的時(shí)候(例如在組成型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下)，表達(dá)SEQ ID NO: 1或3的轉(zhuǎn)化體的HR損傷表型優(yōu)選地^皮用作參照?；蛘?， 從所要轉(zhuǎn)化的宿主物種中獲得的野生型等位基因可以被用作參照。然后 可以選擇這樣的等位基因在后續(xù)中繼續(xù)使用，即那些與SEQ ID NO: 1 或3相比可以提供更少和/或更小的HR損傷的等位基因，或者那些與從 所述被轉(zhuǎn)化物種獲得的野生型等位基因的表達(dá)所引起的相比可以提供更 少和/或更小的HR損傷的等位基因。例如，可以制備表達(dá)它們的轉(zhuǎn)基因 植物——如下文的描述。
具體地說，可以使用例如yW67特異的PCR引物或探針或者利用計(jì)算 機(jī)生物信息學(xué)分析獲得或者鑒定來自番茄的等位基因和來自馬鈴薯的直 系同源物。遺傳作圖也可以被用于對(duì)所述植物(例如番茄或馬鈴薯)基 因組中的V^"基因座作圖，由此可以通過將所述基因組圖語與現(xiàn)有的 (例如番茄測(cè)序項(xiàng)目中開發(fā)的)基因組測(cè)序數(shù)據(jù)庫關(guān)聯(lián)獲得序列。這些 等位基因和/或直系同源物可能尤其適合于產(chǎn)生具有增強(qiáng)的抗病性的植 物。
當(dāng)用上述的方法鑒定廚"的馬鈴薯直系同源物時(shí)，這些直系同源物 (或這些直系同源物的變體)優(yōu)選用于產(chǎn)生具有增強(qiáng)的致病疫霉 (戶力7"/^^ora //2/"es^/^)抗寸生的植物。
本發(fā)明的嵌合基因、表達(dá)載體和重組生物體
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，編碼NRC1蛋白(包括變體或片段)的 核酸序列(如上述)被用于制備嵌合基因，以及包含這些嵌合基因的載 體，用于將所述嵌合基因轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞并且在宿主細(xì)胞(例如從轉(zhuǎn)化 的細(xì)胞得到的細(xì)胞、組織、器官或生物體)中產(chǎn)生NRC1蛋白。用于在植 物細(xì)胞中產(chǎn)生NRC1蛋白(或蛋白片段或變體)的載體在本文中被稱為"表 達(dá)載體"。宿主細(xì)胞優(yōu)選是植物細(xì)胞，而微生物宿主(細(xì)菌例如農(nóng)桿菌、 酵母、真菌等)也被考慮。
任何植物(例如單子葉植物或雙子葉植物)都可以是適宜的宿主， 但最優(yōu)選地，所述宿主植物屬于茄科。例如，所述植物屬于茄屬(包括 番癡屬(Zyco/ e"/co77))、煙草屬、辣椒屬、碧冬茄屬和其他的屬。以 下的宿主種可適合于被使用煙草(煙草種，例如本生煙草 (6e/7Ma邊/ai7a )、鈹葉煙草(; /"巡6ag/刀/7"o7/a )、普通煙草( "6ac咖)等)、蔬菜種例如番癡(厶e5^y/e/7f咖異名 5Wa/7咖//co/ ers/cw巡)(例如櫻書匕番茄變種s/'尸or邁e或醋栗番癡變種 /7//z7/72'/7e/7W/"邁)或樹番癡 (511. 6"ace腿異名 077力0邁a/2dra 6efaceae)、馬鈴募(6V /a/7i/邁fi/6erosw/z )、癡子(AS^/a/7w/z 邁e/o/ ge/za )、 鳳果(pepino ) ( ^0/a/7wz 2Zw/"/cafw邁)、cocona( iS^/a/zwz/sess/y/ZVo/T/zz )
和果癡(5Wa/7W邁《W/7oe/7Se)、辣椒類( 一年生辣椒(^2/757c咖a/7/7W咖)、
灌木椒(Ca/7^/cz/邁/"/7/fesce/zs )、 鈴椒(Ca/ "'c咖6acc"咖))、觀賞 物種(例如矮牽牛(戶e^/ /a Ar6"Va )、腋花矮牽牛(戶e"/7/a auV/ar/es )、 膨大矮牽牛(戶.//^egW/W/a ))。
或者，所述植物可以屬于任何的其他科，例如屬于葫,科 (C"cwr6"aceae)或禾本科(fr緒/."eae )。合適的宿主植物包括例如 玉米/谷類(玉蜀黍?qū)俜N(Zea species ))、小麥(小麥屬種(7W〃c咖 species ))、大麥(例如大麥(浙de咖^//gare))、燕麥(例如燕麥 (爿簡(jiǎn)a m〃m ))、高粱(高粱(i^細(xì)6/co/or))、黑麥(黑麥(化ca/e cerea/e))、大豆(野生大豆屬種(67yc//ze spp ),如大豆(C邁ax))、 棉花(棉屬種(Co"/; /"" species ),例如陸地棉(C力/"W"邁)、海 島棉(《6ar&de/^e))、蕓莒屬種(Ara^/ca spp.)(例如甘藍(lán)型油 菜(A / a/7M)、大頭菜(A 乂.畫ea)、甘藍(lán)(A Wer"ea )、蘢菁(A rapa)等)、向日葵(^e/Zai^Ai/s a/2/7""、紅花、山藥、木薯、紫花 苜蓿(s"2'ra)、稻(稻屬種(。zrza species), 例如扭稻 栽培種(。.y"2>a 2'/7d/ca cultivar-group )或粳稻日本晴栽培種 (japonica cultivar-group ))、 飼料草、珍珠栗(狼尾草屬種 (戶e/7/ /^e"邁spp.), 例如珍珠栗(戶e/7/7/s"咖 g/ai/c咖))、樹種 (松屬(戶//7^)、楊樹、杉、芭蕉等)、茶樹、咖啡樹、油棕櫚樹、椰 子樹、蔬菜種(例如豌豆、小西葫蘆、豆類(例如菜豆屬種(戶力weo/M species ))、黃瓜、朝鮮薊、蘆筍、青花菜、大蒜、韭菜、萵苣、洋蔥、 蘿卜、蕪菁、抱子甘藍(lán)、胡蘿卜、花椰菜、菊苣、芹菜、菠茱、苣荬菜、 茴香、甜菜)、結(jié)肉質(zhì)果植物(葡萄、桃樹、李類(plums )、草莓、芒果 樹、蘋果樹、李樹(plum)、櫻桃樹、杏樹、香蕉樹、黑莓、越橘、柑橘、 獼猴桃樹、無花果樹、檸檬樹、椴樹(lime)、油桃樹、樹莓、西瓜、橙 樹、葡萄柚等)、觀賞物種(例如薔蔽屬種、矮牽牛屬種、菊屬種、百合 屬種、大丁草屬種)、草本類(薄荷、荷蘭芽、羅勒(basil )、百里香(thyme ) 等)、木質(zhì)樹(例如楊屬種、柳屬種、櫟屬種、桉屬種)、纖維物種(例如亞麻(Z/"咖z/s/f"/5^/邁"邁)和大麻(Ca/7/7aWs sa〃ra))或者模 式生物(，J如才以南芥(Jra6/do/7s/s f力a/Za/7a ))。
優(yōu)選的宿主是"作物植物"，即人類種植和培育的植物種。可以種植 作物植物用于食用(例如田間作物)或者用于觀賞(例如產(chǎn)生用于切枝 的花、用于草碎的草等)。本文定義的作物植物還包括從其中收獲非食用 產(chǎn)物的植物，所述產(chǎn)物例如用于燃料的油、塑料聚合物、藥物制品、軟 木等。
用于將編碼NRC1蛋白的核酸序列(優(yōu)選穩(wěn)定地)導(dǎo)入宿主細(xì)胞基因 組的嵌合基因和載體的構(gòu)建方法是本領(lǐng)域普遍公知的。為了形成嵌合基 因，使用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)將編碼NRC1蛋白(或者變體或片段)的 核酸序列可操作地連接至適宜于在宿主細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子序列上。所 述啟動(dòng)子序列可以已經(jīng)存在于載體中，從而將膽"核酸序列簡(jiǎn)單地插入 至所述載體中所述啟動(dòng)子序列的下游。然后將所述載體用于轉(zhuǎn)化所述宿 主細(xì)胞，并且將所述嵌合基因插入到核基因組中或質(zhì)體、線粒體或葉綠 體的基因組中，并且使用合適的啟動(dòng)子在該處進(jìn)行表達(dá)(例如Mc Bride "a/. ， 1995 Bio/Technology 13， 362; US 5, 693， 507 )。在一個(gè)實(shí) 施方案中，嵌合基因包含適宜于在植物細(xì)胞或微生物細(xì)胞(例如細(xì)菌) 中表達(dá)的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子可操作地連接至編碼本發(fā)明的NRC1蛋白的核 酸序列，其后端任選地連接一條3'非翻譯核酸序列。
編碼功能性NRC1蛋白(或者在某些實(shí)施方案中的具有組成型活性的 NRC1蛋白)的^W C7核酸序列(優(yōu)選A^G嵌合基因)可以以常規(guī)的方式 被穩(wěn)定地插入至單個(gè)的植物細(xì)胞的核基因組中，并且經(jīng)這樣轉(zhuǎn)化的植物 細(xì)胞可以以常規(guī)的方式用于產(chǎn)生表型發(fā)生改變的轉(zhuǎn)化植林，此表型改變 是由于某些細(xì)胞在某些時(shí)間存在NRC1蛋白導(dǎo)致。在這一點(diǎn)上，在根癌農(nóng) 桿菌C^i"o6aCer/〃邁紐邊e/"ac2'e/7力中包含編碼NRC1蛋白的核酸序列的 T-DNA載體可以被用于轉(zhuǎn)化所述植物細(xì)胞，并且之后使用例如在EP 0 116 718、 EP 0 270 822、 PCTV^開文本W(wǎng)0 84/02913和^>布的歐洲專利申請(qǐng) EP 0 242 246中記載的以及Gould等人(1991， Plant Physiol. 95， 426-434)描述的方法可以從所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生成轉(zhuǎn)化植林。用 于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化的T-DM載體的構(gòu)建方法是本領(lǐng)域公知的。所 述T-DNA載體可以是如EP 0 120 561和EP 0 120 515中記載的二元載 體，或者是如EP Q 116 718中記載的可以通過同源重組整合至所述農(nóng)桿菌n質(zhì)粒中的共整合載體。
每個(gè)優(yōu)選的T-DNA載體均包含可操作地連接有編碼NRC1 (例如編碼 SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4)的核酸序列的啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子位于 T-DNA邊界序列之間，或者至少位于所述右邊界序列的左邊。邊界序列 在Gielen a/. (1984， EMBO J 3， 835-845)中有記載。當(dāng)然，也可以 通過例如以下的方法使用其他類型的栽體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞直接基因轉(zhuǎn)移 (例如在EP 0 223 247中記載的)、花粉介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(例如在EP 0 270 356 和WO 85/01856中記載的)、例如在US 4, 684, 611中記載的原生質(zhì)體轉(zhuǎn) 化、植物RNA病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(例如在EP 0 067 553和US 4, 407， 956 中記載的)、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(例如在US 4, 536, 475中記載的)以及其 他方法。對(duì)于番茄或煙草轉(zhuǎn)化，亦參見An G. a/. ， 1986， Plant Physiol. 81: 301-305j HorschR. B. e"/. ， 1988, In: Plant Molecular Biology Manual A5， Dordrecht, Netherlands, Kluwer Academic Publishers.第l-9頁；Koornneef M. e"入，1986， In: Nevins D. J. and R. A. Jones eds, Tomato Biotechnology, New York, NY， USA, Alan R. Liss， Inc.第169-178頁。對(duì)于馬鈴薯轉(zhuǎn)化，參見例如Sherman and Bevan( 1988， Plant Cell Rep. 7: 13-16)。
類似地，對(duì)來自于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的轉(zhuǎn)化植物的選擇和再生是本領(lǐng)域公知 的。很明顯，對(duì)于不同物種和甚至單個(gè)物種的不同變種或栽培種，可以 對(duì)方案具體調(diào)整以高頻地再生轉(zhuǎn)化體。
除核基因組的轉(zhuǎn)化外，本發(fā)明還包括質(zhì)體基因組(優(yōu)選葉綠體基因組) 的轉(zhuǎn)化。質(zhì)體基因組轉(zhuǎn)化的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可以減少所述一種或多種轉(zhuǎn)基因 擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)。質(zhì)體基因組轉(zhuǎn)化可以按本領(lǐng)域的公知方法進(jìn)行，參見例如 Sidorov VA e"/. 1999、 Plant J. 19: 209-216或Lutz KA e"入2004， Plant J. 37 (6): 906-13。
可以將這樣產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化植物用于常規(guī)的植物育種方案中以產(chǎn)生更多 的包含所述轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)化植林。使用例如DM印跡分析、基于PCR的方 法或Invader Technology觀'J定法(Third Wave Technologies, Inc.) 可以篩選單拷貝轉(zhuǎn)化體。通過所述嵌合基因的存在可以容易地將非轉(zhuǎn)化 的細(xì)胞和植林與轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和植林區(qū)分開。還可以對(duì)位于所述轉(zhuǎn)基因的 插入位點(diǎn)兩側(cè)的植物DNA序列進(jìn)行測(cè)序，從而可以開發(fā)一種用于常規(guī)使
用的"事件特異性"檢測(cè)方法。參見例如wo 0141558,它記載了基于例如整合序列和側(cè)翼(基因組)序列的突出事件檢測(cè)試劑盒(e 1 i te event detection kit)(例如PCR檢測(cè)試劑盒)。
將所述W67核酸序列插入至植物細(xì)胞基因組中，使得所述插入的編 碼序列位于能指導(dǎo)在植物中表達(dá)的啟動(dòng)子的下游(即3。并且受到所述 啟動(dòng)子的控制。這優(yōu)選地通過將所述嵌合基因插入至所述植物細(xì)胞基因 組，尤其是核基因組或質(zhì)體(例如葉綠體)基因組中來實(shí)現(xiàn)。
因?yàn)镹RC1蛋白的組成型產(chǎn)生可以誘導(dǎo)細(xì)胞的死亡(例如^l觀的損傷 和/或宏觀的損傷)并且/或者會(huì)降低產(chǎn)量(參見例如Rizhsky and Mittler， Plant Mol Biol， 2001 46: 313-23 )，所以在一個(gè)實(shí)施方案 中優(yōu)選使用活性為可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的實(shí)例是創(chuàng)傷誘導(dǎo)型 啟動(dòng)子，例如Cordera等人(1994， The Plant Journal 6， 141)描述 的MPI啟動(dòng)子，它由創(chuàng)傷誘導(dǎo)(例如由昆蟲或物理創(chuàng)傷造成)；或者 COMPTII啟動(dòng)子(WO0056897 );或者US6031151中記載的PR1啟動(dòng)子。 或者，所述啟動(dòng)子可以被化學(xué)藥品誘導(dǎo)，所述化學(xué)藥品例如Aoyama和 Chua ( 1997, Plant Journal 11: 605-612 )和US6063985中記載的地 塞米木>或例如四環(huán)素(T0PFREE或T0P IO啟動(dòng)子，見Gatz， 1997， Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 48: 89-108 and Love et al. 2000， Plant J. 21: 579-88 )。其他的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可由例如溫度變化誘導(dǎo)(例 如記載于US5， 447, 858中的熱休克啟動(dòng)子)、缺氧條件誘導(dǎo)(例如玉米 ADH1S啟動(dòng)子)、光誘導(dǎo)(US6455760 )、病原體誘導(dǎo)(例如EP759085的 啟動(dòng)子或EP309862的啟動(dòng)子)或者衰老i秀導(dǎo)(SAG12和SAG13， 參見US5689042 )。 4艮明顯還有大量的其他啟動(dòng)子。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中優(yōu)選使用病原體誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，從而所述 NRC1蛋白(或者變體或片段)將僅會(huì)在病原體侵襲所述植物的組織后產(chǎn) 生。尤其合乎需要的是受病原體侵襲后被迅速地上調(diào)的基因的啟動(dòng)子。 病原體誘導(dǎo)的啟動(dòng)子包括例如煙草的hsr203J、str246C和sgd24啟動(dòng)子； Yin等人(1997， Plant Physiology 115 (2): 437-51 )描述的EAS4啟動(dòng) 子；tapl或tap2啟動(dòng)子(Mohan et al. ， 1993， Plant Mol Biol. 1993 22:475-90 ); gstl啟動(dòng)子或其變體(Martini " ". 1993, Mol. Gen-Gen. 236， 179-186; Hermin C. ， 1997， Afstudeerwerk， Faculteit Landbouwkundigeen Toegepaste Biologische Wetenschappen， University of Gent, Belgium); WRKY啟動(dòng)子(Eulgem et al., EMB0 J.,1999， 18 (17) :4689-99 );以及WO0029592中記載的嵌合啟動(dòng)子)。也可 以使用已知方法例如cDNA-AFLP⑧鑒定由具體植物病原體誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。 優(yōu)選地，所述啟動(dòng)子可以被大量的病原體誘導(dǎo)，即它被所述宿主植 物的廣譜病原體誘導(dǎo)。對(duì)于每個(gè)具體的宿主植物種，可以有不同的最適 的啟動(dòng)子。例如，當(dāng)番茄被用作宿主時(shí)，所述啟動(dòng)子優(yōu)選地被至少一種
(但優(yōu)選多于一種)番茄病原體誘導(dǎo)。具體地說，優(yōu)選可以被一種或多 種真菌植物病原體和/或細(xì)菌植物病原體(尤其是被一種或多種活體營養(yǎng) 性植物病原體和/或半活體營養(yǎng)性植物病原體)誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。
對(duì)于每個(gè)植物種，都可以獲得關(guān)于植物病原體、它們引起的疾病癥 狀以及它們的生命周期的詳細(xì)描述。例如，番茄的病原體被記載于
"Compendium of Tomato Diseases", Editors Jones, Jones, Stall and Zitter ,ISBN0-89054-120-5 ,APS Press
(http: /www. shopapspress/org )。 馬鈴薯的病原體被記載于
"Compendium of Potato Disease", 第2版， Editors Stevenson、 FrancandWeingartner， APS Press, ISBN 0-89054-275-9。
番茄的病原體包括例如以下的真菌種、細(xì)菌種和病毒(非限制性的) 灰葡萄孢菌("o"/〃s c/z erea )(真菌/死體營養(yǎng))、球狀炭疽病
(Co//efo"/cAw/z7 coccode《)(真菌/死體營養(yǎng))、互隔交鏈孢霉
(J"e777ar2'a a"ei77"a)(真菌)、癡病交鏈孢霉(J"e/77aria ^/a/7i")
(真菌/死體營養(yǎng))、茄旬柄霉(5Ye巡/7A^/咖so/a/7/)、致病疫霉 // /"e^a/^)(卵菌綱(oomycte) /半活體營養(yǎng))、番茄 殼針孢菌(i9e/^or/a //co/ e"/c/)、黃枝孢霉("a^y/70/7咖/Wp7/邁)
(真菌/半活體營養(yǎng))、寄生疫霉(戶A^o/7力Mo" /7"as/"ca)、番茄粉 孢子(。W咖//co/ er".c咖)(活體營養(yǎng))、尖孢鐮刀菌(,"sar/咖 017ypOi7/邁)、整齊小菌核菌(Sc/ei"o".wz7ro//^//)、腐霉屬(戶7^力7"巡)、 絲核菌屬(^/zoc"/ /a )(真菌/死體營養(yǎng))、密執(zhí)安棍狀桿菌
(Cor7/zedaCer/i/邁邁/c/ /gs"e/2se)(細(xì)菌)、丁香假單胞菌番癡致病變 型或丁香致病變型(/^ewdo邁o/7a51 ^r/z^ae pv or pv ^"'/^ae)
(細(xì)菌/活體營養(yǎng))、青枯假單胞菌(/^e^o邁o/7as so/a/ acear咖)、波狀 假單胞菌(Ae油節(jié)/^ C0r，"e)、棒開沐菌屬("a"'6a"er)、野 油菜黃單胞菌(Ja/^力0/Z70/7a^ c^z7/7e"r/s)(細(xì)菌/活體營養(yǎng))、輪枝孢屬
(^^〃^7//"巡)(真菌)、番茄斑萎病毒(TSWV)、煙草花葉病毒或番茄花葉病毒(TobMV， TomMV)。
馬鈴薯的病原體包括例如多種真菌、細(xì)菌、線蟲類和病毒一一例如 致病疫霉(Mora 2'/ 尸""w)(卵菌綱/半活體營養(yǎng))、線蟲類(活 體營養(yǎng)性)、胡蘿卜軟腐歐氏桿菌(Ar『/zz/a carc^op^ra )(細(xì)菌)、球狀 炭疽病(tW/efo"2'c力"邁cocco^/es)(真菌)、立枯絲核菌(W力/zo"o/ /a so/a/ /)(真菌/死體營養(yǎng))、大麗輪斗支菌(rerf/c////wz7 c^力7/ae)(真 菌)、齊齊鏈霉菌(5Yre/^oiz^cey yca6/es)、癡病交鏈孢霉(J"er/7ar/a so/a/ /)(真菌/死體營養(yǎng))、腐霉屬、馬鈴薯粉痂菌(5^0/^Oi770n s"Werra/ ea/7)、 PVX和PVY、馬鈴薯巻葉病毒(PLRV)等。
多種植物種的植物疾病亦參見 http://www.apsnet.org/online/common/toc.asp。 因此,在一個(gè)實(shí)施 方案中，所述啟動(dòng)子優(yōu)選地被上述病原體中的一種或多種誘導(dǎo)，最優(yōu)選 地至少被以上活體營養(yǎng)性病原體和/或半活體營養(yǎng)性病原體中的一種或 多種誘導(dǎo)。
或者，宿主植物可以包含多個(gè)膽"轉(zhuǎn)基因，每個(gè)均受一種不同的病 原體誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制，以保證在受到多種病原體侵襲后產(chǎn)生NRC1
蛋白。例如，對(duì)于番茄的轉(zhuǎn)化， 一個(gè)啟動(dòng)子可以被疫霉屬誘導(dǎo)并且一個(gè) 被枝孢菌屬誘導(dǎo)。
詞語"誘導(dǎo)的，，不一定要求所述啟動(dòng)子在不存在誘導(dǎo)物刺激的時(shí)候 完全沒有活性?？梢源嬖诘退降姆翘禺愋曰钚裕灰@不會(huì)對(duì)所述植 物產(chǎn)量或質(zhì)量產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。因此，可誘導(dǎo)的優(yōu)選地是指在與所述誘 導(dǎo)物接觸后所述啟動(dòng)子活性的增加，導(dǎo)致下游編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄的增 加。
本文中最優(yōu)選的組合是使用病原體誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，它可操作地連接 至一個(gè)編碼具有組成型活性的NRC1蛋白的tW67核酸序列——如上文所 述。在這種情況下當(dāng)受病原體侵襲時(shí)，將表達(dá)所述具有組成型活性的 NRC1從而導(dǎo)致局部的HR (局限在病原體侵襲的位點(diǎn))，阻礙任何(半) 活體營養(yǎng)性病原體的進(jìn)一步生長(zhǎng)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中可以使用組成型的啟動(dòng)子，例如花椰菜花葉病 毒(CaMV)分離林CM 1841的強(qiáng)組成型35S啟動(dòng)子或增強(qiáng)型35S啟動(dòng)子 ("35S啟動(dòng)子，，)(Gardner " a丄，1981， Nucleic Acids Research 9， 2871-2887 )、 CabbB-S (Franck " a/. ， 1980， Cell 21， 285-294 )和CabbB-JI (Hull and Howell, 1987, Virology 86,482-493); Odell等 人(1985' Nature 313， 810-812 )描述的或記載于US5164316中的35S 啟動(dòng)子；來自泛素家族的啟動(dòng)子(例如記載于Christensena/., 1992， Plant Mol. Biol. 18, 675-689、 EP 0 342 926的玉米泛素啟動(dòng)子，亦 參見Cornejo e"入1993， Plant Mol. Biol. 23， 567-581 )、 gos2啟 動(dòng)子(de Pater e"入，1992 Plant J. 2， 834-844 )、 emu啟動(dòng)子(Last "a/. ， 1990， Theor. Appl. Genet. 81, 581-588 )、擬南芥肌動(dòng)蛋白 啟動(dòng)子例如An等人(1996， Plant J. 10， 107-121)描述的啟動(dòng)子、稻肌 動(dòng)蛋白啟動(dòng)子例如Zhang等人(1991, The Plant Cell 3， 1155-1165)描 述的啟動(dòng)子和US 5, 641， 876中記載的啟動(dòng)子或者W0 070067中記載的稻 肌動(dòng)蛋白2啟動(dòng)子；木薯葉脈花葉病毒的啟動(dòng)子(W0 97/48819、Verdaguer "".1998， Plant Mol. Biol. 37, 1055-1067)、來自地三葉草矮化 病毒的pPLEX系列啟動(dòng)子(WO 96/06932，尤其是S7啟動(dòng)子)、乙醇脫氫 酶啟動(dòng)子例如pAdhlS (GenBank登錄號(hào)X04049、 X00581)、分別驅(qū)動(dòng)1' 基因和2'基因表達(dá)的T-DNA的TR1'啟動(dòng)子和TR2'啟動(dòng)子(分別為"TR1' 啟動(dòng)子"和"TR2'啟動(dòng)子")(Velten a/., 1984, EMBO J 3， 2723-2730 )、 US 6051753和EP 426641中記載的玄參花葉病毒啟動(dòng)子、 組蛋白基因啟動(dòng)子例如來自擬南芥的Ph4a748啟動(dòng)子(PMB 8: 179-191) 等。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中4吏用了 PCT/NL2005/050083 ( 2005年12 月16日提交)中記載的AA6啟動(dòng)子。
或者，可以利用不是組成型的而是植物的一個(gè)或多個(gè)組織或器官特 異性的啟動(dòng)子(組織優(yōu)選的/組織特異性的啟動(dòng)子，包括發(fā)育調(diào)控的啟動(dòng) 子)，例如葉優(yōu)選的、表皮優(yōu)選的、根優(yōu)選的、花組織例如絨氈層或花藥 優(yōu)選的、種子優(yōu)選的、莢優(yōu)選的等)，由此所述VW"基因僅在特定的一 種或多種組織或器官的細(xì)胞中并且/或者僅在某一發(fā)育階段表達(dá)。例如， 通過將所述編碼序列置于光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(例如植物本身的或其他植物 (例如US 5, 254， 799中^>開的豌豆或US5034322中7>開的擬南芥)的
1，5-二磷酸核酮糖羧化酶小亞基基因的啟動(dòng)子)控制下，可以在所述植 物葉中選擇性地表達(dá)所述iWW基因。
在一個(gè)實(shí)施方案中使用了內(nèi)源性^"基因的啟動(dòng)子。例如，可以將 番茄Ai G基因的啟動(dòng)子分離并可操作地連接至編碼SEQ ID NO: 2或4 的NRC1蛋白的編碼區(qū)。使用已知的方法例如熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR(TAIL-PCR) (Liu " ". 1995， Genomics 25 (3): 674-81; Liu " a厶 2005， Methods Mol Biol. 286:341—8 )、接頭PCR (Linker—PCR)或反 向PCR (Inverse PCR ) ( IPCR ),可以將所述啟動(dòng)子(SEQ ID NO: 1 和3的上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū))從番茄植林中分離。
優(yōu)選地將y^^7編碼序列插入至所述植物的基因組中，從而4吏所述編 碼序列位于合適的3'端非翻譯區(qū)("3'端"或3' UTR )的上游(即5')。 合適的3'端包括以下基因的3'端CaMV 35S基因("3' 35S")、胭脂堿 合酶基因("3' nos，， ) ( Depicker e"厶，1982 J. Molec. Appl. Genetics 1， 561-573.)、章魚堿合酶基因("3' ocs，， )(Gielen e"/. , 1984, EMB0 J 3， 835—845 )和T-DNA基因7("3'基因7") ( Velten and Schel 1， 1985， Nucleic Acids Research 13, 6981-6998 )等，所述3'端可以作為轉(zhuǎn)化 的植物細(xì)胞中的-非翻譯DNA序列。在一個(gè)實(shí)施方案中使用了番茄艏" 基因的3' UTR，如SEQIDN0: 3中的第2748-3168位核苷酸和SEQ ID NO: 5中所示的。所述#7 " 3' UTR本身也是本發(fā)明的實(shí)施方案，這是因?yàn)?它也可以與其他的編碼區(qū)一起被用作3' UTR。同樣，提供了 SEQ ID NO: 5的任何的變體或片段。SEQ ID NO: 5的變體包括與SEQ ID NO: 5有至 少40、 50、 60、 70、 80、 90、 95、 98、 99%或更高的序列同一性的核酸 序列(這是使用上文定義的Needleman和Wunsch算法以及GAP罰分確定 的)。片段包括任何包含SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 5的變體的至少 30、 50、 100、 150、 200、 300、 400或更多個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列。
可以使用現(xiàn)有技術(shù)已知的方法例如電穿孔或三親融合將T-DNA載體 導(dǎo)入農(nóng)桿菌。
任選地將所述編碼NRC1的核酸序列作為雜合基因序列插入至所述 植物基因組中，由此將所述i^C7序列在閱讀框內(nèi)連接至(US 5， 254， 799; Vaeck a/. ， 1987， Nature 328， 33-37 )編碼可選擇標(biāo)i己或可i己錄 標(biāo)記的基因(例如編碼卡那霉素抗性的neo (或nptll)基因(EP 0 242 236 ))，使得所述植物表達(dá)容易被檢測(cè)的融合蛋白。
編碼NRC1蛋白(或者變體或片段)的^ "核酸序列的全部或一部 分還可以被用于轉(zhuǎn)化微生物例如細(xì)菌(例如大腸桿菌、假單胞菌、農(nóng)桿 菌、芽胞桿菌等)、真菌、藻類或昆蟲，或者被用于制備重組病毒。用結(jié) 合進(jìn)合適的克隆載體的本發(fā)明的A^C7核酸序列的全部或一部分轉(zhuǎn)化細(xì) 菌可以以常規(guī)的方式進(jìn)行——優(yōu)選使用Maillon等人(l989， FEMSMicrobiol. Letters 60, 205-210.)和WO 90/06999中描述的常規(guī)的 電穿孔技術(shù)。對(duì)于在原核宿主細(xì)胞中的表達(dá)，所述核酸序列的密碼子選 擇可以做相應(yīng)的優(yōu)化(如上文對(duì)植物的描述)。如現(xiàn)有技術(shù)已知的，應(yīng)該 將內(nèi)含子序列去除并且進(jìn)行其他的修改以優(yōu)化表達(dá)。
還可以以不改變翻譯的方式，進(jìn)一步改變;WW核酸序列的DNA序列， 以修飾所述基因部分中存在的可能的抑制DNA序列，并且/或者將變化引 入密碼子選擇，例如將密碼子選擇調(diào)整為植物如上文所述的特別相關(guān)的 植物屬最優(yōu)選的密碼子選擇。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，所述NRC1蛋白(或嵌合蛋白)定位于 細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器例如質(zhì)體(優(yōu)選葉綠體、線粒體)或者由所述細(xì)胞分泌， 這可能會(huì)優(yōu)化蛋白的穩(wěn)定性和/或表達(dá)。類似地，所述蛋白可以定位于液 泡。為了該目的，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的嵌合基因包含 連接至本發(fā)明的NRC1蛋白編碼區(qū)的編碼信號(hào)肽或靶向肽的編碼區(qū)。本發(fā) 明的蛋白所包含的特別優(yōu)選的肽為用于葉綠體或其他質(zhì)體定位的轉(zhuǎn)運(yùn) 肽，尤其是其基因產(chǎn)物定位于所述質(zhì)體的植物基因的兩個(gè)(duplicated) 轉(zhuǎn)運(yùn)肽區(qū)域、Capellades等人(US 5, 635, 618 )優(yōu)化的轉(zhuǎn)運(yùn)肽、菠菜 鐵氧還蛋白-NADP+氧化還原酶的轉(zhuǎn)運(yùn)肽(Oelmuller a/. ， 1993， Mol. Gen. Genet. 237,261-272 )、 Wong等人(1992， Plant Molec. Biol. 20， 81-93 )描述的轉(zhuǎn)運(yùn)肽和已^Hf的PCT專利申請(qǐng)WO 00/26371中7>開的耙 向肽。還優(yōu)選對(duì)與其連接的蛋白的細(xì)胞外分泌起信號(hào)作用的肽一一例如 馬鈴薯蛋白酶抑制因子II的分泌^言號(hào)(Keil a7. ， 1986， Nucl. Acids Res. 14, 5641-5650 )、稻a淀粉酶3基因的分泌信號(hào)(Sutl if f W a/.， 1991， Plant Molec. Biol. 16, 579-591 )和煙草PR1蛋白的分泌信號(hào) (Cornelissen " ， 1986， EMBO J. 5, 37-40 )。本發(fā)明的特別有用 的信號(hào)肽包括葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(例如VanDenBroecka/. ， 1985, Nature 313， 358 )或者US 5,510， 471和US 5, 635, 618中的將蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至葉 綠體的優(yōu)化的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽、分泌信號(hào)肽或?qū)⒌鞍装严蚱渌|(zhì)體、線粒 體、ER或另一個(gè)細(xì)胞器的肽。在天然的靶向蛋白或分泌蛋白中存在靶向 至細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器或者用于分泌至植物細(xì)胞胞外或耙向至細(xì)胞壁的信號(hào)序 列，優(yōu)選在下述文獻(xiàn)中描述的那些信號(hào)序列Kl6sgen等人(1989， Mol. Gen. Genet. 217, 155-161)、 Kl6sgen和Weil (1991， Mol. Gen. Genet. 225， 297-304 )、 Neuhaus & Rogers ( 1998， Plant Mol. Biol. 38，127-144 )、Bih等人(1999， J. Biol. Chem. 274， 22884-22894 )、 Morris 等人(1999， Biochem. Biophys. Res. Commun. 255, 328-333 )、 Hesse 等人(1989， EMBO J. 8， 2453-2461 )、 Tavladoraki等人(1998， FEBS Lett. 426, 62-66. )、 Terashima等人(1999, Appl. Microbiol. Biotechnol. 52, 516-523 )、 Park等人(1997， J.Biol. Chem. 272， 6876-6881 )和Shcherban等人(1995, Proc. Natl. Acad. Sci USA 92, 9245-9249 )。
為了使NRC1蛋白分泌至所述被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞外，可以將合適的分 泌信號(hào)肽連接于所述NRC1蛋白的氨基末端(N-末端)。推定的信號(hào)肽的 檢測(cè)可以使用基于計(jì)算機(jī)的分析、使用例如信號(hào)肽搜索程序(Signal Peptide search ) ( SignalP, 版本1. 1或2. 0 ) ( Von Heijne， Gunnar， 1986和Nielsen a/. ， 1996 )的程序來完成。
在一個(gè)實(shí)施方案中，多條編碼NRC1的核酸序列在單個(gè)的宿主中共表 達(dá)，它們可選地受不同啟動(dòng)子的控制。通過轉(zhuǎn)化已經(jīng)表達(dá)本發(fā)明的NRC1 蛋白的植抹或者通過將本發(fā)明的由不同NRC1蛋白轉(zhuǎn)化的植林進(jìn)行雜交， 可以容易地獲得共表達(dá)的宿主植祙?；蛘撸鄠€(gè)編碼NRCl蛋白的核酸序 列可以存在于單個(gè)的轉(zhuǎn)化載體中，或者可以使用不同的載體同時(shí)對(duì)其進(jìn) 行共轉(zhuǎn)化然后選擇包含兩種嵌合基因的轉(zhuǎn)化體。相似地， 一個(gè)或多個(gè)編 碼NRC1的基因可以與其他(例如編碼其他的增強(qiáng)抗病性的蛋白或者參與 抗病性信號(hào)傳遞通路的蛋白等)的嵌合基因同時(shí)在單林植物中表達(dá)。
需要理解的是，不同的蛋白可以在同一林植物中表達(dá)，或者每種蛋 白均在單林植物中表達(dá)，然后通過將所述單林植物與另一單林植物雜交 把所述蛋白組合于同一林植物中。例如，在雜種種子的制備中，每個(gè)親 本植祙可以表達(dá)單獨(dú)一種蛋白。當(dāng)將所述親本植林雜交產(chǎn)生雜種時(shí)，就 可以在所述雜種植物中組合兩種蛋白。
優(yōu)選地，為了選擇的目的而且亦為了雜草防治選擇，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基 因植物還可以被編碼可賦予除草劑抗性的蛋白的DNA轉(zhuǎn)化，所述除草劑 例如廣i普除草劑一一例如以草銨膦作為活性成分的除草劑(如Liberty 或BASTA;由PAT或bar基因賦予抗性；參見EP 0 242 236和EP 0 242 246 )或者草甘膦(如RoundUp⑧；由EPSPS基因賦予抗性，參見例如EPO 508 909和EP 0 507 698 )。使用除草劑抗性基因(或者賦予所需表型的 其他基因)作為選擇性標(biāo)記還有這樣的優(yōu)點(diǎn)，即可以避免引入抗生素抗性基因。
或者，可以使用其他的選擇性標(biāo)記基因例如抗生素抗性基因。因?yàn)?將抗生素抗性基因保留在轉(zhuǎn)化的宿主植物中通常不^皮接受，所以在篩選 所述轉(zhuǎn)化體后可以再次將這些基因去除。有不同的技術(shù)可用于去除轉(zhuǎn)基
因。 一種實(shí)現(xiàn)去除的方法是通過在所述嵌合基因的側(cè)翼加入lox位點(diǎn)， 在進(jìn)行篩選后將所述轉(zhuǎn)化的植林與表達(dá)CRE重組酶的植林雜交(參見例 如EP506763B1)。位點(diǎn)特異的重組導(dǎo)致所述標(biāo)記基因的切除。另一個(gè)位 點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)是EP686191和US5527695中記載的FLP/FRT系統(tǒng)。例 如CRE/L0X和FLP/FRT的位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)也可以;陂用于基因疊加的 目的。此外，現(xiàn)有4支術(shù)已經(jīng)記載了單組分切除系統(tǒng)(one-component excision system),參見例如W09737012或W09500555。
轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞/植物/種子以及本發(fā)明的核酸序列和蛋白的用途
在以下的部分中將描述本發(fā)明的v^67序列在產(chǎn)生具有增強(qiáng)的抗病 性表型的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、植物、植物種子等以及它們的任何的衍生物/ 子代中的用途。
通過這樣的途徑可以產(chǎn)生具有增強(qiáng)的抗病性的轉(zhuǎn)基因植物，即用受 合適的啟動(dòng)子控制的編碼至少一種NRC1蛋白的核酸序列轉(zhuǎn)化植物宿主 細(xì)胞一一如上文所述，然后由所述細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物。
優(yōu)選的啟動(dòng)子是可由外部生物刺激物和/或非生物刺激物誘導(dǎo)的啟 動(dòng)子。尤其優(yōu)選病原體誘導(dǎo)型啟動(dòng)子——如上文所述。優(yōu)選的啟動(dòng)子-乂W67組合為
a) 病原體誘導(dǎo)型啟動(dòng)子-編碼具有組成型活性的NRC1蛋白的核酸序 列；
b) 病原體誘導(dǎo)型啟動(dòng)子-編碼野生型NRC1蛋白的核酸序列；
c) 植物膽"基因的啟動(dòng)子(優(yōu)選與所要轉(zhuǎn)化的植物同種)-編碼具 有組成型活性的NRC1蛋白的核酸序列；
d) 植物順C7基因的啟動(dòng)子(優(yōu)選與所要轉(zhuǎn)化的植物同種)-編碼野 生型NRC1蛋白的核酸序列；
e) 生物脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(例如昆蟲損傷誘導(dǎo)型、病原體誘導(dǎo)型等) -編碼具有組成型活性的NRC1蛋白的核酸序列；
f )生物脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(例如昆蟲損傷誘導(dǎo)型、病原體誘導(dǎo)型等)-編碼野生型NRC1蛋白的核酸序列；
g) 組成型啟動(dòng)子(例如35S啟動(dòng)子)-編碼野生型NRC1蛋白的核酸 序列；
h) 組成型啟動(dòng)子(例如35S啟動(dòng)子)-編碼一種在全長(zhǎng)上與SEQ ID NO: 2有至少70%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。
i) 病原體誘導(dǎo)型啟動(dòng)子-編碼一種在全長(zhǎng)上與SEQ ID N0:2有至少 7 0%的氨基酸序列同 一性的氨基酸序列的核酸序列。
j )植物膽"基因的啟動(dòng)子-編碼一種在全長(zhǎng)上與SEQ ID NO: 2有至 少70°/ 的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因植物可以表現(xiàn)出組成型HR損傷或者 誘導(dǎo)型HR損傷，以及對(duì)一種或多種病原體的增強(qiáng)的抗病性。然而，本文 也考慮到了不出現(xiàn)HR損傷或出現(xiàn)"弱"HR損傷(例如較小的損傷如微
別是上^的方法g )和I)中)尤其優(yōu):k樣的""力W"的等位基因或直系 同源物，即當(dāng)在同樣的啟動(dòng)子控制下在宿主植物中表達(dá)時(shí)產(chǎn)生的HR損傷 比SEQ ID NO: l或3，或者比從被轉(zhuǎn)化的相同宿主種中獲得的野生型艏a 等位基因的表達(dá)所產(chǎn)生的HR損傷更少或更小。這些等位基因/直系同源 物可以被稱為在給定宿主中賦予"弱HR表型"的tW"等位基因。如本 文上文中所述，可以鑒定并且/或者分離這些#^7等位基因或直系同源 物。不同的#7 "等位基因和/或直系同源物的HR表型可以通過這樣的方 式進(jìn)行比較，即用它們制備表達(dá)載體(優(yōu)選地，將待對(duì)比的所有核酸可 操作地連接至相同的啟動(dòng)子例如35S),用這些表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物或植物 組織，然后比較這些植物之間的HR損傷的表型。對(duì)于茄科植物的轉(zhuǎn)化體， 表達(dá)SEQIDNO: 1或3的轉(zhuǎn)化體的HR損傷表型優(yōu)選被用作參照，并且 在相同的啟動(dòng)子的控制下表達(dá)時(shí)任何產(chǎn)生更少和/或更小HR損傷的等位 基因都是賦予弱HR表型的等位基因?？梢允褂枚喾N方法(例如顯微術(shù)(任 選地對(duì)死細(xì)胞進(jìn)行染色)；視覺評(píng)估、計(jì)數(shù)損傷以計(jì)算每cm'的數(shù)目；測(cè) 定HR損傷的直徑等)比較并且任選地定量所述HR損傷的表型。
優(yōu)選地，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物具有對(duì)一種或多種病原體(尤其是對(duì) 所述轉(zhuǎn)基因植物種的活體營養(yǎng)性病原體和/或半活體營養(yǎng)性病原體)的增 強(qiáng)的抗病性。因此，例如轉(zhuǎn)基因的番茄或馬鈴薯植物具有對(duì)上文中列出的至少一種或多種的真菌種、細(xì)菌種、線蟲種和/或病毒病原體(最優(yōu)選 對(duì)至少一種或數(shù)種活體營養(yǎng)的和/或半活體營養(yǎng)的種)的增強(qiáng)的抗性。
本文使用的"抗病性"或"增加的/增強(qiáng)的抗病性"是指(與野生型 或?qū)φ辙D(zhuǎn)化體相比)轉(zhuǎn)化體抵抗一種或多種植物病原體侵襲的增強(qiáng)的能 力，或者換而言之，它是指與非轉(zhuǎn)化的(或空載體轉(zhuǎn)化的)對(duì)照相比在 轉(zhuǎn)化體中的疾病癥狀的顯著降低。使用多種方法可以確定抗病性或增強(qiáng) 的抗病性。經(jīng)常通過在接種或接觸病原體后的一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)評(píng)估所 述疾病癥狀(在生物測(cè)試中或者在田地中)用肉眼對(duì)疾病癥狀進(jìn)行打分。 其他可用的方法包括檢測(cè)并任選地進(jìn)4亍定量所述病原體的方法。因此， 如果轉(zhuǎn)基因植物與對(duì)照相比在組織中/上檢測(cè)到的病原體的量顯著減少， 或者所述病原體在所述轉(zhuǎn)基因植物中的擴(kuò)散比在對(duì)照中的擴(kuò)散顯著減 慢，那么所述轉(zhuǎn)基因植物有增強(qiáng)的抗病性。最后，當(dāng)種植于相同的疾病 壓力下(優(yōu)選在田地中)時(shí)，與對(duì)照相比轉(zhuǎn)化體的平均產(chǎn)量的顯著增加
(例如至少1%、 2%、 5%、 10%或更多)可提供增強(qiáng)的抗病性的間接量度。
因此，如果與未轉(zhuǎn)化的或者空白載體轉(zhuǎn)化的對(duì)照相比疾病癥狀有顯
著減少，那么表達(dá)NRC1蛋白(或具有組成型活性的NRC1蛋白)的大多 數(shù)轉(zhuǎn)化植物顯示增強(qiáng)的抗病性。很明顯需要進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析以確定是否 存在顯著性差異。優(yōu)選地，在iW67轉(zhuǎn)化體中的一種或多種疾病癥狀平均 比對(duì)照植物^f氐至少2%、 5%、 10°/。、 15%、 20%、 30%、 40%、 50%甚至100%。 因?yàn)榧膊y(cè)定法對(duì)于每種宿主-病原體組合是不同的，所以無法提供具體 的方案，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉怎樣確定轉(zhuǎn)化體是否具有對(duì)一種或多 種病原體的顯著增強(qiáng)的抗病性。本領(lǐng)域已知的用每種植物-病原體組合的 生物測(cè)定法可以被用于比較轉(zhuǎn)基因植物與合適的對(duì)照的抗性。
由于NRC1蛋白在某些實(shí)施方案中可以在無病原體的情況下產(chǎn)生HR 損傷(例如，如果順"基因受組成型啟動(dòng)子控制)在某些實(shí)施方案中 區(qū)分膽G表達(dá)導(dǎo)致的癥狀與病原體感染和擴(kuò)散引起的癥狀是重要的。因 此，優(yōu)選使用檢測(cè)病原體本身(而不是植物組織上的壞死)的方法，以 及比較存在的病原體的量或者病原體的擴(kuò)散速度。例如可以使用其中通 過染色檢測(cè)所述病原體的生物測(cè)定法。在所述實(shí)例中，使用了表達(dá)GUS 的轉(zhuǎn)基因的黃枝孢霉小種。因此，使用X-gluc對(duì)所述接種的植物組織進(jìn) 行染色可以觀察真菌的菌絲體。與對(duì)照相比，所述轉(zhuǎn)基因植抹的真菌菌 絲體的顯著減少表明了對(duì)所述真菌的增強(qiáng)的抗性。另 一個(gè)實(shí)施方案是產(chǎn)生表達(dá)多種NRC1蛋白的轉(zhuǎn)基因植林，所述NRC1 蛋白優(yōu)選地受不同的啟動(dòng)子(例如不同的病原體誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)的控制。
通過在合適的時(shí)間和合適的位點(diǎn)表達(dá)合適量的NRC1蛋白，可以對(duì)抗 病性表型進(jìn)行微調(diào)。通過確定最適當(dāng)于特定的宿主-病原體組合的啟動(dòng)子 并且還通過選擇有所需表達(dá)水平的轉(zhuǎn)基因"事件，，，可以實(shí)現(xiàn)這樣的微調(diào)。 在病原體侵襲后過低水平的NRC1蛋白或NRC1蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的太慢可能 會(huì)不足以增強(qiáng)抗病性水平。在另一方面，太高的蛋白水平或者在沒有病 原體侵襲的時(shí)間和位點(diǎn)的表達(dá)可以導(dǎo)致不合乎需要的農(nóng)藝表型，例如沒 有病原體時(shí)葉或果實(shí)的損傷以及產(chǎn)量的降低。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員能 夠容易地制備具有增強(qiáng)的抗病性的植物，而所述植物同時(shí)又是農(nóng)藝上可 接受的。按照上文所述可分離或鑒定最佳的NRC1等位基因一—例如提供 高抗性水平和弱HR表型的等位基因。
表達(dá)所需水平NRC1蛋白的轉(zhuǎn)化體通過例如分析拷貝數(shù)目(DNA印跡 分析)、mRNA轉(zhuǎn)錄水平(例如使用A^7引物對(duì)或側(cè)翼序列引物的RT-PCR ) 或者通過分析各個(gè)組織中NRC1蛋白的存在和水平(例如SDS-PAGE、ELISA 測(cè)定等)來進(jìn)行篩選。由于調(diào)控的原因，優(yōu)選單拷貝的轉(zhuǎn)化體，并且分 析(優(yōu)選測(cè)序)嵌合基因插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列以表征該"事件"。選擇高 度或中等龎"表達(dá)的轉(zhuǎn)基因事件用于進(jìn)一步地雜交/回交/自交，直至獲 得具有穩(wěn)定的靨G轉(zhuǎn)基因的高效的優(yōu)勢(shì)事件。
表達(dá)本發(fā)明的一種或多種順Ci基因的轉(zhuǎn)化體還可以包含其他的轉(zhuǎn) 基因—一例如賦予對(duì)其他生物脅迫和/或非生物脅迫的抗病性或耐受性
的其他基因。為了獲得這種具有"重疊的"轉(zhuǎn)基因的植物，可以將其他 轉(zhuǎn)基因滲入至所述膽"轉(zhuǎn)化體中，或者可以在隨后用 一種或多種其他基 因轉(zhuǎn)化所述轉(zhuǎn)化體；或者可以用多個(gè)嵌合基因轉(zhuǎn)化植物系或變種。 例如，多個(gè)嵌合基因可以存在于單載體中，或者可以存在于共轉(zhuǎn)化的不 同載體中。
在一個(gè)實(shí)施方案中，以下的基因與本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)v^"基因組
合已知的抗病基因(尤其是賦予抗死體營養(yǎng)性病原體的增強(qiáng)的抗性的 基因)、抗病毒基因、抗昆蟲基因、抗非生物脅迫基因(例如耐干旱性、 耐鹽性、耐熱或耐冷性等)、抗除草劑基因等。因此，所述重疊的轉(zhuǎn)化體 可以有更廣語的生物應(yīng)激耐受性和/或非生物應(yīng)激耐受性、病原體抗性、 昆蟲抗性、線蟲類抗性、鹽度、冷脅迫、熱脅迫、水脅迫等。同時(shí)，可以在單植物中將y^"沉默方法與NRC1表達(dá)方法聯(lián)合使用。例如， 在根或根莖中的過量表達(dá)可以賦予或者增強(qiáng)根或根莖對(duì)土壤病原體的抗 性。同時(shí)，NRC1在地上部分中的下調(diào)可以賦予對(duì)死體營養(yǎng)性病原體的抗 性(或反之亦然)。
還有可能將所述基因?qū)牖驖B入至已經(jīng)具有一定水平抗病性 的植物育種品系中。為了獲得田地中的持續(xù)抗病性，可能需要在一種植 物中疊加多種抗病才幾制，優(yōu)選地由此所述抗性源具有不同的潛在分子枳j 制。
本文包括上述任何轉(zhuǎn)基因植物的全植林、種子、細(xì)胞、組織和子代 (例如Fl雜種、F2種子/植林等)，并且可以通過其DNA中存在所述轉(zhuǎn) 基因?qū)λ鼈冞M(jìn)行鑒定一 一例如通過使用總基因組DNA為模板和使用艏G 特異的PCR引物對(duì)的PCR分析。也可以開發(fā)"事件特異的"PCR診斷方 法，其中所述PCR引物是基于位于所述插入的嵌合基因側(cè)翼的植物DNA， 參見US6563026。類似地，可以開發(fā)事件特異的AFLP指紋或RFLP指紋， 所述AFLP指紋或RFLP指紋可鑒定所述轉(zhuǎn)基因植物或由其獲得的任何的 植物、種子、組織或細(xì)胞。
需要理解的是，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物優(yōu)選地沒有不利的表型，例如 產(chǎn)量減少、增強(qiáng)的對(duì)疾病(尤其對(duì)死體營養(yǎng))的易感性或不合乎需要的 形態(tài)變化(矮化、變形)等，并且如果在所述原代轉(zhuǎn)化體中出現(xiàn)這些表
本文描^的任何轉(zhuǎn)基因植物對(duì)于所述轉(zhuǎn)基因都;以是純合的或半;的:
基因沉默方法和基因沉默載體
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案還提供了具有增強(qiáng)的抗病性(尤其是針對(duì) 抗死體營養(yǎng)性病原體)的植物，由此所述植物被7W"基因沉默載體轉(zhuǎn)化。 這樣的想法不是對(duì)本發(fā)明的范圍的限制，即對(duì)內(nèi)源性蕭d基因或基因家 族的沉默會(huì)造成所述轉(zhuǎn)基因植物失去觸發(fā)和/或啟動(dòng)HR應(yīng)答的能力。由 于死體營養(yǎng)性病原體的生長(zhǎng)和發(fā)育需要細(xì)胞的死亡，這樣的植物可以具 有對(duì)一種或多種死體營養(yǎng)性病原體的增強(qiáng)的抗性。
"基因沉默"是指一種或多種靶基因(例如內(nèi)源的W"基因)的基 因表達(dá)的下調(diào)或完全抑制。抑制性RM在降低或消除基因表達(dá)中的用途 已經(jīng)在本領(lǐng)域中被確立，并且是多篇綜述文獻(xiàn)的研究主題(例如Baulcombe 1996， Stametal. 1997， Depicker and Van Montagu, 1997 )。 現(xiàn)有的多種技術(shù)可以在植物中實(shí)現(xiàn)基因沉默一 例如產(chǎn)生全長(zhǎng)或部分靶 基因的反義RNA的嵌合基因(參見例如EP 0140308 Bl、 EP 0240208 Bl 和EP 0223399 Bl )，或者產(chǎn)生正義RNA (也^皮稱為共抑制)的嵌合基因 (參見EP 0465572 Bl )。
然而，迄今為止最成功的方法是同時(shí)產(chǎn)生所述靶基因("反向重復(fù)序 列")的正義RNA和反義RNA，它在細(xì)胞中形成雙鏈RNA (dsRNA)并且沉 默所述靶基因。用于dsRNA產(chǎn)生和基因沉默的方法和載體已經(jīng)記載于EP 1068311、 EP 983370 Al、 EP 1042462 Al、 EP 1071762 Al和EP 1080208 Al中。因此，本發(fā)明的載體可以包含在植物細(xì)胞中有活性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)， 所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)可操作地連接至本發(fā)明的順"基因的正義和/或反義 DNA片段。通常，所述乾基因序列的短(正義和反義)片段，例如編碼 或非編碼序列的17、 18、 19、 20、 21、 22或23個(gè)核苷酸就足矣。也可 以使用較長(zhǎng)的序列，例如50、 100、 200或250個(gè)核苷酸或者更多。優(yōu)選 地，所述短的正義和反義片段可以被間隔序列例如內(nèi)含子隔開，該序列 在形成dsRNA時(shí)產(chǎn)生一個(gè)環(huán)(即發(fā)夾)。SEQ ID NO: 1或3或者它們變
在所有ii些組，織或器官(依賴于所i用的啟動(dòng)子)中工一種或多4的
^ t7基因被沉默。產(chǎn)生發(fā)夾構(gòu)建體的方便的方法是使用通用載體例如 pHANNIBAL和pHELLSGATE、基于Gateway⑧技術(shù)的載體(參見Wesley ef W. 2004， Methods Mol Biol. 265:117—30; Wesley etal. 2003， Methods Mol Biol. 236:273-86 and Helliwell & Waterhouse 2003, Methods 30 (4): 289-95.)，所有這些文獻(xiàn)通過引用的方式納入本文。
通過選擇vW"基因的保守核酸部分，可以沉默宿主植物或植物部分 中的；w"家族成員。本文還涵蓋這樣的轉(zhuǎn)基因植物，它包含一種可操作 地連接至y^67基因的正義和/或反義DNA片段的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，并且對(duì) 一種或多種病原體(尤其是死體營養(yǎng)性病原體)有增強(qiáng)的抗性。
同時(shí)提供了對(duì)一種或多種活體營養(yǎng)性病原體和/或半活體營養(yǎng)性病 原體并且對(duì)一種或多種死體營養(yǎng)性病原體有增強(qiáng)的抗性的植物。這樣的 植物可以通過選擇合適的啟動(dòng)子-VWt7基因組合產(chǎn)生。例如，可以在某 一時(shí)間的某一組織中(例如在誘導(dǎo)時(shí)或者在植物地上部分中)產(chǎn)生功能 性的NRC1蛋白，提供對(duì)活體營養(yǎng)性和/或半活體營養(yǎng)性病原體的抗性；而同時(shí)在不同組織中和/或在不同時(shí)間(例如在幼苗中，在根或塊莖中等) 一種或多種所述內(nèi)源的y^"基因被沉默，從而提供對(duì)一種或多種死體營
養(yǎng)性病原體的抗性。因此，單獨(dú)一種植物可以同時(shí)包含嵌合的表達(dá)NRC1 的轉(zhuǎn)基因和；^"的沉默基因。
本發(fā)明的突變等位基因和植物
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案還有使用非轉(zhuǎn)基因的方法例如TILLING (定 向誘導(dǎo)基因組局部突變(Targeting Induced Local Lesions IN Genomics); McCallum " a/" 2000， Nat Biotech 18:455和McCallum ". 2000， Plant Physiol. 123， 439-442，這兩篇文獻(xiàn)都通過引用 的方式納入本文)等誘變系統(tǒng)和選擇，來形成產(chǎn)生較高水平的本發(fā)明的 一種或多種NRC1蛋白并且/或者產(chǎn)生具有組成型活性的所描述的NRC1 蛋白的植物品系。不是對(duì)本發(fā)明的范圍的限制，本發(fā)明人相信這些植物 的啟動(dòng)子的抑制蛋白結(jié)合位點(diǎn)中可以包含點(diǎn)突變/缺失突變，所述點(diǎn)突變 /缺失突變將使所述宿主VW"基因組成型表達(dá)或者較高水平表達(dá)。具有 組成型活性的vW"突變將包含編碼區(qū)(例如MHD區(qū))中的突變。優(yōu)選地， 所述突變體或所述突變體的部分中的NRC1蛋白水平與非突變的植物相 比增加至少約2、 5、 10、 15%或更多。TILLING使用傳統(tǒng)的化學(xué)誘變(例 如EMS誘變)，隨后對(duì)突變體進(jìn)行高通量篩選(例如使用Cel l酶切割突 變體-野生型DNA異源雙鏈并且使用測(cè)序凝膠系統(tǒng)檢測(cè))，參見例如 Henikoff " ". Plant Physiology Preview May 21， 2004。因此， 本發(fā)明涵蓋在一種或多個(gè)組織中具有增強(qiáng)的基因表達(dá)并且具有一 種或多種本發(fā)明的NRC1表型(增強(qiáng)的抗病性和/或HR損傷)的非轉(zhuǎn)基因 植物、種子和組織，以及用于產(chǎn)生和鑒定這樣的植物的方法。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包含下述步驟將植物種子誘變處理 (例如EMS誘變)、收集植物個(gè)體或DNA、 PCR擴(kuò)增目的區(qū)域、形成異源 雙鏈體并進(jìn)行高通量檢測(cè)、鑒定所述突變植物、將所述突變體PCR產(chǎn)物 測(cè)序。應(yīng)理解的是，同樣可以使用其他的誘變和篩選方法以產(chǎn)生這樣的 突變植物。例如，可以對(duì)種子進(jìn)行輻射或化學(xué)處理并且在植林中篩選變 化的表型，例如增強(qiáng)的抗病性和/或HR損傷。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物材料是所述物種或相關(guān)物 種的自然群體(populations),所述物種或相關(guān)物種在位于^WC7直系同源基因編碼序列和/或調(diào)控序列的DNA序列中包含多態(tài)性或變異。使用 ECOTILLING方法(Henikof f et al 2004，見上文)可以篩選在所述Aff" 基因乾標(biāo)的突變。在該方法中，可以通過上述的TILLING方法篩選育種 系或者相關(guān)物種中的天然多態(tài)性，其中植物的個(gè)體或群體(pools)被用 于AW67靼標(biāo)的PCR擴(kuò)增、異源雙鏈體的形成和高通量分析。隨后可以選 擇具有所需突變的植物個(gè)體，所述植物個(gè)體可以被用于隨后的育種程序， 以引入所需的VW"-直系同源的等位基因以便用于開發(fā)具有所需性狀的 栽培種。
通過分子方法(例如DNA中存在的一個(gè)或多個(gè)突變、NRC1蛋白水平、 膽"RM水平等)并且通過變化的表型特征可以將突變植物與非突變體 區(qū)分開。
所述非轉(zhuǎn)基因的突變體對(duì)于所述突變來說可以是純合的或雜合的。
序列參照
SEQ ID NO 1:
SEQ ID NO 2:
SEQ ID NO 3:
SEQ ID NO 4: SEQ ID NO
番茄^W"基因的編碼區(qū) 番茄NRC1蛋白的氨基酸序列 番癡y^"基因的全長(zhǎng)cDNA (包括 番茄NRClD柳v蛋白的氨基酸序列 番茄A) 67基因的3' UTR
和3' UTR )


圖1-預(yù)測(cè)的NRCl蛋白序列
前150個(gè)氨基酸殘基表示巻曲螺旋(CC)結(jié)構(gòu)域，并且預(yù)測(cè)形成所 述CC結(jié)構(gòu)的殘基用下劃線標(biāo)示。第151-508位殘基包含核苷酸結(jié)合 (NB-ARC)結(jié)構(gòu)域，它具有下列基序(由下劃線并標(biāo)出)激酶1A ( P環(huán))、 RNBS-A、激酶2、 RNBS-B、 RNBS-C、 GLPL、 RNBS-D和MHD。第509-846 位殘基包含13個(gè)非完全的富含亮氨酸的重復(fù)單元(LRR );保守的疏水殘 基和脯氨酸殘基以粗體標(biāo)示。在所述蛋白序列的下方，LRR共有基序被 標(biāo)出'1，表示保守的脂肪族殘基，'c，表示保守的帶電荷殘基，并且 'P，表示保守的脯氨酸殘基。
圖2A- t^C7是67-4介導(dǎo)的番茄對(duì)黃枝孢霉的完全HR所必需的 將CfO番茄植林和包含67*-4的番茄植抹用指定的TRV構(gòu)建體接種，在VIGS開始后3周分析所述植林。在TRV感染的含C/一的番茄植林的 小葉中注入Avr4蛋白并檢查HR的發(fā)生。將在TRV: 00感染的植物上出現(xiàn) HR位點(diǎn)的數(shù)目設(shè)定為100%。每個(gè)誤差條都代表4次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)誤差。
圖2B-膽"是<7/-4介導(dǎo)的番茄對(duì)黃枝孢霉的完全抗性必需的
將非TRV感染的和TRV感染的6T-4或植抹用黃枝孢霉 -pGPD::GUS接種，并且在接種后2周用X-gluc測(cè)定法研究小葉的定殖。
圖3-用TRV:NRC1接種本生煙草會(huì)影響Cf/Avr、 LeEix2/tvEix、 Pto/AvrPto和Rx/CP i秀導(dǎo)的HR
用TRV:OO (空載體)、TRV:NRC1和TRV: SGT1接種本生煙草。在3 周后，用表達(dá)誘導(dǎo)HR的蛋白的農(nóng)桿菌浸潤葉并在浸潤后的4天拍照。第 1列、第2列和第3列是分別以Jw《以(7/-夕和j吖夕的混合物或者以 ^&>2和tvEix混合物(以1: 1的比例混合)進(jìn)行農(nóng)桿菌浸潤的表達(dá)C尸j 抗性基因的本生煙草葉。第4列由J^^"進(jìn)行農(nóng)桿菌浸潤的表達(dá)戶^ 抗性基因的轉(zhuǎn)基因本生煙草葉。第5列用表達(dá)PVX (C)包被蛋白的 基因進(jìn)行農(nóng)桿菌浸潤的表達(dá)^抗性基因的轉(zhuǎn)基因本生煙草葉。暗圏表示 HR,亮圈表示弱化的HR。
圖4-具有組成型活性的NRC1誘導(dǎo)不依賴于誘導(dǎo)子的HR并且使NRC1 定位于細(xì)胞死亡信號(hào)傳遞通路中
將表達(dá)"^/抗性基因的本生煙草用指定的基因進(jìn)行農(nóng)桿菌浸潤。對(duì) 于圖A和圖C,在進(jìn)行農(nóng)桿菌浸潤前3周將所述植物用指定的TRV構(gòu)建 體接種。暗圏表示HR,亮圏表示弱化的HR。
(A) 編碼具有組成型活性的MAPKK和MAPK激酶的基因的農(nóng)桿菌浸 潤。第1列用編碼LeMAPKKKoc (MAPKKK-KD)的具有組成型活性的激 酶結(jié)構(gòu)域的基因進(jìn)行農(nóng)桿菌浸潤。第2列用編碼組成型活性形式的 LeMEK2 ( MEK2DD )的基因進(jìn)行農(nóng)桿菌浸潤。用MAPKKK-KD或MEK2DD浸潤 2天后，以雌二醇噴灑葉來誘導(dǎo)表達(dá)。在農(nóng)桿菌浸潤后4天拍照。
(B) 受35S啟動(dòng)子調(diào)控的野生型蕭"(wt)和該基因的突變形式 的農(nóng)桿菌浸潤，所述基因以1: 1的比例與指導(dǎo)編碼沉默抑制子p19的基 因表達(dá)的農(nóng)桿菌混合使用(左圖)或者單獨(dú)使用(右圖)。#v C97/
(K191R): ;Wt7的無活性P-環(huán)突變體；V^C柳^ DW1V ):具有組成型 活性的#7 〃 (在MHD基序中有突變)；^C9//2/DWK (K"1R/DW1V): yw C7的雙突變體。在農(nóng)桿菌浸潤后3天拍照。(C) j^^和編碼具有組成型活性的NRC1D481V (D481V)的基因的農(nóng) 桿菌浸潤。在農(nóng)桿菌浸潤后3天拍照。
圖5- NRCl介導(dǎo)的細(xì)胞死亡信號(hào)傳遞;f莫型
模型基于在本生煙草中將細(xì)胞死亡測(cè)定和VIGS結(jié)合的異位顯性實(shí) 斷epistasis experiment )。Cf-4/Avr4以EDS1、NRC1、MEK2和SGT1/RAR1
依賴的方式介導(dǎo)細(xì)胞死亡信號(hào)。
如下的非限制實(shí)施例舉例說明了本發(fā)明的不同的實(shí)施方案。除非在 實(shí)施例中另外聲明，否則所有重組DNA技術(shù)都是按照在Sambrook "a/. (1989) "o/ 2'w "a60r"or7他/7w"，第2版,Cold Spring
Harbor Laboratory Press中；Sambrook and Russel 1 (2001) M /ecw/ar "o/7//7f JZa6or"o/y他/ wa/'第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY中；以及在Ausubel "a/. (1994) Cz/rre/7"y"0c0/s
Cwre/7f ^rofocoh， USA的第1和2巻中記載的 標(biāo)準(zhǔn)方法完成。用于植物分子實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)材料和方法在戶/a/7/M /ec"/ar A/o/柳Za6/"ai (1993) by R. D. D. Croy， jointly published by BIOS Scientific Publications Ltd (UK) and Blackwell Scientific Publications, UK中有記載。
實(shí)施例
1.材料和方法
1. 1本生煙草中的VIGS、農(nóng)桿菌浸潤、HR和疾病測(cè)定 用pTVOO-衍生的構(gòu)建體(二元TRV RNA2載體)和pBintra6 ( 二元 TRVRNA1載體)的1: 1混合物(Ratcliff et al.， 2001 Plant J. 25， 237-245 )，或者用pTRV-RNA2衍生的構(gòu)建體和pTRV-RNAl的1: 1混合物 (Liuetal.， 2002， Plant J. 31， 777-786; Liu et al., 2002， Plant J. 30, 415-429 )對(duì)4周齡的本生煙草植林進(jìn)行了農(nóng)桿菌浸潤。使用了 下列TRV構(gòu)建體TRV: NRC1、 TRV: Cf-4和TRV: SGTl( Peart et al. ， 2002， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99， 10865-10869 )，它們都在Ratcliff 等人(2001，見上文)描述的TRV載體中；以及TRV:EDS1、 TRV:MEK2、 TRV:RAR1和TRV:NDRl(Ekengrenet al.， 2003， Plant J. 36, 905-917 )， 它們都在Liu等人(2002， Plant J. 30， 415-429 )描述的TRV載體中。對(duì)于每種TRV構(gòu)建體，每次實(shí)驗(yàn)均使用4林植物。J盯/^o和W分別對(duì) 表達(dá)抗性基因W"本生煙草Ao(品系38-12) (Rommens et al. ， 1995， Plant Cell 7， 1537-1544 )) ( Pedley and Mart in, 2003， A腿.Rev. Phytopathol. 41， 215-243 )和Wi(本生煙草(品系Rx-18 )
(Bendahmane et al. ， 1999， Plant Cell 11， 781-791 ))的TRV感染 的本生煙草進(jìn)行農(nóng)桿菌浸潤。在所有其他情況下，用表達(dá)抗性基因C尸-4 的本生煙草(本生煙草進(jìn)行農(nóng)桿菌浸潤。在TRV接種后3周， 以這樣的根瘤農(nóng)桿菌攻擊所述接種葉上面的第3、 4和5片葉，即所述根 瘤農(nóng)桿菌指導(dǎo)下列基因的表達(dá)^盯戶^(006。。=0. 06) (Tangetal.， 1996， Science 274， 2060-2063 ); 6V7( OD600=0. 12 ) ( Bendahmane et a 1. ， 1999， 見上文)；j盯4 OD6。。=0. 03 )、 C/"-夕和J盯^以1: 1的比例混合，0D6。。=0. 2 )
(Van der Hoorn et al. ， 2000 Mol. Plant-Microbe Interact. 13， 439-446 ); ZeAAr2和/ W乂以1: 1的比例混合，OD600=1 ) ( Ron and Avni， 2004， Plant Cell 16， 1604-1615 ); P-葡糖搭酸糖苷酶(GUS )基因
(OD600=2 ) ( Van der Hoorn et al. ， 2000， Mol. Plant-Microbe Interact. 13， 439-446 ); 和(以1: 1的比例混合，0D6。。=1) ( Voinnet et
al.， 2003， Plant J. 33, 949-956 );具有組成型活性的A^7戶柳^或無 活性的^C,w^^^雙突變(0D6。。=2); Ze船尸^X"滯、Ze^^ftOXo^-
(Del Pozo et al.， 2004， EMBO J. 23， 3072-3082 )(兩者都是 OD6。。=0. 12);或者ZevI/a^"/ 和(Del Pozo et al., 2004，見上 文)(兩者都是OD600= 0 . 25 )。 Ze^息"c^"、 Ze麼^OX,、 Ze船vT，或 Ze^必T^浸潤后2天，以含silwet (4 pl/100 ml)的7. 5 -的17-0-雄二醇水溶液對(duì)葉進(jìn)行噴灑(Del Pozo et al. ， 2004，見上文)。為了 進(jìn)行蛋白的注入，依照廠商的建議(Invitrogen， Breda, NL )使用腸激 酶EK-max處理Avr4-HIS-FLAG標(biāo)記的蛋白，并且將添加0. 2%吐溫(v/v ) 的5 的Avr4蛋白水溶液用于注入。在農(nóng)桿菌浸潤或蛋白注入后3-5 天，檢查葉上HR的形成，或者測(cè)定P-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的活性。 1.2番茄中的VIGS、 HR和疾病測(cè)定
為了在番茄中進(jìn)行VIGS，使用了 Liu等人(2002， Plant J. 30， 415-429 )描述的pTRV-RNAl和pTRV-RNA2載體。通過使用A感l(wèi)/h>718 的消化從pTV00上切下C尸-4和iW"片段，并將其插入至勘/HHl/J^7718-消化的pTRV-RNA2(pYL156 ) (Liu et al. , 2002， Plant J. 31， 777-786 )。為了構(gòu)建 TRV: 222-UTR ， 使用引物 222-3 ，UTR-F ( 5 ， -GTGGATCCGCAGGTTCAACCAGCCTGGT-3， ； 位點(diǎn)用下劃線標(biāo)出)和
222-3， UTR-R(5' -GTGGTACCCAAGTGACTTGTTCTGCTGT-3， ； ^y/ 718位點(diǎn) 用下劃線標(biāo)出)擴(kuò)增了膽"3， -UTR的一部分；并且為了構(gòu)建 TRV:222-LRR ， 使 用 引 物 222-LRR-F ( 5 ， -GTGGATCCGTTAAGAGGCTGCAATTTCT-3,;勘威l位點(diǎn)用下劃線標(biāo)出)和 222-LRR-R ( 5， -GTGGTACCGATCTTCTCAAGTTTATCAC-3， ; Js/ 718位點(diǎn)用下 劃線標(biāo)出)擴(kuò)增了編碼LRR的區(qū)的一部分。所述PCR片段經(jīng) 勘威l/A/ 718-消化并被插入至勘威l/^/ 718消化的pTRV-RNA2中。 TRV:Prf的構(gòu)建在(Ekengren et al., 2003， Plant J. 36, 905-917 ) 中有記載。使用電穿孔將所有質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌林GV3101中
(Takken et al., 2000, Plant J. 24， 275-283 )。為了在番癡中建立 VIGS，用pTRV-RNA1和pTRV-RNA2 f汙生的構(gòu)建體的混合物(以1: 1的比 例組合)對(duì)番茄幼苗的10-12日齡的子葉進(jìn)行農(nóng)桿菌浸潤(Liuet al., 2002,見上文)。對(duì)于每種TRV構(gòu)建體，使用4林對(duì)表達(dá)J^^的黃枝孢 霉有抗性的且含C/J的番茄植林(以Cf-4)轉(zhuǎn)化的Cf 0植物)
(Thomas et al. ， 1997, Plant Cell 9, 2209-2224 ),或者4林對(duì)表 達(dá)Jw夕的黃枝孢霉有抗性的且含6T-夕的番茄植林(以iycr夕-夕C( 轉(zhuǎn)化的CfO植物)(Jones et al., 1994， Science 266， 789-793 )。 4吏 用了以TRV:OO接種的或者以TRV:NRC1接種的對(duì)黃枝孢霉完全敏感的 Cf0番茄植林(匪-CfO)作為對(duì)照。為了進(jìn)行疾病測(cè)定，TRV接種后3 周將CfO植林和含C尸-4的植林用黃枝孢霉接種(De Wit， 1977， Neth. J. Plant Path. 83， 109-122 )。使用了黃枝孢霉的小種5-; 67^ : 67^
(在組成型C"啟動(dòng)子控制下表達(dá)J盯4和p-葡糖醛酸糖苷酶基因)。兩 周后通過X-gluc染色評(píng)估小葉的定殖。同時(shí)，所述植林的第2、第3或 第4復(fù)葉的小葉被用于RT-PCR分析，以測(cè)試目的基因的"敲低"(見下 文)。為了進(jìn)行HR測(cè)定，在TRV感染的含C/、或(7/-夕的植林的第3復(fù) 葉的小葉中分別注入Avr4或Avr9。 4吏用孩i量注射器(Ito Corporation, Fuji, Japan)在小葉中注入兩種誘導(dǎo)子。在每林植物的四片小葉且每片 小葉的10個(gè)位點(diǎn)注射濃度為10 pM的Avr4。對(duì)于Avr9,從黃枝孢霉的 小種5和CfO植物的匹配相互作用物中分離的含約10陣的Avr9的細(xì)胞 質(zhì)外體(apoplastic)液經(jīng)8倍稀釋，注射于每林植物的四片小葉且每片小葉的8個(gè)位點(diǎn)上。在接種TRV:OO、 TRV: Prf或TRV: NRC1的番茄 RG-PtoR (Ao/Wo,戶r/ZPr/")中測(cè)定了對(duì)丁香假單胞菌番茄致病變型的 抗性。接種的方法以及葉細(xì)菌定殖的確定按照上文的描述進(jìn)4亍(Ekengren et al.， 2003，見上文)。
1. 3 二元JJ5VY^7載體的構(gòu)建和誘變 使用引物
222-Start-F (5， -GGGATCCATGGTTGATGTAGGGGTTGA-3，)和 222-Stop-R (5， -GTCACTGCAGACCTTTCTAAGAAGCTGTCTG-3，) PCR-擴(kuò)增全長(zhǎng)W"cDNA，從而分別引入#"1和尸WI限制位點(diǎn)(限
制位點(diǎn)用下劃線標(biāo)出)。所述PCR片段經(jīng)v^0l/戶5""消化并被插入
腸I/戶"I消化的pRH80中(Van der Hoorn et al. ， 2000， Mol. Plant-Microbe Interact. 13， 439-446 )。隨后，所述構(gòu)建體經(jīng)J6al/f/7/ / 消化，產(chǎn)生的含有35S啟動(dòng)子、yWG開;^文閱讀框和NOS終止子(tNOS) 的片段^皮克隆至丄^I/f; /71消化的pM0G800 二元載體中(Hon6 eet al.， 1998, Plant Physiol. 117， 809-820 ),以形成質(zhì)并立NRC1 (wt )。為了 形成具有組成型活性的二元y^"w*7J/,通過重疊延伸PCR (Higuchi et al., 1988， Nucleic Acids Res. 16， 7351—7367 )導(dǎo)入D481V突變， 所述PCR使用膽"W質(zhì)粒作為模板并且使用側(cè)翼引物222-Start-F、 222-Stop-R以及4昔配引物
222MHD-F (5 ， -CAAAACTTGTCGTGTTCATGICATGTTGTATGAG-3 ，)和 222MHD-R (5， -CCAGCAAAACTCATACAACATG4CATGAACACGAC-3，)(突變用 下劃線標(biāo)出)。
所述片段經(jīng)vVc0I/戶Wl消化，被插入至pRH80中，并且將 ^5^-膽C戶""-^WS片段切下，然后將其插入pM0G800中——如上述。 以類似的方式形成P-環(huán)突變體^WC""和無活性雙突變體 WC79//M^/「。這里，K191R突變的引入是使用錯(cuò)配引物
222Ploop-F (5， -GGAATGCCTGGTCTTGGCA^ACTACACTAGC-3，)和 222Ploop-R (5， - GCTAGTGTAGTTgTGCCAAGACCAGGCATTCC-3，)(突變 用下劃線標(biāo)出)，并且分別以質(zhì)粒膽"(W)和廁C戶""作為模板。所 有的構(gòu)建體均經(jīng)序列確證并被轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌林GV3101中。1. 4 DNA凝膠印跡分析
使用QIA-Gen DNA提取方案(Qiagen， Venlo, NL )分離本生煙草的 基因組DNA,而對(duì)于番癡則使用(Sambrook and Russell, 2001， Molecular cloning: A Laboratory Manual, 第 3版.(Cold Spring Harbor, NY, U.S.A.: Cold Spring Harbor Laboratory Press)中記 載的標(biāo)準(zhǔn)方案。用A/aHI、 #//7^111、 fcMI、 fco; V或Z6al消化所述DNA。 用TRV: NRCl載體中252 bp的32P標(biāo)記(Prime-a-gene Labeling System, Promega， Madison, WI )片段雜交本生煙草的凝膠印跡物，并且用對(duì)應(yīng) 于全長(zhǎng)NRC1 cDNA的第1876-3168位核苷酸的1293個(gè)堿基的"P-標(biāo)記探 針雜交番茄的DNA凝膠印跡物。所使用的限制性酶位點(diǎn)并不存在所述探 針中。低嚴(yán)格度是指55。C下在2x SSC和0. 5% SDS中洗滌。高嚴(yán)格條件 包括65。C下在0. 5x SSC和0.5% SDS中洗滌。
1. 5 RT-PCR顯示番癡中的沉默
從TRV-感染植物的第2、第3或第4復(fù)葉收集4個(gè)葉盤(leaf disc) (總計(jì)大約100 mg組織)。使用QIA-Gen RNAeasy提取方案(Qiagen， Venlo， NL敗取總RNA，并且用無RNA酶的DNA斷Bio-Rad， Veenendaal， NL)進(jìn)行處理。使用Bio-RadcDNA合成試劑盒(Bio-Rad， Veenendaal, NL)用1 總RNA合成cDNA的第一條鏈，并且使用以下的循環(huán)進(jìn)行 RT-PCR: 95。C下15秒，60。C下45秒，以及72t:下60秒。所j吏用的引 物
(222F: 5， - TGAGGTATATTGCTTTCTCATCTGAC-3，和 222R: 5, -AGCTATTTTCCCACGGATGCCCAG-3，) 不覆蓋插入TRV: NRC1中的片段。肌動(dòng)蛋白引物
(ActinFnrl82: 5， -TATGGAAACATTGTGCTCAGTGG-3，和 ActinRnrl83: 5' -CCAGATTCGTCATACTCTGCC-3') 被用于檢查在所述PCR反應(yīng)物中是否存在等量的cDNA。
實(shí)施例2-結(jié)果
2. 1番癡NRC1; CC-NB-LRR蛋白
進(jìn)行了 cDNA-AFLP分析，隨后對(duì)本^;^,.'C尸-4中的經(jīng)鑒定的番茄 片段進(jìn)行VIGS。20條cDNA片段被鑒定，這些片段的VIGS影響C尸-4力吖4誘導(dǎo)的HR。對(duì)于其中的一條——#i^7,分離了它的全長(zhǎng)cDNA，如SEQID N0: 3所示。y儀G的開放閱讀框在SEQ ID N0: l中示出，其編碼SEQ ID NO: 2所示的NRC1蛋白。
所述NRC1蛋白(SEQ ID NO: 2)的預(yù)測(cè)的一級(jí)結(jié)構(gòu)一般類似于 CC-NB-LRR抗性蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)(圖1 )。NRC1有一個(gè)氨基端巻曲螺旋(CC ) 結(jié)構(gòu)域、 一個(gè)NB-ARC(Apaf-l、 R蛋白和CED4共有的核苷酸結(jié)合接頭) 結(jié)構(gòu)域(Van der Biezen and Jones, 1998, Curr. Biol. 8， R226-R227; Aravind et al.， 1999， Trends Biochem. Sci. 24， 47_53)和13個(gè) 不完全的富含亮氨酸的重復(fù)單元(LRR)。如圖1中所示，與同源的 NB-ARC結(jié)構(gòu)域的比較表明存在一個(gè)激酶1A或P-環(huán)基序、4個(gè)RNBS(抗 性核苷酸結(jié)合部位)基序以及一個(gè)GLPL和MHD基序(Meyers et al.， 1999， Plant J. 20， 317-332; Meyers et al.， 2003， Plant Cell 15， 809-834 )。
在用于VIGS的TRV: NRC1載體中存在的252 bp的cDNA-AFLP片段編 碼氨基酸599-681,它們位于第4-7個(gè)LRR中。
將BamHI、 HindIII、 EcoRI、 EcoRV和Xbal消>(匕的番茄基因組DNA 用作為探針的1293 bp NRC1 cDNA片段(SEQ ID NO: 3的第1876-3168 位核苷酸)來雜交，從而進(jìn)行低嚴(yán)格度DNA凝膠印跡分析，所述NRC1 cDNA 片段涵蓋了存在于TRV: NRC1、TRV: NRC1-LRR和TRV: NRC1-UTR構(gòu)建體(見 下文)中的NRC1序列。該DNA印跡顯示，在高嚴(yán)格度洗滌后僅剩下一條 主帶，這說明M"在番茄中是單拷貝基因。
用TRV載體中的番茄廚"cDNA-AFLP片段探測(cè)經(jīng)BamHI、 HindIII、 EcoRI、 EcoRV和Xbal消化的本生煙草基因組DM的凝膠印跡物，出現(xiàn) 了 2-3條雜交帶(結(jié)果未顯示)(0. 5 x SSC， 0. 5% SDS， 65°C )。該結(jié)果 說明了在本生煙草的基因組中至少存在有2-3種在用TRV: NRCl接種時(shí)可 被沉默的VW"直系同源物。
2. 2 NRC1沉默的番茄在Cf-4介導(dǎo)的HR和抗病性方面受到影響 為了研究NRC1在HR信號(hào)傳遞和黃枝孢霉抗性中的作用，本發(fā)明人 在番茄中進(jìn)行了 VIGS，這是因?yàn)榉咽沁@種真菌唯一的宿主。用 TRV:NRC1對(duì)10日齡的番茄幼苗進(jìn)行農(nóng)桿菌浸潤，在浸潤后3周從潛在 被沉默的小葉中分離RNA并使用RT-PCR進(jìn)行分析。所述NRC1轉(zhuǎn)錄物水平在不同的TRV:NRC1感染植物中有變化，但在多數(shù)情況下它們均低于 TRV: OO感染的植物中的水平，這表明發(fā)生了 NRC1表達(dá)的"敲低，，(數(shù)據(jù) 未顯示)。
為了排除這樣的可能性，即本發(fā)明人在番茄中觀察到的表型是由其 他NB-LRR蛋白的沉默引起的，本發(fā)明人還使用靶向第8-12個(gè)LRR的360 bp的順"片段(TRV: NRC1-LRR)以及由297 bp組成的的3'-非翻 譯區(qū)(UTR)的片段(TRV:NRC1-UTR)在番茄中進(jìn)行了 VIGS。通過將AvH 蛋白注入至TRV: 222-LRR和TRV: 222-UTR感染的、含Cf-4的番茄植林中， 本發(fā)明人使用這些構(gòu)建體測(cè)試了 NRC1對(duì)于番茄中Cf-4介導(dǎo)的HR是否是 必需的。(使用所述3種構(gòu)建體中的每種)對(duì)W"的沉默導(dǎo)致了輕度的 表型變化，其表現(xiàn)是所述番茄植林比TRV: 00或TRV: Cf-4感染的植林稍 小(數(shù)據(jù)未顯示)。將Avr4蛋白注入至TRV:00和TRV:Cf-4感染的植林 中作為對(duì)照。在TRV:Cf-4感染植林中，Avr4注入位點(diǎn)的應(yīng)答百分?jǐn)?shù)是 52°/ (圖2 ),這表明由于Cf-4的沉默而導(dǎo)致了 HR的減少。在TRV: 222-LRR 和TRV: 222-UTR感染的植林中，該百分?jǐn)?shù)類似(分別是56%和48% )(圖 2)，在番茄中也確證了 NRC1在C尸-4/^W誘導(dǎo)的HR中的作用。當(dāng)在含 C尸-夕的番茄中對(duì)進(jìn)行VIGS以及隨后注入包含Avr9的細(xì)胞質(zhì)外體 液時(shí)也獲得了類似的結(jié)果(未顯示)。為了在含夕的番茄中對(duì) 進(jìn)行VIGS，本發(fā)明人使用了 TRV: Cf-4構(gòu)建體，這是因?yàn)?04 bp的Cf-4 編碼高度保守的第15-21個(gè)LRR,能夠同時(shí)沉默C尸-4以及同源的 抗'性基因(Van der Hoorn et al. ， 2001,見上文)。
再者，還研究了 NRC1是否也是番茄對(duì)黃枝孢霉的完全抗性所必需 的。將Cf 0和Cf—植抹用TRV: 00、 TRV: Cf-4和TRV: NRC1接種，3周后 將沉默的植林用表達(dá)Avr4和P -葡糖醛酸糖苷酶(GUS )基因的黃枝孢霉 菌抹接種，由此將真菌的生長(zhǎng)可視化。在黃枝孢霉接種后2周，用X-gluc 對(duì)葉進(jìn)行染色。在以TRV: 00感染的Cf-4植林的小葉上沒有檢測(cè)到黃枝 孢霉的生長(zhǎng)，而在TRV: Cf-4感染的Cf-4植林中藍(lán)染色的斑表明弱化的 C/^介導(dǎo)的抗性(未顯示)。在TRV: NRC1感染植林中藍(lán)染色的小斑還表 明了對(duì)該真菌完全失去抗性。顯微鏡分析顯示，在TRV: Cf-4和TRV: NRC1 感染植林中有細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)的真菌菌絲，而在TRV: OO感染的對(duì)照植林中沒 有。所有的CfO植林均表現(xiàn)出大量的黃枝孢霉定殖，這說明既不是TRV 感染本身也不是使用TRV:NRC1的VIGS影響了這些植物對(duì)該真菌的敏感性。
2. 3 NRC1的VIGS可影響由不同的匹配R基因/Avr基因組合i秀導(dǎo)的
巡
在使用NRC1進(jìn)行VIGS時(shí)除了減少了 Cf-4/Avr4誘導(dǎo)的HR之外，發(fā) 明人發(fā)現(xiàn)在本生煙草中使用NRC1進(jìn)行VIGS時(shí)還減少了由卵菌
(oomycete)病/^、體致病疫審(戶力j^o/7力f力ora /./7尸es^/751)的i秀 導(dǎo)子誘導(dǎo)的HR。為了進(jìn)一步研究NRC1在防御信號(hào)傳遞中的特異性，本 發(fā)明人測(cè)試了由另外的R/Avr組合誘導(dǎo)的HR對(duì)它的需求。以TRV: OO(空 載體)和TRV:SGT1作為對(duì)照，這是因?yàn)楝F(xiàn)有技術(shù)已知SGT1對(duì)于由多種 R/Avr組合i秀導(dǎo)的HR來說是必需的(Peart etal.， 2002， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99， 10865-10869 )。
Cf-9和Avr9的混合物(Van der Hoorn et al. ， 2000，見上文) 或者M(jìn)/W和"臉的混合物(Ron and Avni, 2004， Plant Cell 16， 1604-1615 )對(duì)TRV: NRCl感染的本生煙草的農(nóng)桿菌浸潤導(dǎo)致HR的減少， 而在TRV: 00感染的植林中HR正常發(fā)生。在TRV: SGT1感染的植林中HR 被完全地消除，這證實(shí)了 Peart等人(2002，見上文)的發(fā)現(xiàn)(圖3 )。 同時(shí)，將細(xì)菌病原體丁香假單胞菌番茄致病變型的J盯戶"和編碼馬鈴薯 X病毒(PVX )包被蛋白(CP )的基因分別對(duì)表達(dá)抗性基因戶"(Pedley and Martin, 2003, Annu. Rev. Phytopathol. 41， 215-243 )和 h
(Bendahmane et al. ， 1999， Plant Cell 11， 781-791 )的TRV感染 的本生煙草進(jìn)行農(nóng)桿菌浸潤。在兩種情況下，以TRV: OO感染的植林均出 現(xiàn)HR,而TRV:SGT1感染的植林中HR被消除。TRV: NRCl感染除了深度抑 制Wi/T尸誘導(dǎo)的HR外，還深度抑制i^o力盯戶"誘導(dǎo)的HR,這表明在本 生煙草中由多種^/4盯基因-對(duì)-基因組合激活的HR信號(hào)傳遞需要NRCl 蛋白(圖3)。
為了排除這樣的可能性，即在TRV: NRCl感染的本生煙草中弱化的 HR是農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化率的降低的結(jié)果，本發(fā)明人用表達(dá)P-葡糖醛酸糖苷 酶(GUS)基因的農(nóng)桿菌(Van der Hoorn et al.，見上文)浸潤TRV: 00 和TRV: NRCl感染的本i;^事.'進(jìn)行浸潤3天后，TRV: 00和TRV: NRCl 感染的植林中的相似強(qiáng)度的藍(lán)染色表明了農(nóng)桿菌對(duì)所述植林的轉(zhuǎn)化率沒 有受到影響(數(shù)據(jù)未顯示)。另外，用Avr4蛋白注入時(shí)所述TRV: NRCl感染的植林也顯示出HR的減少，而在TRV:OO感染的植林中2天內(nèi)出現(xiàn) 了明顯的HR。
2.4 NRC1作用于細(xì)胞死亡信號(hào)傳遞途徑中EDS1的下游和MAPK級(jí)聯(lián) 的上游
因?yàn)椴坏獵/-4/^i^誘導(dǎo)的HR，而且多個(gè)其他W力盯組合誘導(dǎo)的HR 都需要NRC1，所以NRC1似乎會(huì)參與共同的HR信號(hào)傳遞途徑。出現(xiàn)在HR 起始前的典型宿主反應(yīng)包括MAPK級(jí)聯(lián)的激活(Romeis a人，2001， EMBOJ. 20， 5556-5567; Del Pozo et al. ， 2004， EMB0 J. 23， 3072-3082; Pedley and Martin, 2005， Plant Biol. 8, 541-547)。
為了研究由MAPK啟動(dòng)的HR對(duì)NRC1的需求，在本生煙草中進(jìn)行了異 位顯性實(shí)驗(yàn)。將植林用TRV:OO、 TRV:SGT1和TRV:NRC1接種，然后用編 碼LeMAPKKK oc的激酶結(jié)構(gòu)域(Ze^^^iT"滯)或具有組成型活性的 LeMEK2 的基因進(jìn)行農(nóng)桿菌浸潤(Yangetal.， 2001， Pro"
Natl. Acad. Sci. USA 98, 741-746; Del Pozo et al., 2004， EMBO J. 23, 3072-3082.)。進(jìn)行農(nóng)桿菌浸潤2天后，通過用雌二醇噴灑經(jīng)浸潤的 葉誘導(dǎo)所述基因的表達(dá)。在TRV: 00感染的植林中每個(gè)基因的短暫表達(dá)均 形成了 HR,而在TRV: SGT1感染的植林中HR減少(圖4A )。在TRV: NRC1 感染的植抹中，兩種具有組成型活性的激酶引起的HR都不受影響(圖 4A)。相應(yīng)的陰性對(duì)照——Ze船/^OXor屈-和野生型ZeJ/E/[7的農(nóng)桿菌浸潤 在任何TRV感染的植林中都沒有導(dǎo)致HR (數(shù)據(jù)未顯示)。這些結(jié)果表明， SGT1在這些MAPK的下游區(qū)起作用，而MAPK作用于NRC1的下游區(qū)或者 獨(dú)立于NRCl發(fā)揮作用。
2. 5 ;^ "的短暫過表達(dá)以及具有組成型活性的NRC1蛋白的構(gòu)建 為了進(jìn)一步研究哪些基因是CC-NB-LRR蛋白介導(dǎo)的HR信號(hào)傳遞所必 需的，研究了朥"過表達(dá)的作用。因此，將所述cDNA的編碼序列(SEQ ID NO: 1)與組成型35S啟動(dòng)子融合并插入至二元載體中。該構(gòu)建體對(duì) 本生煙草的農(nóng)桿菌浸潤沒有導(dǎo)致HR，而NRC1和p19沉默抑制子(Voirmet et al.， 2003， Plant J. 33， 949-956 )的混合物的表達(dá)確實(shí)引起了不 依賴于誘導(dǎo)子的HR (圖4B)。編碼NRC1的P-環(huán)突變體(K191R)的構(gòu)建 體的農(nóng)桿菌浸潤破壞了 P-環(huán)基序，從而影響ATP的水解(Tameling et al.，2002， Plant Cell 14， 2929-2939 )，不管有沒有p19都沒有形成HR (圖 4B)。
因此，上述的數(shù)據(jù)表明所述yw"基因的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)可
以阻止在iW67過表達(dá)組織中發(fā)生HR。同時(shí)，P-環(huán)基序的破壞會(huì)形成無 功能的NRCl蛋白。
因?yàn)樵贜B-LRR抗性蛋白R(shí)x (D460V) ( Bendahmane et al., 2002; Tameling et al. ， 2002 )和I_2 ( D495V ) ( Bendahmane et al.， 2002, Plant J. 32， 195-204; Tameling et al., 2002， Plant Cell 14, 2929-2939; Van Bentem et al. ， 2005， Plant J. 43， 284-298 )的MHD 基序中的突變會(huì)產(chǎn)生組成型活性，所以本發(fā)明人制備了類似的NRCl的突 變體(NRC1D481V)。事實(shí)上，在NRClD訓(xùn)v的農(nóng)桿菌浸潤后3天內(nèi)，本生 煙草的葉上形成了不依賴于誘導(dǎo)子的HR，而雙突變體NRC1K191R/D481V的 農(nóng)桿菌浸潤還是沒有出現(xiàn)HR (圖4B)。再者，NRClD訓(xùn)v在SGTl-沉默的 植林中表達(dá)時(shí)沒有誘導(dǎo)出HR(見下文)。這些結(jié)果表明，NRQD術(shù)v的農(nóng) 桿菌浸潤時(shí)誘導(dǎo)的應(yīng)答尤其是由該NRCl蛋白的組成型活性造成的，并且 NRCl在會(huì)導(dǎo)致HR的信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)中發(fā)揮功能。
2. 6使用具有組成型活性的NCR1蛋白的異位顯性實(shí)驗(yàn) 進(jìn)行了使用NRC1D481V的異位顯性實(shí)驗(yàn)以進(jìn)一步研究該蛋白介導(dǎo)的 HR信號(hào)傳遞還需要哪些基因，并由此確定其在HR通路中的推定位置。 除了對(duì)已知通常參與HR信號(hào)傳遞的基因例如5677和A4iW (Mlal2抗性 必需的 (Required for Ml且12 resistance ) ) ( Shirasu and Schulze-Lefert， 2003， Trends Plant Sci. 8， 252-258 )進(jìn)4亍VIGS 之夕卜，將本生煙草,C尸一的^ZW7(非小種特異的抗病性)(Century et al.: 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92， 6597—6601 )、 EDS1 (增強(qiáng)的 疾病易感性)(Aarts et al. ， 1998， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95， 10306-10311 )和(MAPKK) (Ekengren et al. ， 2003， Plant J. 36， 905-917 )沉默，隨后用NRQD^v或J^^進(jìn)行農(nóng)桿菌浸潤。再者，使用 TRV: 00、 TRV:Cf-4和TRV:魔1的VIGS 4皮作為對(duì)照。弱化的NRC1D481V 或Jp^/誘導(dǎo)的HR表明基因的"敲低，，分別是NRCl或Cf-4/Avr4誘導(dǎo) HR信號(hào)傳遞所必需的。
如預(yù)期的一致，Avr4的農(nóng)桿菌浸潤時(shí)誘導(dǎo)的HR在TRV: Cf-4和TRV:NRC1感染的植林中被弱化。Cf-4介導(dǎo)的信號(hào)傳遞還需要EDS1，這 是因?yàn)樵摶虮怀聊闹擦殖霈F(xiàn)了較輕程度的Avr4誘導(dǎo)的HR。另外， 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在MEK2、 RAR1和SGT1 ;故沉默的植抹中Avr4的農(nóng)桿菌浸 潤時(shí)出現(xiàn)了 HR的減少(圖4C;亮圈)。所述Avr4誘導(dǎo)的HR在TRV: 00 和TRV: NDR1感染的植祙中沒有被弱化(圖4C;暗圈)，這表明NDR1不 是Cf-4介導(dǎo)的信號(hào)傳遞必需的。類似地，NRQD訓(xùn)v誘導(dǎo)的HR在TRV:00 和TRV: NDR1感染的植林以及在TRV: Cf-4感染的植林中都沒有^皮弱化。 值得注意的是，與Avr4相反，NRClD^v仍會(huì)在TRV:EDS1-感染的植抹中 誘導(dǎo)HR，這表明NRC1在EDS1的下游區(qū)起作用(圖4C;暗圏)。NRC1D481V 誘導(dǎo)的HR在MEK2被沉默的植林中被弱化，這表明NRC1需要MAP激酶級(jí) 聯(lián)用于其信號(hào)傳遞，并且可以位于這些激酶的上游。RAR1和SGT1的VIGS 還弱化了 D481V誘導(dǎo)的HR，這類似于由Avr4誘導(dǎo)的HR (圖4C;亮圈)。 因此，NRC1是由Cf-4啟動(dòng)的HR信號(hào)傳遞必需的，并且可以位于所述MAPK 級(jí)聯(lián)的上游和EDS1的下游。
NRC1介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)傳遞的模型參見圖5。
實(shí)施例3- W介導(dǎo)的抗性需要NRC1
為了確定NRC1對(duì)于#/介導(dǎo)的針對(duì)線蟲類、粉虱和辨蟲的抗性是否 是必需的，將組成型活性形式的#/(參見US 6613962和EP0937155B1) 農(nóng)桿菌浸潤至y^"被沉默的植林中。jW"被沉默的植抹中HR的減少表 明了 A^"也是Mi介導(dǎo)的HR必需的，并且NRC1的(過)表達(dá)可以被用 于產(chǎn)生具有增強(qiáng)的針對(duì)線蟲類、粉虱和蟲牙蟲的抗性的轉(zhuǎn)基因植物。
權(quán)利要求
1. 一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述轉(zhuǎn)基因植物與非轉(zhuǎn)基因的對(duì)照植物相比具有增強(qiáng)的抗病性，所述方法包含步驟(a)用可操作地連接至在植物細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子的編碼NRC1蛋白的核苷酸序列轉(zhuǎn)化植物或植物細(xì)胞，(b)再生植物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述核苷酸序列被整合進(jìn)所述植 物的基因組中。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，還包含步驟(c )就對(duì)一種或多種植物病原體的抗性對(duì)所述再生植物或它們通 過自交或雜交得到的植物進(jìn)行篩選，并且鑒定對(duì)一種或多種所述植物 病原體具有增強(qiáng)的抗性的植物。
4. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述啟動(dòng)子是病原體 誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
5. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述NRC1蛋白包含 SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4的氨基酸序列或者與SEQ ID NO: 2在全 長(zhǎng)上有至少70%氨基酸同一性的氨基酸序列。
6. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述植物屬于茄科 (5Wa/ aceae)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述植物是茄屬(So/a/7咖)植物。
8. —種通過根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法獲得的轉(zhuǎn)基因植 物、植物細(xì)胞、種子或果實(shí)。
9. 一種分離的蛋白，所述蛋白包含SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4 的氨基酸序列或者與SEQ ID NO: 2在全長(zhǎng)上有至少70%氨基酸同一性的 氨基酸序列。
10. —種分離的核酸分子，所述核酸分子編碼根據(jù)權(quán)利要求9的蛋白。
11. 一個(gè)嵌合基因，所述嵌合基因包含一個(gè)在植物細(xì)胞中有活性 的啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子可操作地連接至根據(jù)權(quán)利要求10的核酸分子， 并且任選地還可操作地連接至一個(gè)3，非翻譯的核酸分子。
12. —種包含根據(jù)權(quán)利要求11的嵌合基因的載體。
13.編碼NRC1蛋白的核酸分子用于產(chǎn)生抗病植物的用途，其中所 述NRC1蛋白包含SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4的氨基酸序列或者與 SEQ ID NO: 2在全長(zhǎng)上有至少70%氨基酸同 一性的氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及產(chǎn)生具有增強(qiáng)的抗病性的植物的方法。提供了NRC1蛋白和編碼這些蛋白的核酸序列，還提供了產(chǎn)生NRC1蛋白的轉(zhuǎn)基因植物。
文檔編號(hào)C07K14/415GK101415828SQ200680054232
公開日2009年4月22日 申請(qǐng)日期2006年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月28日
發(fā)明者J·H·沃森, M·H·A·J·喬斯騰, P·J·G·M·德威特, S·H·E·J·加布里埃爾斯 申請(qǐng)人:關(guān)鍵基因公司;瓦格寧根大學(xué)