專利名稱：紅笛鯛特異性抗體及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，特別是涉及一種紅笛鯛特異性抗體及其制備方法。
背景技術：
大多數魚的幼體出生或孵化后的一定時間內，其自身的免疫系統尚不完善，不能產生針對特異性病原的抗體，無法抵御水中病原微生物的侵襲，而導致抗病力下降，以致于仔魚成活率很低。在我國魚類特別是海水魚類種苗生產過程中，種苗的成活率很低，如紅笛鯛種苗的成活率不到5％，石斑魚種苗的成活率則更低，這嚴重制約著我國魚類規(guī)模化育苗的健康發(fā)展。傳統的手段無法取得很好的效果，如抗生素的長期使用，會導致病原微生物的抗藥性增強，使其對動物的抗病促生長效果逐漸降低，增加養(yǎng)殖成本地同時也造成了藥物在動物體內的殘留和病原菌抗藥性的傳播。對人體健康也構成嚴重威脅；而采取免疫手段，僅對成魚比較合適，而仔魚此時器官尚未發(fā)育完全，對仔魚起到相反的作用。
魚類種苗死亡率居高不下的直接原因與孵化后仔魚自身免疫力低有著密切的關系。在這個免疫未熟期內，幼體抵抗病原感染的主要免疫分子是來源于母體的抗體，胎生動物幼體可通過胎盤或初乳獲得所需的抗體，而卵生動物則有別于胎生動物。禽類母體的特異性抗體能轉移到卵，雛禽出殼后通過卵黃獲得母源抗體，其血液中的IgY可為其提供強有力的被動免疫，保護雛禽免受相應疾病的早期感染以提高其自身的抗病能力。由于絕大數魚類是卵生動物，仔魚可能象禽類一樣能從母體獲得特異性抗體。因而，雌親魚母源抗體如何轉移到仔魚已成為當今魚類免疫學家所關注的熱點。因此通過免疫親魚來提高卵黃抗體的含量使仔魚獲得足夠多的母源抗體，保護其免受相應疾病的早期感染以提高其自身的抗病能力，有可能開辟一條新的防治途徑。澄清魚類母源抗體的諸多學術問題的同時也為促進水產種苗生產的健康發(fā)展提供重要的理論依據。
抗體在所有脊椎動物中都有發(fā)現，在機體抵抗病原微生物的侵襲中發(fā)揮著重要的作用，魚類對各類抗原的刺激的特異性反應是通過產生特異性抗體來實現的。用抗體來治療，預防各種感染及替代減少抗生素的使用已有相當長的歷史。由于抗體生產制備過程復雜，來源有限，價格昂貴，使得抗體的應用受到極大限制。
魚類免疫系統以及應答規(guī)律的基礎研究，都有賴于高純度的抗體。純化魚類抗體常采用凝膠過濾和離子交換層析二者結合的方法，但操作較為煩瑣，分離蛋白的純度達不到要求；SPA親和層析技術也有應用，而SPA對哺乳類IgG有較高的非特異性結合能力，對魚類Ig的結合能力差，導致其分離純化的抗體量少，純度也不高；用單克隆抗體作配體的免疫親和層析純化抗體也有報道，可是單克隆抗體的制備過程較為復雜。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是為了克服上述現有技術存在的不足，提供一種紅笛鯛特異性抗體及其制備方法。該來源廣泛的特異性抗體，涉及其性質詳細的說明，并提供一種理想的、適用于實驗室小量純化抗體的有效方法。為對其充分利用提供科學依據，用于防治水生動物早期的低成活率，滿足海水魚類規(guī)?；绲慕】蛋l(fā)展。
為實現上述目的本發(fā)明采取的技術方案是本發(fā)明的紅笛鯛特異性抗體的基本特征為1、三種抗體L鏈分子量均為29kD；2、血清IgM、特異性卵黃抗體H鏈分子量為80kD；3、仔魚母源抗體H鏈分子量為77.5kD；4、血清IgM與人IgM無免疫同源性；5、血清IgM與皮膚粘液、膽汁中的Ig存在相同的抗原決定簇；6、血清IgM的等電點為5.60；7、卵黃抗體的等電點為6.08；8、三種抗體均能夠特異性結合山羊IgG和兔抗紅笛鯛IgM抗血清。
一種紅笛鯛特異性抗體的制備方法，包括以下步驟免疫，催產繁殖，取樣，飽和硫酸銨分級鹽析，親和層析；應用商品化的山羊IgG免疫性成熟的雌性紅笛鯛，取親魚的血清、卵黃，對其它親魚人工催產，孵化繁殖后，取仔魚勻漿，以飽和硫酸銨分步鹽析與親和層析2步法，對親魚特異性卵黃抗體，仔魚抗體進行分離純化，對親魚血清抗體直接用親和層析純化，十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳表明三種抗體的均一性。
所述紅笛鯛特異性抗體的制備方法，該方法如下(1)免疫親魚①以商品化的山羊IgG按體積比加入等量的弗氏完全佐劑乳化完全后制成抗原a，按體積比加入等量弗氏不完全佐劑乳化完全后制成抗原b；②選擇性成熟的雌性紅笛鯛作生物反應器，基礎免疫和第一次加強免疫用步驟①中抗原a免疫，此后的第二此加強免疫和第三次加強免疫采用抗原b，每次間隔兩周，0.3-0.5mL/尾，經腹腔注射免疫；③最后一次免疫完1-2個星期后，用雙向免疫擴散檢測步驟②中免疫紅笛鯛親魚所產生的血清抗體效價，取效價1∶8以上的血清，-20℃保存；(2)催產繁殖，取樣①最后一次免疫完20-30天后，對步驟(1).②中親魚進行人工催產，產卵前取親魚卵黃，勻漿、離心后，取上清，-20℃保存；②最后一次免疫完20-30天后，對步驟①中部分親魚進行人工催產，孵化繁殖后，取早期仔魚勻漿，離心取上清，-20℃保存；(3)飽和硫酸銨分級鹽析①硫酸銨沉淀步驟(2).①中特異性卵黃抗體的飽和度區(qū)間為45～55％，4℃、8000轉/分離心20分鐘，-20℃保存；②硫酸銨沉淀步驟(2).②仔魚抗體的飽和度區(qū)間為40～50％，4℃、8000轉/分離心20分鐘，-20℃保存；(4)親和層析①用親和層析分離純化步驟(1).③中親魚血清抗體，-20℃保存；親和層析所用的填料為羊IgG-瓊脂糖，平衡液為0.01mol/L pH7.2磷酸鹽緩沖液，含0.5mol/L氯化鈉，洗脫液為0.1mol/L pH11的甘氨酸-氫氧化鈉；②用親和層析分離純化步驟(3).①中特異性卵黃抗體，-20℃保存；親和層析所用的填料為羊IgG-瓊脂糖，平衡液為0.01mol/L pH7.2磷酸鹽緩沖液，含0.5mol/L氯化鈉，洗脫液為0.1mol/L pH11的甘氨酸-氫氧化鈉；③用親和層析分離純化步驟(3).②中仔魚抗體，經微孔濾膜過濾后上柱，沒有與等體積的磷酸鹽緩沖液混勻，而是直接上柱，-20℃保存；親和層析所用的填料為羊IgG-瓊脂糖，平衡液為0.01mol/L pH7.2磷酸鹽緩沖液，含0.5mol/L氯化鈉，洗脫液為0.1mol/L pH11的甘氨酸-氫氧化鈉。
本方法以商品化的耦聯抗原的瓊脂糖作親和層析介質純化時可以有效的純化。該法不僅可得到高純度的紅笛鯛仔魚母源抗體，而且具有操作簡便、耗時少、實驗條件要求低的特點。
本發(fā)明的積極效果除了其資源豐富，特異性強，可有效純化海水魚的抗體之外，還可以闡明本領域存在的一些極具爭議性的問題1.證實了紅笛鯛母源抗體的垂直轉移，說明紅笛鯛血清抗體、卵黃抗體和仔魚抗體的一致性，卵黃抗體和仔魚抗體從母體免疫系統轉移而來。
2.皮膚粘液、膽汁中的免疫球蛋白和血清免疫球蛋白可能是同源的。
3.特異性卵黃抗體、仔魚抗體不是血清抗體的單體，也不是血清抗體的變異精簡結構體。
本發(fā)明的三種抗體均能夠特異性結合山羊IgG和兔抗紅笛鯛IgM抗血清，且純度和特異性極高，本發(fā)明的抗體及其衍生物可制備檢測紅笛鯛體內抗體的試劑盒，已制備多克隆抗體、還可以制備單克隆抗體等，以便更深的研究魚的一些免疫系統和部分免疫機理等問題?？煽朔鹘y研究手段的一些不足。
具體實施例方式
本發(fā)明用下列實施例來進一步說明。
(1)抗原制備在無菌操作臺上將商品化的0.3mg-3mg山羊IgG溶于0.15mL磷酸鹽緩沖液后，分別按1∶1與弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑乳化后制成抗原a和抗原b，4℃保存?zhèn)溆谩?br> (2)親魚的免疫基礎免疫和14天后的第一次加強免疫，分別經腹腔注射抗原a免疫；29天和44天的進一步加強免疫分別經腹腔注射抗原b免疫。
(3)血清的制備最后一次免疫完1-2個星期后，用無菌注射器從尾靜脈采血，室溫下靜置1小時，待凝固后置4℃冰箱中過夜，次日以5000-10000轉/分離心10-20分鐘，收集上層血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> (4)卵黃勻漿液的制備最后一次免疫完20-30天后，每尾雌魚注射8-60μg LHRH-A3+100-200IU HCG，雄魚劑量減半，催產12小時后剖腹取出雌魚的卵巢，將魚卵擠到干凈的燒杯并稱重。然后轉移到玻璃研漿器并加入5倍體積的磷酸鹽緩沖液，4℃下勻漿。勻漿液4℃下8000轉/分離心20分鐘，上清液重復離心一次，上清液在-20℃下保存。
(5)仔魚勻漿液的制備最后一次免疫完20-30天后，每尾雌魚注射8-60μg LHRH-A3+100-200IU HCG，雄魚劑量減半，孵化繁殖，自出膜時取四萬尾仔魚，加入2倍體積(w/v)的磷酸鹽緩沖液，低溫勻漿，4℃、8000轉/分離心20分鐘，上清液重復離心一次，收集上清-20℃保存。
(6)血清IgM的純化將山羊IgG-瓊脂糖懸液裝柱，用平衡液預洗，流速為20mL/h。然后用洗脫液流洗。再用平衡液重新平衡。2mL步驟(3)中血清與2mL 0.01M磷酸鹽緩沖液混勻，無菌針頭濾器過濾，濾液上柱。平衡液洗滌，直至OD280降到基線；用洗脫液洗脫，收集組分，立即用中和液中和。層析柱用平衡液流洗備用，置透析液中4℃透析24小時，其間多次更換透析液。用聚乙二醇20000濃縮，4℃保存?zhèn)溆谩?br> (7)飽和硫酸銨分步鹽析特異性卵黃抗體向步驟(4)上清液緩慢加入pH7.2的飽和硫酸銨溶液，并不斷攪拌，使硫酸銨的終濃度為35％飽和度，于4℃靜置12h后，4℃、8000轉/分離心20分鐘，沉淀用Tris-HCl重懸，即得0～30％的沉淀重懸液。往上清液繼續(xù)加飽和硫酸銨，依次得到35～45％，45～55％和55～65％的沉淀重懸液。
將重懸液于4℃、Tris-HCl透析除鹽，此后加入等體積Tris-HCl稀釋分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> (8)飽和硫酸銨分步鹽析仔魚抗體向步驟(5)上清液緩慢加入pH7.2的飽和硫酸銨溶液，并不斷攪拌，使硫酸銨的終濃度為30％飽和度，于4℃靜置12小時后，4℃、8000轉/分離心20分鐘，沉淀用Tris-HCl重懸，即得0～30％的沉淀重懸液。往上清液繼續(xù)加飽和硫酸銨，依次得到30～40％，40～50％和50～60％的沉淀重懸液。將重懸液于4℃、Tris-HCl透析除鹽，此后加入等體積Tris-HCl稀釋分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> (9)特異性卵黃抗體的純化將羊IgG-瓊脂糖懸液裝柱，用平衡液預洗，流速為20mL/h，然后用洗脫液流洗，再用平衡液重新平衡。2mL步驟(7)中45～55％的沉淀重懸液與2mL 0.01mol/L磷酸鹽緩沖液混勻，無菌針頭濾器過濾，濾液上柱。平衡液洗滌，直至OD280nm降到基線；再用洗脫液洗脫，收集層析峰洗脫液，立即用中和液中和。中和后的層析峰洗脫液置透析液中4℃透析24小時，每3小時更換一次透析液。用聚乙二醇20000濃縮，4℃保存?zhèn)溆谩?br> (10)仔魚抗體的純化將羊IgG-Agarose懸液裝柱(高8cm)，先用平衡液預洗，后用20mL洗脫液(0.1mol/L)沖洗，再用平衡液重新平衡。將2mL步驟(8)中40～50％沉淀重懸液經微孔濾膜過濾后上柱，平衡液洗至OD280nm降到基線后改用洗脫液洗脫，流速為20mL/小時，分別收集不同的洗脫峰，立即用中和液中和。中和后置于0.02mol/L，pH 7.2的Tris-HCl中，4℃透析24小時，每3小時更換一次透析液。最后經聚乙二醇20000濃縮后于-20℃保存。
權利要求
1.一種紅笛鯛特異性抗體，其特征是(1)三種抗體L鏈分子量均為29kD；(2)血清IgM、特異性卵黃抗體H鏈分子量為80kD；(3)仔魚母源抗體H鏈分子量為77.5kD；(4)血清IgM與人IgM無免疫同源性；(5)血清IgM與皮膚粘液、膽汁中的Ig存在相同的抗原決定簇；(6)血清IgM的等電點為5.60；(7)卵黃抗體的等電點為6.08；(8)三種抗體均能夠特異性結合山羊IgG和兔抗紅笛鯛IgM抗血清。
2.據權利要求1所述紅笛鯛特異性抗體的制備方法，其特征是包括以下步驟免疫，催產繁殖，取樣，飽和硫酸銨分級鹽析，親和層析；應用商品化的山羊IgG免疫性成熟的雌性紅笛鯛，取親魚的血清、卵黃，對其它親魚人工催產，孵化繁殖后，取仔魚勻漿，以飽和硫酸銨分步鹽析與親和層析2步法，對親魚特異性卵黃抗體，仔魚抗體進行分離純化，對親魚血清抗體直接用親和層析純化，十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳表明三種抗體的均一性。
3.據權利要求2所述的紅笛鯛特異性抗體的制備方法，其特征是該方法如下(1)免疫親魚①以商品化的山羊IgG按體積比加入等量的弗氏完全佐劑乳化完全后制成抗原a，按體積比加入等量弗氏不完全佐劑乳化完全后制成抗原b；②選擇性成熟的雌性紅笛鯛作生物反應器，基礎免疫和第一次加強免疫用步驟①中抗原a免疫，此后的第二此加強免疫和第三次加強免疫采用抗原b，每次間隔兩周，0.3-0.5mL/尾，經腹腔注射免疫；③最后一次免疫完1-2個星期后，用雙向免疫擴散檢測步驟②中免疫紅笛鯛親魚所產生的血清抗體效價，取效價1∶8以上的血清，-20℃保存；(2)催產繁殖，取樣①最后一次免疫完20-30天后，對步驟(1).②中親魚進行人工催產，產卵前取親魚卵黃，勻漿、離心后，取上清，-20℃保存；②最后一次免疫完20-30天后，對步驟①中部分親魚進行人工催產，孵化繁殖后，取早期仔魚勻漿，離心取上清，-20℃保存；(3)飽和硫酸銨分級鹽析①.硫酸銨沉淀步驟(2).①中特異性卵黃抗體的飽和度區(qū)間為45～55％，4℃、8000轉/分離心20分鐘，-20℃保存；②.硫酸銨沉淀步驟(2).②仔魚抗體的飽和度區(qū)間為40～50％，4℃、8000轉/分離心20分鐘，-20℃保存；(4)親和層析①用親和層析分離純化步驟(1).③中親魚血清抗體，-20℃保存；親和層析所用的填料為羊IgG-瓊脂糖，平衡液為0.01mol/L pH7.2磷酸鹽緩沖液，含0.5mol/L氯化鈉，洗脫液為0.1mol/L pH11的甘氨酸-氫氧化鈉；②用親和層析分離純化步驟(3).①中特異性卵黃抗體，-20℃保存；親和層析所用的填料為羊IgG-瓊脂糖，平衡液為0.01mol/L pH7.2磷酸鹽緩沖液，含0.5mol/L氯化鈉，洗脫液為0.1mol/L pH11的甘氨酸-氫氧化鈉；③用親和層析分離純化步驟(3).②中仔魚抗體，經微孔濾膜過濾后上柱，沒有與等體積的磷酸鹽緩沖液混勻，而是直接上柱，-20℃保存；親和層析所用的填料為羊IgG-瓊脂糖，平衡液為0.01mol/L pH7.2磷酸鹽緩沖液，含0.5mol/L氯化鈉，洗脫液為0.1mol/L pH11的甘氨酸-氫氧化鈉。
全文摘要
本發(fā)明公開了紅笛鯛特異性抗體及其制備方法，是從一種海水魚體內提取的高技術生物工程產品及其制備方法，包括三種高純度，特異性強的血清IgM、特異性卵黃抗體和仔魚抗體。應用商品化的山羊IgG免疫性成熟的雌性紅笛鯛，取親魚的血清、卵黃，催產繁殖，取仔魚勻漿，以飽和硫酸銨分步鹽析與親和層析純化特異性抗體。涉及用免疫學方法防治水生動物疾病的技術，對研究提高紅笛鯛仔魚的抗病力和成活率具有極為重要的意義。
文檔編號C07K16/18GK101020717SQ200610124340
公開日2007年8月22日 申請日期2006年12月22日 優(yōu)先權日2006年12月22日
發(fā)明者簡紀常, 彭志東, 吳灶和, 魯義善 申請人:廣東海洋大學