專利名稱：使用季銨雜環(huán)活化劑合成亞磷酸酯化化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用特定的活化劑制備亞磷酸酯化化合物方法，尤 其是涉及亞磷酰胺的合成。
背景技術(shù)：
低聚核苷酸在生命科學中是重要的化合物并在各種領(lǐng)域具有重
要作用。它們例如在基因表達分析領(lǐng)域中用作探針，在PCR或DNA 測序中用作前體。
此外，還有許多潛在的治療應(yīng)用，即包括反義低聚核苷酸。
許多化學改性已引入低聚核苷酸中以增加它們在診斷中作為研 究試劑和治療劑如穩(wěn)定核酸酶的有效性。
使用溶液相和固相方法均可完成低聚核苷酸的合成。目前優(yōu)選 的方法是經(jīng)由在固體載體上制備低聚核苷酸并通過依次加入核苷 酸使低聚核苷酸生長的固相合成。
應(yīng)用的增加需要更大量的低聚核苷酸；因此，正需要開發(fā)改進 的合成方法。
對于一般性綜述，例如參見"Antisense-From Technology to Therapy" Blackwell Science (Oxford, 1997)。
在低聚核苷酸的合成中主要結(jié)構(gòu)單元類型為亞磷酰胺；例如參 見S.L. Beaucage， M. H. Caruttiers， Tetrahedron Letters 1859 (1981) 22。核苷、脫氧核糖核普和兩者衍生物的這些亞磷酰胺均可市購。在 通常的固相合成中，使用3，-0-亞磷酰胺，但在其它合成工藝中也使用 5，-0-和2，-0-亞磷酰胺。在這些核香的亞磷酰胺的制備中， 一個步驟 為使(保護的)核苷亞磷酸酯化。最通常的是將存在于核苷中的羥基和 氨基以及其它官能團在亞磷酸酯化剩余的3，-、 5，-或2，-0羥基之前保 護起來。已知一些制備單體(核普)和聚合(核苷酸或低聚核普酸)亞磷酰 胺的路線。已知方法非常經(jīng)常地導致化學或安全性的問題。對于將這 些化學品用于較大批量的合成(100kg-1000kg)，必須改進成M效性。
在傳統(tǒng)上，核苷的亞磷酸酯化通過用如下亞磷酸酯化試劑處理保
護的核苷而進行例如非常易反應(yīng)的且不需要活化劑的氯-(2-H基乙氧 基)-N,N-二異丙基絲膦或需要活化劑的2-総乙基-N，N，N，,N，-四異 丙基亞磷酰二胺(2畫cyanoethyl-N,N，N，，N，-tetraisopropylphosphoro國 diamidite)(雙磷(bis-phos) i^雙酰胺化物(bis國amidite)試劑)。
常用于亞磷酸酯化反應(yīng)的活化劑為1H-四唑。
尤其是在進行較大,的合成時，使用lH-四唑具有內(nèi)在問題。 例如，已知1H-四唑是爆炸性的和有毒的。根據(jù)材料安全數(shù)據(jù)表 (MSDS)，如果吸入、攝取或通過皮膚吸收lH-四唑(lH-四唑，98%) 可能^1有害的。
此外，1H-四唑是昂貴的。尤其是在大^*^成中，其對于低聚核 苷酸的合成成本具有顯著影響。
MSDS還聲明如果將1H-四唑加熱超過其熔融溫度155'C,則其可 能爆炸并會形成非常敏感的爆炸性金屬化合物。在容器中大^^合成 的情況下，lH-四喳對人類和環(huán)境會有很大危害。
此外，已知1H-四唑在其儲存、使用和處理過程中需要特別的處理。
1H-四唑和相關(guān)的衍生物如5-乙^^代-lH-四唑、5-千1^1代-111-四唑可能會使目標分子分解。因此，酸敏感的保護基團的離解在不同 的出版物(Krotz等，Tetrahedron Letters, 1997， 38， 3875)中有報道。
還已知使用氯-(2-氰基乙ltJ0-N，N-二異丙基氨基膦使酸不穩(wěn)定的 保護基團不經(jīng)意地脫保護。除易于使所用保護基團離解外，所述亞磷 酸酯化試劑會導致較大量的3，-3，異構(gòu)體。這導致必須通過時間和成本 密集的層析步驟來提純所得酰胺化物(amidite)。
尤其是在低聚亞磷酰胺的亞磷酸酯化的應(yīng)用中，已知方法通常導 致分解或目標分子和副產(chǎn)物的^混合物。
使用具有某些活化劑的雙磷對單體核苷酰胺化物通常是已知的， 但在低聚核苷酸的情況下，低反應(yīng)性使得該途徑非常復(fù)雜。
寸^Jl應(yīng)性還導致長反應(yīng)時間(2-6小時)。避免長反應(yīng)時間會需JH吏 用大量過量的亞磷酸酯化試劑和活化劑。在這種反應(yīng)結(jié)束時，還需要
額外的提純步驟來處理。
EP 0 906 917 A2和Hayakawa等，J. Am. Chem. Soc. 120 (1998) 12395-12401公開了將咪唑錯三氟甲磺酸鹽用于合成亞磷酰胺。所述合 成的產(chǎn)率和純度不能重現(xiàn)。
此外，Hayakawa方法通過使用單獨制備、分離和提純的活化劑 而應(yīng)用。在提純對水敏感的活化劑時，需要將這種活化劑在完全干燥 的*下儲存。
這種活化劑的敏感性和低反應(yīng)性將導致復(fù)雜的處理，這對于大規(guī) 模合成酖胺化物是有困難的。
在使用Hayakawa活化劑的所有試驗中，必須通過成本密集的層 析步驟提純所得酰胺化物。
然而，在所有情況下，亞磷酸酯化>^應(yīng)的結(jié)果是不完全且低效率 的，因此總是非常需要提純步驟。
敏感的低聚核苷酸的亞磷酸酯化大多數(shù)最終分解。
所述合成的產(chǎn)率和純度不能重現(xiàn)，因為所用咪唑錯三氟甲磺酸鹽 具有高的親核特征和高的吸水傾向。這些特性會最終導致大量分解和 7jc解。將所述活化劑分離并以其純的形式使用。
所述合成酰胺化物的方法需要快速層析以提純目標化合物。
此外，Hayakawa使用用于形成核苷酸分子間鍵(酖胺化物與核苷 縮合)的化合物。
Hayakawa等，J. Org. Chem. 61 (1996) 7996-7997公開了將苯并 咪喳錯三氟曱磺酸鹽用于亞磷酰胺和核苷的縮合。
Hayakawa等，J. Am. Chem. Soc. 123 (2001) 8165-8176公開了將 ^/唑#物用于亞磷酰胺和核苦的縮合。
Arnold等，Collect. Czech. Chem. Commun. 54 (1989) 523-532 乂> 開了低聚脫氧核普酸的自動氯化物(chloridite)和酰胺化物合成，尤其 是將l-甲基咪唑用于亞磷酰胺和核苷的縮合。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種制備亞磷酸酯化化合物并克服至少一
些現(xiàn)有技術(shù)缺點的方法。
本發(fā)明的另 一 目的是提供與現(xiàn)有技術(shù)的活化劑相比具有改進性 能的活化劑。
本發(fā)明的另 一 目的是提供與現(xiàn)有技術(shù)的活化劑相比具有改進性 能的活化劑/添加劑混合物。 一方面，本發(fā)明提供了一種包括如下步
驟的制備亞磷酸酯化化合物的方法
-使含有羥基的化合物與亞磷酸酯化試劑在具有式I的活化劑存在 下反應(yīng)
其中
R=烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基、雜烷基、雜芳基 Ri、 R2= H或者一起形成5到6元環(huán) Xp X尸獨立地為N或CH
Y-H或Si(R4)3，其中Rr烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基、雜烷基、雜 芳基
B-脫質(zhì)子酸。
活化劑可以采用化學計量或催化量(3-50摩爾％，優(yōu)選10-30摩 爾％)或過量(至多300摩爾％)的量。
在優(yōu)選實施方案中，活化劑具有選自如下的式 <formula>formula see original document page 10</formula>其中
Y如上所定義 R為甲基、苯基或芐基。
這些活化劑的制備例如描述于Hayakawa等，J. Am. Chem. Soc. 123(2001)8165-8176中。
在一個實施方案中，活化劑與添加劑組合使用。添加劑可選自非 質(zhì)子化形式的具有式I的化合物和其它雜環(huán)堿如吡啶。活化劑和添加 劑之間的合適比例為1:1到1:10。
在一個優(yōu)選實施方案中，活化劑可按"原位，，工藝制備。此時不分 離活化劑，這導致改進的反應(yīng)結(jié)果。抑制了目標分子的水解或分解。
對于在低聚核苷酸(二、三、四、五、六、七和八聚物)的3，-和/或 5，-位的高產(chǎn)率亞磷酸酯化，優(yōu)選原位制備活化劑和與添加劑的組合。
如上所述，亞磷酸酯化尤其可用于合成低聚核苷酸和亞磷酰胺結(jié) 構(gòu)單元。因此，在優(yōu)選實施方案中，含羥基化合物包含糖結(jié)構(gòu)部分如 核苷或由其衍生的低聚物。這類核普例如為任選地包含保護基團的腺 苷、胞嘧啶、鳥苷和尿嘧咬、脫氧腺普、脫氧鳥苷、脫氧胸苷、脫氧 胞嘧咬及其衍生物。
本發(fā)明方法尤其可用于佳/f氐聚核苷酸(二、三、四、五、六、七和 八聚物)亞磷酸酯化。這類亞磷酸酯化的低聚核苷酸例如用于通過片段 縮合(fragment condensation)思想合成大的4氐l^核香酸。
通常將它們在其雜環(huán)官能團和除了應(yīng)亞磷酸酯化的羥基外的帶有
羥基的基團處進行合適的保護。通常將二甲氧基三苯甲基、 一甲氧基
三苯甲基或含有甲硅烷基的保護基團(如TBDMS)用作5，-OH基團的 保護基團，并使3，-OH基團亞磷酸酯化。
還可以用保護基團(LEV、TBDMS等)將3'-OH基團保護起來并且 脫保護的5，-OH使得核苷或核普酸可以5，-0-亞磷酸酯化。
亞磷酸酯化的方法可用于合成3，-或5，-亞磷酰胺并具有相同的結(jié)果。
亞磷酸酯化反應(yīng)得到的目標分子為亞磷酖胺的一個實施方案且具 有如下結(jié)構(gòu)
化合物
Z表示離去基團如CH3 、 C2H5 、 CH2C6H5 、 -CH2CH2CN 、 -CH2CH=CHCH2CN、對-CH2C6H4CH2CN 、 -(CH2)2_5N(H)COCF3 、 -CH2CH2Si(C6H5)2CH3或-CH2CH2N(CH3)COCF3，其中R3為具有1 至約6個碳的烷基；或R3為含有4-7個原子且具有至多3個選自氮、 硫和氧的雜原子的雜環(huán)烷基或雜環(huán)烯基環(huán)，"化合物"為含羥基化合物 的剩余部分，如核苷、核苷酸或低聚核苷酸。
此時P(III)原子與2個氧原子(或形成2個P-O鍵)和1個氮原子 (形成一個P-N鍵)連接，其中所述氮原子屬于氨基，優(yōu)選二異丙基 胺，二乙基胺或其它仲胺。
亞磷酰胺與其它分子(化合物A)的其它羥基的縮合反應(yīng)將產(chǎn)生 具有如下結(jié)構(gòu)的亞磷酸三酯
ZZ 、Z 、化合物A
化合物
此時P(III)原子與3個氧原子(形成3個P-O鍵)連接且沒有與氮 連接。
通常而言，亞磷酸酯化試劑可與使用lH-四唑的亞磷酸酯化反 應(yīng)中的相同。
在優(yōu)選實施方案中，其具有下式
R2
其中，Z表示離去基團如CH3、 C2H5、 CH2C6H5、 -CH2CH2CN、 -CH2CH=CHCH2CN、對-CH2C6H4CH2CN 、 -(CH2)2_5N(H)COCF3 、 誦CH2CH2Si(C6Hs)2CH3或國CH2CH2N(CH3)COCF3， 和R2獨立地為 仲氨基N(R3)2，其中R3為具有1至約6個碳的n;或R3為含有4-7 個原子且具有至多3個選自氮、石克和氧的雜原子的雜環(huán)烷基或雜環(huán)烯 基環(huán)。
典型的亞磷酸酯化試劑為2-氰基乙基-N，N，N，，N，-四異丙基亞磷 酰二胺。
其它優(yōu)選的亞磷酸酯化試劑為作為參考引入的N. Ok等，J. Am. Chem.Soc.2003， 125， 8307-8317中所述的嗜、唑膦烷(oxazaphospholi國 dine)衍生物。所述亞磷酸酯化試劑使得可以合成低聚核苷酸，其中核 苷酸分子間鍵可以通過立體選擇性方式轉(zhuǎn)化為硫代磷酸酯 (phosphothioate)。這種非對映異構(gòu)選擇合成的核普酸硫代磷酸酯分子 間鍵對于硫代磷酸酯用作反義藥物具有有利的影響。
合適的脫質(zhì)子酸B—的實例為三氟甲磺酸根、三氟乙酸根、二氯 乙酸根、曱磺酰基、曱1pt?；⑧徛确与x子。優(yōu)選pKa低于4.5 的酸。優(yōu)選它們具有低的親核性。
在一個實施方案中，反應(yīng)在分子篩或其它結(jié)合水的試劑存在下 進行。通常在反應(yīng)過程中應(yīng)排除水或者通過所選干燥介質(zhì)將水固 定。
或者，可將本發(fā)明活化劑與亞磷酸酯化試劑組合，隨后加入羥 基組分。也可以將活化劑與含羥基化合物組合，隨后加入亞磷酸酯 化試劑。
在使用添加劑的情況下，將活化劑與羥基組分在加入亞磷酸酯 化試劑之前混合。
對于"原位，，產(chǎn)生活化劑，優(yōu)選將所選酸在加入添加劑之后在可 控的反應(yīng)溫度下加入。
亞磷酸酯化試劑可在加入所選酸之前或之后加入。
相對于酸和亞磷酸酯化試劑的加入，核苷組分可在結(jié)束或開始 時加入。
在優(yōu)選的實施方案中，將活化劑對應(yīng)的堿、含羥基化合物和亞 磷酸酯化試劑組合并且加入酸開始反應(yīng)。
本發(fā)明的另一目的為具有式I的活化劑在用亞磷酸酯化試劑使 含羥基化合物亞磷酸酯化中作為活化劑的用途
其中
R=烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基、雜烷基、雜芳基 Rp R尸H或者一起形成5到6元環(huán) Xp X尸獨立地為N或CH
Y-H或Si(R4)3，其中Rr烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基、雜烷基、雜
1
芳基
8=脫質(zhì)子酸。
本發(fā)明的另一目的為活化劑和非質(zhì)子化堿(添加劑)的組合，其 中在這兩種物質(zhì)之間將會形成平衡。與現(xiàn)有技術(shù)的活化劑相比，所 得平衡顯示改進的性能。
尤其是與丙酮結(jié)合使用時，活化劑/催化劑不會顯示已知的副反 應(yīng)(分解或形成3，-3，或5，-5，同系物)。丙酮還具有溶解離析物和試劑 的能力。
根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，在較長反應(yīng)時間的情況下，釋放的二異丙基胺 以及存在活化的雙磷導致目標化合物分解(脫三苯甲基、CE-離解、 脫嘌呤或其它保護基團的離解)。丙酮和特定的活化劑制劑的存在降 低了這些傾向。
存在的丙酮猝滅了在亞磷酸酯化工藝中釋放的任何量的二異丙 基胺(DIPA)的活性。這可用于較短和較長的低聚核苷酸的亞磷酸酯 化且具有類似的結(jié)果(沒有分解)。也可使用其它具有式 Rx-C(-O)-Ry(其中Rx和Ry獨立地為d-C6烷基或一起形成環(huán)MJ0的 酮化合物，只要它們能夠在例如a-位具有CH2-基團的胺存在下形成烯 醇化物。
此外，使用丙酮允許較長的反應(yīng)時間而沒有5，-0保護基團的離解。 在兩種情況下，使用丙酮會保護不同的保護基團并避免已知的脫噪呤 傾向。
與例如乙腈相比，丙酮還具有較好的毒性特性和改進的環(huán)境性 能且廉價。
因此，另一目的為丙酮在亞磷酰胺的合成中作為反應(yīng)介質(zhì)或共 溶劑的用途。
活化劑與一定量的添加劑的組合支持了較長且敏感的低聚核苷 酸(3，或5，脫保護)的亞磷酸酯化工藝的較高有效性。
通常，試劑的反應(yīng)性增加到在2-5分鐘后結(jié)束合成。 通過使用本發(fā)明方法不需要額外的提純步驟。 所得單體和低聚酰胺化物可用于低聚核苷酸的固相和液相合
成。
活化劑或活化劑/添加劑組合尤其可用于合成腺苷亞磷酰胺、胞 嘧啶亞磷酰胺、鳥普亞磷酰胺和尿嘧啶亞磷酰胺、脫氧腺苷亞磷酰胺、 脫氧鳥苷亞磷酰胺、脫氧胸苷亞磷酰胺、脫氧胞嘧啶亞磷酰胺以及具
有式Xn的低聚核苷酸^J^磷酸酯，其中每個X選自A、 dA、 C、 dC、 G、 dG、 U、 dTJLn=2-30，優(yōu)選2-12，更優(yōu)選2-8或2-6，及其包含 保護基團的衍生物。
此處使用的低聚核苷酸還包括呈RNA和DNA形式的低聚核苷、 低聚核苷酸類似物、改性的低聚核苷酸、核苷酸類似物等。通常而言， 這些化合物包含鍵接的單體亞單元骨架，其中各鍵接的單體亞單元與 雜環(huán)堿結(jié)構(gòu)部分直接或間接連接。連接單體亞單元、單體亞單元和雜 環(huán)堿結(jié)構(gòu)部分的鍵的結(jié)構(gòu)可以不同，從而產(chǎn)生多種獲得所述合成化合
物的動因。
在本領(lǐng)域中已知的改性為雜環(huán)堿、糖或連接單體亞單元的鍵的改 性。核苷酸分子間鍵的變型例如描述于作為參考引入的WO 2004/011474中，從第ll頁的底部開始。
典型的衍生物為硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、膦酸甲酯和膦^)^ 基酯以及二氧磷基丙酮(phosphonoaceto )衍生物。
其它典型的改性位于糖結(jié)構(gòu)部分?；蛘咄ㄟ^不同的糖取代核糖或 者一個或多個位置被其它基團如F、 O-烷基、S-烷基、N-烷基取代。 優(yōu)選實施方案為2'-甲基和2'-曱氧基乙氡基。所有這些改性均在W 域已知。
對于雜環(huán)堿結(jié)構(gòu)單元，存在許多在本領(lǐng)域中使用的其它合成堿， 如5-甲基-胞嘧啶、5-羥基-甲基-胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-llJ^ 腺噪呤、腺噪呤和鳥噤呤的6-或2-烷基衍生物、2-石iL^嘧咬。這類改 性例如公開于WO 2004/011474中，從第21頁開始。
當用于合成時，這些堿通常具有保護基團，如N-6-節(jié)基腺噤呤、 N-4-千基胞嘧咬或N-2-異丁醃基鳥噪呤。通常而言，所有不#進一 步的反應(yīng)中反應(yīng)的反應(yīng)性基團，尤其是糖的羥基均應(yīng)保護。
在涉及合成低聚核苷酸亞磷酰胺的實施方案中，可用于在丙酮或 其它酮如丙酮、丁酮、戊酮、己酮、環(huán)己酮存在下進行反應(yīng)，所述酮
可用作反應(yīng)介質(zhì)或其它溶劑的共溶劑。
具體實施例方式
本發(fā)明通過如下非限制性實施例進一步說明。 實施例1
使用曱基-咪唑镥-三氟乙酸鹽合成5，-0-DMTr-T-3，-0-亞磷酰胺
將5.0 g 5，誦0畫DMTr國T-3，-OH (9.2mmo1， 1.0當量)和2.34g甲基國 咪唑錄-三氟乙酸鹽(11.9mmo1， 1.3當量)溶于100 ml 二氯甲烷中并 加入3 g分子篩3A并將混合物攪拌10分鐘。加入3.8ml 2-M乙基 N,N，N'，N，-四異丙基亞磷酰二胺(11.9mmo1, 1.3當量)。>^在2小時 之后完成。產(chǎn)率(通過HPLC測定)95%。
實施例2
使用節(jié)基-咪哇錯-三氟乙酸鹽合成5，-0-DMTr-dGiBu-3，-0-亞磷酰
胺
將322mg甲基-咪哇錯-三氟乙酸鹽(1.64mmo1， 1.05當量)和1.0g 5，-0-DMTr-dGiBu-3，-OH(1.56mmol， 1.0當量)溶于10ml二氯曱烷中并 加入500mg分子篩3A。 30分鐘后，將0.52ml 2-^RJ^乙基N,N，N'，N'國 四異丙基亞磷酰二胺(1.64mmo1， 1.05當量)和O.lml丙酮加入到攪拌 的溶液中。反應(yīng)在30分鐘之后完成。產(chǎn)率(通過HPLC測定)74%。
實施例3
使用甲基-咪唑镥-三氟乙酸鹽合成5，-0-DMTr-dC氣3，-0-亞磷酰
胺
將9.51 g 5，-0-DMTr-dCBz-3，-OH (15mmol， 1.0當量)溶于80 ml 丙酮和80ml乙腈中。將6.17g甲基-咪唑錯-三氟乙酸鹽(32mmo1, 2.1當量)和9.64 g 2-氰基乙基N，N,N'，N'-四異丙基亞磷酰二胺 (32mmo1， 2.1當量)加入到攪拌的溶液中。反應(yīng)在30分鐘之后完成。 加入500 ml乙酸乙酯，用250 ml NaHC03溶液和250 ml鹽水萃取該 溶液兩次。用MgS04干燥有機層并蒸發(fā)至干燥。將殘留物溶解在40 ml 二氯甲烷中，加入250ml戊烷，將上層清液潷析，并將殘留物在減壓 下干燥形成無色泡沫。產(chǎn)率(12.0 g， 14.4mmol): 96%，純度(通過HPLC 測定)93%。
實施例4
使用爺基-咪唑錯-三氟乙酸鹽合成5，-0-DMTr-dABz-3，-0-亞磷酰
胺
38 mg千基-咪唑錄-三氟乙酸鹽(0.14mmol， 1.5當量)溶于5 ml 乙腈中并加入300mg分子篩3A。加入145^12-1^乙基N,N，N，，N，-四異丙基亞磷酰二胺(0.46mmo1， 5.0當量)。30分鐘后加入61 mg 5，-0-DMTr-dABz-3，-OH (0.09mmol， 1.0當量)，將溶液攪拌過夜。反 應(yīng)在17小時之后完成。產(chǎn)率(通過HPLC測定)91%。
實施例5
使用催化量的曱基-咪唑錄-三氟乙酸鹽合成 5，-0-DMTr-dCBz-3,-0-亞磷酖胺
將500 mg 5，-0-DMTr-dCBz-3，-OH (0.79mmo1,1.0當量)溶于18 ml 二氯甲垸和lmlDMF中，加入3g分子篩3A。將50mg曱基-咪唑錄-三氟乙酸鹽(0.17mmo1， 0.2當量)和276 pl 2-H^乙基N,N，N'，N，-四 異丙基亞磷酖二胺(0.87mmo1， 1.1當量)加入到攪拌的溶液中。M 在24小時之后完成。產(chǎn)率(通過HPLC測定)89%。
實施例6
使用催化量的芐基-咪唑餚-三氟乙酸鹽合成 5，-0-DMTr-dGiBu-3，-0-亞磷酰胺
將5 mg節(jié)基-咪唑錄-三氟乙酸鹽(0.02mmo1， 0.2當量)溶于5 ml乙腈中并加入300mg分子篩3A。將145 pl 2-ll&乙基N,N，N'，N'-四異丙基亞磷酰二胺(0.46mmo1， 5.0當量)加入到攪拌的溶液中。1 小時后加入60mg5，-O-DMTr-dGiBu-3，-OH(0.09mmo1, 1.0當量)，將 溶液攪拌過夜。反應(yīng)在48小時之后完成。產(chǎn)率(通過HPLC測定)90%。
實施例7
使用催化量的節(jié)基-咪唑錯-三氟乙酸鹽合成5，-0-DMTr-T-3，-0-亞磷酰胺
將50mg爺基-咪唑镥-三氟乙酸鹽(0.18mmol，0.18當量)和500 mg5，-O-DMTr-T-3，-OH(0.92mmo1, 1.0當量)溶于28 ml 二氯甲烷中 并加入3 g分子篩3A。將350 jil2-氰基乙基N，N，N',N，-四異丙基亞磷
酰二胺(l.Ommol， 1.1當量)加入到攪拌的溶液中。>^應(yīng)在25小時之 后完成。產(chǎn)率(通過HPLC測定)卯％。
實施例8
使用甲基-咪唑錯-三氟乙酸鹽合成 5，國0-DMTr國T-P(S)-dCBz-3，-0-亞褲酰胺
將100 mg 5，-0-DMTr-T-P(S)-dCBz-3，-OH (O.lOmmol， 1.0當量) 和24.4mg甲基-咪哇錯-三氟乙酸鹽(O.llmmol， 1.1當量)溶于10ml 二氯甲烷中，加入200 mg分子篩4A。將32 jil 2-氰基乙基N，N，N'，N'-四異丙基亞磷酖二胺(O.lOmmol， 1.0當量)加入到攪拌的溶液中。反 應(yīng)在24小時之后完成。產(chǎn)率(通過HPLC測定)60%。
實施例9
使用甲基-咪唑錯-三氟乙酸鹽合成 5，畫0-DMTr國dCBz畫P(S)國dG迅u誦3，國0-亞磷酰胺
將100 mg 5,-0-DMTr-dCBz-P(S)-dGiBu-3，-OH (0.09mmol， 1.0 當量)和17.8 mg甲基-咪唑錯-三氟乙酸鹽(0.09mmol， 1.0當量)溶于 10 ml 二氯甲烷中，加入200 mg分子篩4A。將28 pi 2-氰基乙基 N，N，N'，N，-四異丙基亞磷酰二胺(0.09mmol， 1.0當量)加入到攪拌的溶 液中。反應(yīng)在3小時之后完成。產(chǎn)率(通過HPLC測定)56%。
實施例10
使用甲基-咪唑錯-三氟乙酸鹽合成 5，國0畫DMTr誦dG迅u國P(0)-dG出U-3，畫0誦亞彿酰胺
將106 mg 5，-0-DMTr-dGiBu-P(0)-dGiBu-3，-OH (O.lOmmol， 1.0 當量)和30mg甲基-咪哇錄-三氟乙酸鹽(0.15mmol， 1.5當量)溶于10 ml丙酮中，加入500 mg分子篩3A。在30分鐘之后將34 pi 2-H^ 乙基N,N,N，，N'-四異丙基亞磷酰二胺(O.llmmol， 1.1當量)加入到攪 拌的溶液中。反應(yīng)在4小時之后完成。產(chǎn)率(通過HPLC測定)55%。
實施例11
使用曱基-咪唑錄-三氟乙酸鹽合成 5，-0-DMTr-T-P(S)-dCBz-P(S)-T-P(S)-dCBz-P(S)-dCBz-P(S)-dCBz-3,-0-亞磷酰胺
將10 mg 5，-0-DMTr-T-P(S)-dCBz-P(S)-T-P(S)-dCBz-P(S)-dCBz-P(S)-dCBz-3，-OH (3.6 jnmol， 1.0當量)和1.4 mg甲基-咪唑錯-三氟乙酸 鹽(7.2 pmol， 2.0當量)溶于0.5 ml丙酮和0.5 ml乙腈中，加入50 mg 分子篩3A。在30分鐘之后將5.8 pl2-ll基乙基N,N，N',N，-四異丙基 亞磷酰二胺(18.1 pmol， 5.0當量)加入到攪拌的溶液中。反應(yīng)在5小 時之后完成。產(chǎn)率(通過HPLC測定)71%。
實施例12
經(jīng)由原位產(chǎn)生N-甲基咪唑錯三氟乙酸鹽合成 5，-0誦DMTr畫dT國3，國0誦亞磷酰胺
將1.00 g 5，-0國DMTr-dT畫3，-OH (1.84mmo1， 1.0當量)溶于2 mL 二氯曱烷和2mL丙酮中。加入300 mg N-曱基咪唑(3.68mmo1， 291 pL， 2.0當量)和665 mg 2-^J^乙基-N，N，N，，N，-四異丙基亞磷酰二胺 (2.21mmo1， 700 ^L， 1.2當量)，之后加入1.00 g分子篩3A。向所述 攪拌的懸浮液中，滴加在lmL 二氯曱烷中的230 mg三氟乙酸 (2.02mmo1， 159 pL， 1.1當量)。反應(yīng)在3小時之后完成。產(chǎn)率(通過 HPLC測定)99%。
實施例13
經(jīng)由原位產(chǎn)生N-曱基咪唑錄三氟乙酸鹽合成 5，-0-DMTr-dG迅U-3，-0-亞褲酰胺
將1.00 g 5，-0-DMTr-dGiBu-3，-OH (1.56mmol， 1.0當量)溶于2 mL 二氯甲烷和2mL丙酮中。加入255 mgN國曱基咪唑(3.11mmol， 247 pL， 2.0當量)和563 mg 2-fl^乙基-N，N，N，，N，-四異丙基亞磷酰二 胺(1.87mmo1, 593 ^L， 1.2當量)，1^加入1.00 g分子篩3A。向所 述攪拌的懸浮液中，滴加在lmL 二氯甲烷中的195 mg三氟乙酸 (1.72mmo1， 135 jtL， 1.1當量)。反應(yīng)在5小時之后完成。產(chǎn)率(通過 HPLC測定)88%。
實施例14
使用N-曱基咪唑鏘三氟乙酸鹽-N-甲基咪唑混合物合成 5，-0-DMTr-dGiBu-3，-0-亞磷酰胺
將1.00 g 5，-0-DMTr-dGiBu-3，-OH (1.56mmol， 1.0當量)溶于2 mL 二氯甲烷和2mL丙酮中。加入2.00g分子篩3A、 367 mgN-曱
基咪唑錯三氟乙酸鹽(1.87mmo1， 1.2當量)和383 mg N-甲基咪唑 (4.68mmol,371 jiL,3.0當量)，隨后加入563 mg 2國IL^乙基-N，N，N，，N，-四異丙基亞磷酰二胺(1.87mmo1， 593 jtL, 1.2當量)。反應(yīng)在20分鐘 之后完成。產(chǎn)率(通過HPLC測定)卯％。
實施例15
使用N-甲基咪唑錄三氟乙酸鹽-N-甲基咪唑混合物合成 5，誦0-DMTr畫dCBz誦3，-0-亞褲酖胺
將1.00 g 5，-0-DMTr-dGiBu-3，-OH (1.56mmol， 1.0當量)溶于2 mL 二氯甲烷和2mL丙酮中。加入2.00g分子篩3A、 367mgN-甲 基咪唑錯三氟乙酸鹽(1.87mmo1， 1.2當量)和383 mg N-甲基咪哇 (4.68mmol，371 |nL，3.0當量)，1^加入563 mg 2誦IL^乙基-N,N,N，，N，-四異丙基亞磷跣二胺(1.87mmo1， 593 jiL， 1.2當量)。反應(yīng)在20分鐘 之后完成。產(chǎn)率(通過HPLC測定)卯％。
實施例16
經(jīng)由原位產(chǎn)生甲基咪唑錄三氟乙酸鹽合成 5,隱0-DMTr-dCBz-P(0)-dABz-3，-0-亞磷酰胺
將100 mg 5，-0-DMTr-dCBz-P(0)-dABz-3，-OH (卯.7 pmol， 1.0 當量)溶于200 jtL 二氯甲烷和200 pL丙酮中。加入15 mg N-曱基咪 唑(180 pmol， 14 ^L, 2.0當量)和54.6 mg 2-H^乙基-N，N，N，，N，誦四 異丙基亞褲酰二胺(181 pmol, 57 pL， 2.0當量)，1^#加入100 mg分 子篩3A。向所述攪拌的懸浮液中滴加100 pL的1M三氟乙酸在二氯 曱烷中的溶液。反應(yīng)在30分鐘之后完成。產(chǎn)率(通過HPLC測定)90%。
實施例17
使用N-甲基咪唑錯三氟乙酸鹽合成5，-0-亞磷酰胺 -dT-P(0)-dGiBu-P(0)-dGiBu-3，-0-Lev
將2.0 g 5,-HO-dT-P(0)-dGiBu-P(0)-dGiBu-3，-0-Lev (1.6mmol， 1.0當量)溶于80 mL丙酮中，加入500 mg甲基咪喳錯三氟乙酸鹽 (2.5mmol， 1.56當量)和4.0 g分子篩3A。加入2.76 ml 2-H^乙基 -N,N,N，，N，-四異丙基亞磷酰二胺(2.62 g， 8.7mmol， 5當量)，在攪拌 30分鐘之后，通#入300 mL正庚烷使亞磷酰胺沉淀。產(chǎn)率(通過 HPLC測定)72%。
實施例18
使用N-甲基咪唑錄三氟乙酸鹽合成5，-0-亞磷酰胺 -dCBz-P(0)-dABz-3，-0-Lev
將1.0g5，國HO-dCBz-P(O)-dABz國3，國O-Lev(l.lmmo1， 1.0當量)和 326 mg曱基咪唑錯三氟乙酸鹽(1.66mmol, 1.5當量)溶于8 mL丙酮 和10mL 二氯甲烷中并加入2.0g分子篩3丄。加入700pL2-IL^乙 基畫N，N，N，，N，-四異丙基亞磷酰二胺(664 mg, 2.2mmol， 2當量)，并在 攪拌l小時之后，通過加入50mL正庚烷使亞磷酰胺沉淀。產(chǎn)率(通過 HPLC測定)78%。
實施例19
使用N-甲基咪唑錯三氟乙酸鹽合成5，-0-亞磷酰胺 -T-P(0)-dCBz-P(0)-dCBz-P(0)-dCBz-3,-0-Lev
將20 mg 5,-HO-T-P(0)-dCBz-P(0)-dCBz-P(0)-dCBz-3，-0-Lev (11.6 jimol, 1.0當量)和4.3 mg N誦甲基咪哇錨三氟乙酸鹽(22 pmol， 1.9當量)溶于2mL丙酮中并加入40mg分子篩3A。加入15pL2-^J^乙基-N，N，N，，N，-四異丙基亞磷酰二胺(14 mg, 47 pmol, 4當量)， 并在攪拌1小時之后，通過加入3mL正庚烷使亞磷酰胺沉淀。產(chǎn)率(通 過HPLC測定)86%。
實施例20
使用N-甲基咪唑錯三氟乙酸鹽合成5，-0-TBDPS-dT-3，-0-亞磷
酰胺
將510 mg 5，國0-DMTr-dT-3，-OH (1.06mmo1, 1.0當量)溶于 20mL丙酮中，在攪拌下加入251 N-甲基咪唑錄三氟乙酸鹽 (1.27mmo1， 1.2當量)，1.0 g分子篩3A和383 mg 2誦氰基乙基 畫N，N，N，，N，畫四異丙基亞磷酰二胺(403 jiL， 1.27mmo1， 1.2當量)。反 應(yīng)在30分鐘之后完成。產(chǎn)率(通過HPLC測定)88%。
實施例21
使用N-甲基咪唑镥三氟乙酸鹽合成5，-0-TBDMS-dGiBu-3，-0-亞磷酰胺
將1 mg 5，-0-TBDMS-dGiBu-3，-OH (2.21mmol， 1.0當量)溶于
20 mL丙酮中，在攪拌下加入875 N-甲基咪唑錯三氟乙酸鹽 (4.42mmol,2當量)、2力g分子篩3丄和3.33 g 2-|1^乙基國1^,1^,]\，，]\，-四異丙基亞褲酰二胺(3.5 mL， llmmol， 5當量)。反應(yīng)在30分鐘之 后完成。產(chǎn)率(通過HPLC測定)88%。
權(quán)利要求
1.一種制備亞磷酸酯化化合物的方法，所述方法包括如下步驟-使含有羥基的化合物與亞磷酸酯化試劑在具有式I的活化劑存在下反應(yīng)，式I其中，R＝烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基、雜烷基、雜芳基，R1、R2＝H或者一起形成5到6元環(huán)，X1、X2＝獨立地為N或CH，Y＝H或Si(R4)3，其中R4＝烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基、雜烷基、雜芳基，B＝脫質(zhì)子酸。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述活化劑具有選自如下的化學式<formula>formula see original document page 2</formula>其中，Y如權(quán)利要求l中所定義， R為甲基、苯基或芐基。
3. 權(quán)利要求1或2的方法，其中所述含羥基化合物包含糖結(jié)構(gòu) 部分。
4. 權(quán)利要求l-3中任一項的方法，其中所述含羥基化合物為核 苷或由其衍生的低聚物。
5. 權(quán)利要求l-4中任一項的方法，其中所述含羥基化合物為具 有3，-羥基的5，-0-保護的核苷或具有5，-羥基的3，-0-保護的核苷。
6. 權(quán)利要求l-5中任一項的方法，其中所述活化劑是原位制備 的且不經(jīng)提純而使用。
7. 權(quán)利要求1-6中任一項的方法，其中所述反應(yīng)在具有式I的 活化劑和相應(yīng)的具有式VIII的堿的混合物存在下進行式VIII:<formula>formula see original document page 3</formula>其中Rp R2、 Xp X2和R如權(quán)利要求1中所定義。
8. 權(quán)利要求7的方法，其中將所述相應(yīng)的堿與所述含羥基化合物和所述亞磷酸酯化試劑接觸，并加入酸eTb-。
9. 權(quán)利要求l-8中任一項的方法，其中所述亞磷酸酯化試劑具 有式II:<formula>formula see original document page 3</formula>其中Z表示離去基團，Ri和R2獨立地為仲Jl^或鹵原子。
10. 權(quán)利要求1-9中任一項的方法，其中所述亞磷酸酯化試劑 為2-氰基乙基-N,N,N'，N'-四異丙基亞磷酖二胺。
11. 權(quán)利要求1-10中任一項的方法，其中所述脫質(zhì)子酸衍生自 三氟乙酸、二氯乙酸、曱磺酸、三氟甲磺酸(三氟曱磺酸酯)、鄰氯 酚酯及其混合物。
12. 權(quán)利要求l-ll中任一項的方法，其中所述反應(yīng)在丙酮存在 下進行。
13. 具有式I的活化劑在用亞磷酸酯化試劑使含羥基化合物亞 磷酸酯化中作為活化劑的用途，式I:<formula>formula see original document page 4</formula>其中，11=烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基、雜坑基、雜芳基，Rp R產(chǎn)H或者一起形成5到6元環(huán)，X尸獨立地為N或CH,Y-H或Si(R4)3，其中Rr烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基、雜烷基、雜 芳基，8=脫質(zhì)子酸。
14. 權(quán)利要求13的用途，用于合成腺苷亞磷酰胺、胞嘧啶亞磷 酰胺、鳥苷亞磷酰胺和尿嘧咬亞磷酰胺、脫氧腺苷亞磷酰胺、脫氧鳥 苷亞磷酰胺、脫氧胸苷亞磷酖胺、脫氧胞嘧啶亞磷酰胺以及具有式Xn 的低聚核苷酸# ^磷酸酯，其中每個X選自A、 dA、 C、 dC、 G、 dG、 U、 dT且n-2-8，優(yōu)選2-6，及其包^護基團的衍生物。
15. —種摩爾比為1:1到1:10(摩爾:摩爾)的具有式I的活化劑 和具有式VIII的添加劑或吡咬的混合物， 其中，11=烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基、雜烷基、雜芳基，Ri、 R尸H或者一起形成5到6元環(huán)， X" X尸獨立地為N或CH，Y-H或Si(R4)3，其中Rr烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基、雜烷基、雜 芳基，B-脫質(zhì)子酸； 式VIII:<formula>formula see original document page 5</formula>其中R、R2、 Xp X2如對式I所定義。
16. 權(quán)利要求15的混合物的用途，用于合成腺苷亞磷酰胺、胞 嘧啶亞磷酰胺、鳥苷亞磷酰胺和尿嘧啶亞磷酰胺、脫IU^苷亞褲酰胺、 脫氧鳥苷亞磷酰胺、脫氧胸苷亞磷酰胺和脫氧胞嘧啶亞磷酰胺以及具 有式Xn的低聚核苷酸Jl^磷酸酯，其中每個X選自A、 dA、 C、 dC、 G、 dG、 U、 dT且n-2-8，優(yōu)選2-6，及其包絲護基團的衍生物。
17. 具有式Rx-C(-O)-Ry的酮在合成亞磷跣胺中作為反應(yīng)介質(zhì)或 共溶劑的用途，其中Rx和Ry獨立地為d-C6烷基或一起形成環(huán)烷基。
18. 權(quán)利要求17的用途，其中所述酮為丙酮、丁酮、戊酮、己 酮、環(huán)己酮或其混合物。
全文摘要
一種包括如下步驟的制備亞磷酸酯化化合物的方法使含有羥基的化合物與亞磷酸酯化試劑在具有式(I)的活化劑存在下反應(yīng)，其中R＝烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基、雜烷基、雜芳基，R₁、R₂＝H或者一起形成5到6元環(huán)，X₁、X₂＝獨立地為N或CH，Y＝H或Si(R₄)₃，其中R₄＝烷基、環(huán)烷基、芳基、芳烷基、雜烷基、雜芳基，B＝脫質(zhì)子酸。含羥基化合物優(yōu)選為糖結(jié)構(gòu)部分或核苷或由其衍生的低聚物。
文檔編號C07D233/54GK101103040SQ200580046685
公開日2008年1月9日 申請日期2005年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月15日
發(fā)明者克里斯蒂娜·基?；舴? 奧拉夫·格羅塞爾, 安德烈亞斯·舍恩貝格爾, 安德烈亞斯·霍爾菲爾德, 弗里茨·林克, 納賈·奧梅琴科, 邁諾爾夫·朗格 申請人:集潤德斯股份公司