專利名稱：美洲一枝黃花總黃酮提取物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥、食品、飲料技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是涉及中藥提取物及其制備方法和用途，更具體地說是涉及一種中藥美洲一枝黃花的總黃酮提取物及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
(一)美洲一枝黃花的研究概況1、概述美洲一枝黃花，又稱加拿大一枝黃花，為菊科植物一枝黃花屬(Solidago)植物加拿大一枝黃花(Solidago Canadensis)的全草或根。美洲一枝黃花始載于《植物名實(shí)圖考》山草類，其主要分布于華東、中南以及陜西、臺灣等地。
一枝黃花屬(Solidago)為菊科(Compositae)中的一屬。一枝黃花屬植物全球大約120種，在中國的分布有4種，分別為一枝黃花(Solidago decurrens Lour.)、新疆一枝黃花(Solidago virgaurea)、朝鮮一枝黃花(Solidago pacifica)和加拿大一枝黃花(SolidagoCanadensis)，另外，東北和新疆有一個(gè)變種Solidago virgaurea 1.var.dahurica kitag.也是同等入藥。
美洲一枝黃花是原產(chǎn)于北美的菊科多年生草本植物，適合于在低溫的環(huán)境中生長，秋季開黃花?，F(xiàn)在中國已經(jīng)廣泛引種栽培，由于其適應(yīng)性非常強(qiáng)，生長旺盛，其花能散發(fā)出清香氣味，花店已經(jīng)作為插花材料使用。
一枝黃花在中國藥用歷史比較悠久，得到廣泛應(yīng)用。隨著藥學(xué)及其相關(guān)學(xué)科以及科研設(shè)備的發(fā)展，人們對于一枝黃花的認(rèn)識也越來越豐富。一枝黃花中主要含有黃酮、皂苷以及甾醇類等化學(xué)成分，具有廣泛的生理活性。由于近年來人們發(fā)現(xiàn)美洲一枝黃花具有良好的臨床應(yīng)用，已逐漸成為新的研究熱點(diǎn)。
2、采制方法美洲一枝黃花以全草入藥，成熟時(shí)采收，洗凈，曬干。
3、化學(xué)成分研究美洲一枝黃花的化學(xué)成分研究甚少，就其化學(xué)研究，目前調(diào)查到的國內(nèi)外研究材料的主要內(nèi)容有(1)萜類化合物
Danuta從波蘭產(chǎn)的美洲一枝黃花葉子和莖中分離鑒定了18種精油成分，其中主要含有γ2-Cadinenes(γ2-杜松烯，27.1％)、α-Pinene(α-蒎烯，13.0％)、檸檬烯(limonene，12.0％)和δ-Cadinenes(杜松烯，7.5％)。
Peter等從波蘭產(chǎn)的美洲一枝黃花中利用GC-MS鑒定了主要成分是異大香葉烯-D(Germacrene D)，α-蒎烯和檸檬烯。
中國學(xué)者夏文孝等從杭州產(chǎn)的美洲一枝黃花中分析并鑒定了精油成分，其主要成分為異大香葉烯-D，另外還含有α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯，雙環(huán)大香葉烯等揮發(fā)油成分。
Kasali等從美洲一枝黃花中分離得到兩種新的精油成分，分別為6-epi-α-cubebene和6-epi-β-cubebene，其中后者含量高達(dá)20.5％。
(2)黃酮類成分T.Anthonsen報(bào)道從美洲一枝黃花的根中分離得到一枝黃花酮(Solidagenone)成分。到目前為止，黃酮類報(bào)道的成分主要有以下化合物。Budzianowski從美洲一枝黃花的花中分離得到槲皮素(quercetin)、槲皮素-3-O-β-D-蕓香苷(quercetin-3-O-β-D-rutinoside)、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷(quercetin-3-O-β-D-galactoside)、山奈酚(Kaemoferol)、山奈酚-3-O-α-L-蕓香苷(Kaemoferol-3-O-α-L-rutinoside)、綠原酸(chlorogrnic acid)、咖啡酸(caffeicacid)、異鼠李素(isorhamnetin)、山奈酚-3-O-α-L鼠李糖苷(Kaemoferol-3-O-α-L-rhamnoside)、異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷(isorhamnetin-3-O-β-D-glycosides)。
(3)三萜(皂苷)類化合物Murach從美洲一枝黃花中分離得到一個(gè)2，23-二羥基齊墩果酸(bayogenin)成分。
Reznicek等從美洲一枝黃花中分離得到4個(gè)新的齊墩果酸類型的皂苷化合物，分別為Canadensissaponins 1、Canadensissaponins 2、Canadensissaponins 3、Canadensissaponins 4、Canadensissaponins 5、Canadensissaponins 6、Canadensissaponins 7、Canadensissaponins 8。
Chaturvedula等從美洲一枝黃花的根中分離得到四種新的羽扇型三萜酸化合物3β-(3R-acetoxyhexadecanoyloxy)-lup-20(29)-ene、3β-(3-ketohexadecanoyloxy)-lup-20(29)-ene、3β-(3R-acetoxyhexadecanoyloxy)-29-nor-lupan-20-on和3β-(3-hetohexadecanoyloxy)-29-nor-lupan-20-one，并且這幾種化合物具有阻止DNAβ-聚合酶的裂解活性。
另外，Apati等從美洲一枝黃花中分離得到許多的礦物成分，如Al、Ca、Co、Cr、Cu、Fe、K、Mg、Mn、Na、P、S、Ti、Zn等。
4、藥理作用研究(1)抗氧化活性McCune通過對加拿大國家的35種藥用植物研究發(fā)現(xiàn)，美洲一枝黃花的甲醇提取物具有很強(qiáng)的抗氧化性，對于自由基的DPPH指標(biāo)測試分析來看，美洲一枝黃花的提取物抗氧化能力明顯強(qiáng)于綠茶提取物和抗壞血酸。
韓為民等研究發(fā)現(xiàn)，美洲一枝黃花植物的花具有良好的保鮮作用。
(2)利尿作用研究表明，利用美洲一枝黃花提取物經(jīng)小鼠皮下注射有一定的利尿作用，但是劑量比較大的時(shí)候反而使得尿量減少。
(3)抗炎作用美洲一枝黃花水提取物或醇提物具有較好的抑制膀胱炎的作用，可以調(diào)節(jié)腎功能的紊亂。
(4)抗菌作用實(shí)驗(yàn)表明，美洲一枝黃花煎劑對于金黃色葡萄球菌、傷寒桿菌均有不同程度的抑制作用，對于紅色癬菌及禽類癬菌有極強(qiáng)的殺菌作用。另外研究表明，美洲一枝黃花水煎醇提液有抗白色念珠菌作用，其療效與制霉菌素相當(dāng)。
(5)平喘祛痰作用對于家兔實(shí)驗(yàn)性支氣管炎(吸入氨蒸氣法)，美洲一枝黃花煎劑，可以解除喘息癥狀，亦有祛痰作用。
(6)其他根據(jù)文獻(xiàn)記載，美洲一枝黃花全草具有清熱解毒，消腫止痛的作用，可以用于感冒熱頭痛，咽喉腫痛以及肺熱咳喘等病癥。
5、美洲一枝黃花的臨床應(yīng)用研究(1)治療流行性感冒，上呼吸道感染用美洲一枝黃花(鮮品)、馬鞭草(鮮品)各50g(兒童酌減)，切碎，水煎服，每日1劑。共治療60例，其中流感50例，上感10例。結(jié)果除了1例因嚴(yán)重并發(fā)癥改用其它藥物外，均單用本方治愈，療程最短1天，最長3天，大多數(shù)只服1劑即愈。
(2)治療急性扁桃體炎用美洲一枝黃花15g，煎服。每日1劑，以愈為度。治療31例均痊愈，其中1劑治療者4例，2劑14例，3劑13例。追訪觀察半年，無1例復(fù)發(fā)。另用美洲一枝黃花鮮品適量，搗爛絞汁，加入食鹽和醋少許拌勻，徐徐含咽，共治小兒急性扁桃體炎300例。結(jié)果是服藥1～3劑治愈率78％，服藥4～6劑治愈率98％。美洲一枝黃花治療本病有退熱快，止痛佳，療效快等特點(diǎn)。
(3)治療真菌性陰道炎每日用100％美洲一枝黃花水煎液揩洗陰道1次，10天為1療程；另用制霉菌素50萬單位片治療(每日1片置陰道后穹隆部)，8～10天為1療程)作對照。兩組均在1療程結(jié)束后第4天復(fù)檢陰道分泌物，鏡檢陰性及癥狀消失者為有效。結(jié)果是用美洲一枝黃花組50例，有效44例，有效率為88％；用制霉菌素組26例，有效23例，有效率為88.4％，兩組療效無顯著差異(P＞0.05)，提示美洲一枝黃花與制霉菌素療效相當(dāng)。
(4)預(yù)防口腔霉菌感染黃飛翔等對充血性心力衰竭并發(fā)肺部感染患者用美洲一枝黃花煎液預(yù)防口腔霉菌感染，取得了良好的療效。心衰并發(fā)肺部感染患者(觀察組)122例，用美洲一枝黃花30g煎液100ml，分3次漱口，對照組用生理鹽水漱口。結(jié)果是觀察組中僅有1例出現(xiàn)口腔霉菌感染，對照組中出現(xiàn)12例口腔霉菌感染，兩組比較非常顯著差異。美洲一枝黃花煎液漱口可以有效的預(yù)防心衰患者口腔霉菌感染，價(jià)格低廉且無毒副作用，值得臨床推廣應(yīng)用。
(5)治療乳腺小葉增生馬國精利用美洲一枝黃花鮮品50g，荔枝核7粒，橘核7粒，鮮橘子葉3片，米酒200ml，燉服。藥渣搗爛外敷患處12小時(shí)，1日1劑，1個(gè)療程5天。結(jié)果治愈率93.75％。
(6)治療食管癌以美洲一枝黃花內(nèi)服、外用，配合服食老鼠肉，治療晚期食管癌引起的疼痛、吞咽困難，延長存活期，療效比較顯著。
(二)阿爾茨海默癥的研究進(jìn)展1、概述癡呆癥包括阿爾茨海默癥(Alzheimer’s Disease，或稱阿爾茲海默癥，簡稱AD)、多重梗塞型癡呆(Multimfarct Dementia)、酒精性癡呆(Alcoholic Dementia)及正常腦壓水腦癥(Normal Pressure Hychocephalus)。
AD是一種慢性原發(fā)、進(jìn)行性腦變性疾病，是發(fā)生于老年期或老年前期的一種進(jìn)行性的神經(jīng)退行性疾病，是進(jìn)入暮年后的一種常見病態(tài)反應(yīng)，屬于非正常衰老狀態(tài)的早老性癡呆病癥。由于AD好發(fā)病于60歲以上老年人，所以習(xí)慣被稱為老年癡呆癥或早老性癡呆癥。
AD以記憶減退、認(rèn)知障礙，行為異常和語言能力喪失位特征，主要表現(xiàn)為大腦皮層獲得性高級功能的全面障礙和認(rèn)知功能明顯受損，腦功能退化衰亡，即記憶功能迅速衰減及識別能力障礙，并伴有行為或人格方面的改變。
該類疾病病程一般較長，約為3～20年。對AD患者常年的護(hù)理費(fèi)用是巨大的，不僅對整個(gè)社會(huì)的醫(yī)療保障系統(tǒng)有極大影響，對中國未來社會(huì)的小家庭模式也是極大的挑戰(zhàn)。因此，其發(fā)生給社會(huì)、家庭均帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和精神負(fù)擔(dān)，也給患者自身帶來極大的痛苦。目前，該疾病仍是全球較為棘手的病癥之一，積極研究開發(fā)新的治療方法是一件刻不容緩的事情。
2、病理表現(xiàn)及發(fā)病機(jī)制
AD的主要病理表現(xiàn)是在前腦基底、海馬和大腦皮層細(xì)胞外神經(jīng)炎斑的形成，細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)的出現(xiàn)以及神經(jīng)細(xì)胞和突觸數(shù)目的減少。斑點(diǎn)主要由淀粉樣前體蛋白(簡稱APP)的蛋白水解產(chǎn)物β淀粉樣蛋白(簡稱Aβ)聚集組成。在正常情況下，APP水解產(chǎn)物是可溶性的Aβ40，而在病理?xiàng)l件下，APP水解產(chǎn)物是長的易形成纖維的Aβ1-42，它先以一種未成熟的、非纖維狀的分散的斑點(diǎn)形式存在，最終經(jīng)過構(gòu)象改變，聚合成一種有毒的纖維狀物質(zhì)，即形成斑點(diǎn)。神經(jīng)纖維纏結(jié)主要存在于錐狀神經(jīng)元的胞內(nèi)和異常的神經(jīng)軸突中，為一非水溶性結(jié)構(gòu)，其主要組成為直徑10nm的雙螺旋纖維結(jié)構(gòu)(簡稱PHF)，主要成分是一種微管結(jié)合蛋白，即tau蛋白，正常的tau蛋白能穩(wěn)定微管蛋白的相互作用，而PHFs中的tau蛋白則以超磷酸化的形式存在。
AD的病因?qū)W復(fù)雜，目前主要有兩種假說tau蛋白假說和淀粉樣蛋白假說。tau蛋白假說的主要論點(diǎn)是由于tau蛋白的超磷酸化導(dǎo)致微管蛋白的不穩(wěn)定，引起高爾基體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而影響APP的代謝，產(chǎn)生過量的Aβ。該假說還未在細(xì)胞或者動(dòng)物個(gè)體水平得到證實(shí)。淀粉樣蛋白假說的主要論點(diǎn)是在細(xì)胞外神經(jīng)病變發(fā)生的周圍淀粉樣蛋白的聚集，導(dǎo)致神經(jīng)炎斑的形成和隨后神經(jīng)纖維纏結(jié)的形成。因此，淀粉樣蛋白是AD病理鏈形成的起因。支持淀粉樣蛋白假說的證據(jù)很廣泛。
在AD病人中，對神經(jīng)元的功能缺失和死亡起關(guān)鍵警示作用的是APP的蛋白水解過程，由此導(dǎo)致了Aβ的產(chǎn)生增加，并在大腦中以神經(jīng)毒性形式聚集。Aβ是一種含有40～43個(gè)氨基酸的蛋白結(jié)構(gòu)，一部分嵌在細(xì)胞膜內(nèi)，另一部分則裸露在細(xì)胞外。Aβ蛋白的前身是淀粉樣前體蛋白(簡稱APP)，共長695～770個(gè)氨基酸，其絕大部分裸露在細(xì)胞外，一小部分嵌在細(xì)胞膜內(nèi)及細(xì)胞質(zhì)中。能夠切除APP的3種酶是α分泌酶、β分泌酶(beta-siteAPP-cleaving enzyme，簡稱BACE)及γ分泌酶。Aβ的形成需要APP在β分泌酶作用下斷裂形成N端的Aβ和在γ分泌酶作用下斷裂形成C端的Aβ。α分泌酶能夠在Aβ內(nèi)部斷裂APP，從而阻礙了Aβ的形成。由α分泌酶及γ分泌酶切除之產(chǎn)物則比Aβ小一點(diǎn)，稱為P3蛋白。Aβ及P3皆會(huì)自細(xì)胞膜上游離出去，其中游離的Aβ又會(huì)自行凝聚成團(tuán)，形成所謂的斑點(diǎn)。
以神經(jīng)退行級聯(lián)的特殊位點(diǎn)為靶點(diǎn)的藥物正在研發(fā)中，由于在AD病理形成過程中，從APP轉(zhuǎn)化成神經(jīng)毒性的Aβ形式是一個(gè)決定性事件，研發(fā)能夠阻斷β分泌酶或γ分泌酶的藥物是一個(gè)熱點(diǎn)。能夠降低Aβ生成的特殊的γ分泌酶抑制劑被開發(fā)出來，但由于它有阻斷γ分泌酶斷裂Notch和其它蛋白底物的副作用，它在人體的應(yīng)用并不可行。BACE缺乏的小鼠能降低Aβ的生成而無明顯異常生理現(xiàn)象，證實(shí)BACE抑制劑能夠減少Aβ生成而無明顯副作用，但是有可能存在除APP外的其他的有重要生理學(xué)意義的BACE的底物，抑制它們的形成可能引起其他嚴(yán)重問題。盡管在抑制β分泌酶和γ分泌酶方面作了許多努力，直接作用于α分泌酶卻被忽視。目前極少有人考慮以α分泌酶作為藥物靶點(diǎn)，α分泌酶在Aβ序列內(nèi)部斷裂，產(chǎn)生一條大的、可溶性的細(xì)胞外片段(簡稱sAPPa)和一條小的細(xì)胞內(nèi)片段(簡稱C83)，這些片段并未表現(xiàn)出病理毒性，并且sAPPa還可能具有神經(jīng)保護(hù)性能。由于α分泌酶和β分泌酶競爭APP，促進(jìn)α分泌酶能夠?qū)е聹p少的病理性片段。理論上，直接或間接的α分泌酶的促進(jìn)劑都有利于AD治療。
3、流行病學(xué)情況隨著發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中國家人均壽命的提高，患癡呆癥的老年人數(shù)迅速增加。在所有的癡呆癥中，以AD所占的比例最高(約50％～60％)。
據(jù)資料報(bào)道，隨著年齡的增長，在人體組織老化和基因的影響下，癡呆現(xiàn)象的發(fā)生率不斷升高；其中，AD隨年老急劇上升，從60歲起，每4年～5年上升一倍；AD的發(fā)病率在65歲左右的老年人中約占10％，在85歲以上的老年人中約占47％，已經(jīng)成為人類的第四號殺手。
過去學(xué)術(shù)界曾認(rèn)為中國是AD低危險(xiǎn)性國家，然而，早前于安徽屯溪召開的第二屆中國老年人癡呆癥和抑郁癥學(xué)術(shù)研討會(huì)暨國際老年癡呆學(xué)術(shù)研討會(huì)上，這一觀點(diǎn)受到挑戰(zhàn)。有5份研究報(bào)告表明，中國也是AD高危國家，這次會(huì)議報(bào)道的大量研究成果還表明，中國對AD的研究正在迅速接近國際先進(jìn)水平。
目前全球的AD病人估計(jì)在1200萬左右，中國現(xiàn)有老年癡呆患者大約為300萬～400萬，且呈迅速上升趨勢，確診后一般約7年～9年內(nèi)死亡。有資料表明，中國60歲以上人口早在1998年已達(dá)1.2億，并以年均3.2％的速度遞增，大大高于人口增長速度。75歲以上的老人有2000萬，80歲以上老人有800萬，并以年均5.4％的速度增加，下世紀(jì)中葉可達(dá)4億左右，將成為世界上老齡人口最多的國家。
1988年中美上海調(diào)查研究表明，中國65歲以上老年人的癡呆發(fā)生率為4.6％，其中AD的比重為63％，多發(fā)梗塞性癡呆為28％，腦組織損傷后遺癥、化學(xué)藥物中毒以及神經(jīng)系統(tǒng)失調(diào)或營養(yǎng)缺乏導(dǎo)致的癡呆約占10％。
上海的流行病學(xué)調(diào)查顯示，中國55歲、65歲以上癡呆的患病率分別為2.57％和4.6％。北京老年病醫(yī)療研究中心對北京地區(qū)2788名60歲以上老人的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，有208名老人患有癡呆癥，患病率達(dá)7.5％。其中女性病人139人，患病率達(dá)9.7％，顯著高于男性的5.8％。他們的研究還表明，高齡、低教育水平、居住在農(nóng)村是老年癡呆癥的高危因素。而解放軍總醫(yī)院對1728名離退休老干部的調(diào)查表明，有癡呆家庭史、“文革”中受迫害、電磁場暴露、腦外傷亦是老年癡呆癥的危險(xiǎn)因素。在廣州城區(qū)75歲以上老年人癡呆患病率的調(diào)查中，AD患病率為7.49％。
4、老年癡呆癥的治療藥物
AD是老年人的常見病之一，是一種漸進(jìn)性的神經(jīng)功能退化性失調(diào)癥，目前本病的病因尚未得到充分闡明，一直是治療上的一個(gè)棘手問題。
抗癡呆藥物的研究和開發(fā)已引起世界各國醫(yī)藥界的高度重視。近年來，隨著對老年人神經(jīng)生理、生化、藥理等方面研究的不斷深入，導(dǎo)致相關(guān)藥物的開發(fā)研究不斷取得進(jìn)展。2001年有1270多種產(chǎn)品投放市場，這些產(chǎn)品中90％是80年代發(fā)現(xiàn)、90年代研究與開發(fā)成功的，此類藥物開發(fā)的新產(chǎn)品數(shù)目超過了任何其它治療類藥物開發(fā)的數(shù)目。
經(jīng)過近10年的臨床表明，乙酰膽堿酯酶(簡稱AChE)抑制劑對AD具有一定的治療作用，其主要藥物他克林、利斯的明、多奈哌齊、加蘭他敏已是這一領(lǐng)域中的代表性品種，從而也推動(dòng)了癡呆治療藥品市場的發(fā)展進(jìn)程。
(1)腦代謝激動(dòng)劑研究發(fā)現(xiàn)，老年癡呆癥患者存在有糖代謝及核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等代謝系統(tǒng)障礙，同時(shí)其腦血流量及耗氧量明顯低于同齡正常人。因此，腦代謝激動(dòng)劑和腦循環(huán)改善劑，特別是具有腦血管擴(kuò)張作用的腦代謝激動(dòng)劑就成為治療本病可供選用的藥物。此類藥物有吡拉西坦、腦復(fù)康、吡硫醇、腦復(fù)新、氫化麥角堿、喜得鎮(zhèn)、都可喜、長春胺、長效長春胺、長春乙酯、尼莫地平、尼莫通、桂利嗪、環(huán)扁桃酯、氯酯醒、己酮可可堿、巡能泰、麥角溴煙酯等。這些藥物對老年癡呆癥的某些癥狀如記憶力減退、適應(yīng)環(huán)境能力降低等，有程度不同的改善作用。
(2)擬膽堿藥現(xiàn)已知腦內(nèi)乙酰膽堿含量與記憶密切相關(guān)，老年或癡呆病人腦內(nèi)乙酰膽堿量減少，補(bǔ)充膽堿類藥物能改善其記憶和思維能力。但直接給予膽堿或卵磷脂并不能使乙酰膽堿增加。有人試以膽堿或卵磷脂與能通過血腦屏障的膽堿酯酶抑制劑毒扁豆堿合用于本病患者，可使其記憶力有提高，而單獨(dú)給予卵磷脂效果不明顯。另有人單用毒扁豆堿給本病患者靜注，記憶測定成績較安慰劑提高約20％，并發(fā)現(xiàn)對行為障礙也有效。研究認(rèn)為，膽堿酯酶抑制劑可延遲乙酰膽堿的代謝分解，從而延長突觸后受體的興奮。另外，國內(nèi)研制的哈伯因(石杉堿甲)，系中國學(xué)者從石杉屬植物千層塔中分離到的一種新生物堿，藥理實(shí)驗(yàn)證明，本品具有很強(qiáng)的擬膽堿活性，是一種高效、可逆的膽堿酯酶抑制劑。
(3)乙酰膽堿酯酶抑制劑(Acetylcholinesterase Inhibitors)乙酰膽堿酯酶抑制劑包括毒扁豆堿(商品名Synapton，F(xiàn)orest實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn))、四氫氨基吖啶(他克林，商品名Cognex，Parke-Davis公司生產(chǎn))、donepezil(商品名Aricept，輝瑞/衛(wèi)材公司生產(chǎn))、metrifonate(拜耳公司生產(chǎn))和rivastigmine(商品名Exelon，諾華公司生產(chǎn))。這些化合物通過抑制乙酰膽堿酯酶在神經(jīng)腱內(nèi)濃縮乙酰膽堿，并能持續(xù)更長的作用時(shí)間。
四氫氨基吖啶是第一個(gè)通過FDA并在臨床上治療阿爾茨海默病的膽堿酯酶抑制劑，但規(guī)定仍需作改進(jìn)。該品生物利用度要低于rivastigmine和donepezil，并有較大的副作用。多奈哌齊(Donopozil)是第二代也是第二個(gè)被美國FDA特許用于治療阿爾默海茨病(老年癡呆)的膽堿酯酶抑制劑，于1997年被FDA批準(zhǔn)用于臨床，可促進(jìn)輕、中度老年癡呆病人的認(rèn)知能力以及改善病人的精神狀態(tài)和保持腦功能活性等作用。與第一代膽堿酯酶抑制劑相比，該品有多項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)(1)作用時(shí)間長，每日只須口服一次；(2)藥效強(qiáng)、療效高；(3)安全性高、選擇性高，藥物不良反應(yīng)小。目前該品已進(jìn)入中國銷售，國內(nèi)也有廠家生產(chǎn)。
Sanochemia Pharmazeutika AG公司(維也納、奧地利)宣布第一個(gè)在歐洲上市的乙酰膽堿酯酶抑制劑-Reminyl(加蘭他敏)。該品被批準(zhǔn)在瑞典上市，并報(bào)送歐盟以期獲準(zhǔn)進(jìn)入歐洲其它市場。
麥的NeuroSearch公司最近利用NS2330進(jìn)行臨床研究開發(fā)。NS2330增加多巴胺和去甲腎上腺素的活性，同時(shí)也激活其抑制機(jī)制以刺激乙酰膽堿在大腦皮層(包括感知部位)的釋放。這樣所有三個(gè)神經(jīng)傳遞素的功能都將受到阿爾茨海默病的影響。該公司希望NS2330能夠具有較好的治療效果，目前該藥的I期臨床工作已經(jīng)完成，F(xiàn)DA也同意該公司繼續(xù)II期臨床工作。
其它用來研究的化合物還包括xanomeline(諾和諾德/禮來公司生產(chǎn))、besperidine(赫司特公司生產(chǎn))和talsaclidine(勃林格殷格翰/法瑪西亞普強(qiáng)公司)。
①他克林他克林的化學(xué)名為四氫氨基吖啶(簡稱THA)，商品名Cognex，該藥是美國華納—蘭伯特公司開發(fā)并第一個(gè)上市的中樞系統(tǒng)的非競爭、可逆性膽堿酯酶抑制劑，1993年獲得FDA批準(zhǔn)后首先在美國上市，是改善AD認(rèn)知癥新藥和老年益智藥物，同年在英國、法國、加拿大等國上市，其化合物專利于1996年到期，目前市場上主要是美國派德—戴維斯的產(chǎn)品。
他克林尤其對女性AD癥具有顯著的療效，與卵磷脂合用可獲得理想的效果，能明顯改善患者的記憶力，因此他克林已被認(rèn)為是治療、預(yù)防早老性癡呆僅有的幾種藥物之一。
他克林的不足之處是對肝功能及轉(zhuǎn)氨酶指數(shù)有較大影響，制約了市場的開發(fā)，其銷售額的增長也遠(yuǎn)不如其它AD藥物。經(jīng)過進(jìn)一步的研究，在他克林母核的基礎(chǔ)上加成篩選，由德國赫斯特魯塞爾公司研制出維那克林。該藥是他克林1位羥基衍生物，其藥物作用機(jī)制得到相應(yīng)的改善，但仍有一些不良反應(yīng)，隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，將被新一代乙酰膽堿酯酶抑制劑所替代。
②多奈哌齊多奈哌齊是具有高度選擇性、可逆性治療AD的藥物，為第二代中樞性乙酰膽堿酯酶抑制劑，是日本衛(wèi)材制藥公司開發(fā)的藥物，1996年11月25日獲得FDA的特許批準(zhǔn)用于臨床，商品名安理申。1997年初首先在美國上市，由衛(wèi)材/輝瑞共同開發(fā)全球市場，1999年10月安理申在中國上市，目前已形成了世界50多個(gè)國家地區(qū)的銷售網(wǎng)絡(luò)。
多奈哌齊是第二個(gè)獲準(zhǔn)治療老年癡呆癥的藥物，其最大優(yōu)勢是治療達(dá)標(biāo)劑量小、毒副作用低，耐受性好。專家普遍認(rèn)為，該藥在AD治療藥物中處于領(lǐng)先地位，在四個(gè)主要品種中占據(jù)了60％的市場份額，預(yù)計(jì)這一優(yōu)勢將延續(xù)到能夠?qū)膊≈委煯a(chǎn)生重要影響的新藥問世為止。
據(jù)Pharma Business雜志報(bào)道在2000年全球最暢銷500種藥品中，日本衛(wèi)材公司銷售額為4.31億美元，輝瑞公司的銷售額為1.19億美元，分別比上一年增長了27.3％和30.8％。2001年多奈哌齊在全球排第101名，銷售額合計(jì)約6.83億美元，2002年在全球超過了1100億日元，已是AD市場中的佼佼者。
2001年中國醫(yī)藥研究開發(fā)中心、重慶桑田藥業(yè)開發(fā)了多奈哌齊原料藥及其片劑產(chǎn)品，國家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)其以四類新藥生產(chǎn)。
③利斯的明利斯的明是氨基酸甲酸類腦選擇性膽堿酯酶抑制劑，屬于該類藥的第二代產(chǎn)品，由瑞士諾華制藥英國公司開發(fā)，商品名艾斯能，1997年12月首先在瑞士上市，次年在英國上市。2000年4月21日獲得FDA批準(zhǔn)，同年6月底在美國上市，從而擴(kuò)展了阿爾茨海默癥治療藥物市場的格局。
研究結(jié)果顯示該藥雖然半衰期相對較短，但對膽堿酯酶抑制作用可達(dá)10小時(shí)，該藥不經(jīng)肝臟及P450代謝，對輕、中度早老性癡呆癥耐受性較好，同時(shí)具有抑制腦內(nèi)的丁酰膽堿酯酶作用，在歐洲、美國等45個(gè)國家進(jìn)行的一項(xiàng)前瞻性、隨機(jī)多中心雙盲研究中獲得較高的評價(jià)。
由于利斯的明在藥物市場中獲得越來越多的份額，2000年的銷售額比上一年增長了83％，為1.195億美元，2001年利斯的明在全球銷售額增加101％，已達(dá)2.4億美元。
④加蘭他敏加蘭他敏屬于第二代乙酰膽堿酯酶抑制劑藥物，其藥物成份與歐洲山區(qū)水仙花鱗莖提取的生物堿相同，該植物藥在一些國家、地區(qū)已經(jīng)有過30多年的臨床應(yīng)用，用于治療逆轉(zhuǎn)神經(jīng)肌肉阻滯、重癥肌無力和幼兒腦型麻痹癥等。
加蘭他敏是希雷與強(qiáng)生公司合作開發(fā)的化學(xué)合成藥物，制劑有片劑、膠囊、口服液等，臨床用于改善AD患者總體功能。該藥具有雙重作用機(jī)制，能較好的刺激和抑制乙酰膽堿酯酶，并且能夠調(diào)節(jié)腦內(nèi)的煙堿受體位點(diǎn)，可顯著改善輕、中度早老性癡呆病人的認(rèn)知功能，延緩腦細(xì)胞功能減退的進(jìn)程。
加蘭他敏于2000年7月被歐盟批準(zhǔn)后在英國、愛爾蘭首次上市，2001年獲美國FDA許可用于治療阿爾茨海默癥，現(xiàn)已在25個(gè)國家上市。希雷公司負(fù)責(zé)在英國、愛爾蘭的銷售，強(qiáng)生公司負(fù)責(zé)美國和其它歐洲國家的銷售。國外報(bào)道2001年加蘭他敏銷售額為1.36億美元。
1998年上海申興制藥廠已生產(chǎn)加蘭他敏原料藥，1999年國家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)蘇州第六制藥廠生產(chǎn)四類新藥氫溴酸加蘭他敏膠囊，2001年上海申興產(chǎn)量同比增長3倍，年產(chǎn)量達(dá)到30kg。該藥進(jìn)入市場后，臨床推廣長足邁進(jìn)，2000年已在中國主要城市重點(diǎn)醫(yī)院抗癡呆藥品中嶄露頭角。
近幾年，乙酰膽堿脂酶抑制劑已成為AD的一線治療藥物，確認(rèn)了其有效緩解認(rèn)知功能障礙的地位，產(chǎn)品銷售量占據(jù)了抗癡呆藥物中的最大份額，研究表明石杉堿甲、毒扁豆堿、美曲磷脂對阿爾茨海默癥也有一定的治療作用，中科院上海藥物所開發(fā)的石杉堿甲化合物已申請了國際專利，其作用機(jī)制正在進(jìn)行深入的研究，北京四環(huán)制藥、寧波立華制藥、上海漢殷藥業(yè)和上海醫(yī)科大學(xué)紅旗藥廠獲得了新藥證書和生產(chǎn)文號。
(4)鉀通道阻滯劑研究表明，非選擇性的鉀通道阻滯劑通過延遲去極化和延長突觸前神經(jīng)末梢的鈣流入引起神經(jīng)遞質(zhì)(包括Ach)釋放增加。若要想這類藥物用于治療老年癡呆，則所用藥物應(yīng)具備能增加乙酰膽堿的釋放而不減少膜磷脂酰膽堿組成的優(yōu)點(diǎn)，而減少膜磷脂酰膽堿的組成可能是AchE抑制劑存在的副作用。磷脂酰膽堿是膽堿的貯存庫，被神經(jīng)元用來合成Ach。膜磷脂酰膽堿的損失使乙酰膽堿的合成受到限制，導(dǎo)致膽堿輸出量減少。臨床研究已表明非選擇性鉀通道阻滯劑對改善患者的識別能力僅有中度作用，其作用不強(qiáng)可能是這些藥物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)穿透力低，選擇性差或活性不夠等，有待于進(jìn)一步研究加以完善。
(5)谷氨酸受體調(diào)控劑在老年疾呆癥患者的大腦中，皮質(zhì)皮層和離皮層途徑的錐體細(xì)胞發(fā)生了神經(jīng)纖維混亂和退化。據(jù)報(bào)道，這些錐體細(xì)胞以谷氨酸為興奮遞質(zhì)。這些神經(jīng)元受損，功能喪失時(shí)會(huì)導(dǎo)致老年癡呆癥；但若功能過強(qiáng)，則會(huì)產(chǎn)生興奮性毒性，引起神經(jīng)元死亡，造成多種神經(jīng)退化性疾病。因此，調(diào)控退化的谷氨酸神經(jīng)元的突觸活性有望治療老年癡呆癥。研究表明，直接活化突觸后受體將有利于谷氨酸的傳遞，其部分激動(dòng)劑具有這樣的優(yōu)點(diǎn)，即當(dāng)內(nèi)源性谷氨酸低于正常水平時(shí)起激動(dòng)劑作用，而當(dāng)谷氨酸釋放過量時(shí)起拮抗劑作用，因此，部分激動(dòng)劑會(huì)對興奮毒性情況產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用。已有報(bào)道的藥物如美金剛胺(memantine)，當(dāng)谷氨酸以病理量釋放時(shí)，美金剛胺會(huì)減少谷氨酸的神經(jīng)毒性作用；當(dāng)谷氨酸釋放過少時(shí)，美金剛胺可以改善記憶過程所需谷氨酸的傳遞，臨床研究表明，美金剛胺用于老年癡呆癥患者具有較好的耐受性，在精神病理學(xué)和行為測定中產(chǎn)生溫和的有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的顯著改善。
(6)5-羥色胺3受體拮抗劑5-羥色胺3(簡稱5-HT3)受體拮抗劑原用于止吐，現(xiàn)有研究根據(jù)5-HT3受體在大腦中的分布狀態(tài)，推測此類拮抗劑應(yīng)有其它中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用。如5-HT3拮抗劑昂丹司瓊樞復(fù)寧 能改善膽堿能神經(jīng)功能正常和不足的動(dòng)物如鼠、狨等的識別能力；在50歲以上與老年有關(guān)的記憶力受損(AAMI)病人的臨床試驗(yàn)中，昂丹司瓊能使相當(dāng)于喪失6年的記憶力得到改善。因此，昂丹司瓊及其他5-HT3受體拮抗劑(托烷司瓊、格拉司瓊等有可能給老年癡呆患者帶來福音。
(7)天然藥物方面的研究現(xiàn)今很多醫(yī)藥公司還把目光移向天然藥物，試圖從中開發(fā)出有效的治療藥物。在這方面同樣也取得了一定的進(jìn)展。
①阿樸脂蛋白E4(ApoE4)眾所周知，阿爾茨海默病的發(fā)病情況與遺傳基因有著較為緊密的聯(lián)系，阿樸脂蛋白E4ApoE4是特別值得讓大家去注意并朝著治療和預(yù)防阿爾茨海默病的方向進(jìn)行研究。在藥物開發(fā)中，ApoE4已經(jīng)進(jìn)行過人體藥物臨床試驗(yàn)，并極有可能成為療效比較確切的藥品。
②β-淀粉素(體)(Beta-amyloid)β-淀粉素是一種不能溶解的多肽。該種物質(zhì)能夠有效防止激烈氧化過程中導(dǎo)致的二乙基溴乙酰胺的破壞。在從事阿爾茨海默病研究理論中就是利用β-淀粉素限制自由基的產(chǎn)生以及清除自由基，以防止自由基所帶來的損害。這種類型的化合物包括idebenone(武田公司、Osaka日本)，該化合物既是一種自由基的清道夫也是某種神經(jīng)增長因子的刺激物。早期研究表明，idebenone能有效治療中度癡呆癥。盡管葛蘭素威康公司(英國)和美國家用產(chǎn)品公司已經(jīng)在少數(shù)一些國家上市，但它已經(jīng)從日本退出市場，而且其III期臨床試驗(yàn)已經(jīng)被停止。
(8)其它類型藥物的研究進(jìn)展2000年上半年，一些研究表明，雌激素替代療法可以較明顯地延緩婦女阿爾茨海默病的發(fā)作，并能降低阿爾茨海默病的病情嚴(yán)重化。個(gè)別臨床研究也發(fā)現(xiàn)雌激素治療能夠提高感知度。雌激素對抗氧劑和抗炎藥的作用能力可以減少發(fā)病的機(jī)率，推動(dòng)乙酰膽堿的產(chǎn)生、促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的生長和存活。
2000年年中，日本的Toyama Chemical公司期望開始在英國進(jìn)行T-588的II期臨床研究，并能在美國進(jìn)行較早的試驗(yàn)。在紐約大學(xué)的合作下，公司發(fā)現(xiàn)T-588可以保護(hù)大腦神經(jīng)細(xì)胞。
日本藤澤制藥公司的FK-960在日本和美國進(jìn)行。該藥能夠提高感知度，具有新的作用機(jī)制。在最近有關(guān)研究報(bào)道是表明，咀嚼可以防止上年紀(jì)的人記憶力衰退，但其作用機(jī)制現(xiàn)在仍然沒有明確。研究人員通過研究小鼠的遺傳改變來研究人體老化的跡象。實(shí)驗(yàn)表明，拔除牙齒以防止咀嚼的小鼠的記憶力要遜于正常對照小組。此外，研究人員還研究了咀嚼時(shí)大腦的活動(dòng)情況，并發(fā)現(xiàn)下巴的活動(dòng)可以增強(qiáng)腦部海馬區(qū)的信號。
來自肯塔基州立大學(xué)的研究人員發(fā)現(xiàn)減少食用量可以保護(hù)大腦避免因年齡引起紊亂，這種紊亂類似于阿爾茨海默病。最近出版的研究論文表明，通過喂養(yǎng)減少食物量的小鼠，研究人員發(fā)現(xiàn)它們大腦的損傷能減少。對熱量攝入量和人體神經(jīng)變性疾病的研究還沒有開始，但有一些相關(guān)性研究顯示，相比于美國和加拿大，中國和日本由于攝入較少的熱量，因此相應(yīng)的阿爾茨海默病的發(fā)病率也減少。
加拿大的神經(jīng)生物技術(shù)公司在2000年上半年宣布了一個(gè)較為確切的產(chǎn)品memantine。該產(chǎn)品是一種非競爭性N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)阻斷劑，在美國進(jìn)行了III期臨床試驗(yàn)，主要用于治療阿爾茨海默病。
5、老年癡呆癥的市場發(fā)展前景2000年世界七大藥品市場表明，AD藥品市場已從90年代中期的4億多美元增長了近一倍，2001年全球AD市場價(jià)值已近12億美元；國外分析家預(yù)測在未來十年內(nèi)AD患者將會(huì)增加到20％左右，AD藥品市場的增長速度將有較大幅度的上升。
由于患者的不斷增多，AD治療藥物的市場銷售額也一直在穩(wěn)步增長。90年代該類藥物已成為暢銷藥物，1995年世界銷售額已達(dá)50億美元。21世紀(jì)初，該類藥物的銷售額超過了排列在前三位的治療心血管病藥物、治療胃腸道病藥物和抗感染藥物市場的份額，其發(fā)展勢頭看好。
目前，該類疾病已越來越受到中國國家和社會(huì)的高度重視，而且由于該類疾病類似于糖尿病等富貴病，一樣需要長期服用治療藥物，因此其用藥市場隨著人口老齡化而逐漸擴(kuò)大，市場前景看好?；诖?，為及時(shí)了解中國治療AD藥物的市場狀況，中國國家食品藥品監(jiān)督管理局南方醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)研究所信息中心選取中國六個(gè)主要用藥城市(北京、上海、廣州、南京、杭州、成都)的百家抽樣醫(yī)院、60名醫(yī)生專家和120名消費(fèi)者，對中國國內(nèi)老年癡呆癥用藥市場(1999年及2000年)及其主要競爭品種進(jìn)行了全面的市場調(diào)研活動(dòng)。
(1)1999年～2000年中國治療老年癡呆藥物醫(yī)院用藥金額情況分析從1999年～2000年六城市(北京、上海、廣州、南京、杭州、成都)抽樣醫(yī)院治療老年癡呆癥用藥金額構(gòu)成情況來看，2000年六城市抽樣醫(yī)院銷售總金額較1999年同比增長28.49％。而在治療老年癡呆藥主要品種中，使用金額百分比較大的品種排名依次為吡拉西坦、銀杏葉制劑、氫化麥角堿、阿米三嗪/蘿巴新、阿尼西坦、尼麥角林、胞磷膽堿、石杉堿甲、多奈哌齊、吡硫醇、長春西汀、加蘭他敏、氯酯醒、艾地苯醌。其中前四位品種市場份額(金額百分比)較大。
具體品種中，吡拉西坦的市場份額(金額百分比)2000年較1999年上升了8個(gè)百分點(diǎn)，仍居首位，金額增長率達(dá)55.59％。銀杏葉制劑、氫化麥角堿保持較穩(wěn)定的市場份額，使用金額都保持一定的增長。使用金額增長較快的品種有石杉堿甲、加蘭他敏，其中加蘭他敏增長幅度最高。阿米三嗪/蘿巴新、阿尼西坦、尼麥角林、胞磷膽堿、長春西汀和吡硫醇總體市場出現(xiàn)萎縮，而艾地苯醌基本退出市場競爭。多奈哌齊由于是較新的品種，在1999年未見銷售，但在2000年市場份額(使用金額百分比)占0.45％，顯示出一定的市場潛力。
(2)1999年～2000年中國治療老年癡呆藥物醫(yī)院用藥金額走勢分析從1999年～2000年六城市老年癡呆用藥金額走勢情況來看，2000年整體用藥水平要明顯高于1999年整體用藥水平，出現(xiàn)上升趨勢。其中1999年用藥金額高峰期和2000年用藥金額高峰期均出現(xiàn)在二季度(2000年用藥量高峰期是第三季度)，表明在2000年二季度高價(jià)品種的使用量相對要高。從六城市用藥情況中可以反映出中國城市的一個(gè)用藥趨勢。
(3)主要用藥城市醫(yī)院用藥情況分析從各品種在各城市的用藥金額排序情況來看，其銷售情況表現(xiàn)得較好的品種主要有銀杏葉制劑、吡拉西坦、氫化麥角堿和阿米三嗪/蘿巴新。其中銀杏葉制劑2000年在上海、廣州、杭州和成都地區(qū)排在第一位，在北京地區(qū)排名第二，南京地區(qū)排名第三，表現(xiàn)得相當(dāng)好，較1999年有所增長，其幾個(gè)主打品牌達(dá)納康、銀杏天保、活血寧膠囊、百路達(dá)膠囊、天保寧、銀可絡(luò)的市場反應(yīng)有口皆碑；其次表現(xiàn)較好的則為吡拉西坦，該品2000年在北京和南京地區(qū)占據(jù)第一的位置，在其它幾個(gè)城市也是前三名之列，只有在杭州地區(qū)較弱(排名第5)；氫化麥角堿總體情況排在第三位，不過2000年排名較1999年排名有所提高。氫化麥角堿在各城市的排名基本保持不變，并在個(gè)別城市如上海和成都地區(qū)排名上升，而在南京地區(qū)排名下降一個(gè)位置。
(4)其它方面的市場評價(jià)隨著治療AD藥物臨床推廣的普及，AD已越來越受到社會(huì)和家庭的重視，從調(diào)查的醫(yī)生信息反饋來看，68％的醫(yī)生認(rèn)為社會(huì)大眾已經(jīng)開始關(guān)心和重視AD，與此同時(shí)，8.16％的醫(yī)生認(rèn)為市場供給嚴(yán)重不足，63.2％的醫(yī)生認(rèn)為市場供給不足。可見，AD用藥市場供給不足，市場仍有空間，有近八成醫(yī)生認(rèn)可市場前景較好。
同樣，隨著近年來OTC市場的蓬勃發(fā)展，有相當(dāng)部份品種(口服劑型)也在零售藥店中進(jìn)行銷售，由于長期服藥的特點(diǎn)，越來越多的患者選擇直接從藥店進(jìn)行購藥治療。從中國國家藥品監(jiān)督管理局南方醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)研究所零售研究部對這類藥品的監(jiān)測結(jié)果顯示，銀杏葉制劑的市場份額(銷售金額百分比)約占市場的4成左右，中成藥較受零售市場的青睞，都可喜(阿米三嗪/蘿巴新)的市場份額約占3成左右，其余品種則占據(jù)余下的市場份額。從所調(diào)查的消費(fèi)者情況反映，有67.80％的消費(fèi)者是從醫(yī)院藥房獲得所需藥品的；而有27.97％的消費(fèi)者直接到藥店購買；4.24％的病患者從所在單位門診部獲得；還有0.85％的病患者到批發(fā)商處購買。這表明，目前來說，醫(yī)院雖然是老年人用藥的主要銷售渠道，但也可以看出，零售渠道也占有不可忽視的比例。
AD的治療占世界藥品市場的第七位，到2005年底價(jià)值61億美元。而目前抗AD藥物主要是緩解癥狀，并不遏制病情的發(fā)展。因此，研究出一種有效的治療方法來阻止?jié)撛诘陌l(fā)病過程是很必要的，所以本發(fā)明認(rèn)為研制用于預(yù)防、診斷、檢測、保護(hù)和治療AD等方面的產(chǎn)品特別是藥物能夠具有顯著的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。阿爾茨海默癥(Alzheimer’sDisease，或稱阿爾茲海默癥，簡稱AD)，是一種慢性腦變性疾病，是發(fā)生在老年期或老年前期的一種進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病，屬于非正常衰老狀態(tài)的早老性癡呆病癥。
AD以記憶減退、認(rèn)知障礙，行為異常和語言能力喪失為特征，主要表現(xiàn)為大腦皮層獲得性高級功能的全面障礙和認(rèn)知功能明顯受損，腦功能退化衰亡，即記憶功能迅速衰退及認(rèn)知能力障礙，并伴有行為或人格方面的改變。
該病病程一般較長，約為3～20年。對AD患者常年的護(hù)理費(fèi)用是巨大的，不僅對整個(gè)社會(huì)的醫(yī)療保障系統(tǒng)有極大影響，對中國未來社會(huì)的小家庭模式也是極大的挑戰(zhàn)。因此，其發(fā)生給社會(huì)、家庭均帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和精神負(fù)擔(dān)，也給患者自身帶來極大的痛苦。目前，該疾病仍是全球較為棘手的病癥之一，積極研究開發(fā)新的治療方法是一件刻不容緩的事情。
2、流行病學(xué)情況隨著發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中國家人均壽命的提高，患YY疾病的老年人數(shù)迅速增加。在所有的YY疾病中，以AD所占的比例最高(約50％～60％)。
據(jù)資料報(bào)道，隨著年齡的增長，在人體組織老化和基因的影響下，癡呆現(xiàn)象的發(fā)生率不斷升高；其中，AD隨年老急劇上升，從60歲起，每4年～5年上升一倍；AD的發(fā)病率在65歲左右的老年人中約占10％，在85歲以上的老年人中約占47％，已經(jīng)成為人類的第四號殺手。
3、AD的治療藥物AD是老年人的常見病之一，是一種漸進(jìn)性的神經(jīng)功能退化性失調(diào)癥，目前本病的病因尚未得到充分闡明，一直是治療上的一個(gè)棘手問題。
經(jīng)過近10年的臨床表明，乙酰膽堿酯酶(簡稱AChE)抑制劑對AD具有一定的治療作用，其主要藥物他克林、利斯的明、多奈哌齊、加蘭他敏已是這一領(lǐng)域中的代表性品種，從而也推動(dòng)了癡呆治療藥品市場的發(fā)展進(jìn)程。主要有以下幾類(1)腦代謝激動(dòng)劑(2)擬膽堿藥
(3)乙酰膽堿酯酶抑制劑(4)鉀通道阻滯劑(5)谷氨酸受體調(diào)控劑(6)5-羥色胺3受體拮抗劑(7)天然藥物方面的研究阿樸脂蛋白E4(ApoE4)、β-淀粉素(體)(Beta-amyloid)(8)其它類型藥物的研究進(jìn)展2000年上半年，一些研究表明，雌激素替代療法可以較明顯地延緩婦女阿爾茨海默病的發(fā)作，并能降低阿爾茨海默病的病情嚴(yán)重化。個(gè)別臨床研究也發(fā)現(xiàn)雌激素治療能夠提高感知度。雌激素對抗氧劑和抗炎藥的作用能力可以減少發(fā)病的機(jī)率，推動(dòng)乙酰膽堿的產(chǎn)生、促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的生長和存活。
4、AD的市場發(fā)展前景2000年世界七大藥品市場表明，AD藥品市場已從90年代中期的4億多美元增長了近一倍，2001年全球AD市場價(jià)值已近12億美元；國外分析家預(yù)測在未來十年內(nèi)AD患者將會(huì)增加到20％左右，AD藥品市場的增長速度將有較大幅度的上升。
由于患者的不斷增多，AD治療藥物的市場銷售額也一直在穩(wěn)步增長。90年代該類藥物已成為暢銷藥物，1995年世界銷售額已達(dá)50億美元。21世紀(jì)初，該類藥物的銷售額超過了排列在前三位的治療心血管病藥物、治療胃腸道病藥物和抗感染藥物市場的份額，其發(fā)展勢頭看好。
目前，該類疾病已越來越受到中國國家和社會(huì)的高度重視，而且由于該類疾病類似于糖尿病等富貴病，一樣需要長期服用治療藥物，因此其用藥市場隨著人口老齡化而逐漸擴(kuò)大，市場前景看好?；诖耍瑸榧皶r(shí)了解中國治療AD藥物的市場狀況，中國國家食品藥品監(jiān)督管理局南方醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)研究所信息中心選取中國六個(gè)主要用藥城市(北京、上海、廣州、南京、杭州、成都)的百家抽樣醫(yī)院、60名醫(yī)生專家和120名消費(fèi)者，對中國國內(nèi)YY疾病用藥市場(1999年及2000年)及其主要競爭品種進(jìn)行了全面的市場調(diào)研活動(dòng)。
(1)1999年～2000年中國治療老年癡呆藥物醫(yī)院用藥金額情況分析從1999年～2000年六城市(北京、上海、廣州、南京、杭州、成都)抽樣醫(yī)院治療老年癡呆癥用藥金額構(gòu)成情況來看。2000年六城市抽樣醫(yī)院銷售總金額較1999年增長28.49％。
(2)1999年～2000年中國治療老年癡呆藥物醫(yī)院用藥金額走勢分析從1999年～2000年六城市老年癡呆用藥金額走勢情況來看，2000年整體用藥水平要明顯高于1999年整體用藥水平，出現(xiàn)上升趨勢。其中1999年用藥金額高峰期和2000年用藥金額高峰期均出現(xiàn)在二季度(2000年用藥量高峰期是第三季度)，表明在2000年二季度高價(jià)品種的使用量相對要高。從六城市用藥情況中可以反映出中國城市的一個(gè)用藥趨勢。
(3)其它方面的市場評價(jià)隨著治療AD藥物臨床推廣的普及，AD已越來越受到社會(huì)和家庭的重視，從調(diào)查的醫(yī)生信息反饋來看，68％的醫(yī)生認(rèn)為社會(huì)大眾已經(jīng)開始關(guān)心和重視AD，與此同時(shí)，8.16％的醫(yī)生認(rèn)為市場供給嚴(yán)重不足，63.2％的醫(yī)生認(rèn)為市場供給不足?？梢姡珹D用藥市場供給不足，市場仍有空間，有近八成醫(yī)生認(rèn)可市場前景較好。
經(jīng)文獻(xiàn)檢索等，到目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)有中藥美洲一枝黃花的活性部位總黃酮用于預(yù)防、診斷、檢測、保護(hù)、治療和研究抗氧化及其相關(guān)疾病方面的報(bào)道。
(三)咽喉炎的研究概況咽喉是人體重要器官之一，是吞咽食物、呼吸空氣、發(fā)音的器官?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，患有不同程度的咽喉炎病人占人群中的40％。慢性咽喉炎如久治不愈易成鏈球菌、鏈霉菌、葡萄球菌、肺炎雙球菌等細(xì)菌及病毒流注關(guān)節(jié)及臟腑，出現(xiàn)心臟病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、肺結(jié)核、咽喉腫瘤、食道腫瘤等難治之癥。咽喉炎發(fā)病的典型表現(xiàn)是咽喉分泌物增多，咽部潰瘍、咽后壁有明顯淋巴濾泡增生。咽中有異物感、吞之不下、吐之不出，午后或勞累后加重、嚴(yán)重時(shí)聲音嘶啞，呼吸有時(shí)咽喉有灼熱感、胸部脹悶、頭暈、頭痛、失眠多夢、四肢無力、腰酸軟等癥。目前西藥治療只能臨時(shí)控制病情，服用太多消炎藥，抗生素或磺胺類藥會(huì)導(dǎo)致人體陰陽失去平衡、免疫功能低下，抵抗力減退，致使病情反復(fù)難愈。
本發(fā)明是在研究美洲一枝黃花藥理活性的基礎(chǔ)上，選擇以美洲一枝黃花的乙醇提取物作為原料，通過合理的配方，開發(fā)出具有治療咽喉炎的美洲一枝黃花藥物制劑。不僅可以有效的控制美洲一枝黃花帶來的生物破壞性，同時(shí)還可以明顯改善患有咽喉炎的健康狀況，提高人們的生活質(zhì)量。
(四)食管癌的研究概況管癌(carcinoma of esophagus)是食管鱗狀上皮的惡性腫瘤，進(jìn)行性咽下困難為其最典型的臨床癥狀。本病是人類常見的惡性腫瘤之一。中國是食管癌的高發(fā)國家，也是本病死亡率最高的國家。全世界每年食管癌新發(fā)病例約31.04萬，而中國占16.72萬。
食道癌的放療不同于其它部位的腫瘤治療，由于腫瘤始終與食管于一體，在規(guī)劃靶區(qū)時(shí)，管腔和病變一起被劃入，如果和照射其它部位的腫瘤一樣，一次大劑量照射勢必會(huì)引起食管粘膜的損傷，甚至穿孔，有發(fā)現(xiàn)在肺部腫瘤的定向放射時(shí)，食管接受24～30Gy量，即可出現(xiàn)放射性損傷，后期表現(xiàn)食管局部性狹窄。又由于食道癌患者就癥時(shí)絕大多數(shù)已屬晚期，不僅局部病變已廣泛浸潤，而且已有亞臨床病灶的遠(yuǎn)處播散或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，尸檢發(fā)現(xiàn)，許多臨床認(rèn)為局部早期的病例死亡時(shí)，已有半數(shù)以上伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，70％以上有廣泛的淋巴結(jié)受侵，真正能根治性切除的病例不足1/3，常規(guī)放療5年生存率僅為13％，局部復(fù)發(fā)也是食道癌手術(shù)和放療失敗的主要原因，占80％以上，由此可以看出，食道癌的治療僅靠手術(shù)和放療是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。
1、發(fā)病率歐、美和大洋洲諸國的食管癌發(fā)病率一般在20/10萬，前蘇聯(lián)的中亞地區(qū)高達(dá)100/10萬以上；中國北方各省的發(fā)病率和死亡率均高于南方，河南省林縣35？4歲男性食管癌發(fā)病率高達(dá)478.87/10萬，是世界高發(fā)地區(qū)之一。
2、死亡率目前中國是世界上食管癌死亡率最高的國家之一，年平均死亡率為14.59/10萬。據(jù)1990年的統(tǒng)計(jì)資料，部分城市惡性腫瘤死亡率位次為肺癌、胃癌、肝癌、食管癌，其死亡率分別為32.89/10萬、21.51/10萬、20.1/10萬和9.70/10萬。
3、性別和年齡男女發(fā)病比例為1.37∶1。發(fā)病年齡以高齡組為主，35歲以前的構(gòu)成比例很小，35歲以后隨年齡增長而構(gòu)成比增高，以60～64歲組最高(17.95％)，其次為65～69歲組，70歲以后逐漸降低。
食管癌的發(fā)病主要與以下5點(diǎn)有關(guān)(1)亞硝胺類亞硝胺類化合物是一種很強(qiáng)的致癌物質(zhì)，研究表明食管癌高發(fā)區(qū)林縣食用酸菜的居民，胃液、尿液中存在有誘發(fā)食管癌的甲基芐基亞硝胺、亞硝基吡咯烷、亞硝基胍啶。并發(fā)現(xiàn)食用酸菜量和食管癌發(fā)病率成正比。(2)食管粘膜的損傷長期喜進(jìn)燙食、粗食，飲濃茶，多食辣椒等刺激性食物可引起食管粘膜損傷、引起食管粘膜增生間變，也可能是致癌因素之一。吸煙、飲烈性酒與食管癌發(fā)病有一定關(guān)系。各種長期不愈的食管炎可能是食管癌的癌前病變。(3)霉菌致癌因素用霉變食品可以誘發(fā)小鼠食管和胃的癌前病變或鱗狀上皮癌。這類霉菌與亞硝胺促癌有協(xié)同作用。(4)微量元素食道癌高發(fā)區(qū)人群中血清鉬、發(fā)鉬、尿鉬及食管癌組織中的鉬都低于正常。林縣食管癌高發(fā)區(qū)水土中缺少鉬，鉬的抑癌作用被多數(shù)學(xué)者證實(shí)。(5)遺傳因素食管癌具有顯著的家族聚集現(xiàn)象，高發(fā)區(qū)連續(xù)三代或三代以上患病家族屢見。
從食道癌的長期病例普查來看，食道癌細(xì)胞的發(fā)展過程是從輕度增生開始逐步發(fā)展到重度增生，原位癌和浸潤癌，從食管粘膜輕度增生到原位癌發(fā)展較慢，有認(rèn)為這一演變過程大約5到10年時(shí)間，一旦形成浸潤癌，其發(fā)展速度相當(dāng)快，當(dāng)病人有明顯吞咽梗阻癥狀，此間的治愈率很低。食道癌的治療目前仍以手術(shù)和放療為主，由于化療對人體的毒副反應(yīng)較大，僅作為一種輔助手段。而在目前的手術(shù)治療容易在短期內(nèi)重新復(fù)發(fā)并擴(kuò)散，且有很多患者由此拒絕接受手術(shù)治療。在放療中，一旦患者有惡液質(zhì)。穿孔、CT證實(shí)有嚴(yán)重的氣管或大血管受侵或嚴(yán)重的胸背部疼痛，白細(xì)胞升高等都不宜再放療，相對禁忌。
化學(xué)藥物治療常用藥有順鉑、平陽霉素等，雖然其有效率在50％左右，但其遠(yuǎn)期療效并不理想。
由于在化療過程中，伴有極大的副反應(yīng)及并發(fā)癥，即使通過放療結(jié)合化學(xué)治療，其5年生存率也僅13％左右。生存5年以上者，對于后期的生活質(zhì)量也大受影響，不能從根本上有效地來治療食道癌，更不能做到防患于未然。
(五)常用中草藥有效成分的提取分離方法1、溶劑提取法(1)原理溶劑提取法是根據(jù)中草藥中各種成分在溶劑中的溶解性質(zhì)，選用對活性成分溶解度大，對不需要溶出成分溶解度小的溶劑，而將有效成分從藥材組織內(nèi)溶解出來的方法。當(dāng)溶劑加到中草藥原料(需適當(dāng)粉碎)中時(shí)，溶劑由于擴(kuò)散、滲透作用逐漸通過細(xì)胞壁透入到細(xì)胞內(nèi)，溶解了可溶性物質(zhì)，而造成細(xì)胞內(nèi)外的濃度差，于是細(xì)胞內(nèi)的濃溶液不斷向外擴(kuò)散，溶劑又不斷進(jìn)入藥材組織細(xì)胞中，如此多次往返，直至細(xì)胞內(nèi)外溶液濃度達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡時(shí)，將此飽和溶液濾出，繼續(xù)多次加入新溶劑，就可以把所需要的成分近于完全溶出或大部溶出。中草藥成分在溶劑中的溶解度直接與溶劑性質(zhì)有關(guān)。溶劑可分為親水性有機(jī)溶劑及親脂性有機(jī)溶劑，被溶解物質(zhì)也有親水性及親脂性的不同。有機(jī)化合物分子結(jié)構(gòu)中親水性基團(tuán)多，其極性大而疏于油；有的親水性基團(tuán)少，其極性小而疏于水。各類溶劑的性質(zhì)，同樣也與其分子結(jié)構(gòu)有關(guān)。這樣，發(fā)明人就可以通過對中草藥成分結(jié)構(gòu)分析，去估計(jì)它們的此類性質(zhì)和選用的溶劑?？偟恼f來，只要中草藥成分的親水性和親脂性與溶劑的此項(xiàng)性質(zhì)相當(dāng)，就會(huì)在其中有較大的溶解度，即所謂“相似相溶”的規(guī)律。這是選擇適當(dāng)溶劑自中草藥中提取所需要成分的依據(jù)之一。
(2)溶劑的選擇運(yùn)用溶劑提取法的關(guān)鍵，是選擇適當(dāng)?shù)娜軇Ｈ軇┻x擇適當(dāng)，就可以比較順利地將需要的成分提取出來。選擇溶劑要注意以下三點(diǎn)①溶劑對有效成分溶解度大，對雜質(zhì)溶解度??；②溶劑不能與中藥的成分起化學(xué)變化；③溶劑要經(jīng)濟(jì)、易得、使用安全等。常見的提取溶劑可分為以下三類①水水是一種強(qiáng)的極性溶劑。中草藥中親水性的成分，如無機(jī)鹽、糖類、分子不太大的多糖類、鞣質(zhì)、氨基酸、蛋白質(zhì)、有機(jī)酸鹽、生物堿鹽及苷類等都能被水溶出。為了增加某些成分的溶解度，也常采用酸水及堿水作為提取溶劑。
②親水性的有機(jī)溶劑也就是一般所說的與水能混溶的有機(jī)溶劑，如乙醇(又稱酒精)、甲醇(又稱木精)、丙酮等，以乙醇最常用。乙醇的溶解性能比較好，對中草藥細(xì)胞的穿透能力較強(qiáng)。親水性的成分除蛋白質(zhì)、粘液質(zhì)、果膠、淀粉和部分多糖等外，大多能在乙醇中溶解。難溶于水的親脂性成分，在乙醇中的溶解度也較大。還可以根據(jù)被提取物質(zhì)的性質(zhì)，采用不同濃度的乙醇進(jìn)行提取。用乙醇提取比用水量較少，提取時(shí)間短，溶解出的水溶性雜質(zhì)也少。乙醇為有機(jī)溶劑，雖易燃，但毒性小，價(jià)格便宜，來源方便，有一定設(shè)備即可回收反復(fù)使用，而且乙醇的提取液不易發(fā)霉變質(zhì)。由于這些原因，用乙醇提取的方法是歷來最常用的方法之一。甲醇的性質(zhì)和乙醇相似，沸點(diǎn)較低(64℃)，但有毒性，使用時(shí)應(yīng)注意。
③親脂性的有機(jī)溶劑也就是一般所說的與水不能混溶的有機(jī)溶劑，如石油醚、苯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、二氯乙烷等。這些溶劑的選擇性能強(qiáng)，不能或不容易提出親水性雜質(zhì)。但這類溶劑揮發(fā)性大，多易燃(氯仿除外)，一般有毒，價(jià)格較貴，設(shè)備要求較高，且它們透入植物組織的能力較弱，往往需要長時(shí)間反復(fù)提取才能提取完全。如果藥材中含有較多的水分，用這類溶劑就很難浸出其有效成分，因此，大量提取中草藥原料時(shí)，直接應(yīng)用這類溶劑有一定的局限性。
(3)提取方法用溶劑提取中草藥成分，常用浸漬法、滲漉法、煎煮法、回流提取法及連續(xù)回流提取法等。同時(shí)，原料的粉碎度、提取時(shí)間、提取溫度、設(shè)備條件等因素也都能影響提取效率，必須加以考慮。
①浸漬提取法(簡稱浸漬法)浸漬法系將中草藥粉末或碎塊裝入適當(dāng)?shù)娜萜髦?，加入適宜的溶劑(如乙醇、稀醇或水)，浸漬藥材以溶出其中成分的方法。本法比較簡單易行，但浸出率較差，且如用水為溶劑，其提取液易發(fā)霉變質(zhì)，須注意加入適當(dāng)?shù)姆栏瘎?br> ②滲漉提取法(簡稱滲漉法)滲漉法是將中草藥粉末裝在滲漉器中，不斷添加新溶劑，使其滲透過藥材，自上而下從滲漉器下部流出浸出液的一種浸出方法。當(dāng)溶劑滲進(jìn)藥粉、溶出成分比重加大而向下移動(dòng)時(shí)，上層的溶液或稀浸液便置換其位置，造成良好的濃度差，使擴(kuò)散能較好地進(jìn)行，故浸出效果優(yōu)于浸漬法。但應(yīng)控制流速，在滲渡過程中隨時(shí)自藥面上補(bǔ)充新溶劑，使藥材中有效成分充分浸出為止。或當(dāng)滲滴液顏色極淺或滲涌液的體積相當(dāng)于原藥材重的10倍時(shí)，便可認(rèn)為基本上已提取完全。在大量生產(chǎn)中常將收集的稀浸出液作為另一批新原料的溶劑之用。
③煎煮提取法(簡稱煎煮法)煎煮法是中國最早使用的傳統(tǒng)的浸出方法。所用容器一般為陶器、砂罐或銅制、搪瓷器皿，不宜用鐵鍋，以免藥液變色。直火加熱時(shí)最好時(shí)常攪拌，以免局部藥材受熱太高，容易焦糊。有蒸汽加熱設(shè)備的藥廠，多采用大反應(yīng)鍋、大銅鍋、大木桶，或水泥砌的池子中通入蒸汽加熱。還可將數(shù)個(gè)煎煮器通過管道互相連接，進(jìn)行連續(xù)煎浸。
④加熱回流提取法應(yīng)用有機(jī)溶劑加熱提取，需采用回流加熱裝置，以免溶劑揮發(fā)損失。小量操作時(shí)，可在圓底燒瓶上連接回流冷凝器。瓶內(nèi)裝藥材約為容量的20％～60％，溶劑浸過藥材表面約1～2cm。在水浴中加熱回流，一般保持沸騰3～6小時(shí)，放冷過濾，再在藥渣中加溶劑，作第二、三次加熱回流分別約半小時(shí)，或至基本提盡有效成分為止。此法提取效率較冷浸法高，大量生產(chǎn)中多采用連續(xù)提取法。
⑤連續(xù)回流提取法應(yīng)用揮發(fā)性有機(jī)溶劑提取中草藥有效成分，不論小型實(shí)驗(yàn)或大型生產(chǎn)，均以連續(xù)提取法為好，而且需用溶劑量較少，提取成分也較完全。實(shí)驗(yàn)室常用脂肪提取器或稱索氏提取器。連續(xù)提取法，一般需數(shù)小時(shí)才能提取完全。提取成分受熱時(shí)間較長，遇熱不穩(wěn)定易變化的成分不宜采用此法。
2、分離和純化方法上述提取法所得到的中草藥提取液或提取物仍然是混合物，需進(jìn)一步除去雜質(zhì)，分離并進(jìn)行精制。
(1)溶劑分離法一般是將上述總提取物，選用三、四種不同極性的溶劑，由低極性到高極性分步進(jìn)行提取分離。水浸膏或乙醇浸膏常為膠狀物，難以均勻分散在低極性溶劑中，故不能提取完全，可拌入適量惰性填充劑，如硅藻土或纖維粉等，然后低溫或自然干燥，粉碎后，再以選用溶劑依次提取，使總提取物中各組成成分，依其在不同極性溶劑中溶解度的差異而得到分離。利用中草藥化學(xué)成分，在不同極性溶劑中的溶解度進(jìn)行分離純化，是最常用的方法。
(2)溶劑萃取法①萃取法溶劑提取萃取法又簡稱萃取法，是利用混合物中各成分在兩種互不相溶的溶劑中分配系數(shù)的不同而達(dá)到分離的方法。萃取時(shí)如果各成分在溶劑中分配系數(shù)相差越大，則分離效率越高；如果在水提取液中的有效成分是親脂性的物質(zhì)，一般多用親脂性有機(jī)溶劑，如苯、氯仿或乙醚進(jìn)行萃取，如果有效成分是偏于親水性的物質(zhì)，在親脂性溶劑中難溶解，就需要改用弱親脂性的溶劑，例如乙酸乙酯、丁醇等。還可以在氯仿、乙醚中加入適量乙醇或甲醇以增大其親水性。提取黃酮類成分時(shí)，多用乙酸乙脂和水萃取。提取親水性強(qiáng)的皂苷則多選用正丁醇、異戊醇和水作萃取。不過，一般有機(jī)溶劑親水性越大，與水作萃取的效果就越不好，因?yàn)槟苁馆^多的親水性雜質(zhì)伴隨而出，對有效成分進(jìn)一步精制影響很大。
②逆流連續(xù)萃取法是一種連續(xù)的溶劑萃取法。其裝置可具有一根、數(shù)根或更多的萃取管。管內(nèi)用小瓷圈或小的不銹鋼絲圈填充，以增加溶劑萃取時(shí)的接觸面。如果一種中草藥的水浸液需要用比水輕的苯、乙酸乙酯等進(jìn)行萃取，則需將水提濃縮液裝在萃取管內(nèi)，而苯、乙酸乙酯貯于高位容器內(nèi)。萃取是否完全，可取樣品用薄層層析、紙層析及顯色反應(yīng)或沉淀反應(yīng)進(jìn)行檢查。
③逆流分配法逆流分配法又稱逆流分溶法、逆流分布法或反流分布法。逆流分配法與溶劑逆流萃取法原理一致，但加樣量一定，并不斷在一定容量的溶劑中，經(jīng)多次移位萃取分配而達(dá)到混合物的分離。
④液滴逆流分配法液滴逆流分配法又稱液滴逆流層析法。為近年來在逆流分配法基礎(chǔ)上改進(jìn)的溶劑萃取法。對溶劑系統(tǒng)的選擇基本同逆流分配法，但要求能在短時(shí)間內(nèi)分離成，并可生成有效的液滴。由于移動(dòng)相形成液滴，在細(xì)的分配萃取管中與固定相有效地接觸、摩擦不斷形成新的表面，促進(jìn)溶質(zhì)在溶劑中的分配，故其分離效果往往比逆流分配法好。
(3)大孔吸附樹脂法大孔吸附樹脂是20世紀(jì)60年代發(fā)展起來的一類有機(jī)高聚物吸附劑，具有良好的吸附性能，近十余年來逐漸被應(yīng)用于中草藥化學(xué)成分的提取分離和中藥新藥的開發(fā)研制。
大孔吸附樹脂為吸附和篩選原理相結(jié)合的分離材料。它的吸附性是由于范德華引力或生成氫鍵的結(jié)果。篩選原理是由于其本身多孔性結(jié)構(gòu)所決定。由于吸附和篩選原理，有機(jī)化合物根據(jù)吸附力的不同及分子量的大小，在大孔吸附樹脂上經(jīng)一定的溶劑洗脫而分開。這使得有機(jī)化合物尤其是水溶性化合物的提純得以大大簡化。大孔吸附樹脂的骨架由苯乙烯和二乙烯苯縮聚而生成，由于改性劑的加入，大孔吸附樹脂的極性發(fā)生改變，按照樹脂的表面性質(zhì)，吸附樹脂一般分為非極性、中極性和極性三類。
非極性吸附樹脂是由偶極矩很小的單體聚合物制得的不帶任何功能基的吸附樹脂。典型的例子是苯乙烯-二乙烯苯體系的吸附樹脂，如D101、XAD-1、DiaionHP-10大孔吸附樹脂。
中極性吸附樹脂指含酯基的吸附樹脂，如丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯與雙甲基丙烯酸酯等交聯(lián)的一類共聚物。它是在非極性大孔吸附樹脂的基礎(chǔ)上，加入丙烯酸甲酯或丙烯腈縮聚而成，如中國國內(nèi)經(jīng)常使用的AB-8大孔吸附樹脂。
極性吸附樹脂是指含酰胺基、腈基、酚羥基等含氮、氧、硫極性功能基的吸附樹脂。此外，有時(shí)把含氮、氧、硫等配體基團(tuán)的離子交換樹脂稱作強(qiáng)極性吸附樹脂，強(qiáng)極性吸附樹脂與離子交換樹脂的界限很難區(qū)別。極性大孔吸附樹脂可以由甲基丙烯酸甲酯、丙烯酰胺或亞砜類縮聚而成，如日本三菱化工的Diaion HP 2MG、美國Rohm-hass公司的XAD-10，XAD-9大孔吸附樹脂。
與活性炭和其它吸附劑相比，大孔吸附樹脂具有很多的優(yōu)點(diǎn)，如對某種物質(zhì)的吸附選擇性較高；物理化學(xué)穩(wěn)定性和機(jī)械強(qiáng)度較好；品種規(guī)格較多，可根據(jù)需要改變樹脂物理或化學(xué)結(jié)構(gòu)；吸附樹脂一般為球狀顆粒，流體阻力較小等等。因而被廣泛應(yīng)用于化工、醫(yī)藥等領(lǐng)域，近年來關(guān)于大孔吸附樹脂在天然產(chǎn)物提取分離中的應(yīng)用研究報(bào)道越來越多。大孔吸附樹脂對中草藥化學(xué)成分如生物堿、黃酮、皂苷、香豆素及其他一些苷類成分都有一定的吸附作用。對糖的吸附能力很差，對色素的吸附能力較強(qiáng)。
(4)沉淀法是在中草藥提取液中加入某些試劑使產(chǎn)生沉淀，以獲得有效成分或除去雜質(zhì)的方法。如鉛鹽沉淀法鉛鹽沉淀法為分離某些中草藥成分的經(jīng)典方法之一。由于醋酸鉛及堿式醋酸鉛在水及醇溶液中，能與多種中草藥成分生成難溶的鉛鹽或絡(luò)鹽沉淀，故可利用這種性質(zhì)使有效成分與雜質(zhì)分離。然后將鉛鹽沉淀懸浮于新溶劑中，通以硫化氫氣體，使分解并轉(zhuǎn)為不溶性硫化鉛而沉淀。
(5)鹽析法鹽析法是在中草藥的水提液中，加入無機(jī)鹽至一定濃度，或達(dá)到飽和狀態(tài)，可使某些成分在水中的溶解度降低沉淀析出，而與水溶性大的雜質(zhì)分離。常用作鹽析的無機(jī)鹽有氯化鈉、硫酸鈉、硫酸鎂、硫酸銨等。
(6)透析法透析法是利用小分子物質(zhì)在溶液中可通過半透膜，而大分子物質(zhì)不能通過半透膜的性質(zhì)，達(dá)到分離的方法。反之也可將大分子的雜質(zhì)留在半透膜內(nèi)，而將小分子的物質(zhì)通過半透膜進(jìn)入膜外溶液中，而加以分離精制。
(7)結(jié)晶、重結(jié)晶和分步結(jié)晶法鑒定中草藥化學(xué)成分，研究其化學(xué)結(jié)構(gòu)，必須首先將中草藥成分制備成單體純品。在常溫下，物質(zhì)本身性質(zhì)是液體的化合物，可分別用分餾法或?qū)游龇ㄟM(jìn)行分離精制。一般地說，中草藥化學(xué)成分在常溫下多半是固體的物質(zhì)，都具有結(jié)晶體的通性，可以根據(jù)溶解度的不同用結(jié)晶法來達(dá)到分離精制的目的。
3、常用干燥方法(1)真空干燥是基于這樣一基本原理水的飽和蒸氣壓與溫度緊密相關(guān)，在真空狀態(tài)下，水的沸點(diǎn)降低，即在真空下操作也就是在低溫下操作，可避免在高溫下營養(yǎng)成分如維生素等的破壞，同時(shí)提高了干燥速度。真空干燥在食品、制藥、化工等行業(yè)有廣泛的應(yīng)用，中國也開發(fā)和引進(jìn)了各種真空干燥設(shè)備，其結(jié)構(gòu)形式多種多樣。常用的形式主要有箱式真空干燥器、雙錐式真空干燥器、帶式真空干燥器等。這些傳統(tǒng)的真空干燥裝置主要采用熱風(fēng)，蒸汽或電等加熱，利用熱傳導(dǎo)、對流或輻射原理將熱量從外部傳到物料內(nèi)部。真空干燥具有干燥溫度低，干燥室內(nèi)相對缺氧，可避免脂肪氧化，色素褐變等一系列優(yōu)點(diǎn)，適合于熱敏感性食品物料的干燥，此外設(shè)備成本、干燥費(fèi)用也相對較低。
(2)噴霧干燥是流化技術(shù)用于液態(tài)物料干燥的一種方法。因是瞬間干燥，特別適用于熱敏性物料，故所得產(chǎn)品質(zhì)量好，保持原來的色香味，且易溶解。利用噴霧干燥來制備微囊的研究正在進(jìn)行，它是將心料混懸在衣料的溶液中，經(jīng)離心噴霧器將其噴入熱氣流中，所得的產(chǎn)品是衣料包心料而成的微囊，這種微囊粉末可采用于直接壓片，也可制備膠囊劑、糖漿劑或混懸劑。
(3)冷凍干燥是將干燥液體物料冷凍成固體，在低溫減壓條件下利用冰的升華性能，使物料低溫脫水而達(dá)到干燥的一種方法。由于物料在高度真空及低溫條件下干燥，故對某些極不耐熱物品的干燥很適合。王大林報(bào)道了一種噴霧通氣凍干新技術(shù)，是利用冷的空氣或氮?dú)庾鳛榻橘|(zhì)，迅速流經(jīng)凍結(jié)物使水升華，噴霧凍干制得的產(chǎn)品微粒小、干燥快、時(shí)間短、均勻、流動(dòng)性好，并具良好的速溶性。近年來，對膏狀物料和粘稠物料干燥的研究取得了較大進(jìn)展，流態(tài)化技術(shù)、噴射技術(shù)、惰性載體技術(shù)，則是在此研究基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。旋轉(zhuǎn)閃蒸干燥機(jī)、熱噴射氣流干燥機(jī)、惰性載體干燥機(jī)均適合熱敏性物料和膏狀物料的干燥。這些新的研究成果用于中藥制劑生產(chǎn)，將大大改善中藥加工的技術(shù)水平，提高生產(chǎn)效率。
(4)遠(yuǎn)紅外加熱干燥法是一項(xiàng)新的干燥技術(shù)，其干燥原理是將電能轉(zhuǎn)變?yōu)檫h(yuǎn)紅外輻射，從而被藥材的分子吸收，產(chǎn)生共振，引起分子和原子的振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)，導(dǎo)致物體變熱，經(jīng)過熱擴(kuò)散、蒸發(fā)和化學(xué)變化，最終達(dá)到干燥的目的。遠(yuǎn)紅外干燥可節(jié)省電能20％～50％，效果較好。
(5)微波干燥法是一項(xiàng)20世紀(jì)60年代迅速發(fā)展起來的新技術(shù)，微波干燥實(shí)際上是通過感應(yīng)加熱和介質(zhì)加熱，使被干燥物中的水分和脂肪不同程度地吸收微波能量，并把它轉(zhuǎn)變?yōu)闊崃繌亩_(dá)到干燥的目的。微波干燥可殺滅微生物和霉菌，并具有消毒作用。目前中國生產(chǎn)的微波加熱成套設(shè)備有915mhz和2450mhz兩個(gè)頻率。
4、超臨界CO2萃取方法(1)有關(guān)動(dòng)、植物脂肪油成分的提取方法有水煮法、水媒分離法、分子蒸餾和減壓蒸餾法、金屬加合法、萃取結(jié)晶法、分盤冷凍壓榨法和有機(jī)溶劑法等。
采用水煮加熱法，因加熱時(shí)間長、溫度高，易使對熱不穩(wěn)定的揮發(fā)成分發(fā)生變化，如一些不飽和脂肪酸的氧化。水媒分離法，此分離法的明顯優(yōu)點(diǎn)是消除了有機(jī)溶劑法造成的高費(fèi)用和公害，但是這種技術(shù)的缺點(diǎn)是得到的飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的純度或級別不如有機(jī)溶劑分離法高。分子蒸餾和減壓蒸餾法為減少熱變性，需用尿素加合物等方法來除去大部分飽和脂肪酸，在得到的產(chǎn)品中必須將其除去；雖然可得到較純的脂肪酸，但需幾步才能達(dá)到目標(biāo)，較費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，增加了生產(chǎn)成本。金屬加合法分離需要較低的低溫處理，最后還要設(shè)法去除金屬離子，清除不盡還會(huì)造成金屬離子污染。萃取結(jié)晶法得到脂肪酸純度較高，在較低的溫度下進(jìn)行，能防止脂肪酸的氧化，但時(shí)間較長，不太適用于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。分盤冷凍壓榨法缺點(diǎn)是，安放盤架和液壓機(jī)的冷凍室需要數(shù)千平方米的面積和龐大的冷卻系統(tǒng)，大的設(shè)施需要多人操作，勞動(dòng)強(qiáng)度高，分離速度緩慢，效率低，不能連續(xù)操作。有機(jī)溶劑法是采用石油醚或乙醚有機(jī)溶劑在水浴上加熱情況下，進(jìn)行回流循環(huán)提取；由于所采用的有機(jī)溶劑如石油醚或乙醚等均為一種低沸點(diǎn)物質(zhì)，易燃易爆，同時(shí)，有機(jī)溶劑的使用一方面會(huì)污染環(huán)境，另一方面有機(jī)溶劑有可能在提取物中有殘留，會(huì)影響提取物在醫(yī)藥上的進(jìn)一步應(yīng)用。
(2)有關(guān)動(dòng)、植物脂肪油成分的超臨界CO2萃取方法一種流體當(dāng)處在其臨界溫度和壓力狀態(tài)時(shí)，被稱為超臨界流體。由于超臨界流體的密度接近于液體，具有與液體溶劑相當(dāng)?shù)妮腿∧芰?。又具有與氣體相當(dāng)?shù)牡驼扯?，擴(kuò)散能力比液體要大100倍，因而具有較高的傳質(zhì)性。采用超臨界萃取的時(shí)候，利用超臨界流體的這些性質(zhì)，使之與待分離的物質(zhì)相接觸穿透基體，從中萃取出目標(biāo)物質(zhì)。然后利用降壓和/或升溫的辦法降低其密度，從而降低溶質(zhì)在其中的溶解度，使被萃取物與溶劑分離。因?yàn)椴煌奈镔|(zhì)在相同的萃取條件下溶解度是不同的，因而有可能借助這種差異將它們進(jìn)一步分開。超臨界流體萃取常常選用CO2等臨界溫度低且化學(xué)惰性的物質(zhì)為萃取劑，它特別適用于熱敏物質(zhì)和易氧化物質(zhì)的分離，因此非常適用于對于動(dòng)物油脂的提取分離。因此，本發(fā)明采取該方法，能夠制備高純度的被提取物的脂肪油。
超臨界CO2萃取方法是這樣提取的把干燥的被提取物的粗粉放在超臨界萃取設(shè)備中用CO2進(jìn)行萃取，減壓后即得被提取物的脂肪油，室溫條件下呈淺黃色透明油狀；提取的被提取物的脂肪油中總脂肪酸的純度在40以上，優(yōu)于其他提取方法；總脂肪酸一般包括油酸、亞油酸、棕櫚酸以及余量的其他組分等。
超臨界CO2萃取被提取物的脂肪油的方法包括如下步驟(1)將干燥的被提取物粉碎至10～30目后，置于超臨界萃取釜中，連續(xù)地通入超臨界狀態(tài)下的CO2進(jìn)行萃取，優(yōu)選的條件一般是CO2流量10～55kg/h·kg原料、壓力5～50Mpa、溫度15～75℃、時(shí)間0.5～6h；進(jìn)一步優(yōu)選的條件一般是CO2流量45kg/h·kg原料、壓力35Mpa、溫度50℃、時(shí)間1h；(2)將萃取了被提取物的脂肪油的CO2減壓至1～12MPa，即可獲得在室溫條件下被提取物的脂肪油，被提取物的脂肪油中總脂肪酸的純度在40％以上，萃取物的理化性狀和脂肪酸純度都優(yōu)于其他提取方法。
萃取條件的選擇是通過以下辦法實(shí)現(xiàn)的首先選定四因素、三水平，根據(jù)正交設(shè)計(jì)方法，按L9(34)正交設(shè)計(jì)表安排實(shí)驗(yàn)(正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)安排參考郭祖超主編的《醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)》，人民軍醫(yī)出版社，1999年第一版)。從正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分析得到萃取工藝條件。
對超臨界CO2萃取的被提取物的脂肪油進(jìn)行脂肪酸甲酯化后，進(jìn)行氣相色譜—質(zhì)譜分析。
超臨界CO2萃取被提取物的脂肪油的制備方法不使用有機(jī)溶劑等物質(zhì)，不會(huì)污染環(huán)境，也不存在有害溶劑殘留等問題，而且操作簡便、萃取時(shí)間短、產(chǎn)品純度高，使用的CO2廉價(jià)而且可重復(fù)循環(huán)使用，工業(yè)生產(chǎn)成本低廉。
經(jīng)文獻(xiàn)檢索等，到目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)有對美洲一枝黃花總黃酮提取物及其制備方法和用途的有關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所需要解決的技術(shù)問題是公開了中藥美洲一枝黃花的活性部位，以及該活性部位的抗氧化、抗腫瘤、抗炎作用，即該活性部位是用于制備抗氧化產(chǎn)品、抗腫瘤產(chǎn)品、抗炎產(chǎn)品的活性成分，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷。
也就是說，本發(fā)明意在明確一種中藥活性部位即總提取物及其制備方法和用途；即本發(fā)明涉及一種中藥總黃酮提取物及其制備方法和用途。
該活性部位是抗氧化、抗腫瘤、抗炎的活性成分，能夠用于制備抗氧化產(chǎn)品、抗腫瘤產(chǎn)品、抗炎產(chǎn)品。
所述的抗氧化產(chǎn)品是指用于預(yù)防、診斷、檢測、保護(hù)、治療和研究因過氧化引起的疾病如癡呆癥疾病特別是老年癡呆等的起因、早期發(fā)生發(fā)展，或后期的發(fā)病，以及過氧化引起的相關(guān)疾病的產(chǎn)品中的一種或多種；也就是說主要針對過氧化的起因、發(fā)生發(fā)展到后期的發(fā)病全過程。所述的因過氧化引起的疾病及其相關(guān)疾病是包括老年性疾病及其相關(guān)疾病等各類疾病等中的一種或多種，所述的老年性疾病的相關(guān)疾病是包括衰老、腫瘤、炎癥、腦缺血等疾病和病理生理現(xiàn)象中的一種或多種；優(yōu)選癡呆癥疾病，進(jìn)一步優(yōu)選阿爾茨海默癥、多重梗塞型癡呆、酒精性癡呆及正常腦壓水腦癥等中的一種或多種，再進(jìn)一步優(yōu)選阿爾茨海默癥。
所述的抗炎產(chǎn)品是指用于預(yù)防、診斷、檢測、保護(hù)、治療和研究各種炎癥，優(yōu)選咽喉炎。
所述的抗腫瘤產(chǎn)品是指用于預(yù)防、診斷、檢測、保護(hù)、治療和研究各種腫瘤，優(yōu)選食管癌。
所述的抗氧化產(chǎn)品、抗腫瘤產(chǎn)品、抗炎產(chǎn)品均是包括醫(yī)藥、食品或飲料等領(lǐng)域產(chǎn)品中的一種或多種，例如包括藥物、試劑、食品、保健食品、添加劑或飲料等中的一種或多種，優(yōu)選藥物、保健食品或添加劑等中的一種或多種，進(jìn)一步優(yōu)選藥物。
(一)技術(shù)構(gòu)思自主開發(fā)創(chuàng)新藥物是中國目前的一項(xiàng)緊迫任務(wù)。中國中醫(yī)藥學(xué)具有悠久的歷史，用中草藥預(yù)防和治療疾病方面也積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，因此中藥的開發(fā)利用是一條有效的途徑，也是發(fā)揮中國藥物研制的優(yōu)勢之所在。
根據(jù)發(fā)明人的研究結(jié)果顯示，美洲一枝黃花中含有不同類型的化學(xué)成分，如大量的黃酮類成分、揮發(fā)油、極性較大的三萜皂苷類成分，但是美洲一枝黃花尚未被中國2005版藥典收載。
發(fā)明人檢索了《新編國家中成藥》、《臨床常用方劑手冊》、《中國常用中成藥大全》等書籍，并對美洲一枝黃花的醫(yī)院用藥和市售藥進(jìn)行了調(diào)查統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)由于對其化學(xué)成分研究不深入，藥理篩選不足，導(dǎo)致活性部位和活性成分不明確以及沒有可行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，限制了美洲一枝黃花的進(jìn)一步開發(fā)和利用。
經(jīng)過化學(xué)成分研究，證明美洲一枝黃花活性部位中的主要成分為黃酮類成分。而根據(jù)文獻(xiàn)檢索，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)黃酮類成分大多具有多種顯著的藥理活性，發(fā)明人從而推測美洲一枝黃花的抗氧化作用、抗炎作用和抗腫瘤作用及治療多種疾病的臨床藥效，應(yīng)主要是通過活性部位美洲一枝黃花總黃酮類成分的藥效來發(fā)揮的，研究結(jié)果也證明和證實(shí)了美洲一枝黃花總黃酮提取物具有顯著的藥理活性。
也就是說，本發(fā)明通過對包括美洲一枝黃花藥材的總黃酮提取物進(jìn)行系統(tǒng)的活性和應(yīng)用研究，并篩選和證明該復(fù)方的組成和用途。
(二)美洲一枝黃花的總黃酮提取物發(fā)明人通過對美洲一枝黃花進(jìn)行系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)研究和理論探索，包括化學(xué)成分分離、純化和結(jié)構(gòu)鑒定、藥理、藥劑、中藥配伍等實(shí)驗(yàn)研究和分析，發(fā)現(xiàn)美洲一枝黃花總黃酮提取物的總黃酮的含量為55％～90％(重量百分比，下同)，主要包括槲皮素(quercetin)、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷(quercetin-3-O-β-D-galactoside)、山奈酚(kaemoferol)、山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷(kaemoferol-3-O-α-L-rhamnoside)和綠原酸(chlorogrnic acid)等，其中槲皮素的含量為10％～50％(重量百分比，下同)。
所述美洲一枝黃花總黃酮提取物的總黃酮的含量優(yōu)選為55％～80％，進(jìn)一步優(yōu)選為55％～70％；所述美洲一枝黃花總黃酮提取物的槲皮素的含量優(yōu)選為10％～40％，進(jìn)一步優(yōu)選為10％～30％。
優(yōu)選的，所述美洲一枝黃花總黃酮提取物含有槲皮素，以及選自槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷)、山奈酚、山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷和綠原酸的至少兩種。
更優(yōu)選的，所述美洲一枝黃花總黃酮提取物含有槲皮素，以及選自槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷)、山奈酚、山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷和綠原酸的至少三種。
再優(yōu)選的，所述美洲一枝黃花總黃酮提取物同時(shí)含有槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚、山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷和綠原酸。
最優(yōu)選的，所述美洲一枝黃花總黃酮提取物同時(shí)含有的槲皮素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚、山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷和綠原酸的重量比為10～50∶2～28∶1～17∶2～24∶0.5～13。
本發(fā)明所述的美洲一枝黃花總黃酮提取物，是指采用目前現(xiàn)有的任何提取方法從菊科(Compositae)一枝黃花屬(Solidago)的美洲一枝黃花(Solidago Canadensis)的全草中提取獲得的、以總黃酮類化學(xué)成分作為主要組分的提取物。因此，美洲一枝黃花總黃酮提取物為所含各個(gè)活性成分協(xié)同起效的混合物，它不同于活性單體，它的藥效也不同于各個(gè)活性成分藥效的簡單加和。本發(fā)明所述的提取物中，總黃酮的含量≥55％，本領(lǐng)域技術(shù)人員通常將這樣的提取物稱為有效部位。
所述的槲皮素(CAS登錄號117-39-5)，其分子式C15H10O7，分子量302.2。
采用紫外分光光度法，以槲皮素為對照品，在266nm測定美洲一枝黃花總黃酮提取物中總黃酮的含量。
當(dāng)色譜條件為C18色譜柱，規(guī)格為4×250mm，柱溫30℃，流動(dòng)相為水和乙睛，梯度洗脫，洗脫程序?yàn)?min時(shí)，水∶乙腈為88∶12；20min時(shí)，水∶乙睛為72∶28，60min時(shí)，水∶乙睛為40∶60，流速為1ml/分鐘，用高效液相色譜法檢測，在標(biāo)準(zhǔn)品槲皮素的保留時(shí)間為12.3分鐘時(shí)，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷的保留時(shí)間為13.8±0.3分鐘時(shí)，和/或山奈酚的保留時(shí)間為22.3±0.2分鐘，和/或山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷的保留時(shí)間為24.1±0.2分鐘，和/或綠原酸的保留時(shí)間為31.3±0.2分鐘。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，使用Hypersil BDSC18填料常規(guī)色譜柱進(jìn)行檢測。
(三)美洲一枝黃花總黃酮提取物的制備方法本發(fā)明所述的美洲一枝黃花總黃酮提取物能夠通過下述方法制備得到1)藥材用含水乙醇提?。?)減壓濃縮步驟所得提取液；3)以水稀釋濃縮液，并作澄清處理，取上清液；4)利取上清液，過大孔樹脂柱吸附，棄流出液；然后用水洗滌所述吸附柱，棄水洗液；之后，采用乙醇洗脫吸附柱并收集該乙醇洗脫液；5)濃縮、干燥乙醇洗脫液，得到美洲一枝黃花總黃酮提取物。
(四)美洲一枝黃花總黃酮提取物的用途1、概述根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)方面，本發(fā)明提供了所述的美洲一枝黃花總黃酮提取物特別是美洲一枝黃花總黃酮提取物在制備預(yù)防和/或治療老年癡呆的應(yīng)用。藥效試驗(yàn)結(jié)果表明，美洲一枝黃花總黃酮提取物的抗氧化作用具有一定的量效關(guān)系，隨著劑量的增加而增急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，美洲一枝黃花總黃酮提取物經(jīng)灌胃給藥途徑，ICR小鼠的食量、體重未見異常，LD50＞16.5g/Kg，表明毒性低，具有很好的用藥安全性，而未經(jīng)該工藝處理的乙醇提取物和超臨界提取物具有一定的毒性。
根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)方面，本發(fā)明提供了所述美洲一枝黃花總黃酮提取物在制備抗炎藥物中的應(yīng)用。由于本發(fā)明的美洲一枝黃花總黃酮提取物有效的去除了具有刺激咽喉黏膜作用的非黃酮類雜質(zhì)，因此該提取物尤其適合于預(yù)防和/或治療各種炎癥引起的呼吸道疾病，如咽喉炎、氣管炎等。
根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)方面，本發(fā)明提供了所述美洲一枝黃花總黃酮提取物在制備預(yù)防和/或治療食道癌藥物中的應(yīng)用。
藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，結(jié)果表明，美洲一枝黃花總黃酮提取物對小鼠耳廓二甲苯致炎和大鼠角叉膠致足腫脹均有明顯的抑制作用，與對照組相比具有顯著性差異，其作用與阿司匹林相似，顯示本發(fā)明的總黃酮提取物具有良好的抗炎作用。
2、美洲一枝黃花總黃酮提取物的使用方法與要求本發(fā)明美洲一枝黃花總黃酮提取物可以單獨(dú)使用或與其它活性組分聯(lián)合使用，包括用于制備用于診斷、檢測、治療或研究相關(guān)疾病的產(chǎn)品，包括藥物、試劑、食品或飲料等，尤其是藥物。
在具體使用方面，本發(fā)明所述的美洲一枝黃花總黃酮提取物能夠單獨(dú)使用，還能夠與其他許多化學(xué)物質(zhì)一起使用。無論這些化學(xué)物質(zhì)是否具有生物活性或具有治療疾病的功能，包括輔助功能如協(xié)同放大作用、拮抗或緩解美洲一枝黃花總黃酮提取物的副作用等，這些化學(xué)物質(zhì)是包括醫(yī)藥學(xué)上可接受的載體、食品、天然產(chǎn)物、化學(xué)合成藥物或人類用藥等中的一種或多種；優(yōu)選包括醫(yī)藥學(xué)上可接受的載體或者食品等中的一種或多種；進(jìn)一步優(yōu)選醫(yī)藥學(xué)上可接受的載體。
所述的有活性的化學(xué)物質(zhì)是包括有治療作用的化學(xué)物質(zhì)，或者是對治療有輔助作用的化學(xué)物質(zhì)等中的一種或多種。有治療作用的化學(xué)物質(zhì)是包括免疫調(diào)節(jié)劑(免疫增強(qiáng)劑或免疫抑制劑)等中的一種或多種，對治療有輔助作用的化學(xué)物質(zhì)包括抗炎、抗菌、鎮(zhèn)痛或解毒等物質(zhì)中的一種或多種。
本文使用的“醫(yī)藥學(xué)上可接受的載體”包括任何和所有的生理適用的溶劑、分散介質(zhì)、胞衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑或吸收延遲劑等中的一種或多種。醫(yī)藥學(xué)上可接受載體的例子包括一種或多種的水、鹽水、磷酸緩沖鹽水、葡萄糖、甘油或乙醇等等及其組合物中的一種或多種。在許多情況下，在該組合物中最好包括等滲劑，例如，糖、諸如甘露醇、山梨醇、山梨醇的多元醇或氯化鈉等中的一種或多種。醫(yī)藥學(xué)上可接受載體還可以包含少量的輔助物質(zhì)，例如潤濕劑或乳化劑、防腐劑或緩沖液等中的一種或多種，它們增強(qiáng)了美洲一枝黃花總黃酮提取物的有效期或效力。
從具體的分類上看，所說的醫(yī)藥學(xué)上可接受的載體是指醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的藥物載體，包括賦形劑，如淀粉或水等中的一種或多種；潤滑劑，如甘油、硬脂酸鎂或聚乙二醇等中的一種或多種；崩解劑，如瓊脂、碳酸氫鈉或微晶纖維素等中的一種或多種；吸收促進(jìn)劑，如季銨化合物等；填充劑，如淀粉或乳糖等中的一種或多種；粘接劑，如預(yù)膠化淀粉、糊精、纖維素衍生物、藻酸鹽或明膠等中的一種或多種；滲透壓調(diào)節(jié)劑，如葡萄糖、蔗糖、山梨醇或甘露醇等中的一種或多種；稀釋劑，如水等；表面活性劑，如十六烷醇等；吸附載體，如高嶺土或皂粘土等中的一種或多種；另外，還可以在組合物中加入其它輔劑，如香味劑或甜味劑等中的一種或多種。
例如，將活性組分美洲一枝黃花總黃酮提取物溶解、混懸或乳化于適宜的水性溶劑中(例如，蒸餾水、生理鹽水或格林溶液等中的一種或多種)或油性溶劑中(例如，植物油例如橄欖油、芝麻油、棉籽油、玉米油或丙二醇等中的一種或多種)中，即可制得注射制劑，其中溶劑中可含有分散劑(例如，聚山梨酯80、聚氧乙烯硬化蓖麻油60、聚乙二醇、苯甲醇、氯代丁醇或苯酚等中的一種或多種)、滲透壓調(diào)節(jié)劑(例如，氯化鈉、甘油、D9-甘露糖、D-山梨醇或葡萄糖等中的一種或多種)。在這種情況下，如有必要，可加入添加劑，例如增溶劑(例如，水楊酸鈉或醋酸鈉等中的一種或多種)、穩(wěn)定劑(例如，人血清白蛋白等)、止痛劑(例如，苯甲醇等)等。
本發(fā)明所述及的美洲一枝黃花總黃酮提取物還可以以組合物的形式聯(lián)合使用，特別是與用其它化學(xué)物質(zhì)如藥物對動(dòng)物尤其是哺乳動(dòng)物包括人或其他動(dòng)物進(jìn)行治療所用的組合物或者是類似的組合物。所述哺乳動(dòng)物，包括人、小鼠、大鼠、羊、猴、牛、豬、馬、兔、犬、黑猩猩、狒狒、狨、獼猴或恒河猴等中的一種或多種。例如，可以將本發(fā)明美洲一枝黃花總黃酮提取物加入適于給與受治療者的藥用組合物中。
通常，該藥用組合物包含本發(fā)明美洲一枝黃花總黃酮提取物和藥學(xué)上可接受的載體和/或賦形劑。例如，一種藥物組合物可以是將美洲一枝黃花總黃酮提取物和藥學(xué)上可接受的載體和/或賦形劑按照一定的配比混合而成；還可以是將美洲一枝黃花總黃酮提取物、其它中藥提取物和藥學(xué)上可接受的載體和/或賦形劑按照一定的配比混合而成。
美洲一枝黃花總黃酮提取物的組合物特別是藥物組合物可以有各種形式，按照常規(guī)制劑方法配制成可供給藥的形式，包括經(jīng)口或胃腸外給藥形式，例如液體、半固體和固體等劑量形式中的一種或多種；其中所說的藥物組合物包括治療有效量的美洲一枝黃花總黃酮提取物為活性成分，以及一種或多種醫(yī)藥學(xué)上可接受的載體。
美洲一枝黃花總黃酮提取物的藥物組合物可以采用本領(lǐng)域公知的常規(guī)生產(chǎn)方法制成各種劑型，例如使活性成分與一種或多種載體混合，然后將其制成所需的劑型。所述的劑型包括片劑、膠囊劑、顆粒劑、錠劑、栓劑、貼劑、凝膠劑、粉劑或液體制劑(如口服或無菌胃腸外溶液或懸浮液，例如混懸劑、乳劑、溶液劑、糖漿劑或注射劑)等中的一種或多種，還可以根據(jù)需要制備成緩控釋制劑或靶向制劑，采取口服或注射(包括靜脈注射、靜脈滴注、肌肉注射或皮下注射等中的一種或多種)、粘膜透析等中的一種或多種給藥途徑進(jìn)行抗氧化、抗腫瘤、抗炎及相關(guān)病癥的診斷、檢測、治療或科學(xué)研究。
藥物組合物優(yōu)選含有重量比為0.5％～99％的活性成分美洲一枝黃花總黃酮提取物，進(jìn)一步優(yōu)選含有重量比為1％～95％的活性成分美洲一枝黃花總黃酮提取物，最優(yōu)選含有重量比為5％～90％的活性成分美洲一枝黃花總黃酮提取物。
美洲一枝黃花總黃酮提取物的藥物組合物一般必須無菌且在生產(chǎn)儲(chǔ)存條件下穩(wěn)定。可以將該組合物配制成溶液、微乳液、分散液、脂質(zhì)體或其它適合于高藥物濃度的有序結(jié)構(gòu)。通過將所需量的美洲一枝黃花總黃酮提取物與所需上述成分的一種或組合一起加入適當(dāng)?shù)娜軇┲胁⒔又M(jìn)行除菌過濾制備無菌注射液。一般而言，通過將美洲一枝黃花總黃酮提取物加入含有基本分散介質(zhì)和所需的上述其它成分的無菌溶媒中制備分散液。在用于制備無菌注射液的無菌粉劑的情況下，推薦的制備方法是真空干燥和冷凍干燥劑。例如，通過諸如卵磷脂的包衣、在分散液的情況下通過保持所需顆粒大小和通過使用表面活性劑，可以保持溶液的適當(dāng)流動(dòng)性。通過在該組合物中包括延遲吸收的藥劑(例如單硬脂酸鹽或明膠)可以達(dá)到注射組合物的延長吸收。
用于患者時(shí)，本發(fā)明所述的美洲一枝黃花總黃酮提取物劑量為5～20mg/kg·d，該劑量或用量通常根據(jù)患者或使用者的年齡和體重以及身體狀況或患者癥狀的狀況來決定。
本發(fā)明美洲一枝黃花總黃酮提取物及其藥用組合物可以包括“治療有效量”或“預(yù)防有效量”的本發(fā)明美洲一枝黃花總黃酮提取物?！爸委熡行Я俊笔侵冈诒匾膭┝亢蜁r(shí)間下有效達(dá)到所需治療效果的量，即在該劑量下，本發(fā)明的提取物能夠改善或減輕疾病癥狀，或能夠抑制或阻斷疾病的發(fā)展。美洲一枝黃花總黃酮提取物的治療有效量可以根據(jù)諸如個(gè)體的病況、年齡、性別和體重以及美洲一枝黃花總黃酮提取物在該個(gè)體引起所需反應(yīng)的能力等因素而變化。治療有效量亦指美洲一枝黃花總黃酮提取物的有益治療效果超過其任何毒性或有害效果的量?！邦A(yù)防有效量”是指在必要?jiǎng)┝亢蜁r(shí)間下有效達(dá)到所需預(yù)防效果的量。因?yàn)轭A(yù)防劑量用于患病前或疾病早期的受治療者，預(yù)防有效量通常小于治療有效量。本發(fā)明美洲一枝黃花總黃酮提取物的治療或預(yù)防有效量的典型的非限制性范圍是5～20mg/kg，更優(yōu)選為5～10mg/kg。應(yīng)注意，劑量值將根據(jù)欲減輕的疾病類型和嚴(yán)重性變化，也就是說用于患者時(shí)，本發(fā)明所述的美洲一枝黃花總黃酮提取物的劑量或用量，通常根據(jù)患者或使用者的年齡和體重以及身體狀況或患者癥狀的狀況來決定。另外，應(yīng)理解，對于任何特定受治療者，應(yīng)隨著時(shí)間根據(jù)個(gè)體需要和給與或監(jiān)督給與所述組合物的人的專業(yè)判斷調(diào)整特定劑量制度，并且本文設(shè)定的劑量范圍僅為例證性的，并不會(huì)限制要求保護(hù)的組合物的范圍或?qū)嵺`。
也就是說，需要根據(jù)治療的對象、給藥途徑、所治療疾病和狀況等，變化本發(fā)明美洲一枝黃花總黃酮提取物的每次和/或每日的劑量或用量。例如，經(jīng)靜脈給予哺乳動(dòng)物，尤其是成年人(如體重60kg)，所述美洲一枝黃花總黃酮提取物的單劑量約為5～10mg，優(yōu)選約10mg，優(yōu)選每日給藥1～3次?？梢哉{(diào)整劑量單位，以提拱最佳所需反應(yīng)(例如治療或預(yù)防應(yīng)答)。例如，可以單次大劑量給藥，可以在一段時(shí)間內(nèi)給予幾個(gè)均分量或根據(jù)治療情況的迫切性按比例降低或增加劑量。配制易于給藥和劑量統(tǒng)一的劑量單位形式的非腸道組合物尤其有利。本文使用的劑量單位形式，指適于欲治療的哺乳動(dòng)物受治療者的單元?jiǎng)┝康奈锢矸蛛x單位；每個(gè)單位含有預(yù)定量的計(jì)算用于與所需藥用載體一同產(chǎn)生所需治療效果的活性物美洲一枝黃花總黃酮提取物。本發(fā)明的劑量單位形式的規(guī)格，由以下確定并直接取決于以下(a)美洲一枝黃花總黃酮提取物的獨(dú)特特征和欲達(dá)到的特定治療或預(yù)防效果，和(b)在混合這種用于治療個(gè)體敏感性美洲一枝黃花總黃酮提取物的技術(shù)中的內(nèi)在限制。
3、美洲一枝黃花總黃酮提取物的藥物劑型和給藥途徑本發(fā)明所述的美洲一枝黃花總黃酮提取物制備抗炎性反應(yīng)產(chǎn)品，其中按照飲料、食品技術(shù)領(lǐng)域的要求制備的產(chǎn)品能夠抗氧化、抗腫瘤、抗炎以及診斷、檢測、治療或研究抗氧化、抗炎、抗腫瘤方面的疾病及其相關(guān)病癥；按照醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域的要求制備的產(chǎn)品能夠用于患者的治療或保健，既能夠單獨(dú)直接用于制備治療或保健的藥物，也能夠與許多化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行混合或組合，直接或間接用于制備治療或保健的藥物。這里所述的化學(xué)物質(zhì)與本節(jié)上文中所述的相同。
在本發(fā)明中，所需物料包括本發(fā)明的原料、上述配套使用的化學(xué)物質(zhì)等，均應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況和需要，采用食品級或藥用級的物料。
本發(fā)明所述的美洲一枝黃花總黃酮提取物，可以用本領(lǐng)域已知的各種方法給藥，盡管在許多治療用途中推薦的給藥途徑/給藥方式是噴霧劑或口服給藥。但是，技術(shù)人員會(huì)理解給藥途徑/給藥方式隨所需的結(jié)果而變化。在某些具體實(shí)施中，該活性化合物可以與保護(hù)該化合物免于快速釋放的載體一同制備例如空釋制劑，包括移植物傳遞系統(tǒng)、透皮貼傳遞系統(tǒng)或微囊傳遞系統(tǒng)等中的一種或多種。此外，還可以使用生物可降解的、生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙酯、聚酐、聚羥基乙酸、膠原蛋白、聚正酯或聚乳酸等中的一種或多種。制備這種制劑的許多方法均已申請專利或一般為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知(參見例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson編輯，Marcel Dekker，Inc.，紐約，1978)。
本發(fā)明所述的美洲一枝黃花總黃酮提取物，通常通過口服、鼻吸入、直腸或腸胃外給藥等中的一種或多種方式，施用于需要這種治療的患者。
用于口服時(shí)，可將其制成常規(guī)的固體制劑如片劑、粉劑、顆粒劑或膠囊等中的一種或多種，它們可以含有?，F(xiàn)賦形刑如粘合劑像糖漿、阿拉伯膠、明膠、山梨醇、黃若膠、羥兩基中基纖維素或聚乙烯毗咯烷酮填充劑如乳糖、蔗糖、玉米淀粉。磷酸鈣、山梨醇或盲氨酸；壓片潤滑劑如硬脂酸鎂；崩解劑如淀粉、聚乙烯毗咯烷酮、交聚維酮、羥乙酸淀粉鈉或微晶纖維素或藥學(xué)上可接受的潤濕劑如十二烷基硫酸鈉。在實(shí)施時(shí)，本發(fā)明美洲一枝黃花總黃酮提取物可以與例如惰性稀釋劑或可同化的食用載體一同口服。美洲一枝黃花總黃酮提取物(和共它成分，如果需要)亦可以包于硬或軟殼明膠膠囊、壓制成片劑或直接加入受治療者的膳食中。關(guān)于口服治療給藥，可以將所述美洲一枝黃花總黃酮提取物與賦形劑一起加入并以可食片劑、頰含片劑、酊劑、膠囊、懸液、糖漿或糯米紙囊劑等等中的一種或多種形式使用。
胃腸外組合物(如胃腸外給藥組合物)可以含有所述活性化合物和無菌溶媒，根據(jù)使用的濃度，所述活性化合物可以懸浮于或溶解于該溶媒中。制備胃腸外給藥的溶液時(shí)，可以將本發(fā)明的組合物溶于注射用水中，過濾除菌，然后溫裝于適當(dāng)?shù)墓苤破炕虬碴持胁⒚芊狻Ｗ詈脤⑤o助劑如局部麻醉劑、防腐劑和緩沖劑溶解于所述溶媒中。為增加穩(wěn)定性，可以將該組合物灌裝于管制瓶中后冷凍并真空去除水分。以基本相同的方法可以制各胃腸外懸浮液，但是所述活性化合物是懸浮于溶媒中而不是溶解于溶媒中，并且除菌不能通過過濾進(jìn)行。
為了以非腸道給藥之外給予本發(fā)明美洲一枝黃花總黃酮提取物，可能需要用防止其失活的材料對美洲一枝黃花總黃酮提取物包衣或與美洲一枝黃花總黃酮提取物一同給予。亦可以將補(bǔ)充的活性化合物加入該組合物中。在具體實(shí)施時(shí)，將本發(fā)明美洲一枝黃花總黃酮提取物與一種或多種可以用于治療疾病的其它治療藥物共配制和/或共給予。這種聯(lián)合使用，可以優(yōu)越地利用較低劑量的該給予的治療藥物，因此避免可能的毒性或與各種單一療法相關(guān)的并發(fā)癥。
制成液體制劑如水劑、油懸浮劑或其它液體制劑中的一種或多種，如糖漿或酏劑等中的一種或多種；用于腸胃外給藥時(shí)，可將其制成注射用的溶液劑、水劑或油性懸浮劑等中的一種或多種。
液體組合物(如日服液體組合物)可以制備為乳液、糖漿劑或酗劑形式，或者將它們制備為干燥產(chǎn)物形式，在使用前用水或其它適當(dāng)?shù)娜苊饺芙?。此類液體制劑可以含有常規(guī)的添加劑，如懸浮劑像山梨醇、糖漿。甲基纖維素。明膠、羥乙基纖維素、接甲基纖維素、硬脂酸鋁凝膠、氫化可食用脂肪；乳化劑如卵磷脂、脫水山梨醇單油酸酯或阿拉伯膠；非水溶性溶媒(可以包括食用油)如杏仁油、分餾椰子油、油性酯如甘油、丙二醇或乙醇的酯；防腐劑如對羥基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨醇；并且如果需要可以含有常規(guī)的矯味劑或著色劑。
可以將所述化合物通過暴露于環(huán)氧乙烷中滅菌，然后將其懸浮于無菌溶媒中。
最好該組合物中含有表面活性劑或潤濕劑以有助于活性組分的均勻分布。
以上所述的使用形式中，優(yōu)選的形式是顆粒劑、片劑、包衣片劑、膠囊、栓劑或注射劑等中的一種或多種，進(jìn)一步優(yōu)選顆粒劑、片劑、包衣片劑、膠囊、栓劑或注射劑等中的一種或多種，特別優(yōu)選顆粒劑、包衣片劑。
此外，美洲一枝黃花總黃酮提取物所使用的藥材原料在某些情況下也能夠單獨(dú)直接用于制備抗炎性反應(yīng)產(chǎn)品，也能夠與許多化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行混合或組合，以組合物的形式直接或間接用于制備抗炎性反應(yīng)產(chǎn)品。這里所述的化學(xué)物質(zhì)與本節(jié)上文中所述的相同。
例如，美洲一枝黃花總黃酮提取物所使用的藥材原料的粉末用于制備抗炎性反應(yīng)產(chǎn)品特別是藥物的各種劑型，或者是美洲一枝黃花總黃酮提取物所使用的藥材原料的粉末與有關(guān)的輔料用于制備抗炎性反應(yīng)產(chǎn)品尤其是藥物的各種劑型，或者是美洲一枝黃花總黃酮提取物所使用的藥材原料的粉末與有關(guān)的制備抗炎性反應(yīng)產(chǎn)品如藥物一起用于制備抗炎性反應(yīng)產(chǎn)品如藥物的各種劑型，或者是美洲一枝黃花總黃酮提取物所使用的藥材原料的粉末與有關(guān)的輔助藥物一起用于制備抗炎性反應(yīng)產(chǎn)品如藥物的各種劑型，如優(yōu)選顆粒劑、片劑、包衣片劑、膠囊、栓劑或注射劑等中的一種或多種，特別優(yōu)選包衣片劑。
所述的方法之一是將美洲一枝黃花總黃酮提取物所使用的藥材原料的粉末灌裝為膠囊劑，方法之二是將美洲一枝黃花總黃酮提取物所使用的藥材原料的粉末與有關(guān)的制備抗炎性反應(yīng)產(chǎn)品如藥物一起灌裝為膠囊劑，方法之三是將美洲一枝黃花總黃酮提取物所使用的藥材原料的粉末與有關(guān)的輔助藥物一起灌裝為膠囊劑；方法之四是將美洲一枝黃花總黃酮提取物所使用的藥材原料的粉末與有關(guān)的輔料一起按常規(guī)方法直接壓為片劑或顆粒劑，方法之五是將美洲一枝黃花總黃酮提取物所使用的藥材原料的粉末、有關(guān)的制備抗炎性反應(yīng)產(chǎn)品如藥物一起與有關(guān)的輔料按常規(guī)方法直接壓為片劑或顆粒劑，方法之六是將美洲一枝黃花總黃酮提取物所使用的藥材原料的粉末、有關(guān)的輔助藥物一起與有關(guān)的輔料按常規(guī)方法直接壓為片劑或顆粒劑等。
除上述的六種基本方法外，還能夠選擇美洲一枝黃花總黃酮提取物所使用的藥材原料的其他形式或?qū)γ乐抟恢S花總黃酮提取物所使用的藥材原料進(jìn)行本領(lǐng)域公知的方法處理后，制備各種劑型的含有美洲一枝黃花總黃酮提取物所使用的藥材原料的產(chǎn)品如藥物。但是，需要注意的是，在上述直接使用美洲一枝黃花總黃酮提取物所使用的藥材原料的時(shí)候，應(yīng)先根據(jù)所使用的美洲一枝黃花總黃酮提取物的劑量要求，換算得到所需要使用的美洲一枝黃花總黃酮提取物所使用的藥材原料的用量。
綜上所述，本發(fā)明美洲一枝黃花總黃酮提取物可用于制備抗炎性反應(yīng)產(chǎn)品，優(yōu)選藥物和食品，進(jìn)一步優(yōu)選藥物。
(五)技術(shù)特長本發(fā)明具備以下優(yōu)點(diǎn)1、本發(fā)明提供的美洲一枝黃花總黃酮提取物的制備工藝能有效地富集總黃酮，去除雜質(zhì)，其總黃酮含量高，且其質(zhì)量控制方法可通過紫外分光光度方法和高效派相分析方法進(jìn)行含量測定和高效液相指紋圖譜進(jìn)行分析，該分析方法簡單易控。
2、美洲一枝黃花總黃酮提取物具有明顯的抗氧化的作用，高含量的總黃酮能夠達(dá)到良好治療效果美洲一枝黃花總黃酮還具有顯著的抗腦缺血和抗炎作用。
3、急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，美洲一枝黃花總黃酮提取物的毒性低，具有很好的用藥安全性，而未經(jīng)該工藝處理的乙醇提取物和超臨界提取物具有一定的毒性。這充分提示了本工藝制備的美洲一枝黃花總黃酮提取物的臨床用藥的安全性。
4、本發(fā)明提供的美洲一枝黃花總黃酮提取物制備工藝中采用樹脂純化方法，該方法簡便、快捷、重視性好；所選用的大孔吸附樹脂吸附量大，解吸率大，可反復(fù)使用；所選用的溶劑乙醇，價(jià)廉、無毒。
該工藝技術(shù)突出優(yōu)點(diǎn)是(1)提取效率高；(2)有效地富集了主要活性成分一黃酮類成分，且提取物體積小，提高了中藥的內(nèi)在質(zhì)量；(3)充分祛除了其非黃酮類成分(具有刺激咽喉黏膜作用)等三萜類化合物、甾體等；(4)減少了產(chǎn)品的吸潮性(5)去除了大量的無機(jī)鹽、粘液質(zhì)等，從而增強(qiáng)了產(chǎn)品的穩(wěn)定性；(6)容易制備成外觀美觀的各種劑型；(6)大孔樹脂再生處理方便，降低了工藝成本。
正因?yàn)橐陨蟽?yōu)點(diǎn)，充分說明了該工藝適合工業(yè)化生產(chǎn)，具有很大的實(shí)用性。
本發(fā)明有針對性地研究美洲一枝黃花總黃酮提取物，該原料使用安全，互為兼顧，一物多用，最大限度地發(fā)揮了作用，而且使用范圍特別廣，因此容易推廣應(yīng)用，能夠在較短的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生巨大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。
也就是說，本發(fā)明的研究結(jié)果可被進(jìn)一步深入開發(fā)為具有臨床應(yīng)用前景的防治抗氧化、抗炎、抗腫瘤產(chǎn)品尤其是新藥。該產(chǎn)品具有療效確切、有效劑量低、無毒副作用的優(yōu)點(diǎn)，與同類產(chǎn)品相比具有顯著的優(yōu)勢。這些疾病為臨床常見病、多發(fā)病，隨著全球大氣污染的日益嚴(yán)重和環(huán)境的惡化，預(yù)計(jì)這些疾病的發(fā)病率將不斷攀升。因此，本發(fā)明還可為后續(xù)的新藥研究打下良好的基礎(chǔ)，并進(jìn)一步產(chǎn)生較大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
經(jīng)過長期的藥理學(xué)試驗(yàn)，美洲一枝黃花總黃酮提取物具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎及其相關(guān)病癥的活性，直接使用美洲一枝黃花總黃酮提取物，作用更直接，從而克服了中藥給藥劑量難以控制的問題，并提高了生物利用度；而且美洲一枝黃花總黃酮提取物藥理作用較強(qiáng)，其原料來源豐富，制備工藝簡單。
(六)社會(huì)效益根據(jù)農(nóng)業(yè)部的最新統(tǒng)計(jì)顯示，目前，入侵中國的外來生物已達(dá)400余種。近10年來，新入侵中國的外來生物至少20余種，平均每年遞增兩種。中國已經(jīng)成為遭受外來入侵生物危害最嚴(yán)重的國家之一。在國際自然保護(hù)聯(lián)盟(IUCN)公布的全球100種最具威脅的外來生物中，中國已經(jīng)有50余種。2004年11月4日，在北京召開的“外來入侵生物預(yù)防與控制技術(shù)發(fā)展戰(zhàn)略國際研討會(huì)”上，包括中國、英國、美國等6個(gè)國家、3個(gè)國際組織以及世界銀行等國際知名專家、學(xué)者、管理專家，為中國外來入侵物種的預(yù)防與管理獻(xiàn)計(jì)獻(xiàn)策。中國將啟動(dòng)外來入侵生物國家發(fā)展策略框架。
美洲一枝黃花作為外來入侵性植物，到目前為止，已經(jīng)嚴(yán)重的破壞了中國的自然資源和生態(tài)環(huán)境，很多地方已經(jīng)把美洲一枝黃花作為一種雜草除掉。通過本發(fā)明研究，可以有效的利用這樣的雜草資源，同時(shí)還可以很好的提高人們的生活質(zhì)量，可以起到變廢為寶的作用。
總之，本發(fā)明積極適應(yīng)了現(xiàn)代醫(yī)療和科研領(lǐng)域的工作需要和人性化服務(wù)的需要，是用于抗氧化、抗腫瘤、抗炎及其相關(guān)病癥的安全原料。


圖1表示TF對肝組織勻漿脂質(zhì)過氧化的作用；圖2表示TF對Vit C-Fe2+系統(tǒng)誘導(dǎo)肝線粒體形態(tài)改變的影響；圖3表示美洲一枝黃花總黃酮低劑量、高劑量和對照組用苡仁提取物(wogonin)抑殺食道癌細(xì)胞的療效比較；圖4表示美洲一枝黃花總黃酮抑殺體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中食道癌細(xì)胞生長的劑量曲線；圖5表示黃霉素抑殺活體動(dòng)物上移植食道癌的生長情況。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明研究了一種中藥的新的活性部位即總提取物及其制備方法和用途，提供了一種能夠用于制備抗氧化、抗腫瘤、抗炎產(chǎn)品如藥物及其相關(guān)病癥產(chǎn)品特別是藥物的原料，便于醫(yī)療行業(yè)和相關(guān)行業(yè)如食品、飲料等領(lǐng)域的安全使用，包括疾病治療、科學(xué)研究等。
(一)美洲一枝黃花總黃酮提取物的制備方法該提取物的制備方法包括以下步驟1)藥材用含水乙醇提取；2)減壓濃縮步驟所得提取液；3)以水稀釋濃縮液，并作澄清處理，取上清波4)取上清液，過大孔樹脂柱吸附，棄流出液；然后用水洗滌所述吸附柱，養(yǎng)水洗液；之后，采用乙醇洗脫吸附柱共收集該乙醇洗脫液；5)濃縮、干燥乙醇洗脫液，得到美洲一枝黃花總黃酮提取物。
其中步驟1中，所述含水乙醇提取是指以含水乙醇作溶劑，采用本領(lǐng)域內(nèi)已知的常規(guī)技術(shù)提取，例如，熱回流提取、滲源法提取、連續(xù)逆流提取等，其中，所述含水乙醇是指10倍體積(與藥材重量比)濃度為50～80％的乙醇水溶液。學(xué)例來說，對于熱回流提取，其溶劑用量為藥材重量的8～10倍(溶劑作積/藥材重量，提取次數(shù)為2～3次；加熱溫度可以為60～85℃。
步驟2中，提取液濃縮后，其體積(L)優(yōu)選為原藥材(kg)的6～10倍體積。
步驟3中，濃縮液化選以加3～5倍體積的水稀釋。
步驟4中，吸附柱吸附提取液后，優(yōu)選用1～5BV(柱床體積)的水洗滌，洗脫液流速優(yōu)選為0.5～2.5BV/小時(shí)；洗脫乙醇優(yōu)選采用50～90％乙醇水溶液，洗脫液流通優(yōu)選為0.5～2.5BV/小時(shí)。
所述大孔樹脂通常為苯乙烯型共聚體的含有酯基或氰基的中等極性吸附樹脂，其結(jié)構(gòu)為大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，例如D-101大孔樹脂、SIPI-40大孔樹脂、SIPI-21大孔樹脂或SIPI-8大孔樹脂等。
在上樣前，應(yīng)當(dāng)對大孔樹脂進(jìn)行前處理，以防止有效成分從廢液中流失。在樹脂前處理時(shí)，通常先用5％HCl洗脫，后用純化水洗至中性，再用2％NaOH洗脫，后用純化水洗至中性，連續(xù)生產(chǎn)時(shí)，用95％乙醇洗柱，后用純化水洗至蜂為零度，即可再次使用。
步驟5中，得到的美洲一枝黃花總黃酮提取物進(jìn)行干燥處理，得到干燥形式的提取物，所用的干燥方法包括真空干燥、噴霧干燥和冷凍干燥等。
因此，進(jìn)一步的，本發(fā)明所述的美洲一枝黃花總黃酮提取物可以通過下述方法制備得到1)藥材用50～80％的乙醇水溶液熱回流提取2～3次，合并提取液；2)減壓濃縮步驟1)所得提取液至原藥材的6～10倍體積；3)以3～5倍體積的水稀釋濃縮液，并作澄清處理，取上清液；4)取上情液，過大孔樹脂柱吸附，棄流出濃；然后用1～5BV的水，以0.5～2.5BV/小時(shí)的流速洗滌所述吸附柱，棄水洗液；之后，采用50～90％的乙醇，以0.5～2.5BV/小時(shí)的流速洗脫吸附柱，收集該乙醇洗脫液；5)濃縮、干燥乙醇洗脫液，得到美洲一枝黃花總黃酮提取物。
上述BV(Bed Volumn)為樹脂柱裝載的樹脂后的柱床體積。樹脂柱的處理能力與它的樹脂裝載量成正比。洗脫液的流量和速率以BV或BV/hr為計(jì)算單位。
在采用上述工藝制備提取物之前，通常需要先將美洲一枝黃花藥材進(jìn)行前處理，即將美洲一枝黃花粉碎，洗凈，曬干，粉碎，過篩。
美洲一枝黃花總黃酮提取物的其他提取方法如下方法一(1)將上述藥才洗凈，浸泡6～24小時(shí)后置入提取溶器內(nèi)煎煮2～6次，每次煎煮的時(shí)間為0.5～3小時(shí)。
(2)將數(shù)次提取的藥液合并，一齊進(jìn)行濃縮成浸膏。
(3)將浸膏靜置后，加入乙醇進(jìn)醇沉，回收乙醇去沉淀。
(4)取醇沉后的上清液，濃縮成純浸膏，該純浸膏比重1.0～1.5(得率8～16％)(5)加入輔料制粒干燥過200～400目篩。
(6)包裝成10～15g/袋，成品顆粒。
方法二(1)將上述藥材浸泡6～24小時(shí)，置入提取容器中，煎煮2～6次，每次煎煮的時(shí)間為0.5～3小時(shí)。
(2)將數(shù)次提取藥液合并，一齊進(jìn)行負(fù)壓濃縮成稠膏，該稠膏比重1.0～1.5。
(3)將稠膏負(fù)壓真空干燥-0.085±0.005mpa，70℃±5℃得干膏(水分＜3％)；粉碎過50～200目篩得干膏細(xì)粉，得率為6.8％。
現(xiàn)有的研究表明，其他成分對藥效或藥物的使用等方面至少?zèng)]有負(fù)面的影響，而且分離這些成分成本較高，因此目前沒有進(jìn)一步純化的必要。
(二)美洲一枝黃花總黃酮提取物的含量控制本發(fā)明采用高效液相色譜法、高效液相色譜一電噴霧質(zhì)譜法和薄層色譜等技術(shù)手段對所述的美洲一枝黃花總黃酮提取物進(jìn)行含量控制，對B紋圖譜特征和非黃酮類雜質(zhì)分析的研究。
1、含量控制采用紫外分光光度法和高效液相色譜法(簡稱HPLC)分別測定由實(shí)施例1和實(shí)施例2制備得到的美洲一枝黃花總黃酮提取物中總黃酮的含量和槲皮素的含量。以槲皮素為對照品，在266nm進(jìn)行檢測。分析測定結(jié)果表明其總黃酮的含量為55～90％(重量百分比)；鴦尾式的含量為10～50％(重量百分比)。
2、指紋圖譜采用高效液相色譜一電噴霧質(zhì)譜法，對美洲一枝黃花總黃酮的主要成分進(jìn)行了分析和鑒定，確定其黃酮主要為槲皮素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚、山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷和綠原酸。
以高效液相分析方法檢測，以峰面積歸一法計(jì)算，其相對峰比例分別為，槲皮素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚、山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷和綠原酸1∶0.12～0.5∶0.10～0.3∶0.20～0.6∶0.1～0.3。
由此推算，槲皮素∶槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷∶山奈酚∶山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷∶綠原酸的重量比為10～50∶2～28∶1～17∶2～24∶0.5～13。
3、雜質(zhì)分析采用薄層色譜法，對美洲一枝黃花總黃酮提取物中所含雜質(zhì)進(jìn)行分析。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了所述美洲一枝黃花總黃酮提取物的制備工藝。本發(fā)明首次對美洲一枝黃花總黃酮進(jìn)行大孔樹脂吸附制備工藝的研究，提供了美洲一枝黃花總黃酮的大孔樹脂吸附純化方法，該純化方法是將美洲一枝黃花液經(jīng)上樹脂柱、洗脫、收集沈脫液、濃縮、干燥，獲得純化的美洲一枝黃花總黃酮，從而有效地富集了總黃酮，并去除了雜質(zhì)。
(三)美洲一枝黃花總黃酮提取物的各種劑型下面以幾個(gè)典型的劑型為例，詳細(xì)闡述美洲一枝黃花總黃酮提取物各種劑型的具體制備方法。
本發(fā)明制備粉針劑一般采用常規(guī)的冷凍干燥法，以水作為溶媒，其步驟為取美洲一枝黃花總黃酮提取物，加入賦形劑，加水溶解，加入活性炭，過濾除菌，灌裝，半軋塞，冷凍干燥，壓塞軋蓋即可。所用的賦形劑選自甘露醇、水解明膠、葡萄糖、乳糖或右旋糖苷等中的一種或幾種。每瓶含美洲一枝黃花總黃酮提取物10～100mg。
本發(fā)明制備粉針劑也可采用噴霧干燥法，以水作為溶媒，其步驟為取美洲一枝黃花總黃酮提取物，加或不加賦形劑(賦形劑同上)，加水溶解，加入活性炭，過濾除菌，噴霧干燥，無菌分裝，壓塞軋蓋即可。每瓶含美洲一枝黃花總黃酮提取物10～100mg。
本發(fā)明制備小針劑時(shí)，以注射用水作為溶媒配制即可，也可加適量輔料，輔料選自乙醇、丙二醇、甘油、聚乙二醇、苯甲酸芐酯或二甲基乙酰胺等中的一種或幾種。每支含美洲一枝黃花總黃酮提取物10～100mg。
本發(fā)明制備葡萄糖輸液或氯化鈉輸液，以注射用水作為溶媒，加入適量葡萄糖或氯化鈉配制即可，也可加適量輔料，輔料選自乙醇、丙二醇、甘油、聚乙二醇、苯甲酸芐酯或二甲基乙酰胺等中的一種或幾種。每瓶含美洲一枝黃花總黃酮提取物10～100mg。
本發(fā)明制備片劑、膠囊、顆粒劑、口服液等口服制劑，輔料可以是乳糖、淀粉、糊精、硬脂酸鹽等，按常規(guī)技術(shù)制備。
在本發(fā)明中，以上所述的具體實(shí)施方式
和以下所述的實(shí)例均是為了更好地闡述本發(fā)明，并不是用來限制發(fā)明的范圍。
為了更好地理解本發(fā)明的本質(zhì)，下面結(jié)合附圖，通過實(shí)施例對本發(fā)明作詳細(xì)描述。本發(fā)明所用的美洲一枝黃花(干燥根莖)采自于上海江灣體育場，經(jīng)鑒定為美洲一枝黃花的全草。本發(fā)明所用的試驗(yàn)材料如無特別說明均為市售購買產(chǎn)品。
實(shí)施例1、美洲一枝黃花總黃酮提取物的提取方法之一取美洲一枝黃花藥材500kg，加入5噸70％乙醇，加熱回流提取3h，濾過，藥渣繼續(xù)加3噸乙醇回流提取Zh，濾過，兩次提取液合并。減壓回收溶劑，溫度50～60℃，濃縮到原藥材的8倍體積，將濃縮液加3借熱水稀釋，加入適量中藥澄清劑，離心，去沉淀，取上清液，上樣于大孔樹脂柱(在L樣前分別用酸、堿、水、醇對樹脂柱進(jìn)行前處理)，上樣后先用3BV純水沖洗，水溶液棄除，改用3BV的70％乙醇洗脫，洗脫液流速為1.SBV/h，收集該乙醇洗脫版。繼續(xù)減壓回收溶劑，收集浸育，噴霧干燥，即得。
實(shí)施例2、美洲一枝黃花總黃酮提取物的質(zhì)量分析方法之一下列質(zhì)量分析中所用樣品包括
樣品按實(shí)施例1的方法，從美洲一枝黃花中提取美洲一枝黃花總黃酮提取物，共5個(gè)批號；1、含量分析1.1總黃酮的含量測定采用紫外分光光度法測定美洲一枝黃花總黃酮提取物的含量，其中紫外分光光度為UV-2401PC型，運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方法，以駕尾式為對照品，在266nm測定。
1.1.1標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制精密稱取對照品槲皮素(自制)，HPLC歸一法，含量為99％，16.20mg用適量乙醇溶解。定容于50ml容量瓶中，搖勻，作為儲(chǔ)備液，精密吸取sml儲(chǔ)備液，70％乙醇定客于50ml容量瓶中，分別吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml中，定容于10ml容量瓶中，進(jìn)行紫外測定，記錄吸收度值，以對照品濃度(x)為橫坐標(biāo)，吸收度(y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸計(jì)算。
1.1.2測定方法分別精密稱取20mg樣品，加20ml 70％乙醇，超聲提取半小時(shí)，提取液過濾，藥渣按前法再操作1次，過濾，兩次濾液合并，定容至50mL的容量瓶中，吸取0.5mL續(xù)濾液，定容于25mL的容量瓶中持測定，記錄吸收度，接線性方程計(jì)算含量。由吸收度值計(jì)算總黃酮的含量。
1.1.3結(jié)果五批結(jié)果表明，其總黃酮的含量為分別為55％，60％，70％，65％，61％，平均含量為62.20％；通過多批號檢測證明，運(yùn)用本發(fā)明工藝制備的美洲一枝黃花總黃酮提取物中總黃酮的含量范圍在55％～90％重量。
1.2槲皮苷的含量測定采用高效液相色譜法(簡稱HPLC)，以槲皮素為對照品，測定美洲一枝黃花總黃酮提取物中槲皮苷的含量。
1.2.1色譜條件高效液相色譜儀HP1100系列(美國惠譜公司)，Hypersil BDS C18填料常規(guī)色譜柱(slim，4×250mm)，柱溫(30℃)，水(A)和乙睛(B)為流動(dòng)相，梯度洗脫，洗脫程序?yàn)?min時(shí)，A∶B為88∶12；20min時(shí)為72∶28，60min時(shí)為40∶60，流速1ml/min，紫外檢測器(簡稱UV)，檢測波長266nm。
1.2.2標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制稱取對照品13.62mg，用適量70％乙醇溶解，定容于50ml的容量瓶中，搖勻，作儲(chǔ)備液。精密吸取5ml儲(chǔ)備液，70％乙醇定客于50ml的容量瓶中。分別吸取1，1.5，2，4，10mL，轉(zhuǎn)移到10mL容量瓶中，用70％乙醇定客至刻度。以對照品濃度(x)為橫坐標(biāo)，吸收度(y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸計(jì)算，得到回歸方程Y＝43359.81x-8.43066，R＝0.9999，槲皮苷在0.002724～0.02724mg/ML范圍內(nèi)具良好的線性失系。
1.2.3測定方法取樣品適量，精密稱定20mg左右，轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，加70％乙醇40mL，常溫下超聲30min，取出冷卻到室溫，加70％乙醇至刻度，搖勻，吸取2mL至10mL容量瓶中，70％乙醇定容至刻度，搖勻，即可測定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)線即可計(jì)算槲皮苷的含量。
1.2.4結(jié)果五批測定結(jié)果表明，其槲皮苷的含量分別為12％，18％，15％，16％，17％，平均含量為15.6％；通過多批號檢測證明，運(yùn)用該工藝制備的美洲一枝黃花總黃酮中槲皮苷的含量范圍在10％～50％重量。
2.指紋圖譜分析2.1樣品溶液配制分別取由實(shí)施例1和2得到的美洲一枝黃花總黃酮樣品20mg，精密稱定，置50ml量瓶中，加70％乙醇40ml，超聲提取半小時(shí)，提取液過濾到50ml容量瓶中，冷解恒溫，加適70％乙醇并稀釋至刻度，搖勻，吸取2ml，定客到10ml的容量瓶中，作為供試品溶液。
2.2測定方法高效液相色譜一電噴霧質(zhì)譜法(簡稱HPLC-EIMS)識別提取物化學(xué)組分，高效液相色譜法(簡稱HPLC)檢測各組分含量。
2.2.1高效液相色譜一電噴霧質(zhì)譜法的檢測條件高效液相色譜系統(tǒng)條件同1.2.1；質(zhì)譜儀器ICQ advantage型質(zhì)譜儀(美國Finnigan公司)，Thermo Fingan surveryer包括MS pump、Auto sampler-poADetector)ESI離子源的鞘氣(N2)，流通70ml/min，輔助氣以外，流通20ml/min；源電壓4.SKV；正高于檢測；碰撞氣體為氦氣；噴霧毛細(xì)管溫度280℃，毛細(xì)管電壓43V；采用全離子掃描方式，掃描范圍m/Z＝200～1000。
2.2.2組分含量分析條件高效液相色譜儀HP1100系列(美國惠譜公司)，Hypersil BDS C18填料常規(guī)色譜往(5um，4×250mm)，柱溫(30℃)，水(A)和乙睛(B)為流動(dòng)相，梯度洗脫，洗脫程序?yàn)?min時(shí)，A∶B為88∶12；20min時(shí)為72∶28，60min時(shí)為40∶60，流速1ml/min，紫外檢測器(簡稱UV)，檢測波長266nm，以槲皮素為對照品，進(jìn)行檢測。
2.3結(jié)果2.3.1提取物化學(xué)組分識別采用高效液相色譜一電噴霧質(zhì)譜法，對美洲一枝黃花總黃酮的主要成分進(jìn)行分析和鑒定，確定其黃酮主要為槲皮素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚、山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷和綠原酸。
2.3.2提取物中各化學(xué)組分含量根據(jù)HPLC-EIMS結(jié)果可知，保留時(shí)間(RT)為問.30min的色譜峰為槲皮素峰；RT為13.78min的色譜峰為槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷；RT為22.30min的色譜峰為山奈酚峰；RT為24.09min的色譜峰為山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷峰；RT為引.31min的色譜峰為綠原酸峰。
以峰面積歸一法計(jì)算槲皮素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚、山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷和綠原酸的相對峰比例。
五批結(jié)果相對峰面積比例分別為所以，美洲一枝黃花總黃酮五個(gè)峰(槲皮素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚、山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷和綠原酸)相對比例歸納為1∶0.12～0.5∶0.10～0.3∶0.20～0.6∶0.1～0.3。
由此推算槲皮素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚、山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷和綠原酸的百分含量依次為10.00～50.00％、2.80～8.00％、1.60～16.20％、2.33～23.30％、0.83～2.53％；槲皮素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚、山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷和綠原酸的重量比約為10～50∶2～28∶1～17∶2～24∶0.5～13。
3、雜質(zhì)分析采用薄層色譜法對從美洲一枝黃花中提取的美洲一枝黃花總黃酮提取物進(jìn)行分析，展開劑石油醚∶丙酮(8∶2)，硅膠GF254層析板，以二萜和美洲一枝黃花藥材為參比。
由檢測結(jié)果可知，本發(fā)明的美洲一枝黃花總黃酮中不含雜質(zhì)二萜。
本發(fā)明對從駕尾中提取的美洲一枝黃花總黃酮提取物也進(jìn)行如上的雜質(zhì)分析，分析條件與結(jié)果均與上述相同，此處不作重復(fù)說明。
實(shí)施例3、美洲一枝黃花總黃酮提取物的體外抗氧化藥理作用研究之一1.1.美洲一枝黃花總黃酮對超氧陰離子自由基的清除作用(Ponti V，Dianzani MV，Cheeseman KJ，et al.Studies on the reduction of nitroblue tetra-zolium chloride mediated throughthe action of NADH and phenazine methosulate[J].Chem Biol Interact，1978，23281)在16mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.0)中含煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)73μmol/L，甲硫酸吩嗪(Phenazine methosulphate，PMS)15μmol/L，氮蘭四唑(nitroblue tetrazolium，NBT)50μmol/L產(chǎn)生O2-，空白管不加PMS，對照管不加美洲一枝黃花總黃酮(簡稱TF)，TF的終濃度為20mg/L、40mg/L、80mg/L、160mg/L，總體積為3ml，于560nm處測吸收度，計(jì)算抑制率。結(jié)果顯示，TF能明顯清除NADH-PMS-NBT系統(tǒng)產(chǎn)生的超氧陰離子自由基，且呈量效關(guān)系(表1)。
表1、總黃酮對NADH-PMS-NBT系統(tǒng)產(chǎn)生的O2-的清除作用Scavenging effect of TF on O2-produced by NADH-PMS-NBT system

n＝4，x±s，*P＜0.05**P＜0.01 vs control group1.2TF對H2O2系統(tǒng)產(chǎn)生的羥基自由基的清除作用以Smirnoff等(Smirnoff N，Cumbes Q J.Hyroxyl radical scavenging activity of compatible solutes.[J].Phytochemistry，1989，28(4)1057-1060.)的方法為基礎(chǔ)并改進(jìn)。即采用亞鐵離子催化過氧化氫產(chǎn)生羥自由基(·OH)方法。以·OH氧化水楊酸所得產(chǎn)物的吸收度示·OH多少，吸收度越大，·OH越多。最后加H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，37℃反應(yīng)1h，在510nm處測定吸收度，吸收度越小，清除效果越好。
1.3.TF對誘導(dǎo)的H2O2小鼠紅細(xì)胞溶血作用的影響(Wu YJ，Li WG，Zhang ZM，et al.Antioxidative activity of 4-oxy- and 4-hydroxy-nitroxides in tissues and eyethrocytes fromrats[J].Acta Pharmacol Sin，199718150)小鼠經(jīng)眼球取血，肝素抗凝，4℃離心3000r/min，10min，得紅細(xì)胞，用冰冷生理鹽水溶液洗3次，制成0.5％懸浮液。取紅細(xì)胞懸液1ml，模型管加H2O2(使終濃度為100mmol/L)，受試物管中加入H2O2(終濃度為100mmol/L)以及不同濃度的TF(終濃度分別為20，40，80，160mg/L)，同時(shí)設(shè)未誘導(dǎo)溶血的空白對照管。上述各管混勻后37℃水浴中溫育1h，以生理鹽水稀釋5倍，離心3000r/min，10min，上清液在415nm波長處測吸收度。計(jì)算溶血率及抑制率溶血率＝(A受試物/A模型組)×100％，抑制率＝(模型組溶血率-受試物溶血率)/(模型組溶血率-空白組溶血率)×100％
與對照組比，H2O2明顯誘導(dǎo)了紅細(xì)胞溶血的發(fā)生，模型組的吸收度值明顯升高(P＜0.01)；同時(shí)TF對由H2O2引起的該效應(yīng)均有抑制作用，并表現(xiàn)出一定的量效關(guān)系(表2)。
表2、總黃酮對H2O2系統(tǒng)產(chǎn)生的O2-的清除作用Scavenging effect of TF on for OH produced by H2O2system

n＝4，x±s，*P＜0.05**P＜0.01 vs control group表3、總黃酮對H2O2引起的小鼠紅細(xì)胞溶血的作用Effect of TF on the hemolysis of mouse RBC induced H2O2

n＝4，x±s，△△P＜0.01 vs control group*P＜0.05**P＜0.01 vs model group1.4.TF對肝組織勻漿脂質(zhì)過氧化的作用(龔國清，劉同征，李立文，等。西紅花酸的體外抗氧化作用的研究[J]。中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，32(4)306-309)小鼠脫頸椎處死，迅速取肝，置于4℃PBS中洗凈表面殘血，用濾紙吸干，制成10％的勻漿備用。取上述組織勻漿1ml，加入不同濃度的TF溶液0.5ml(終濃度分別為20mg/L、40mg/L、80mg/L、160mg/L)，以DMSO為陽性對照藥(終濃度為1.5μmol/L)，終反應(yīng)體積為1.5ml。37℃水浴中溫育，且于不同時(shí)間點(diǎn)吸取0.1ml混懸液，按丙二醛測定試劑盒操作測定MDA的生成量(見圖1)。由圖1可見，肝勻漿在自氧化的過程中，氧化產(chǎn)物MDA生成量是隨時(shí)間的延長而增加的，在0～1小時(shí)間，MDA的含量增長最快，在以后增長較緩慢。在各個(gè)時(shí)間段中，TF和DMSO對肝勻漿的自氧化有顯著的抑制作用，且TF呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系。
1.5.TF對Vit C-Fe2+系統(tǒng)誘導(dǎo)肝線粒體氧化損傷的影響(羅景慧，楊迎暴，林永成，等。海洋真菌Halorosellina oceanicum 323代謝產(chǎn)物的體外抗菌素氧化活性研究[J]。中藥材，2004，27(3)188-192)1.5.1.線粒體的制備 昆明種小鼠，脫頸椎致死，取肝臟置于預(yù)冷至0℃～4℃的0.25mol/L，PH7.4的蔗糖溶液中洗滌，洗凈血液，用濾紙吸去肝組織表面的溶液，稱重，以1∶8的比例加入預(yù)冷的蔗糖溶液，將肝組織用剪刀剪碎，置于勻漿器中打成勻漿，以低溫離心10min，取上清液低溫離心10min，分離沉淀，用預(yù)冷的0.25mol/L的蔗糖溶液洗滌兩次，每次離心10min，即得到純化的線粒體，沉淀物用緩沖液(Tris-HCl 20mmol/L，pH7.0，KCl 175mmol/L)混懸，取線粒體混懸液涂片，用1％的詹納斯綠B液染色20min，覆上蓋玻片，顯微鏡鑒定，線粒體藍(lán)綠色，呈小棒狀或者啞鈴狀。用雙縮脲測定線粒體蛋白含量。
1.5.2.TF對Vit C-Fe2+系統(tǒng)誘導(dǎo)肝線粒體形態(tài)改變的影響 反應(yīng)體系為反應(yīng)體積3ml，0.1mmol/L VitC，5μmol/L FeSO4，含有1.0mg線粒體蛋白質(zhì)，加入各種濃度的TF或者緩沖液，37℃水浴中溫育30min。于520nm處測線粒體懸液的濁度變化。光密度的下降表示線粒體膨脹度增加。結(jié)果表明TF能明顯抑制由FeSO4/Vit C所引起的線粒體的形態(tài)改變效應(yīng)(見圖2)。與對照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.討論超氧陰離子自由基、羥基自由基等活性氧自由基是在機(jī)體代謝過程中產(chǎn)生的。在生理狀態(tài)下，活性氧自由基處于較低的水平，其產(chǎn)生和與清除處于動(dòng)態(tài)平衡，但在某些病理情況下，這種平衡被打破，將導(dǎo)致機(jī)體損傷。其中羥基自由基的危害最大，可導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生，許多病理生理現(xiàn)象如衰老、腫瘤、炎癥、腦缺血等均與氧自由基有密切聯(lián)系。本研究采用H2O2和Fe2+系統(tǒng)產(chǎn)生羥基自由基，利用NADH-PMS-NBT系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基，來研究TF的清除自由基活性，結(jié)果表明TF于體外可清除O2-、·OH。
另一方面活性氧可促發(fā)多不飽和脂肪酸的脂質(zhì)過氧化(簡稱LPO)，反應(yīng)中產(chǎn)生的各種中間過氧化產(chǎn)物也具有損傷作用，LPO反應(yīng)的終產(chǎn)物丙二醛(簡稱MDA)可使含氨基的蛋白質(zhì)、核酸、腦磷脂發(fā)生交聯(lián)并喪失其活性。本研究結(jié)果顯示TF能顯著地抑制H2O2誘導(dǎo)的小鼠紅細(xì)胞溶血和降低肝勻漿自氧化產(chǎn)物MDA的含量。
線粒體是細(xì)胞內(nèi)能量代謝的主要場所，參與包括自由基生成、脂質(zhì)代謝等在內(nèi)的許多生理和生化過程。近年來的研究還表明，線粒體是多類藥物的細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)。因此維持其結(jié)構(gòu)和功能正常對生物體的正常活動(dòng)有著至關(guān)重要的意義。本研究證實(shí)TF可降低Vit C-Fe2+系統(tǒng)誘導(dǎo)肝線粒體的腫脹，表明其對自由基過度生成而引起的線粒體功能損傷有一定的保護(hù)作用。
以上結(jié)果說明TF有明顯的體外抗氧化作用，又是一種天然水溶性色素，對于進(jìn)一步開發(fā)成抗衰老藥物或保健食品輔料有較大的參考價(jià)值。
結(jié)果表明TF能明顯清除H2O2系統(tǒng)產(chǎn)生的羥基自由基。與對照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
實(shí)施例4、美洲一枝黃花總黃酮提取物的抗炎作用實(shí)驗(yàn)1、實(shí)驗(yàn)材料1.1試驗(yàn)樣品有效部位1(簡稱1號)從美洲一枝黃花中提取的美洲一枝黃花總黃酮(按實(shí)施例1工藝方案制備，含量大于50％)，200mg/kg低劑量有效部位1(簡稱1號)從美洲一枝黃花中提取的美洲一枝黃花總黃酮(按實(shí)施例1工藝方案制備，含量大于50％)，400mg/kg低劑量阿司匹林系sigma化學(xué)公司產(chǎn)品。
角叉菜膠系sigma化學(xué)公司產(chǎn)品。
1.2試驗(yàn)動(dòng)物1.2.1昆明種小鼠，8～22g，購于中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
1.2.2SD大鼠，體重180～220g，購于中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
2、實(shí)驗(yàn)方案和結(jié)果2.1小鼠耳廓二甲苯致敏試驗(yàn)小鼠隨機(jī)分成4組，每組10只，分成有效部位1(200mg/kg)、有效部位2(400mg/kg)、阿司匹林對照組(300mg/kg)及空白對照組。每日一次，連續(xù)5天，末次給藥40min，各鼠左耳兩面涂以二甲苯60ul致炎。右耳作對照，1h后脫頸椎處死，沿耳廓是部剪下兩耳，用直徑8mm打孔器取下相同部位耳片，稱重。以對照耳片重量為100％，計(jì)算致炎耳炎癥增重百分率。
結(jié)果見表4，結(jié)果表明，2小時(shí)即對甲苯致炎的小鼠耳腫脹有顯著的抑制作用，與對照組相比有顯著性差異。
2.2大鼠足角叉膠致炎試驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，分設(shè)有效部位1(200mg/kg)、有效部位2(400mg/kg)，阿司匹林對照組(300mg/kg)及空白對照組。及空白對照組。每日一次，連續(xù)5d，末次給藥30min，向大鼠左后足墊部皮下注射0.8％角叉菜膠0.1ml后，用游標(biāo)卡尺(精密度0.02mm)測定致炎前和致炎后的1.0、2.0、3.0h大鼠足厚度的差值為腫脹度，比較各組腫脹度的差異。
結(jié)果見表5。結(jié)果表明，與對照組相比，美洲一枝黃花總黃酮提取物均對大鼠足角叉菜膠致炎有明顯的減輕作用，上述兩個(gè)致炎試驗(yàn)說明該提取物具有良好的抗炎作用，其效果與阿司匹林相似。
表4、美洲一枝黃花總黃酮對二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響

表5、對角叉膠所致大鼠足腸炎癥的影響(n＝10)(X±SD)

與對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01實(shí)施例5、美洲一枝黃花總黃酮抑制裸鼠上移植食道癌內(nèi)的血管生成狀況實(shí)驗(yàn)方法先將食道癌細(xì)胞株接種在探鼠皮下。自第二周開始，總黃酮經(jīng)皮下給藥，每周3次。實(shí)驗(yàn)持續(xù)至第12周，每周測量一次腫瘤的表面積。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將腫瘤自探鼠上分離下來，經(jīng)化學(xué)固定和冰凍切片后，用人因子作抗體進(jìn)行免疫組化染色。圖片中棕色片段即為腫瘤血管斷面。左圖樣本取自未用藥組，右圖樣本取自用藥組，用藥劑量1mg/kg體重，可見血管數(shù)量明顯減少。
結(jié)果如圖3所示，該圖表是美洲一枝黃花總黃酮低劑量、高劑量和對照組用苡仁提取物(wogonin)抑殺食道癌細(xì)胞的療效比較。在離體性別培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，美洲一枝黃花總黃酮低劑量、高劑量和苡仁提取物均有抑殺食道癌細(xì)胞的作用，但作用強(qiáng)度略有差異。相對強(qiáng)度美洲一枝黃花總黃酮高劑量＞低劑量＞苡仁提取物。
實(shí)驗(yàn)方法三種實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株均采用相同的培養(yǎng)條件。1×105細(xì)胞被種植在直徑為15mm的培養(yǎng)盤上，培養(yǎng)液含有10％小牛血清。24小時(shí)待細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)液換成無血清培養(yǎng)液以避免血清中存在的生長因子對細(xì)胞生長的影響。換液后24小時(shí)開始加藥。加藥5天后作細(xì)胞計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)前先用臺潘蘭將細(xì)胞染色以排除已死亡細(xì)胞對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。曲線中每一點(diǎn)為3次實(shí)驗(yàn)的平均值。
如圖4所示，該表是美洲一枝黃花總黃酮抑殺體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中食道癌細(xì)胞生長的劑量曲線。曲線1表示正常細(xì)胞，曲線2表示乳腺癌細(xì)胞，曲線3表示食道癌細(xì)胞。
從曲線中可見，用藥濃度為0.1開始起效果(2％抑制)，濃度為外0.5ug/ml時(shí)，食道癌細(xì)胞生長的抑制為50％。而當(dāng)濃度達(dá)到10ug/ml時(shí)，抑制可達(dá)95％。
實(shí)施例6、美洲一枝黃花總黃酮提取物的質(zhì)量分析方法之一實(shí)驗(yàn)方法先將食道癌細(xì)胞林接種在裸鼠皮下，經(jīng)1～2周后腫瘤開始生長。美洲一枝黃花總黃酮下注射自第二周開始，每周3次。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被隨機(jī)分成3個(gè)實(shí)驗(yàn)劑量組合一個(gè)對照組，每組10個(gè)裸鼠。實(shí)驗(yàn)持續(xù)至第12周，每周測量一次食道癌腫瘤的表面積。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將食道癌腫瘤自裸鼠上分離下來，并做保存處理以備用作藥理，免疫組化及生化檢查。
如圖5所示，是黃霉素抑殺活體動(dòng)物上移植食道癌的生長。
實(shí)施例7、美洲一枝黃花總黃酮提取物的質(zhì)量分析方法之一本實(shí)驗(yàn)觀察ICR小鼠單次灌服美洲一枝黃花總黃酮后，由于吸收所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)和死亡情況。結(jié)果表明本發(fā)明提供的美洲一枝黃花總黃酮6000mg/kg灌胃給藥后，ICR小鼠的食量、體重未見異常。在給藥后14大內(nèi)，小鼠未發(fā)生死亡。因此，美洲一枝黃花總黃酮灌胃給藥的LD50＞6000mg/kg。
1、試驗(yàn)材料1.1動(dòng)物ICR小鼠，清潔級，20±3g，雌雄兼用，購手上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號為滬動(dòng)合格率第152號。
1.2受試藥物樣品1從美洲一枝黃花中提取的總黃酮。(按實(shí)施例1工藝方法制備，含量大于50％)樣品2以乙醇提取所得到的乙醇提取物，總黃酮含量為10％左右。
樣品3以超臨界提取所得到的提取物，總黃酮含量為8％左右。
2、試驗(yàn)方法ICR小鼠20只，給藥前禁食12h(僅供水)。每只小鼠以受試藥物(樣品1)的最大可灌胃濃度(0.15g/ml)和小鼠的最大可灌胃容量(0.4ml/10g)給予6ug/kg，受試藥物(樣品2，樣品3)的最大可灌胃濃度(0.16g/ml)和小鼠的最大可灌胃容量(0.4ml/10g)給予5g/Kg。觀察記錄給藥后14天內(nèi)動(dòng)物全身狀況。體重、呼吸。中樞神經(jīng)系統(tǒng)、四肢活動(dòng)等變化。若動(dòng)物死亡，即立即進(jìn)工尸檢，記錄病變情況。若有肉眼可見變化，則進(jìn)行病理檢查。
3、結(jié)果結(jié)果可知，給藥組和對照組ICR小鼠的體重均有所升高，兩者之間比較無顯著性差異。
4、結(jié)論樣品1灌胃給藥的LD50＞6000mg/kg，這個(gè)結(jié)果提示該藥物在用于臨床時(shí)毒性不大；樣品2和樣品3灌胃給藥的LD50為5000mg/kg。這說明經(jīng)過本發(fā)明制備工藝處理后的樣品明顯無毒。
實(shí)施例8、美洲一枝黃花口服制劑的具體制備方法1.美洲一枝黃花提取物的制備選取一定量的美洲一枝黃花100份置于500～2500份的乙醇、甲醇或丙酮，或其中兩種或三種溶液的混合液，在20～80℃條件下，攪拌0.5～3個(gè)小時(shí)，使之成為溶液或混合液，將溶劑回收，所余固體真空干燥，得到美洲一枝黃花提取物。
2.制劑的制備將上述提取物過60～200目篩，并且根據(jù)制劑劑型的要求加入聚山梨酯80和其它輔料，具體的制備方法如下(1)美洲一枝黃花片、膠囊、顆粒劑的制備將上述提取物過60～200目篩，所得到粉末中加入乳糖100～2000份及微粉硅膠100～500份混合均勻，得到混合物I，取淀粉100～2000份和混合物I混勻，得到混合物II，取10～2000份的聚山梨酯80和20～85％乙醇(潤濕劑)，加入的量為500～2000份，干燥時(shí)去除。混勻喉慢慢加入混合物II，混勻。在上述混合物中加入20～80％的糖漿制成軟材，按照美洲一枝黃花提取物100份計(jì)，糖漿量為50～400份，過10～80目篩制顆粒，40～60℃干燥2～12小時(shí)，過10～80目篩整粒，稱重測定，加入滑石粉1～50份，裝入鋁塑袋中得到美洲一枝黃花顆粒劑；或根據(jù)美洲一枝黃花提取物裝入硬膠囊克，制得美洲一枝黃花膠囊劑，或?qū)㈩w粒經(jīng)壓片機(jī)制成片劑。
(2)美洲一枝黃花軟膠囊劑的制備將提取物過60～200目篩，所得到粉末中加入乳糖10～2000份聚山梨酯80、100～2000份PEG(分子量200～600)、20～200份1，2-丙二醇、1～50份水得混合液，研磨20～120min。使得全部過80～200目篩，靜置過夜；將藥液置于軋囊機(jī)得貯液槽中，保溫40～50℃壓囊。400～4000份明膠液，干燥20～24小時(shí)，無水乙醇洗滌，干燥，選粒即得。
本發(fā)明得美洲一枝黃花口服制劑及其方法，將美洲一枝黃花提取物與聚山梨酯80混合，可以增加美洲一枝黃花得水溶性和分散性，增加對于胃腸道黏膜得通透性，即可改善美洲一枝黃花的口服吸收，實(shí)驗(yàn)證明所用的輔料不與藥物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，不影響藥物的測定及藥理活性，所得制劑性質(zhì)穩(wěn)定，對機(jī)體無毒無刺激性，口服生物利用度顯著提高。
實(shí)施例9、美洲一枝黃花顆粒劑的具體制備方法選取美洲一枝黃花10kg，在50℃回流攪拌條件下使之溶于10倍的乙醇中，反應(yīng)2h，回收乙醇，蒸干，50℃真空干燥10h得到美洲一枝黃花提取物，研磨過120目篩，取150g的提取物與600g的微粉硅膠、1500g的乳糖和600g的淀粉混勻，再取50％的乙醇1000g和180g的聚山梨酯80(分子量是1200.8)混勻后加入上述混合物中，混勻。然后用75％的糖漿200g做粘合劑制得軟材，過30目篩，50℃干燥5h，過20目篩整粒，加入3g滑石粉，制得美洲一枝黃花顆粒劑。
實(shí)施例10、美洲一枝黃花片的具體制備方法選取美洲一枝黃花10kg置于5倍量的80％的乙醇中，在70℃條件下，攪拌3h，使之成為溶液，將溶劑回收，所余固體真空干燥，得到美洲一枝黃花提取物。將上述提取物過100目篩，取150g的提取物與600g的微粉硅膠、1500g的乳糖和600g的淀粉混勻，再取50％的乙醇1000g和180g的聚山梨酯80(分子量是1200.8)混勻后加入上述混合物中，混勻。然后用70％的糖漿200g做粘合劑制得軟材，過30目篩，50℃干燥5h，過50目篩整粒，加入5g滑石粉，將顆粒經(jīng)壓片機(jī)制成片劑。
實(shí)施例11、美洲一枝黃花膠囊的具體制備方法選取美洲一枝黃花8kg置于4倍量的70％的乙醇中，在60℃條件下，攪拌2h，使之成為溶液，將溶劑回收，所余固體真空干燥，得到美洲一枝黃花提取物。將上述提取物過150目篩，取250g的提取物與1000g的微粉硅膠、1000g的乳糖和1000g的淀粉混勻，再取70％的乙醇1500g和200g的聚山梨酯80(分子量是1200.8)混勻后加入上述混合物中，混勻。然后用70％的糖漿100g做粘合劑制得軟材，過60目篩，60℃干燥5h，過60目篩整粒，加入5g滑石粉，將顆粒制成膠囊。
實(shí)施例12、美洲一枝黃花軟膠囊劑的具體制備方法選取美洲一枝黃花15kg置于5倍量的80％的乙醇中，在60℃條件下，攪拌3h，使之成為溶液，將溶劑回收，所余固體真空干燥，得到美洲一枝黃花提取物。將提取物研磨過100目篩，取100g的提取物，向其中加入乳糖200g聚山梨酯80，200g的PEG 400，50g的1，2-丙二醇和10g水得到混合液，研磨60min。使得全部過100目篩，靜置過夜；將藥液置于軋囊機(jī)得貯液槽中，保溫40℃壓囊，壓囊用明膠漿500g，明膠漿為明膠∶甘油∶水＝1∶0.5∶1，冷風(fēng)干燥24小時(shí)，無水乙醇洗滌，干燥，選粒即得美洲一枝黃花軟膠囊。
權(quán)利要求
1.美洲一枝黃花總黃酮提取物，其特征在于，該總黃酮提取物的總黃酮的含量為55％～90％(重量百分比)，是包括槲皮素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚、山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷和綠原酸中的至少兩種，以及其他成分的總提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的美洲一枝黃花總黃酮提取物，其特征在于，所述的該總黃酮提取物的總黃酮的含量為55％～70％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的美洲一枝黃花總黃酮提取物，其特征在于，所述的該總黃酮提取物中的槲皮素的含量為10％～40％。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的美洲一枝黃花總黃酮提取物，其特征在于，所述的含有的槲皮素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚、山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷和綠原酸的重量比為10～50∶2～28∶1～17∶2～24∶0.5～13。
5.根據(jù)權(quán)利要求1～4任一項(xiàng)所述的美洲一枝黃花總黃酮提取物的制備方法，其特征在于，該方法包括如下步驟提取步驟(1)藥材用含水乙醇提?。?2)減壓濃縮步驟所得提取液；(3)以水稀釋濃縮液，并作澄清處理，取上清液；分離步驟(4)取上清液，過大孔樹脂柱吸附，棄流出液；然后用水洗滌所述吸附柱，棄水洗液；之后，采用乙醇洗脫吸附柱并收集該乙醇洗脫液；(5)濃縮、干燥乙醇洗脫液，得到美洲一枝黃花總黃酮提取物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的美洲一枝黃花總黃酮提取物的制備方法，其特征在于，所述的提取方法是包括溶劑提取法在內(nèi)的本領(lǐng)域公知的所有可以使用的方法。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的美洲一枝黃花總黃酮提取物的制備方法，其特征在于，所述的提取方法是溶劑提取法。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的美洲一枝黃花總黃酮提取物的制備方法，其特征在于，所述的溶劑提取法是包括常用的熱回流提取、連續(xù)逆流提取、超聲提取法、浸漬提取法、滲漉提取法、煎煮提取法或連續(xù)回流提取法中的一種或多種；提取次數(shù)是一次或多次。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的美洲一枝黃花總黃酮提取物的制備方法，其特征在于，所述的溶劑提取法是包括超聲提取法、滲漉提取法、連續(xù)逆流提取或加熱回流提取法中的一種；提取次數(shù)是多次。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的美洲一枝黃花總黃酮提取物的制備方法，其特征在于，所述的溶劑提取法是加熱回流提取法；提取次數(shù)是多次。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的美洲一枝黃花總黃酮提取物的制備方法，其特征在于，所述的加熱回流提取法所使用的提取溶劑是包括常見的水試劑、親水性的有機(jī)溶劑或親脂性的有機(jī)溶劑三類提取溶劑中的一種或多種。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的美洲一枝黃花總黃酮提取物的制備方法，其特征在于，所述的水試劑是包括水、酸水或堿水中的一種；所述的親水性的有機(jī)溶劑是包括乙醇、乙醇水溶液或甲醇中的一種或多種；所述的親脂性的有機(jī)溶劑是包括石油醚、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷或二氯乙烷中的一種或多種。
13.美洲一枝黃花總黃酮提取物在制備抗氧化產(chǎn)品、抗炎產(chǎn)品、抗腫瘤產(chǎn)品中的應(yīng)用。
14.美洲一枝黃花總黃酮提取物的組合物在制備抗氧化產(chǎn)品、抗炎產(chǎn)品、抗腫瘤產(chǎn)品中的應(yīng)用。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的美洲一枝黃花總黃酮提取物的應(yīng)用，其特征在于，所述的抗氧化產(chǎn)品是指用于預(yù)防、診斷、檢測、保護(hù)、治療和研究因過氧化引起的疾病的起因、早期發(fā)生發(fā)展，或后期的發(fā)病，以及過氧化引起的相關(guān)疾病的產(chǎn)品中的一種或多種；所述的抗炎產(chǎn)品是指用于預(yù)防、診斷、檢測、保護(hù)、治療和研究各種炎癥的產(chǎn)品中的一種或多種；所述的抗腫瘤產(chǎn)品是指用于預(yù)防、診斷、檢測、保護(hù)、治療和研究各種腫瘤的產(chǎn)品中的一種或多種。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的美洲一枝黃花總黃酮提取物的應(yīng)用，其特征在于，所述的抗氧化產(chǎn)品、抗炎產(chǎn)品、抗腫瘤產(chǎn)品是包括藥物、試劑、食品或飲料中的一種或多種。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的美洲一枝黃花總黃酮提取物的應(yīng)用，其特征在于，所述的所述的抗氧化產(chǎn)品是指用于預(yù)防、診斷、檢測、保護(hù)、治療和研究因過氧化引起的老年性疾病及其相關(guān)疾病的起因、早期發(fā)生發(fā)展，或后期的發(fā)病的產(chǎn)品中的一種或多種；所述的抗炎產(chǎn)品是指用于預(yù)防、診斷、檢測、保護(hù)、治療和研究咽喉炎的產(chǎn)品中的一種或多種；所述的抗腫瘤產(chǎn)品是指用于預(yù)防、診斷、檢測、保護(hù)、治療和研究食管癌的產(chǎn)品中的一種或多種。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的美洲一枝黃花總黃酮提取物的應(yīng)用，其特征在于，所述的所述的抗氧化產(chǎn)品是指用于預(yù)防、診斷、檢測、保護(hù)、治療和研究因過氧化引起的阿爾茨海默癥、多重梗塞型癡呆、酒精性癡呆和正常腦壓水腦癥及其相關(guān)疾病的起因、早期發(fā)生發(fā)展，或后期的發(fā)病的產(chǎn)品中的一種或多種。
全文摘要
本發(fā)明涉及美洲一枝黃花總黃酮提取物及其制備方法和用途。美洲一枝黃花總黃酮提取物的總黃酮主要包括槲皮素、槲皮素－3－O－β－D－葡萄糖苷、山奈酚－3－O－α－L－鼠李糖苷和綠原酸等，能夠預(yù)防和/或治療老年癡呆，各種炎癥引起的呼吸道疾病如咽喉炎、氣管炎等，食道癌藥物等，而這些疾病已逐漸成為影響人口生活質(zhì)量的重要致病原因。該提取物的制備工藝簡單，提取效率高；該提取物藥理作用較強(qiáng)，性質(zhì)穩(wěn)定，安全低毒，質(zhì)量可控。美洲一枝黃花作為外來入侵性植物，已嚴(yán)重破壞中國的自然資源和生態(tài)環(huán)境，很多地方已把其作為一種雜草除掉，本發(fā)明能變廢為寶，為預(yù)防、診斷、檢測、保護(hù)、治療和研究這些疾病及其相關(guān)疾病提供了一種新的藥物來源。
文檔編號C07D311/30GK1899341SQ20061002947
公開日2007年1月24日 申請日期2006年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月27日
發(fā)明者鄭榕, 秦路平, 徐磊 申請人:上海林賽嬌生物科技發(fā)展有限公司