專利名稱：具有蛋白激酶抑制活性的吡啶基或者嘧啶基噻唑化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及取代的嘧啶衍生物。具體地，本發(fā)明涉及芳基-(4-噻唑-2-基-嘧啶-2-基)-胺和芳基-(4-噻唑-2-基-吡啶-2-基)-胺及其治療用途。更具體地，但是非限定地，本發(fā)明涉及能夠抑制一種或多種蛋白激酶的化合物。
背景技術(shù)：
在真核細胞中，所有的生物功能，包括DNA復制、細胞周期進程、能量代謝以及細胞生長以及分化，都是通過蛋白的可逆性磷酸化調(diào)節(jié)的。蛋白的磷酸化狀態(tài)不僅決定其功能、亞細胞分布以及穩(wěn)定性，而且決定其結(jié)合的其它蛋白或細胞成分的種類。因此，生化通路中的作為整體的蛋白質(zhì)組，以及單個成員的特定磷酸化的平衡被生物體用作響應于不斷變化的環(huán)境而保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的策略。執(zhí)行這些磷酸化以及去磷酸化步驟的酶分別為蛋白激酶以及磷酸酶。
真核蛋白激酶家族為人基因組最大的成員之一，包括約500種基因[1，2]。多數(shù)激酶包含帶有保守的核心結(jié)構(gòu)的250-300氨基酸殘基催化結(jié)構(gòu)域。這種結(jié)構(gòu)域包括ATP(較少情形下GTP)的結(jié)合袋(binding pocket)，其末端磷酸被激酶共價轉(zhuǎn)移至其大分子底物上。磷酸供體總是與二價離子(通常為Mg2+或Mn2+)結(jié)合成復合物。催化結(jié)構(gòu)域的另一種重要功能是大分子底物的磷酸轉(zhuǎn)移的結(jié)合以及定位。在絕大多數(shù)激酶中存在的催化結(jié)構(gòu)域具有或多或少的同源性。
本領(lǐng)域已知有許多通過拮抗ATP結(jié)合能抑制蛋白激酶功能的分子[3-7]。例如，申請人以前公開了具有激酶抑制特性(特別地具有對周期蛋白-依賴性激酶(CDKs)具有抑制特性)的2-苯胺基-4-雜芳基-嘧啶化合物[8-12]。CDKs是與多種周期蛋白亞基結(jié)合的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。這些復合物對調(diào)節(jié)真核細胞周期進程以及對轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)非常重要[13，14]。
本發(fā)明尋求提供芳基-(4-噻唑-2-基-嘧啶-2-基)-胺和芳基-(4-噻唑-2-基-吡啶-2-基)-胺。更具體地，本發(fā)明提供了芳基-(4-噻唑-2-基-嘧啶-2-基)-胺和芳基-(4-噻唑-2-基-吡啶-2-基)-胺，其在治療多種不同疾病中具有廣泛治療應用和/或能夠抑制一種或多種蛋白激酶。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一方面涉及式I的化合物，或其可藥用鹽， 其中Z1為N或CH；Z2和Z3各自獨立地為N或CR7；R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7各自獨立地為H、R8或R9；各R8獨立地為烴基(hydrocarbyl)；以及各R9獨立地為鹵素、NO2、烷氧基、CN、CF3、SO3H、SO2NR10R11、SO2R12、NR13R14、(CH2)aCOOR15、(CH2)bCONR16R17、(CH2)cCOR18或(CH2)dOH；a、b、c和d各自獨立地為0、1、2、3或4；R10-18各自獨立地為H或烷基；條件是當R1和R2都為H，Z1為CH；或Z2為N；或Z1為CH且Z2為N的時候；則其中化合物不為4-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-N-(3，4，5-三甲氧基苯基)-2-嘧啶胺或4-(5-(2-羥基乙基)-4-甲基噻唑-2-基)-N-(3，4，5-三甲氧基苯基)-2-嘧啶胺。
本發(fā)明的第二方面涉及藥物組合物，其包括式I的化合物或其可藥用鹽并混合有可藥用載體、賦形劑或稀釋劑。
本發(fā)明第三方面涉及用于醫(yī)藥的式I的化合物或其可藥用鹽。
本發(fā)明的第四方面涉及式I的化合物在制備用于治療下述中的一種或多種疾病的藥物中的用途增生性疾病；病毒性疾??；CNS疾病；糖尿??；中風；脫發(fā)癥；炎性疾?。换蚋腥拘约膊?。
本發(fā)明的第五方面涉及式I的化合物或其可藥用鹽在用于鑒別能抑制周期蛋白依賴性激酶、GSK、aurora激酶、GSK和PLK酶中的一或多種的其它候選化合物的測定中的用途。
本發(fā)明的第六方面涉及制備式I化合物的方法。
詳細描述如本發(fā)明中所使用的，術(shù)語“烴基”是指飽和的或不飽和的，直鏈、支鏈或環(huán)狀的包含至少C和H基團，并任選包含一或多個其他的合適的取代基。所述的取代基的實例可包括鹵素、CF3、OH、CN、NO2、SO3H、SO2NH2、SO2Me、NH2、COOH和CONH2。如果烴基包含多于一個C，那么這些碳并不是必需地需要彼此連接。例如，至少兩個碳原子可通過合適的元素或基團連接。因此，烴基可包含雜原子。合適的雜原子對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言是很顯然的，并包括，例如，硫、氮、氧、磷和硅。當烴基包含一或多個雜原子的時候，烴基可通過碳-碳鍵或碳-雜原子鍵連接至分子的其他部分。
優(yōu)選地，烴基為芳基、烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烷基、雜烷基或雜芳基。更優(yōu)選地，烴基為芳基、烷基或雜環(huán)烷基。
這里使用的術(shù)語“烷基”包括直鏈和支鏈烷基。烷基可被(單-或多-)取代的或未被取代的。合適的取代基包括，例如鹵素、CF3、OH、CN、NO2、SO3H、SO2NH2、SO2Me、NH2、COOH、CONH2和烷氧基。優(yōu)選地，烷基為C1-20烷基，更優(yōu)選地C1-15，更優(yōu)選地C1-12烷基，更優(yōu)選地，C1-6烷基，更優(yōu)選地C1-3烷基。特別優(yōu)選的烷基包括，例如，甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、戊基和己基。
這里使用的術(shù)語“雜烷基”包括包括一或多個雜原子的如上定義的烷基。
這里使用的術(shù)語“環(huán)烷基”指可被(單-或多-)取代的或未被取代的環(huán)狀烷基。合適的取代基包括，例如鹵素、CF3、OH、CN、NO2、SO3H、SO2NH2、SO2Me、NH2、COOH、CONH2和烷氧基。
類似地，術(shù)語“雜環(huán)烷基”指可被(單-或多-)取代的或未被取代的環(huán)狀雜烷基。合適的取代基包括，例如鹵素、CF3、OH、CN、NO2、SO3H、SO2NH2、SO2Me、NH2、COOH、CONH2和烷氧基。優(yōu)選的雜環(huán)烷基包括嗎啉代、哌嗪基和哌啶基。
這里使用的術(shù)語“芳基”指可被(單-或多-)取代的或未被取代的C6-10芳香基團，并包括，例如苯基、萘基等。再次，合適的取代基包括，例如鹵素、CF3、OH、CN、NO2、SO3H、SO2NH2、SO2Me、NH2、COOH、CONH2和烷氧基。
這里使用的術(shù)語“雜芳基”指可被(單-或多-)取代的或未被取代的包含一或多個雜原子的C4-10芳香基團。優(yōu)選的雜芳基包括吡咯、吡唑、嘧啶、吡嗪、吡啶、喹啉、噻吩和呋喃。再次，合適的取代基包括，例如鹵素、CF3、OH、CN、NO2、SO3H、SO2NH2、SO2Me、NH2、COOH、CONH2和烷氧基。
在一個優(yōu)選的本發(fā)明的實施方案中，各R8獨立地為C1-30烴基，任選包含至多12個選自N、S和O的雜原子，并任選包含至多6個取代基，各取代基獨立地選自鹵素、NO2、CN、CF3、SO3H、SO2NH2、SO2Me、OH、NH2、COOH和CONH2。
更優(yōu)選地，各R8獨立地為烷基、芳基或雜環(huán)烷基。優(yōu)選地，雜環(huán)烷基為嗎啉基、吡咯烷基或哌啶基。
優(yōu)選地，雜環(huán)烷基為N-嗎啉基、N-吡咯烷基或N-哌啶基。
在一個優(yōu)選的本發(fā)明的實施方案中，各R9獨立地為鹵素、NO2、烷氧基、CN、CF3、SO3H、SO2NH2、SO2Me、OH、NH2、(CH2)aCOOR15、(CH2)dOH、CONH2或COR18。
在一個優(yōu)選的本發(fā)明的實施方案中，各R9獨立地為鹵素、NO2、烷氧基、CF3、SO3H、SO2NH2、SO2Me、OH、NH2、(CH2)aCOOR15、(CH2)dOH、CONH2或COR18。
在一個更優(yōu)選的本發(fā)明的實施方案中，各R9獨立地為鹵素、NO2、OMe、CF3、SO3H、SO2NH2、SO2Me、OH、NH2、CH2COOMe、COOMe、COOEt、(CH2)2OH、CONH2或COMe。
在一個優(yōu)選的實施方案中，R5和R6都為H且R1-4和R7各自獨立地為H、R8或R9。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，其中Z2和Z3都為CR7，R3、R4和R7中至少一個不為OMe。
在一個特別優(yōu)選的實施方案中，R1為H、烷基、芳基、(CH2)aCOOR15或OH；R2為H、(CH2)dOH、(CH2)aCOOR15、COR18或烷基；R3為鹵素、H、烷氧基、雜環(huán)烷基、烷基或OH；R4為H、NH2、OH、烷基、CF3或NO2；以及R5和R6都為H。
在一個特別優(yōu)選的實施方案中，R1為H、Me、Ph、CH2COOMe或OH；R2為H、(CH2)2OH、COOEt、COMe或Me；R3為Cl、H、OMe、N-嗎啉基、N-吡咯烷基、Me或OH；R4為H、NH2、OH、Me、CF3或NO2；以及R5和R6都為H。
在另一個特別優(yōu)選的實施方案中，R1為H、烷基、芳基、(CH2)aCOOR15或OH；R2為H、COOR15、COR18或烷基；R3為鹵素、H、烷氧基、嗎啉代、烷基或OH；R4為H、NH2、OH、CF3或NO2；以及R5和R6都為H。
更優(yōu)選地，對于該實施方案，
R1為H、Me、Ph、CH2CO2Me或OH；R2為H、CO2Et、COMe或Me；R3為Cl、H、OMe、嗎啉代、Me或OH。
一個優(yōu)選的本發(fā)明的實施方案涉及式I的化合物，其中Z1為CH且Z2和Z3各自獨立地為N或CR7。
在一個特別優(yōu)選的實施方案中，Z2和Z3各自獨立地為CR7。
在一個特別優(yōu)選的實施方案中，Z1為CH，并且Z2和Z3各自獨立地為CR7。
在一個優(yōu)選的實施方案中，當Z1為CH且Z2和Z3各自獨立地為CR7，R1為烷基或OH；R2為烷基或COR18；R3為OH或鹵素；以及Z2和Z3都為CH。
更優(yōu)選地，R1為Me或OH，R2為COMe或Me，以及R3為OH或Cl。
在一個優(yōu)選的實施方案中，當Z1為CH且Z2和Z3各自獨立地為CR7，R1為烷基；R2為COR18；R3為OH；以及Z2和Z3都為CH。
更優(yōu)選地，R1為Me且R2為COMe。
另一個優(yōu)選的本發(fā)明實施方案涉及式I的化合物，其中Z1為N且Z2和Z3各自獨立地為N或CR7。
在一個特別優(yōu)選的實施方案中，Z2和Z3各自獨立地為CR7。
在一個更優(yōu)選的實施方案中，Z1為N，且Z2和Z3各自獨立地為CR7。
更優(yōu)選地，其中Z1為N以及Z2和Z3各自獨立地為CR7，R1為烷基、芳基、OH或(CH2)aCOOR15；R2為COR18、H、COOR15或烷基；R3為鹵素、H、OH、烷基或嗎啉代；R4為H、NH2、OH、CF3或NO2；以及Z2和Z3都為CH。
更優(yōu)選地，
R1為Me、Ph、OH或CH2COOMe；R2為COMe、H、COOEt或Me；以及R3為鹵素、H、OH、烷基或嗎啉代。
另一個優(yōu)選的本發(fā)明的實施方案涉及式I的化合物，其中Z2為N且Z3為CR7。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，Z1為N，Z2為N且Z3為CR7。
對于該實施方案，更優(yōu)選地，R1為H、OH或烷基；R2為H、(CH2)dOH、烷基、(CH2)aCOOR15、COR18；R3為鹵素、烷氧基或雜環(huán)烷基；R4為H或烷基；以及Z3為CH。
對于該實施方案，更優(yōu)選地，R1為H、OH或Me；R2為H、(CH2)2OH、Me、COOEt、COMe；R3為鹵素、OMe或N-吡咯烷基；R4為H或Me；以及Z3為CH。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，R1為H或烷基；R2為H或COR18；R3為鹵素或烷氧基；以及Z3為CH。
更優(yōu)選地，R1為H或Me；R2為H或COMe；以及R3為鹵素或OMe。
在一個特別優(yōu)選的實施方案中，式I化合物選自下述化合物1-{2-[2-(4-氯-苯基氨基)-嘧啶-4-基]-4-甲基-噻唑-5-基}-乙酮(4-氯-苯基)-[4-(4-甲基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基]-胺(4-氯-苯基)-[4-(4-苯基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基]-胺
2-[2-(4-氯-苯基氨基)-嘧啶-4-基]-4-甲基-噻唑-5-羧酸乙基酯{2-[2-(4-氯-苯基氨基)-嘧啶-4-基]-噻唑-4-基}-乙酸甲基酯2-[2-(4-氯-苯基氨基)-嘧啶-4-基]-4-羥基-噻唑-5-羧酸乙基酯N-[4-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基]-苯-1，3-二胺3-[4-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基氨基]-苯酚[4-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基]-(3-三氟甲基-苯基)-胺(4-氯-3-三氟甲基-苯基)-[4-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基]-胺[4-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基]-(3-硝基-苯基)-胺(6-甲氧基-吡啶-3-基)-(4-噻唑-2-基-嘧啶-2-基)-胺(6-氯-吡啶-3-基)-(4-噻唑-2-基-嘧啶-2-基)-胺1-{2-[2-(6-氯-吡啶-3-基氨基)-嘧啶-4-基]-4-甲基-噻唑-5-基}-乙酮[4-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基]-(6-甲氧基-吡啶-3-基)-胺。
(6-氯-吡啶-3-基)-[4-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基]-胺[4-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基]-(4-嗎啉-4-基-苯基)-胺[4-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基]-(4-甲基-3-硝基-苯基)-胺4-[4-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基氨基]-苯酚2-[2-(4-氯-苯基氨基)-吡啶-4-基]-5-甲基-噻唑-4-醇(6-吡咯烷-1-基-吡啶-3-基)-(4-噻唑-2-基-嘧啶-2-基)-胺2-[2-(6-氯-吡啶-3-基氨基)-嘧啶-4-基]-4-羥基-噻唑-5-羧酸乙基酯2-[2-(6-氯-吡啶-3-基氨基)-嘧啶-4-基]-5-甲基-噻唑-4-醇2-[2-(6-氯-吡啶-3-基氨基)-嘧啶-4-基]-5-(2-羥基-乙基)-噻唑-4-醇(6-氯-5-甲基-吡啶-3-基)-(4-噻唑-2-基-嘧啶-2-基)-胺。
在一個特別優(yōu)選的實施方案中，所述的化合物選自下述化合物1-{2-[2-(4-氯-苯基氨基)-嘧啶-4-基]-4-甲基-噻唑-5-基}-乙酮(4-氯-苯基)-[4-(4-甲基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基]-胺(4-氯-苯基)-[4-(4-苯基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基]-胺2-[2-(4-氯-苯基氨基)-嘧啶-4-基]-4-甲基-噻唑-5-羧酸乙基酯{2-[2-(4-氯-苯基氨基)-嘧啶-4-基]-噻唑-4-基}-乙酸甲基酯2-[2-(4-氯-苯基氨基)-嘧啶-4-基]-4-羥基-噻唑-5-羧酸乙基酯
N-[4-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基]-苯-1，3-二胺3-[4-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基氨基]-苯酚[4-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基]-(3-三氟甲基-苯基)-胺(4-氯-3-三氟甲基-苯基)-[4-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基]-胺[4-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基]-(3-硝基-苯基)-胺(6-甲氧基-吡啶-3-基)-(4-噻唑-2-基-嘧啶-2-基)-胺(6-氯-吡啶-3-基)-(4-噻唑-2-基-嘧啶-2-基)-胺1-{2-[2-(6-氯-吡啶-3-基氨基)-嘧啶-4-基]-4-甲基-噻唑-5-基}-乙酮[4-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基]-(6-甲氧基-吡啶-3-基)-胺。
(6-氯-吡啶-3-基)-[4-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基]-胺[4-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基]-(4-嗎啉-4-基-苯基)-胺[4-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基]-(4-甲基-3-硝基-苯基)-胺4-[4-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基氨基]-苯酚更優(yōu)選地，式I化合物選自下述化合物2-[2-(4-氯-苯基氨基)-嘧啶-4-基]-4-羥基-噻唑-5-羧酸乙基酯；N-[4-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基]-苯-1，3-二胺3-[4-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基氨基]-苯酚[4-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基]-(3-三氟甲基-苯基)-胺(4-氯-3-三氟甲基-苯基)-[4-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基]-胺(6-甲氧基-吡啶-3-基)-(4-噻唑-2-基-嘧啶-2-基)-胺(6-氯-吡啶-3-基)-(4-噻唑-2-基-嘧啶-2-基)-胺[4-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基]-(6-甲氧基-吡啶-3-基)-胺2-[2-(4-氯-苯基氨基)-吡啶-4-基]-5-甲基-噻唑-4-醇(6-吡咯烷-1-基-吡啶-3-基)-(4-噻唑-2-基-嘧啶-2-基)-胺2-[2-(6-氯-吡啶-3-基氨基)-嘧啶-4-基]-4-羥基-噻唑-5-羧酸乙基酯2-[2-(6-氯-吡啶-3-基氨基)-嘧啶-4-基]-5-甲基-噻唑-4-醇2-[2-(6-氯-吡啶-3-基氨基)-嘧啶-4-基]-5-(2-羥基-乙基)-噻唑-4-醇(6-氯-5-甲基-吡啶-3-基)-(4-噻唑-2-基-嘧啶-2-基)-胺。
在一個特別優(yōu)選的實施方案中，所述的化合物選自下述化合物
2-[2-(4-氯-苯基氨基)-嘧啶-4-基]-4-羥基-噻唑-5-羧酸乙基酯；N-[4-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基]-苯-1，3-二胺3-[4-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基氨基]-苯酚[4-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基]-(3-三氟甲基-苯基)-胺(4-氯-3-三氟甲基-苯基)-[4-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基]-胺(6-甲氧基-吡啶-3-基)-(4-噻唑-2-基-嘧啶-2-基)-胺(6-氯-吡啶-3-基)-(4-噻唑-2-基-嘧啶-2-基)-胺[4-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基]-(6-甲氧基-吡啶-3-基)-胺更優(yōu)選地，式I化合物選自下述化合物2-[2-(4-氯-苯基氨基)-嘧啶-4-基]-4-羥基-噻唑-5-羧酸乙基酯；(6-甲氧基-吡啶-3-基)-(4-噻唑-2-基-嘧啶-2-基)-胺；(6-氯-吡啶-3-基)-(4-噻唑-2-基-嘧啶-2-基)-胺2-[2-(4-氯-苯基氨基)-吡啶-4-基]-5-甲基-噻唑-4-醇(6-吡咯烷-1-基-吡啶-3-基)-(4-噻唑-2-基-嘧啶-2-基)-胺2-[2-(6-氯-吡啶-3-基氨基)-嘧啶-4-基]-4-羥基-噻唑-5-羧酸乙基酯2-[2-(6-氯-吡啶-3-基氨基)-嘧啶-4-基]-5-甲基-噻唑-4-醇2-[2-(6-氯-吡啶-3-基氨基)-嘧啶-4-基]-5-(2-羥基-乙基)-噻唑-4-醇(6-氯-5-甲基-吡啶-3-基)-(4-噻唑-2-基-嘧啶-2-基)-胺在一個特別優(yōu)選的實施方案中，所述的化合物選自下述化合物2-[2-(4-氯-苯基氨基)-嘧啶-4-基]-4-羥基-噻唑-5-羧酸乙基酯；(6-甲氧基-吡啶-3-基)-(4-噻唑-2-基-嘧啶-2-基)-胺；(6-氯-吡啶-3-基)-(4-噻唑-2-基-嘧啶-2-基)-胺。
更優(yōu)選地，所述的化合物為2-[2-(6-氯-吡啶-3-基氨基)-嘧啶-4-基]-4-羥基-噻唑-5-羧酸乙基酯或2-[2-(6-氯-吡啶-3-基氨基)-嘧啶-4-基]-5-(2-羥基-乙基)-噻唑-4-醇。
在一個高度優(yōu)選的本發(fā)明的實施方案中，式I的化合物為(6-氯-吡啶-3-基)-(4-噻唑-2-基-嘧啶-2-基)-胺。
在一個特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的化合物能夠抑制一種或多種如表5或6所示的激酶。
在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的化合物能抑制一或多種激酶，所述的激酶選自周期蛋白依賴性激酶或GSK。更優(yōu)選地，所述的化合物能抑制GSK3、CDK2/E、CDK2/A、CDK1/B、CDK4/D1、CDK7/H和/或CDK9/T1中的一種或者多種。
優(yōu)選地，本發(fā)明的化合物化合物顯示出的IC50值(對一種或多種上述激酶的激酶抑制)小于10μM，更優(yōu)選地，小于5μM，更優(yōu)選地小于1μM，甚至更優(yōu)選地小于0.1μM，更優(yōu)選地小于0.01μM，如用適當?shù)募っ笢y定測量得到的。合適的測定的細節(jié)顯示在實施例部分中。
在一個特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的化合物能夠選擇性抑制GSK(優(yōu)選地GSK3)，相對于一或多種選自CDK2/E、CDK2/A、CDK1/B、CDK4/D1、CDK7/H和CDK9/T1的周期蛋白依賴性激酶而言。優(yōu)選地，所述的化合物針對GSK顯示至少5-倍的選擇性(相對于CDK)，更優(yōu)選地針對GSK至少10-倍的選擇性，更優(yōu)選地至少100-倍的選擇性。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，所述的化合物相對于CDK針對GSK顯示至少1000-倍的選擇性，更優(yōu)選地至少5000-倍的選擇性。
在一個特別優(yōu)選的實施方案中，所述的化合物相對于CDK針對GSK3顯示至少10-倍的選擇性，所述的CDK選自CDK2/周期蛋白E、CDK1/周期蛋白B、CDK7/周期蛋白H、CDK4/周期蛋白D1、CDK2/周期蛋白A和CDK9/周期蛋白T1。
在另一個特別優(yōu)選的實施方案中，所述的化合物相對于CDK針對GSK3顯示至少100-倍的選擇性，所述的CDK選自CDK2/周期蛋白E、CDK1/周期蛋白B、CDK7/周期蛋白H、CDK4/周期蛋白D1和CDK2/周期蛋白A。
在另一個特別優(yōu)選的實施方案中，所述的化合物相對于CDK針對GSK3顯示至少1000-倍的選擇性，所述的CDK選自CDK1/周期蛋白B、CDK7/周期蛋白H、CDK4/周期蛋白D1和CDK2/周期蛋白A。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的化合物能激活細胞糖原合酶的活性。優(yōu)選地，所述的化合物能激活細胞糖原合酶的活性，如在HEK293、小鼠肌細胞或小鼠脂肪細胞中監(jiān)測GS活性誘導的倍數(shù)。優(yōu)選地，GS活性被激活至少1.5-倍，更優(yōu)選地至少2-倍，更優(yōu)選地至少3-倍、4-倍或5-倍。
藥物組合物在一個優(yōu)選的本發(fā)明的實施方案中，包括如上定義的I化合物與一種或多種可藥用稀釋劑、賦形劑或載體混合。
盡管本發(fā)明的化合物(包括其可藥用鹽、酯以及可藥用溶劑合物)可單獨給藥，通常它們與可藥用載體、賦形劑或稀釋劑一起給藥，尤其是用于對人治療的時候。藥物組合物可用于人和獸醫(yī)中供人或動物使用。
本發(fā)明所述的各種不同形式的藥物組合物的合適賦形劑的實例可見于“Handbook of Pharmaceutical Excipients，2ndEdition，(1994)，由A Wade和PJWeller編著。
治療用途的可接受的載體或稀釋劑是制藥領(lǐng)域中公知的，例如描述于Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro edit.1985)中。
合適的載體的實例包括乳糖、淀粉、葡萄糖、甲基纖維素、硬脂酸鎂、甘露醇、山梨醇等。合適的稀釋劑的實例包括乙醇、甘油和水。
藥用載體、賦形劑或稀釋劑可根據(jù)將要使用的給藥途徑以及標準的制藥規(guī)范進行選擇。藥物組合物可包含作為或除了載體、賦形劑或稀釋劑以外的任何合適的粘合劑、潤滑劑、助懸劑、包衣劑、助溶劑。
合適的粘合劑的實例包括淀粉、明膠、天然糖類如葡萄糖、無水乳糖、自由流動的乳糖、β-乳糖、玉米甜料、天然和合成的樹膠，如阿拉伯樹膠、黃蓍樹膠或藻酸鈉、羧基甲基纖維素和聚乙二醇。
合適的潤滑劑的實例包括油酸鈉、硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、苯甲酸鈉、乙酸鈉、氯化鈉等。
防腐劑、穩(wěn)定劑、染料以及甚至調(diào)味劑可提供在本發(fā)明的藥物組合物中。防腐劑的實例包括苯甲酸鈉、山梨酸以及對羥基苯甲酸的酯類。也可使用抗氧化劑以及助懸劑。
鹽/酯式I的化合物可以鹽或酯，尤其是可藥用的鹽或酯的形式提供。
本發(fā)明化合物的可藥用鹽包括它們合適的酸加成鹽或堿加成鹽。合適的可藥用鹽的評論可參見Berge等人的J.Pharm Sci，66，1-19(1977)。例如，鹽為與以下酸形成的鹽無機強酸，如礦物酸，例如硫酸、磷酸或氫鹵酸；強有機羧酸，如未取代或取代(如被鹵代)的1至4個碳原子的鏈烷羧酸，例如乙酸；飽和或不飽和的二元羧酸，例如草酸、丙二酸、丁二酸、馬來酸、富馬酸、鄰苯二甲酸或?qū)Ρ蕉姿?；羥基羧酸，例如抗壞血酸、羥基乙酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸或檸檬酸；氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸；苯甲酸；或有機磺酸，如未取代或取代(如被鹵代)的(C1-C4)烷基磺酸或芳基磺酸，如甲磺酸或?qū)妆交撬帷?br> 取決于被酯化的官能團，使用有機酸或醇/氫氧化物形成酯。有機酸包括羧酸，如未取代或取代(如被鹵代)的1至12個碳原子的鏈烷羧酸，例如乙酸；飽和或不飽和的二元羧酸，例如草酸、丙二酸、丁二酸、馬來酸、富馬酸、鄰苯二甲酸或?qū)Ρ蕉姿?；羥基羧酸，例如抗壞血酸、羥基乙酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸或檸檬酸；氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸；苯甲酸；或有機磺酸，如未取代或取代(如被鹵代)的(C1-C4)烷基磺酸或芳基磺酸，如甲磺酸或?qū)妆交撬?。合適的氫氧化物包括無機氫氧化物，如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、氫氧化鋁。醇包括未取代或取代(如被鹵代)的1至12個碳原子的鏈烷醇。
對映異構(gòu)體/互變異構(gòu)體在如前討論的本發(fā)明的所有方面中，本發(fā)明還適當?shù)匕ㄊ絀的化合物的全部對映異構(gòu)體和互變異構(gòu)體。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能認識到具有光學性質(zhì)(一個或多個手性碳原子)或互變異構(gòu)特征的化合物。可通過本領(lǐng)域中已知的方法分離/制備相應的對映異構(gòu)體和/或互變異構(gòu)體。
立體異構(gòu)體和幾何異構(gòu)體一些式I的具體化合物可以立體異構(gòu)體和/或幾何異構(gòu)體的形式存在，例如其可具有一個或多個不對稱和/或幾何中心，并因此可以二種或多種立體異構(gòu)和/或幾何形式存在。本發(fā)明包括這些活性成分的所有單獨立體異構(gòu)體和幾何異構(gòu)體及其混合物的使用。權(quán)利要求中使用的術(shù)語包括這些形式，只要所述形式保留適當?shù)墓δ芑钚?但不必到相同程度)。
本發(fā)明還包括所述化合物或其可藥用鹽的所有合適同位素變體。本發(fā)明藥物或其可藥用鹽的同位素變體定義為其中至少一個原子被具有相同原子序數(shù)但原子質(zhì)量與自然界中通常發(fā)現(xiàn)的原子質(zhì)量不同的原子取代的物質(zhì)?？杀粨饺氲剿幬锖推淇伤幱名}的同位素的例子包括氫、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素，分別如2H、3H、13C、14C、15N、17O、18O、31P、32P、35S、18F和36Cl。本發(fā)明的藥物和其可藥用鹽的一些同位素變體，例如結(jié)合放射性同位素如3H或14C的那些化合物，在藥物和/或底物組織分布研究中是有用的。含氚的即3H和碳-14即14C同位素因其容易制備和可檢測性而特別優(yōu)選。此外，用同位素如氘即2H的取代可因較大的代謝穩(wěn)定性而提供特定的治療益處，例如體內(nèi)半衰期增加或劑量要求降低，并因此可在一些情況下是優(yōu)選的。通?？墒褂煤线m試劑的適當同位素變體，通過常規(guī)過程制備本發(fā)明藥物和其可藥用鹽的同位素變體。
溶劑合物本發(fā)明還包括本發(fā)明化合物的溶劑合物形式。權(quán)利要求中使用的術(shù)語包括這些形式。
多晶型物本發(fā)明還涉及本發(fā)明化合物的各種結(jié)晶形式、多晶型形式和無水(水合)形式。眾所周知，在藥物工業(yè)中可通過稍微改變這種化合物合成制備中所用溶劑的純化方法和或分離形式來分離得到化合物的任意這類形式。
前體藥物本發(fā)明還包括本發(fā)明化合物的前體藥物形式。這種前體藥物通常為一個或多個適當基團已被修飾以使在對人或哺乳動物對象給藥后所述的修飾可被逆轉(zhuǎn)的式I的化合物。雖然為了實現(xiàn)體內(nèi)逆轉(zhuǎn)可與這種前體藥物一起給藥第二種藥物，但通常通過在這類對象中天然存在的酶實現(xiàn)這種逆轉(zhuǎn)。這類修飾的例子包括酯(例如上述那些中的任一種)，其中可通過酯酶等進行逆轉(zhuǎn)。其它這類系統(tǒng)為本領(lǐng)域中那些技術(shù)人員所熟知。
治療用途已經(jīng)發(fā)現(xiàn)式I的化合物具有抗增殖活性，并因此相信其可用于治療增殖性疾病例如癌癥、白血病和其它與失控細胞增殖有關(guān)的疾病，例如牛皮癬和再狹窄。如本發(fā)明所定義的，本發(fā)明范圍內(nèi)的抗增殖作用可以由在體外全細胞測定法中抑制細胞增殖的能力得到證明，例如使用A549、HT29、Saos-2中的任何一種細胞系。利用這些測定法，可以確定一種化合物在本發(fā)明的意義上是否具有抗增殖性。
因此，一種優(yōu)選的本發(fā)明實施方案涉及一或多種式I化合物在制備用于治療增殖性疾病的藥物中的用途。
如本發(fā)明所使用的，術(shù)語“藥物的制備”包括式I的化合物直接用作藥物的用途，還包括其在篩選其它治療劑的方案中的用途或者其在制備這種藥物的任何階段中的用途。
優(yōu)選地，增殖性疾病是癌癥或白血病。本發(fā)明所用的術(shù)語“增殖性疾病”在廣義上包括任何需要控制細胞周期的疾病，例如，心血管疾病，例如再狹窄和心臟病和心肌梗塞；自體免疫性疾病，例如腎小球腎炎和類風濕性關(guān)節(jié)炎；皮膚病，例如牛皮癬；抗炎、抗真菌、抗寄生蟲性疾病，例如瘧疾、肺氣腫和脫發(fā)癥和慢性阻塞性肺病。在這些疾病中，本發(fā)明的化合物可以根據(jù)需要在所需細胞內(nèi)誘導細胞凋亡或者維持停滯。
本發(fā)明的化合物可以抑制細胞周期中的任意步驟或階段，例如核被膜的形成、從細胞周期的靜止期(G0)退出、G1進展、染色體解聚、核被膜破裂、START、DNA復制的引發(fā)、DNA復制的進展、DNA復制的終止、中心體復制、G2進展、有絲分裂或減數(shù)分裂功能的激活、染色體聚集、中心體分離、微管成核、紡錘體生成與功能、與微管動力蛋白的相互作用、染色單體分離(separation)與隔開(segregation)、有絲分裂功能的失活、收縮環(huán)的生成和胞質(zhì)分裂活動。確切而言，本發(fā)明的化合物可以影響某些基因功能，例如染色質(zhì)結(jié)合、復制復合體的生成、復制許可、磷酸化或其它次級修飾活性、蛋白水解性降解、微管結(jié)合、肌動蛋白結(jié)合、septin結(jié)合、微管組織中心成核活性和與細胞周期發(fā)信號通路成分的結(jié)合。
在本發(fā)明的一個實施方案中，式I化合物以抑制至少一種CDK酶的有效量給藥。
優(yōu)選地，式I化合物以足以抑制CDK2和/或CDK4中至少一種的量給藥。
本發(fā)明的另一方面涉及式I的化合物在制備用于治療病毒性疾病如人巨細胞病毒(HCMV)、1型單純皰疹病毒(HSV-1)、1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)和水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)的藥物中的用途。
在本發(fā)明更優(yōu)選的實施方案中，式I的化合物以足以抑制一或多種與病毒復制相關(guān)的宿主細胞CDKs即CDK2、CDK7、CDK8和CDK9[39]的量給藥。
如本發(fā)明所定義的，本發(fā)明范圍內(nèi)的抗病毒活性可通過抑制CDK2、CDK7、CDK8或CDK9的能力而得到證實。
在特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及一種或多種式I的化合物在治療CDK依賴性或敏感性的病毒性疾病中的用途。CDK依賴性疾病與一種或多種CDK酶的超過正?；钚运接嘘P(guān)。這類疾病優(yōu)選與CDK2、CDK7、CDK8和/或CDK9的異?；钚运接嘘P(guān)。CDK敏感性疾病是這樣的一種疾病，其中CDK水平的失常不是主要原因，而是下游初級異謝失常導致的。在這種情況下，CDK2、CDK7、CDK8和/或CDK9被認為是敏感性代謝途徑的一部分，并且因此CDK抑制劑可在治療這類疾病中有活性。
本發(fā)明另一方面涉及式I的化合物或其可藥用鹽，在制備用于治療糖尿病的藥物中的用途。
在特別優(yōu)選的實施方案中，所述的糖尿病為II型糖尿病。
糖原合酶激酶3(GSK3)為Ser/Thr蛋白激酶，由2種同工型(α和β)組成，其在催化結(jié)構(gòu)域具有高度的同源性。GSK3為磷酸化糖原合酶(GS)的數(shù)種蛋白激酶之一。骨骼肌中胰島素對糖原合成的刺激源自GS的去磷酸化以及活化。因此，GSK3對GS的作用導致后者的失活并因此抑制肌肉中葡萄糖向糖原的轉(zhuǎn)化。
II型糖尿病(非-胰島素依賴性糖尿病)是一種多因素疾病。高血糖癥是由于肝臟、肌肉以及其它組織中的胰島素耐受性以及受損的胰島素分泌導致的。骨骼肌是胰島素-刺激的葡萄糖攝取的主要部位，在那里其要么離開循環(huán)要么轉(zhuǎn)化成糖原。肌肉糖原沉積是葡萄糖調(diào)節(jié)平衡作用中的主要決定環(huán)節(jié)，并且II型糖尿病具有缺損的肌肉糖原貯存。有證據(jù)表明GSK3活性的增加在II型糖尿病中很重要[1]。此外，已經(jīng)證實GSK3在II型糖尿病的肌肉細胞中被過表達，并且在骨骼肌GSK3活性和胰島素作用之間存在逆相關(guān)[2]。
因此，GSK3的抑制在治療糖尿病尤其是II型糖尿病以及糖尿病神經(jīng)病變中有治療意義。有關(guān)GSK3生物學的最近評述參見[3]。值得注意的是，已知GSK3磷酸化除GS以外的許多底物，并因此參與多種生化通路的調(diào)節(jié)。GSK-3底物包括CREB(已知也為cAMP效應元件-結(jié)合蛋白1)，其涉及繼發(fā)于增加的cAMP水平以及cAMP-依賴性蛋白激酶A的活化后的基因轉(zhuǎn)錄。CREB結(jié)合的效應元件見于許多基因中，包括那些被認為對T細胞功能重要的基因(以及功能障礙-例如T細胞淋巴瘤以及白血病)。CREB似乎還涉及海馬CA1神經(jīng)細胞的長期加強作用以及一般意義上的神經(jīng)功能的調(diào)節(jié)以及腫瘤生物學。EIF2B(真核起始因子-2B)，其為蛋白合成必須的GTP交換蛋白。HSF-1(熱激因子-1)，細胞響應于應激的成分。C/EBPa (也稱為CCAAT/增強子結(jié)合蛋白a)，已經(jīng)建議其調(diào)節(jié)瘦蛋白表達并且已經(jīng)建議在人肥胖中具有功能。定向去除C/E7Pa基因的純合系小鼠不儲存肝糖原，表達低水平的GS并且不能儲存脂質(zhì)。NF-ATc(激活T細胞的核因子)，其活化被鈣調(diào)磷酸酶，一種Ca2+-依賴性磷酸酶控制。最初在T細胞中識別作為細胞因子基因表達誘導劑的NF-AT蛋白在非免疫過程中發(fā)揮多種作用，尤其是那些與適應性反應有關(guān)的過程如心臟肥大以及改變的代謝平衡。c-Jun、c-myc和c-myb，每一種都是原癌基因。β-聯(lián)蛋白，其為見于粘附連接的蛋白并因此對上皮細胞層的的建立以及維持至關(guān)重要。連接介導細胞之間的黏附，促進細胞-細胞信號傳導，以及錨定肌動蛋白的細胞骨架。在充當這些角色的時候，粘附連接調(diào)節(jié)正常細胞的生長以及行為、傷口愈合以及腫瘤細胞轉(zhuǎn)移。Tau，可能其最為最為人所了解的是其參與阿耳茨海默氏病的病因?qū)W。Tau與微管蛋白共聚成微管，但是在阿耳茨海默氏病中，tau形成了大的絲狀纏結(jié)，破壞了神經(jīng)細胞中的微管結(jié)構(gòu)，從而損壞營養(yǎng)的傳輸以及神經(jīng)信息的傳遞。胰島素受體底物(IRS-1)，見于許多胰島素響應的細胞和組織中。其不顯示內(nèi)在的酶活性，但是據(jù)信其在被胰島素受體激酶磷酸化后充當?？康鞍祝婕敖Y(jié)合以及激活其他的信號轉(zhuǎn)導分子。已經(jīng)有人提出IRS-1在胰島素耐受性的發(fā)展中發(fā)揮作用。
值得注意的是已知GSK3磷酸化除了GS以外的許多底物，并因此涉及許多生物化學通路的調(diào)節(jié)。例如，GSK在中樞以及外周神經(jīng)系統(tǒng)中高表達，并因此提出了在神經(jīng)退行性疾病中通過GSK抑制的生物醫(yī)學治療基本原理。
因此，本發(fā)明另一方面涉及式I的化合物或其可藥用鹽，在制備用于治療CNS疾病例如神經(jīng)退行性疾病的藥物中的用途。
優(yōu)選地，所述的CNS疾病為阿耳茨海默氏病。
Tau為參與阿耳茨海默氏病的病因?qū)W的GSK-3底物。在健康的神經(jīng)細胞中，Tau與微管蛋白共聚成微管。但是，在阿耳茨海默氏病中，tau形成了大的絲狀纏結(jié)，破壞了神經(jīng)細胞中的微管結(jié)構(gòu)，從而損壞營養(yǎng)的傳輸以及神經(jīng)信息的傳遞。
盡管不希望被理論所束縛，GSK3抑制劑被認為能預防和/或逆轉(zhuǎn)微管-相關(guān)蛋白tau的異常高度磷酸化，后者是阿耳茨海默氏病以及許多其它的神經(jīng)退行性疾病如進行性核上性麻痹、皮質(zhì)基質(zhì)變性以及皮克氏病的不變特征。tau基因中的突變引起額顳癡呆(fronto-temporal dementia)的遺傳形式，進一步支持tau蛋白功能障礙與神經(jīng)退行性變化之間的關(guān)系[40]。
本發(fā)明另一方面涉及式I的化合物或其可藥用鹽，在制備用于治療雙相性精神障礙(bipolar disorder)的藥物中的用途。
另一方面，本發(fā)明涉及式I的化合物或其可藥用鹽，在制備用于治療中風的藥物中的用途。
降低神經(jīng)元細胞凋亡是頭外傷、中風、癲癇癥以及運動神經(jīng)元疾病中的重要的治療目標[4]。因此，作為神經(jīng)元細胞中的促細胞凋亡因子，GSK3使該蛋白激酶成為設(shè)計用于治療這些疾病的抑制性藥物中有吸引力的治療靶標。GSK3抑制劑能夠預防和/或逆轉(zhuǎn)微管-結(jié)合的蛋白tau的異常高度磷酸化，后者是阿耳茨海默氏病以及大量的其他的神經(jīng)退行性疾病如進行性核上性麻痹、皮質(zhì)基質(zhì)退化以及皮克氏病的不變特征。tau基因中的突變導致額顳癡呆的遺傳形式，進一步證實了tau蛋白功能障礙與神經(jīng)退行性過程的相關(guān)性[5]。
本發(fā)明另一方面涉及式I的化合物或其可藥用鹽，在制備用于治療脫發(fā)癥(alopecia)的藥物中的用途。
毛發(fā)生長受Wnt信號通路尤其是Wnt-3信號通路的控制。在皮膚的組織培養(yǎng)模型體系中，β-聯(lián)蛋白(β-聯(lián)蛋白)的不可降解的突變體的表達導致推定的干細胞的數(shù)量顯著增加，所述干細胞具有更大的增殖活性(proliferativepotential)[6]。這種干細胞群體表達高水平的非-鈣粘蛋白-相關(guān)的β-聯(lián)蛋白[7]，其可促進高的增殖活性。此外，皮膚中過量表達截短的β-聯(lián)蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)生全新的發(fā)-囊形態(tài)發(fā)生，后者在正常情況下只在胚胎形成中才發(fā)生。因此，這凸現(xiàn)出了下述可能性GSK3抑制劑的異位使用可用于治療光禿并可用于化療誘導的脫發(fā)癥的頭發(fā)生長的恢復。
本發(fā)明另一方面涉及一種治療GSK3-依賴性疾病的方法，所述的方法包括對需要該治療的患者以足以抑制GSK3的量給藥如上定義的式I的化合物或其可藥用鹽。
優(yōu)選地，式I的化合物或其可藥用鹽，以足以抑制GSK3β的量給藥。
在本發(fā)明的一個實施方案中，式I的化合物以足以抑制至少一種PLK酶的量給藥。
polo樣激酶(PLKs)由絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族組成。在polo位點的有絲分裂果蠅melanogaster突變顯示出紡錘體異常[41]，并且發(fā)現(xiàn)polo編碼有絲分裂激酶[42]。在人體中，存在三種高度相關(guān)的PLKs[43]。它們包含高度同源的氨基-端催化性激酶結(jié)構(gòu)域并且其羧基端包含兩個或三個保守區(qū)域，polo盒。目前不完全了解polo盒的功能，但是其參與將PLKs靶向亞細胞區(qū)[44，45]、調(diào)節(jié)與其它蛋白的相互作用[46]或或可構(gòu)成自調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域部分[47]。此外，polo盒-依賴性PLK1活性對正確的中期/后期轉(zhuǎn)換以及胞質(zhì)分裂是必須的[48，49]。
研究表明人PLKs調(diào)節(jié)有絲分裂的一些基本方面[50，51]。具體地，認為PLK1活性對G2后期/前期早期中的中心體的功能性成熟以及隨后的雙極紡錘體的形成是必需的。通過小的干擾RNA(siRNA)技術(shù)消耗細胞內(nèi)PLK1已經(jīng)證實，該蛋白對多重有絲分裂過程以及胞質(zhì)分裂的完成是必需的[52]。
在本發(fā)明更優(yōu)選的實施方案中，式I的化合物以足以抑制PLK1的量給藥。
在三種人PLK中，PLK1得到最好的表征；其調(diào)節(jié)多種細胞裂分周期活性(cell division cycle effect)，包括有絲分裂的起始[53，54]、DNA-損害關(guān)卡激活[55，56]、后期促進復合物的調(diào)節(jié)[57-59]、蛋白酶體的磷酸化[60]以及中心體的復制以及成熟[61]。
具體地，有絲分裂的啟動要求活化M-期促進因子(MPF)，細胞周期蛋白依賴性激酶CDK1和B-型細胞周期蛋白之間的復合物[62]。后者在細胞周期的S和G2期聚集，并由WEE1、MIK1和MYT1激酶促進對MPF復合物的磷酸化抑制作用。在G2期末期，由雙重-特異性磷酸酶CDC25C導致的相應脫磷酸作用引發(fā)MPF的活化[63]。在分裂間期，細胞周期蛋白B定位至細胞質(zhì)[64]，然后在前期磷酸化并且該事件引起核易位[65，66]。在前期的活性MPF的核聚集被認為對啟動M-期事件是重要的[67]。但是，由于WEE1，核MPF保持無活性，除非被CDC25C抵消。磷酸酶CDC25C自身在分裂間期定位至細胞質(zhì)，并在前期在核中聚集[68-71]。周期蛋白B[60]和CDC25C[72]二者的核進入可被PLK1的磷酸化促進[54]。這種激酶是M-期啟動的重要調(diào)節(jié)因子。
在一個特別優(yōu)選的實施方案中，式I的化合物為PLK1的ATP-拮抗抑制劑。
在本發(fā)明中，ATP拮抗性指通過削弱或破壞ATP結(jié)合的方式可逆地或不可逆地在酶活性位點結(jié)合，抑制劑化合物減少或防止PLK催化活性，即從ATP磷酸轉(zhuǎn)移至大分子PLK底物的能力。
在另一優(yōu)選的實施方案中，式I的化合物以足以抑制PLK2和/或PLK3的量給藥。
哺乳動物PLK2(也稱為SNK)和PLK3(也稱為PRK和FNK)最初顯示為直接的早期基因產(chǎn)物。PLK3激酶活性似乎在S后期和G2期達到高峰。其也在DNA損害關(guān)卡活化以及嚴重的氧化應激期間活化。PLK3也在細胞中微管動力學和中心體功能的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，并且PLK3表達下調(diào)導致細胞周期停滯和細胞凋亡[73]。PLK2是三種PLKs中了解最少的。PLK2和PLK3二者可能還具有其它重要的有絲分裂后功能[46]。
給藥可使本發(fā)明的藥物組合物適于口服、直腸、陰道、腸胃外、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、支氣管內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、鼻、口腔或舌下給藥途徑。
對于口服給藥，特別利用壓縮片劑、藥丸、片劑、凝膠劑(gellules)、滴劑和膠囊劑。優(yōu)選地，這些組合物每劑包含1-250mg的有效成分，更優(yōu)選包含10-100mg的有效成分。
其它給藥形式包括溶液劑或乳劑，它們可經(jīng)靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)或肌內(nèi)給藥，并由無菌或可滅菌溶液制備。本發(fā)明的藥物組合物還可為栓劑、陰道栓劑、混懸劑、乳劑、洗劑、軟膏、乳膏劑、凝膠、噴霧劑、溶液劑或撲粉(dusting powder)的形式。
經(jīng)皮給藥的替代方式是利用透皮貼片(skin patch)。例如，可將有效成分摻入到由聚乙二醇含水乳液或液體石蠟組成的乳膏劑內(nèi)。還可以1-10wt％的濃度將有效成分摻入到由白蠟或白色軟石蠟基質(zhì)與所需要的穩(wěn)定劑和防腐劑共同組成的軟膏內(nèi)。
可注射形式每劑可包含10-1000mg的有效成分，優(yōu)選10-250mg的有效成分。
組合物可被配制成單位劑型，即包含單位劑量或單位劑量的多重單位或亞單位的形式的離散部分。
劑量本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員無需過度試驗就可容易地確定對患者給藥的本發(fā)明組合物的適宜劑量。通常，醫(yī)師會確定對個體患者最適合的實際劑量，并且根據(jù)多種因素包括使用的具體化合物的活性、化合物的代謝穩(wěn)定性以及作用時間的長短、病人的年齡、體重、一般健康狀況、性別、飲食、給藥的方式以及時間、排泄速率、藥物組合以及具體疾病的嚴重程度以及接受治療的個體進行調(diào)整。本文公開的劑量為一般情況的示例。當然也可有有益的較高或較低劑量范圍個別情況，這都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
根據(jù)需要，可以以0.01-30mg/kg體重，如0.1-10mg/kg體重，更優(yōu)選0.1-1mg/kg體重的劑量給藥所述藥物。
在示例性的實施方案中，對病人施用一或多劑10～150mg/天。
聯(lián)合給藥在特別優(yōu)選的實施方案中，一或多種式I化合物與一或多種其它的治療活性劑(例如，市場上提供的現(xiàn)有藥物)聯(lián)合給藥。在這種情況下，本發(fā)明的化合物可連續(xù)地、同時地或先后地與一或多種活性劑組合給藥。
抗癌癥藥通常在聯(lián)合使用的時候更有效。尤其地，為避免主要毒性作用、作用機制以及耐藥機制的重疊，聯(lián)合療法是理想的。此外，也可以以最大耐受劑量并在這些劑量之間以最小的時間間隔給藥大多數(shù)藥物也是理想的?；瘜W治療藥物聯(lián)合的主要優(yōu)勢在于可能通過生化相互作用促進加和的或可能的協(xié)同作用，并且也可能降低在早期腫瘤細胞中的耐藥性的出現(xiàn)，后者響應于用單藥進行的初始化療。生化相互作用在選擇藥物組合時的用途的實例通過下述事實得到證實施用亞葉酸增加5-氟尿嘧啶的活性細胞內(nèi)代謝物對其靶標胸苷酸合酶的結(jié)合，從而增加其細胞毒性活性。
許多聯(lián)合藥物目前已經(jīng)用于癌癥和白血病的治療中。醫(yī)學實踐的更廣泛的綜述可見“Oncologic Therapies”，由E.E.Vokes和H.M.Golomb編著，由Springer出版。
通過研究受試化合物與已知的或認為在最初治療具體的癌癥中或衍生自癌癥的細胞系中有價值的化合物的抑制活性，從而可建議有利的組合。這種方法也可用于測定施用藥物的順序，即，之前、同時或之后。所述的給藥方案可為這里鑒別的所有細胞周期作用藥物的特征。
測定本發(fā)明另一方面涉及如前定義的式I化合物或其可藥用鹽在用于鑒別其它的候選化合物的測定中的用途，所述候選化合物能影響一或多種選自周期蛋白依賴性激酶、aurora激酶、GSK以及polo-樣激酶的激酶的活性。
優(yōu)選地，所述的測定能鑒定能夠抑制一或多種選自周期蛋白依賴性激酶、aurora激酶、GSK以及polo-樣激酶的激酶的候選化合物。
優(yōu)選地，所述的測定為競爭性結(jié)合測定。
這里所用的術(shù)語“候選化合物”包括但不限于從任何合適的途徑獲得的或者產(chǎn)生的化合物，無論是否來自天然的途徑。
候選化合物可以從化合物庫設(shè)計或者從化合物庫得到，化合物庫包括肽以及其他的化合物，如小的有機分子并且尤其是新的先導化合物。例如，候選化合物可為天然物質(zhì)、生物大分子或者源自生物材料-如細菌、真菌或者動物(尤其是哺乳動物)細胞或者組織的提取物、有機或者無機分子、合成的候選化合物、半合成的候選化合物、結(jié)構(gòu)或者功能模擬物、肽、肽模擬物、衍生化的候選化合物、從全蛋白裂解的肽技術(shù)得到，或者合成方法得到的肽，例如，或者利用肽合成儀或者利用重組技術(shù)或其組合、重組的候選化合物、天然或者非天然的候選化合物、融合肽或者其等當物以及突變體、其衍生物或者組合物。候選化合物甚至可以為周期蛋白依賴性激酶、aurora激酶、GSK以及polo-樣激酶的調(diào)節(jié)劑的化合物，如已經(jīng)通過某種方式例如通過重組DNA技術(shù)或者化學合成技術(shù)修飾的已知抑制劑。
通常，候選化合物可以通過重組DNA技術(shù)和/或化學合成技術(shù)進行制備。
一旦確定能與周期蛋白依賴性激酶、aurora激酶、GSK以及polo-樣激酶相互作用的候選化合物，可以進行其他的步驟以選擇和/或修飾候選化合物和/或修飾現(xiàn)有的化合物，以使其能夠調(diào)節(jié)周期蛋白依賴性激酶、aurora激酶、GSK或者polo-樣激酶。
優(yōu)選地，所述的候選化合物是通過對本發(fā)明化合物進行常規(guī)SAR修飾而產(chǎn)生。
這里所用的術(shù)語“常規(guī)SAR修飾”指通過化學衍生化改變給定的化合物的本領(lǐng)域公知的標準方法。
因此，一方面，鑒別的化合物可用作模型(例如，模板)，用于開發(fā)其他的化合物。在這些測試中使用的化合物可為溶液中的游離狀態(tài)、固定到固相支持物上、結(jié)合至細胞表面或位于細胞內(nèi)。可測量在所述的化合物和測試的試劑之間的結(jié)合復合物的形成或活性的缺失。
本發(fā)明的分析可為一種篩選，其中測試大量的試劑。一方面，本發(fā)明的分析方法為高通量篩選。
本發(fā)明還包括利用競爭性藥物篩選分析，其中能結(jié)合化合物的中和抗體特異地與受試化合物競爭結(jié)合化合物。
用于篩選的另一種技術(shù)為對物質(zhì)具有合適的結(jié)合親和力的試劑的高通量篩選(HTS)，并且基于在WO 84/03564中詳細描述的方法。
預期本發(fā)明的分析方法適于小和大規(guī)模的受試化合物的篩選以及用于定量分析。
本發(fā)明一方面涉及一種方法，包括下述步驟(a)進行上述的測定方法；(b)鑒別一或多種能結(jié)合周期蛋白依賴性激酶、aurora激酶、GSK以及polo-樣激酶的候選化合物；以及(c)制備一定量的所述一或多種候選化合物。
本發(fā)明另一方面提供了一種方法，包括下述步驟(a)進行上述的測定方法；(b)鑒別一或多種能結(jié)合周期蛋白依賴性激酶、aurora激酶、GSK以及polo-樣激酶的候選化合物；以及(c)制備包括所述的一或多種所述候選化合物的藥物組合物。
本發(fā)明另一方面涉及一種方法，包括下述步驟(a)進行上述的測定方法；(b)鑒別一或多種能結(jié)合周期蛋白依賴性激酶、aurora激酶、GSK以及polo-樣激酶的候選化合物；(c)修飾一或多種所述的能結(jié)合周期蛋白依賴性激酶、aurora激酶、GSK以及polo-樣激酶的候選化合物；(d)進行上述的測定方法；(e)任選地制備包括所述的一或多種候選化合物的藥物組合物。
本發(fā)明還涉及利用上述方法鑒定的候選化合物。
本發(fā)明另一方面還涉及包括利用上述方法鑒定的候選化合物的藥物組合物。
本發(fā)明另一方面涉及利用上述方法鑒定的候選化合物在制備用于治療增生性疾病的藥物組合物中的用途。
上述方法可用于篩選用作周期蛋白依賴性激酶、aurora激酶、GSK以及polo-樣激酶抑制劑的候選化合物。
合成本發(fā)明另外一方面涉及用于制備式I化合物的制備方法，所述的方法包括將式9的化合物與式10的化合物反應以形成式I的化合物，其中R1-6如上定義。
本發(fā)明另一方面涉及制備式I化合物的替代性方法，所述的方法包括將式15化合物與式3化合物反應以形成式I化合物，其中R1-6如上定義。

通式結(jié)構(gòu)I的化合物其中Z1為N，即2，4-二取代的嘧啶，可以通過Traube嘧啶合成方法的變通方法制備得到[8，9](流程1)。在這些步驟中，I(Z1＝N)中的嘧啶環(huán)通過下述方法形成縮合1，3-二羰基化合物8或相應的烯氨酮9(其中R為例如Me)以及芳基胍10[10]。后者可從芳基胺11利用許多方法[11，12]制備得到，例如通過用氨腈反應。二酮8可從2-?；邕?得到，利用酰鹵7(例如X＝Cl)或相應的酸酐進行酰化。在其中R6＝H的情形下，5的甲?；瘜⑻峁┫鄳耐?醛8。二羰基化合物8然后用適當?shù)膲AHNR2能夠轉(zhuǎn)化為烯胺酮9。如果R5和R6都是H，則烯胺酮9可直接由?；邕?制備得到，借助甲脒、酰胺縮醛(例如二甲基甲酰胺二甲基縮醛)，或縮醛胺酯(例如叔丁氧基雙(二甲基氨基)甲烷)[13]。
流程12-?；邕?可按照下述步驟制備，鋰化噻唑6的C2，然后將鋰化的中間體與醛R5CH2CHO反應并氧化形成的醇得到?；邕?。或者，鋰化的噻唑可用適當?shù)孽5CH2COOR、酰氯R5CH2COCl，或酸酐(R5CH2CO)2O?；缘玫?-酰基噻唑5[14，15]。也可能借助乙基溴化鎂從2-未取代的噻唑6制備格林雅試劑，然后將這些試劑與酸酐(R5CH2CO)2O反應以得到2-?；邕?[16]。制備2-酰基噻唑5[17]的另一種通用的方法起始自2-羥基丙腈1，后者可通過HCN對醛R5CH2CHO的加成而制備得到。進行醇功能團的保護，例如作為四氫吡喃醚(PG＝四氫吡喃-2-基)的形式，然后將腈官能團轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物2中的硫代乙酰胺，用例如包含二乙基胺的硫化氫-飽和的乙醇溶液處理。根據(jù)Hantzsch噻唑合成方法[8]，硫代酰胺2然后可與α-鹵代酮3縮合，然后去除保護基，得到1-噻唑-2-基-乙醇4。這些化合物隨后氧化，例如借助重鉻酸鉀在冰醋酸的溶液，得到酮5。
通式I化合物的的替代性合成路線顯示在流程2中。
流程2衍生自丙酮酸乙基酯12[18]的這里的烯胺酮13，與芳基胍10縮合[19]。產(chǎn)物嘧啶酯14能很方便地轉(zhuǎn)化成相應的一級甲酰胺，例如用氨的乙醇溶液[20，21]。甲酰胺官能團然后轉(zhuǎn)化成硫代甲酰胺，例如利用Lawesson試劑[22-24]、五硫化磷[18，20，21]，或硫化銨[25]。也可以按照下述方法實現(xiàn)同樣的轉(zhuǎn)化活化酰胺作為吡啶基三氟磺酸酯，然后用硫化銨進行硫解[26]。
無論通式I中的Z1為N(嘧啶)或CH(吡啶)，普遍適用的路線涉及2-鹵代-4-氰基-嘧啶(流程2；18，Z1＝N)或吡啶(18，Z1＝CH)作為關(guān)鍵的中間體。這可通過本領(lǐng)域中公知的許多方法制備得到[27-29]。在嘧啶(Z1＝N)的情形下，方便的合成[30]起始自4-甲基-1H-嘧啶-2-酮16，后者肟化為17。這些醛肟可脫水得到相應的腈，并且如果脫水利用例如三氯氧磷進行，則直接得到氯代腈18(X＝Cl)[31]。然后18中的鹵素(X)可用芳基胺11取代得到中間體19[32]。19中的腈官能團然后氧化得到硫代甲酰胺15，例如利用包含硫化銨的甲醇溶液回流。最終，形成噻唑環(huán)，例如通過在有機堿如吡啶存在下加熱15和合適的α-鹵代酮3的甲醇溶液。當使用微波輻照的時候，這些反應進行地特別平穩(wěn)。
本發(fā)明進一步通過實施例并參考下述附圖進行描述，其中

圖1顯示HEK293細胞響應于暴露于化合物XIV(受試化合物)時β-聯(lián)蛋白蓄積的缺失。
圖2顯示在ZDF fa/fa大鼠中化合物XIV對口服葡萄糖耐量的作用。受試化合物對10-11周齡ZDF大鼠以5mg/kg i.v.在-270和-30分鐘給藥。在0分鐘，給藥2g/kg口服葡萄糖，并以15分鐘的時間間隔收集血樣以測定血液葡萄糖水平。
實施例本發(fā)明的實施例化合物列在表1中。
實施例1概述使用Varian INOVA-500儀器獲得NMR光譜?；瘜W位移相對于四甲基硅烷內(nèi)標物以百萬分率(ppm)給出。利用電噴霧離子化(ESI)，使用WatersZQ2000單四極質(zhì)譜儀獲得質(zhì)譜。分別使用Vydac 218TP54(250×4.6mm)和218TP1022(250×22mm)柱，進行分析和制備性RP-HPLC。使用H2O/MeCN系統(tǒng)(含有0.1％CF3COOH)，以1mL/分鐘(分析柱)和9mL/分鐘(制備柱)的流動速率進行線性梯度洗脫。通過對色譜圖進行積分(λ＝254nm)，以評價純度。硅膠(EM Kieselgel 60，0.040-0.063mm，Merck)或ISOLUTE預填充柱(Jones Chromatography Ltd.UK)用于快速色譜。
實施例23-二甲基氨基-1-噻唑-2-基-丙烯酮將1-噻唑-2-基-乙酮(1.9g，14.9mmol)和二甲基甲酰胺二甲基縮醛(1.98mL，14.9mmol)混合并在85℃加熱8小時。冷卻并濃縮后，將殘留物從乙醚中結(jié)晶并過濾得到形成的固體標題化合物(1.56g，58％)。
1H-NMR(DMSO-d6)δ2.91 & 3.19(6H，s，N(CH3)2)，6.01(1H，s，CH)，7.82(1H，s，CH)，7.92(1H，d，ArH，J＝3.4Hz)，7.95(1H，d，ArH，J＝3.4Hz)。ESI-MSm/z 183[M+1]+；C8H10N2OS理論值182.24。Anal RP-HPLCtR18.4分鐘(0-60％MeCN梯度，用20分鐘)；純度＞95％。
3-二甲基氨基-1-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-丙烯酮將1-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-乙酮(1.8g，11.8mmol)和二甲基甲酰胺二甲基縮醛(1.7mL，14.2mmol)混合并在85℃加熱8小時。冷卻后，過濾得到的結(jié)晶固體并用冷乙醚洗滌(2.1g，85％)。
1H-NMR(DMSO-d6)δ2.25(3H，s，CH3)，2.38(3H，s，CH3)，2.81 & 3.18(6H，s，N(CH3)2)，5.91(1H，s，CH)，7.79(1H，s，CH)。ESI-MSm/z 210[M+1]+；C10H14N2OS理論值210.08。Anal.RP-HPLCtR14.5分鐘(0-60％MeCN梯度，用20分鐘)；純度＞95％。
實施例3(6-氯-吡啶-3-基)-(4-噻唑-2-基-嘧啶-2-基)-胺(XIV)將3-二甲基-氨基-1-噻唑-2-基-丙烯酮(120mg，0.66mmol)、N-(6-氯-吡啶-3-基)-胍硝酸鹽(154mg，0.66mmol)，6-氯-吡啶-3-基胺用氨腈的水溶液在硝酸存在下胍基化，以及碳酸鉀(228mg，1.66mmol)在2-甲氧基乙醇中混合并將混合物在120℃加熱20小時。過濾去除不溶的無機物并將濾液濃縮。將殘留物經(jīng)過硅膠柱層析分級。富集適當?shù)南疵摷壏植⑷コ軇┑玫綐祟}化合物(69mg，27％)。
1H-NMR(DMSO-d6)δ7.48(1H，d，ArH，J＝8.3Hz)，7.54(1H，d，ArH，J＝4.9Hz)，8.04(1H，d，ArH，J＝3.4Hz)，8.11(1H，d，ArH，J＝3.4Hz)，8.25(1H，dd，ArH，J＝8.3，2.9Hz)，8.69(1H，d，ArH，J＝4.9Hz)，8.85(1H，d，ArH，J＝2.9Hz)，10.19(1H，s，NH)。ESI-MSm/z 290[M+H]+；C12H8ClN5S理論值289.02。Anal.RP-HPLCtR20.45分鐘(0-60％MeCN梯度，用20分鐘)；純度＞95％。
在表1中列出的實施例化合物VIII-XIII、XVI、XVII-XX、XXIII和XXVII類似地制備得到，通過將適當?shù)?-二甲基-氨基-1-噻唑-2-基-丙烯酮和苯基-或吡啶基-胍進行縮合。
N-[4-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基]-苯-1，3-二胺(VIII)1H-NMR(DMSO-d6)δ2.36(3H，s，CH3)，2.43(3H，s，CH3)，4.86(2H，s，NH2)，6.21(1H，d，ArH，J＝8.7Hz)，6.93(1H，dd，ArH，J＝8.7，8.7Hz)，6.98(1H，d，ArH，J＝8.7Hz)，7.02(1H，s，ArH)，7.30(1H，d，ArH，J＝5.4Hz)，8.52(1H，d，ArH，J＝5.4Hz)，9.46(1H，s，NH)。ESI-MSm/z 298.3[M+H]+；C15H15N5S理論值297.10。Anal.RP-HPLCtR14.61分鐘(0-60％MeCN梯度，用20分鐘)；純度＞95％。
3-[4-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基氨基]-苯酚(IX)1H-NMR(DMSO-d6)δ2.36(3H，s，CH3)，2.44(3H，s，CH3)，6.39(1H，d，ArH，J＝8.8Hz)，7.07(1H，dd，ArH，J＝8.8，8.8Hz)，7.36(2H，m，ArH)，7.34(1H，d，ArH，J＝5.4Hz)，8.56(1H，d，ArH，J＝5.4Hz)，9.36(1H，s，OH)，9.64(1H，s，NH)。ESI-MSm/z 299.3[M+H]+；C15H14N4OS理論值298.09。Anal.RP-HPLCtR18.44分鐘(0-60％MeCN梯度，用20分鐘)；純度＞95％。
-(3-三氟甲基-苯基)-胺(X)1H-NMR(DMSO-d6)δ2.36(3H，s，CH3)，2.44(3H，s，CH3)，7.31(1H，d，ArH，J＝8.8Hz)，7.42(1H，d，ArH，J＝5.4Hz)，7.54(1H，d，ArH，J＝8.8，8.8Hz)，7.94(1H，d，ArH，J＝8.8Hz)，8.41(1H，s，ArH)，8.62(1H，d，ArH，J＝5.4Hz)，10.16(1H，s，NH)。ESI-MSm/z 351.4[M+1]+；C16H13F3N4S理論值350.08。Anal.RP-HPLCtR20.07分鐘(20-80％MeCN梯度，用20分鐘)；純度＞95％。
(4-氯-3-三氟甲基-苯基)-[4-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基]-胺(XI)1H-NMR(DMSO-d6)δ2.36(3H，s，CH3)，2.43(3H，s，CH3)，7.46(1H，d，ArH，J＝5.4Hz)，7.65(1H，d，ArH，J＝8.8Hz)，7.98(1H，dd，ArH，J＝8.8，2.9Hz)，8.52(1H，d，ArH，J＝2.9Hz)，8.65(1H，d，ArH，J＝5.4Hz)，10.38(1H，s，NH)。ESI-MSm/z 385.3[M+H]+；C16H12ClF3N4S理論值384.04。Anal.RP-HPLCtR24.67分鐘(20-80％MeCN梯度，用20分鐘)；純度＞95％。
-(3-硝基-苯基)-胺(XII)1H-NMR(DMSO-d6)δ2.38(3H，s，CH3)，2.45(3H，s，CH3)，7.47(1H，d，ArH，J＝5.4Hz)，7.61(1H，dd，ArH，J＝8.8，8.8Hz)，7.84(1H，d，ArH，J＝8.8Hz)，8.08(1H，d，ArH，J＝8.8Hz)，8.67(1H，d，ArH，J＝5.4Hz)，9.98(1H，s，ArH)，10.34(1H，s，NH)。ESI-MSm/z 328.4[M+H]+；C15H13N5O2S理論值327.08。Anal.RP-HPLCtR23.70分鐘(10-70％MeCN梯度，用20分鐘)；純度＞95％。
(6-甲氧基-吡啶-3-基)-(4-噻唑-2-基-嘧啶-2-基)-胺(XIII)1H-NMR(DMSO-d6)δ3.72(3H，s，OCH3)，6.82(1H，d，ArH，J＝8.8Hz)，7.43(1H，d，ArH，J＝4.9Hz)，7.99(1H，d，ArH，J＝3.4Hz)，8.03(1H，dd，ArH，J＝8.8，2.9Hz)，8.08(1H，d，ArH，J＝3.4Hz)，8.56(1H，d，ArH，J＝2.9Hz)，8.60(1H，d，ArH，J＝4.9Hz)，9.76(1H，s，NH)。ESI-MSm/z 285[M+H]+；C13H11N5OS理論值285.07。Anal.RP-HPLCtR16.49分鐘(0-60％MeCN梯度，用20分鐘)；純度＞95％。
-(6-甲氧基-吡啶-3-基)-胺(XVI)1H-NMR(DMSO-d6)δ2.36(3H，s，CH3)，2.44(3H，s，CH3)，3.83(3H，s，OCH3)，6.83(1H，d，ArH，J＝8.8Hz)，7.34(1H，d，ArH，J＝5.4Hz)，8.02(1H，dd，ArH，J＝2.9Hz)，8.55(1H，d，ArH，J＝5.4Hz)，8.56(1H，d，ArH，J＝2.9Hz)，9.70(1H，s，NH)。ESI-MSm/z 314.32[M+H]+；C15H15N5OS理論值313.10。Anal.RP-HPLCtR20.26分鐘(0-60％MeCN梯度，用20分鐘)；純度＞95％。
(6-氯-吡啶-3-基)-[4-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基]-胺(XVII)1H-NMR(DMSO-d6)δ2.36(3H，s，CH3)，2.45(3H，s，CH3)，7.44(1H，d，ArH，J＝5.4Hz)，7.48(1H，d，ArH，J＝8.8Hz)，8.21(1H，dd，ArH，J＝8.8，2.9Hz)，8.62(1H，d，ArH，J＝5.4Hz)，8.67(1H，d，ArH，J＝2.9Hz)，10.13(1H，s，NH)。ESI-MSm/z 318.24[M+H]+；C14H12ClN5S理論值317.05。Anal.RP-HPLCtR21.72分鐘(10-70％MeCN梯度，用20分鐘)；純度＞95％。
-(4-嗎啉-4-基-苯基)-胺(XVIII)1H-NMR(DMSO-d6)δ2.36(3H，s，CH3)，2.44(3H，s，CH3)，3.05(4H，m，嗎啉-H)，3.74(4H，m，嗎啉-H)，6.92(1H，d，J＝8.5Hz，ArH)，7.28(1H，d，J＝5.0Hz，嘧啶-H)，7.65(1H，d，J＝8.5Hz，ArH)，8.51(1H，d，J＝5.0Hz，嘧啶-H)，9.54(1H，s，NH)。ESI-MSm/z 368.5[M+H]+；C19H21N5OS理論值367.15。Anal.RP-HPLCtR13.77分鐘(10-70％MeCN梯度，用20分鐘)；純度＞95％。
-(4-甲基-3-硝基-苯基)-胺(XIX)1H-NMR(CDCl3)δ2.43(3H，s，CH3)，2.47(3H，s，CH3)，2.58(3H，s，CH3)，7.29(1H，d，J＝8.0Hz，ArH)，7.35(1H，s，NH)，7.52(1H，d，J＝5.5Hz，嘧啶-H)，7.59(1H，dd，J＝8.0，2.5Hz，ArH)，8.52(1H，d，J＝5.5Hz，嘧啶-H)，8.72(1H，d，J＝2.5Hz，ArH)。ESI-MS；m/z 342.4[M+H]+；C16H15N5O2S理論值341.09。Anal.RP-HPLCtR10.49分鐘(10-70％MeCN梯度，用20分鐘)；純度＞95％。
4-[4-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基氨基]-苯酚(XX)1H-NMR(CDCl3)δ2.40(3H，s，CH3)，2.43(3H，s，CH3)，6.84(1H，m，ArH)，7.37(1H，d，J＝5.0Hz，嘧啶-H)，7.47(1H，m，ArH)，8.40(1H，d，J＝5.0Hz，嘧啶-H)。ESI-MSm/z 299.4[M+H]+；C15H14N4OS理論值298.09。Anal.RP-HPLCtR13.42分鐘(10-70％MeCN梯度，用20分鐘)；純度＞95％。
(6-吡咯烷-1-基-吡啶-3-基)-(4-噻唑-2-基-嘧啶-2-基)-胺(XXIII)1H-NMR(DMSO-d6)δ1.80(2H，m，CH2)，1.94(2H，m，CH2)，3.05(2H，m，NCH2)，3.36(2H，m，NCH2)，6.44(1H，d，ArH，J＝8.8Hz)，7.34(1H，d，ArH，J＝5.4Hz)，7.84(1H，d，ArH，J＝8.8Hz)，7.98(1H，d，ArH，J＝3.4Hz)，8.06(1H，d，ArH，J＝3.4Hz)，8.38(1H，s，ArH)，8.54(1H，d，ArH，J＝5.4Hz)，9.45(1H，s，NH)。ESI-MSm/z 325.41[M+H]+；C16H16N6S理論值324.40。Anal.RP-HPLCtR14.80分鐘(0-60％MeCN梯度，用20分鐘)；純度＞95％。
(6-氯-5-甲基-吡啶-3-基)-(4-噻唑-2-基-嘧啶-2-基)-胺(XXVII)1H-NMR(DMSO-d6)δ2.36(3H，s，CH3)，7.54(1H，d，ArH，J＝4.9Hz)，8.05(1H，d，ArH，J＝2.9Hz)，8.11(1H，d，ArH，J＝2.9Hz)，8.29(1H，d，ArH，J＝2.9Hz)，8.65(1H，d，ArH，J＝2.9Hz)，8.71(1H，d，ArH，J＝4.9Hz)，10.16(1H，s，NH)。ESI-MSm/z 304.37[M+H]+；C13H10ClN5S理論值303.77。Anal.RP-HPLCtR23.19分鐘(0-60％MeCN梯度，用20分鐘)；純度＞95％。
實施例42-氧代-1，2-二氫-嘧啶-4-醛肟在15℃下，向4-甲基-1H-嘧啶-2-酮鹽酸鹽(14.7g，0.1mol)的50％乙酸水溶液(100mL)中，在劇烈攪拌下一次性地加入亞硝酸鈉(10.4g，0.15mol)。放熱反應(～40℃)后，形成黃色的沉淀。過濾，用冷水洗滌，并真空干燥得到標題化合物(13.51g，97％)。
1H-NMR(DMSO-d6)δ6.65(1H，d，ArH，J＝6.4Hz)，7.75(1H，s，CH)，7.91(2H，d，ArH，J＝6.4Hz)，11.87(1H，s，NH)，12.41(1H，s，OH)。ESI-MSm/z139.89[M+H]+；C5H5N3O2理論值139.11。Anal.RP-HPLCtR5.35分鐘(0-60％MeCN梯度，用20分鐘)；純度＞95％。
2-氯-嘧啶-4-腈將2-氧代-1，2-二氫-嘧啶-4-醛肟(5g，0.036mol)在冷的三氯氧磷(20mL)中的溶液緩慢溫熱直到開始劇烈的反應，這時中止溫熱。一旦完全溶解，加入二乙基-苯基-胺(2.5mL)并將反應混合物回流30分鐘。冷卻后，將混合物傾倒在～150g冰上并萃取到二氯甲烷(5×30mL)中，然后用飽和的碳酸氫鈉溶液(2×50mL)和水(2×50mL)洗滌，在無水硫酸鎂上干燥。去除溶劑后，將殘留物真空干燥并放置固化。不需要進一步的純化。
1H-NMR(DMSO-d6)δ7.63(1H，d，ArH，J＝4.9Hz)，8.89(1H，d，ArH，J＝4.9Hz)。Anal.RP-HPLCtR12.07分鐘(0-60％MeCN梯度，用20分鐘)；純度＞95％。
2-(4-氯-苯基氨基)-嘧啶-4-腈將2-氯-嘧啶-4-腈(1.03g，7.38mmol)和4-氯苯胺(0.94g，7.38mmol)溶解在乙醇(10mL)中并將溶液在100℃加熱90分鐘。冷卻后，將標題產(chǎn)物從反應混合物中結(jié)晶并過濾(0.84g，42％)。
1H-NMR(DMSO-d6)δ7.37(2H，d，ArH，J＝8.8Hz)，7.42(1H，d，ArH，J＝4.9Hz)，7.72(2H，d，ArH，J＝8.8Hz)，8.78(1H，d，ArH，J＝4.9Hz)，10.32(1H，s，NH)。ESI-MSm/z 231.16[M+H]+；C11H7ClN4理論值230.65。Anal.RP-HPLCtR22.41分鐘(0-60％MeCN梯度，用20分鐘)；純度＞95％。
2-(4-氯-苯基氨基)-嘧啶-4-硫代甲酰胺(carbothioic acid amid)將2-(4-氯-苯基氨基)-嘧啶-4-腈(463mg，2.01mmol)和硫化銨(20％w/w的H2O溶液，4mL)在甲醇(10mL)中的溶液加熱回流5小時。冷卻后，加入水(1mL)并過濾形成的沉淀得到標題化合物(369mg，69％)。
1H-NMR(DMSO-d6)δ7.44(2H，d，ArH，J＝8.8Hz)，7.53(1H，d，ArH，J＝4.9Hz)，7.78(2H，d，ArH，J＝8.8Hz)，8.64(1H，d，ArH，J＝4.9Hz)，9.61 &10.39(2H，s，S＝CNH2)，9.92(1H，s，NH)。ESI-MSm/z 265.81[M+H]+；C11H9ClN4S理論值264.73。Anal.RP-HPLCtR22.03分鐘(0-60％MeCN梯度，用20分鐘)；純度＞95％。
2-(6-氯-吡啶-3-基氨基)-嘧啶-4-腈該化合物從2-氯-嘧啶-4-腈和6-氯-吡啶-3-基胺制備得到。
1H-NMR(DMSO-d6)δ7.48(1H，d，ArH，J＝4.9Hz)，7.51(1H，d，ArH，J＝8.8Hz)，8.17(1H，dd，ArH，J＝8.8，2.9Hz)，8.70(1H，d，ArH，J＝2.9Hz)，8.83(1H，d，ArH，J＝4.9Hz)，10.51(1H，s，NH)。ESI-MSm/z 231[M]+；C10H6ClN5理論值231.03。Anal.RP-HPLCtR17.84分鐘(0-60％MeCN梯度，用20分鐘)；純度＞95％。
2-(6-氯-吡啶-3-基氨基)-嘧啶-4-硫代甲酰胺該化合物從2-(6-氯-吡啶-3-基氨基)-嘧啶-4-腈制備得到，用硫化銨以上述針對2-(4-氯-苯基氨基)-嘧啶-4-硫代甲酰胺描述的類似的方式。
1H-NMR(DMSO-d6)7.36(1H，d，ArH，J＝4.9Hz)，7.45(1H，d，ArH，J＝8.8Hz)，7.83 & 7.94(2H，s，S＝CNH2)，8.28(1H，dd，ArH，J＝8.8，2.9Hz)，8.74(2H，m，ArH)，10.16(1H，s，NH)。ESI-MSm/z 265[M+H]+(～20％)；C10H8ClN5S理論值265.02。Anai.RP-HPLCtR13.94分鐘(0-60％MeCN梯度，用20分鐘)；純度＞95％。
實施例51-{2-[2-(4-氯-苯基氨基)-嘧啶-4-基]-4-甲基-噻唑-5-基}-乙酮(II)將2-(4-氯-苯基氨基)-嘧啶-4-硫代甲酰胺(31mg，0.113mmol)、3-氯-戊烷-2，4-二酮(30μL，0.249mmol)和吡啶(14μL，0.17mmol)在甲醇(2mL)中的溶液在150℃在Smith Creator微波反應器(Personal Chemistry AB，Uppsala，Sweden)中加熱15分鐘。冷卻后，過濾收集形成的標題化合物的沉淀，并用冷的甲醇洗滌(21mg，54％)。
1H-NMR(DMSO-d6)2.63(3H，s，CH3)，2.74(3H，s，C＝OCH3)，7.39(2H，d，ArH，J＝8.8Hz)，7.15(1H，d，ArH，J＝4.9Hz)，7.82(2H，d，ArH，J＝8.8Hz)，8.71(1H，d，ArH，J＝4.9Hz)，10.08(1H，s，NH)。ESI-MSm/z 345[M+H]+；C16H13ClN4OS理論值344.05。Anal.RP-HPLCtR24.34分鐘(10-70％MeCN梯度，用20分鐘)；純度＞95％。
在表1中列出的實施例化合物III-VII、XV、XXII和XXIV-XXVI類似地進行制備，將2-(4-氯-苯基氨基)-嘧啶-4-硫代甲酰胺或2-(6-氯-吡啶-3-基氨基)-嘧啶-4-硫代甲酰胺與適當?shù)柠u代?；衔?1-氯-丙烷-2-酮、2-溴-1-苯基-乙酮、2-氯-3-氧代-丁酸乙基酯、4-氯-3-氧代-丁酸甲基酯、2-溴代-丙二酸二乙基酯、2-溴-丙酸乙基酯，或2-溴-4-羥基-丁酸乙基酯)反應制備得到。
(4-氯-苯基)-[4-(4-甲基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基]-胺(III)1H-NMR(DMSO-d6)2.47(3H，s，CH3)，7.36(2H，d，ArH，J＝8.8Hz)，7.44(1H，d，ArH，J＝4.9Hz)，7.59(1H，s，ArH)，7.84(2H，d，ArH，J＝8.8Hz)，8.64(1H，d，ArH，J＝4.9Hz)，9.98(1H，s，NH)。ESI-MSm/z 303[M+H]+；C14H11ClN4S理論值302.04。Anal.RP-HPLCtR20.74分鐘(20-80％MeCN梯度，用20分鐘)；純度＞95％。
2-[2-(4-氯-苯基氨基)-嘧啶-4-基]-4-羥基-噻唑-5-羧酸乙基酯(VII)1H-NMR(DMSO-d6)1.28(3H，t，CH3，J＝7.3Hz)，4.24(2H，q，CH2，J＝7.3Hz)，7.31(1H，d，ArH，J＝5.4Hz)，7.36(1H，d，ArH，J＝8.8Hz)，7.78(1H，d，ArH，J＝8.8Hz)，8.70(1H，d，ArH，J＝5.4Hz)，9.94(1H，s，NH)，12.18(1H，s，OH)。ESI-MSm/z 377.25[M+H]+；C16H13ClN4O3S理論值376.04。Anal.RP-HPLCtR20.90分鐘(20-80％MeCN梯度，用20分鐘)；純度＞95％。
1-{2-[2-(6-氯-吡啶-3-基氨基)-嘧啶-4-基]-4-甲基-噻唑-5-基}-乙酮(XV)1H-NMR(DMSO-d6)2.63(3H，s，CH3)，2.74(3H，s，C＝OCH3)，7.52(1H，d，ArH，J＝8.8Hz)，7.57(1H，d，ArH，J＝5.4Hz)，8.22(1H，dd，ArH，J＝8.8，2.9Hz)，8.75(1H，d，ArH，J＝5.4Hz)，8.86(1H，d，ArH，J＝2.9Hz)，10.28(1H，s，NH)。ESI-MSm/z 346[M+H]+；C15H12ClN5OS理論值345.05。Anal.RP-HPLCtR19.77分鐘(10-70％MeCN梯度，用20分鐘)；純度＞95％。
2-[2-(4-氯-苯基氨基)-吡啶-4-基]-5-甲基-噻唑-4-醇(XXII)1H-NMR(DMSO-d6)2.28(3H，s，CH3)，7.26(1H，d，ArH，J＝5.4Hz)，7.37(2H，d，ArH，J＝8.8Hz)，7.36(2H，d，ArH，J＝8.8Hz)，7.82(1H，d，ArH，J＝5.4Hz)，9.91(1H，s，NH)，10.61(1H，s，OH)。ESI-MSm/z 319.24[M+H]+；C15H12ClN3OS理論值317.04。Anal.RP-HPLCtR16.76分鐘(20-80％MeCN梯度，用20分鐘)；純度＞95％。
2-[2-(6-氯-吡啶-3-基氨基)-嘧啶-4-基]-4-羥基-噻唑-5-羧酸乙基酯(XXIV)1H-NMR(DMSO-d6)1.28(3H，t，CH3，J＝6.8Hz)，4.25(2H，q，OCH2，J＝6.8Hz)，7.43(1H，d，ArH，J＝4.9Hz)，7.50(1H，d，ArH，J＝8.8Hz)，8.18(1H，dd，ArH，J＝8.8，2.9Hz)，8.75(1H，d，ArH，J＝4.9Hz)，8.88(1H，d，ArH，J＝2.9Hz)，10.25(1H，s，NH)。ESI-MSm/z 378.42[M+H]+；C15H12ClN5O3S理論值377.81。Anal.RP-HPLCtR14.67分鐘(10-70％MeCN梯度，用20分鐘)；純度＞95％。
2-[2-(6-氯-吡啶-3-基氨基)-嘧啶-4-基]-5-甲基-噻唑-4-醇(XXV)1H-NMR(DMSO-d6)2.28(3H，s，CH3)，7.32(1H，d，ArH，J＝4.9Hz)，7.47(1H，d，ArH，J＝8.8Hz)，8.22(1H，dd，ArH，J＝8.8，2.9Hz)，8.62(1H，d，ArH，J＝4.9Hz)，8.86(1H，d，ArH，J＝2.9Hz)，10.10(1H，s，NH)，10.64(1H，s，OH)。
ESI-MSm/z 320.22[M+H]+；C13H10ClN5OS理論值319.77。Anal.RP-HPLCtR15.51分鐘(10-70％MeCN梯度，用20分鐘)；純度＞95％。
2-[2-(6-氯-吡啶-3-基氨基)-嘧啶-4-基]-5-(2-羥基-乙基)-噻唑-4-醇(XXVI)1H-NMR(DMSO-d6)2.83(2H，t，CH2，J＝6.7Hz)，3.35(CH2OH，J＝6.7Hz)，4.93(1H，s，OH)，7.33(1H，d，ArH，J＝5.4Hz)，7.47(1H，d，ArH，J＝8.3Hz)，8.22(1H，dd，ArH，J＝8.3，2.4Hz)，8.61(1H，d，ArH，J＝5.4Hz)，8.88(1H，d，ArH，J＝2.4Hz)，10.10(1H，s，NH)，10.66(1H，s，OH)。ESI-MSm/z 348.34[M+H]+；C14H12ClN5O2S理論值349.80。Anal.RP-HPLCtR9.41分鐘(20-80％MeCN梯度，用20分鐘)；純度＞95％。
實施例62-(3-羥基-苯基氨基)-異煙堿腈()將2-氯-異煙堿腈(1.0eq)溶解在無水的甲苯中，然后加入3-氨基-苯酚(1.1eq)、乙酸鈀-II(0.1eq)以及雙(二苯基膦基)丙烷(0.12eq)。將反應混合物在室溫攪拌10分鐘，然后加入叔丁醇鈉(1.3eq)。將形成的懸浮液在70℃加熱20小時。將反應混合物冷卻，用乙醚稀釋，并用鹽水洗滌。將有機級分干燥(MgSO4)并真空濃縮。將粗制的產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析純化[庚烷∶乙酸乙酯(12∶1→1∶1)]得到需要的標題化合物，以及作為副產(chǎn)物的2-氯-N-(3-羥基-苯基)-異煙堿脒(isonicotinamidine)[33]。
2-(3-羥基-苯基氨基)-硫代異煙堿甲酰胺(thioisonicotinamide)
將2-(3-羥基-苯基氨基)-異煙堿腈溶解在甲醇中，然后加入硫化銨(20％，水溶液)。將反應混合物在75℃加熱3小時。將水加入到冷卻的溶液中，并過濾期望的標題化合物，用冷水洗滌并干燥。
1-{2-[2-(4-羥基-苯基氨基)-吡啶-4-基]-4-甲基-噻唑-5-基}-乙酮(XXI)將2-(3-羥基-苯基氨基)-硫代異煙堿甲酰胺(1.0eq)溶解在甲醇中，然后加入吡啶(1.4eq)和3-氯-2，4-戊二酮(1.1eq)。將反應混合物在Smith Creator微波反應器中加熱(150℃)15分鐘。冷卻形成的溶液并真空濃縮得到粗制的產(chǎn)物。將粗制的產(chǎn)物利用硅膠柱層析純化[庚烷∶乙酸乙酯(12∶1→3∶1)]得到標題化合物。
1H-NMR(DMSO-d6)δ2.58(3H，s，CH3)，2.71(3H，s，CH3)，6.70(2H，d，ArH，J＝8.5Hz)，7.15(1H，d，ArH，J＝5.5Hz)，7.36(3H，m，ArH，)，8.14(1H，d，Ar-H，J＝5.5Hz)，9.21(1H，s，NH)。ESI-MSm/z 326[M+H]+；C17H15N3O2S理論值325.08。Anal.RP-HPLCtR10.49分鐘(10-70％MeCN梯度，用20分鐘)；純度＞95％。
實施例7重組蛋白的制備CDK4/周期蛋白D1、CDK1/周期蛋白B、CDK2/周期蛋白E、CDK2/周期蛋白A、CDK9/周期蛋白T1和CDK7/周期蛋白H，都在其N-端上具有His6標記，利用適當?shù)臈U狀病毒構(gòu)建體在Sf9昆蟲細胞中表達。Sf9培養(yǎng)(1.6×106細胞/mL)感染(MOI為3)2天。低速離心富集細胞并將蛋白利用金屬親和層析從昆蟲細胞沉淀純化。簡言之將昆蟲細胞沉淀在緩沖液A(10mM Tris-HCl pH 8.0，150mM NaCl，0.02％NP-40，5mM β-巰基乙醇，20mMNaF，1mM Na3VO4，以及Sigma蛋白酶抑制劑混合物)中通過超聲裂解。離心清出溶解的級分并負載到Ni-NTA-Agarose(Qiagen)上。未結(jié)合的蛋白用用300mM NaCl，5-15mM咪唑在緩沖液A中的溶液洗脫去除，并將結(jié)合的蛋白用補充250mM咪唑的緩沖液A洗脫。將純化的蛋白利用儲存緩沖液(20mM HEPES pH 7.4，50mM NaCl，2mM DTT，1mM EDTA，1mM EGTA，0.02％NP-40，10％v/v甘油)進行充分的透析并在-70℃儲存。
實施例8GSK-3β激酶分析GSK-3從New England Biolabs(UK)Ltd.，Hitchin，Herts得到。重組的酶從帶有源自兔骨骼肌cDNA文庫表達GSK-3的克隆的E.coli株分離得到[34]。GSK-3功能的抑制通過測量在受試化合物存在下CREB磷酸肽KRREILSRRPpSYR的磷酸化進行測量。利用96-孔分析形式，將GSK3(7.5U)在多種濃度的受試化合物的存在下在30℃孵育30分鐘，總體積為25μL的20mM MOPS pH 7.2，25mM β-甘油磷酸，5mM EGTA，1mM DTT，1mM Na3VO3，40μM CREB肽，15mM MgCl2和100μM ATP(包含0.25μCi[γ-32P]-ATP)。將樣品轉(zhuǎn)移到96-孔p81濾板(Whatman Polyfiltronics，Kent，UK)上，將板用200μL/孔的75mM正磷酸水溶液洗滌4次。將閃爍液體(50μL)加入到各孔中，并利用閃爍計數(shù)器(TopCount，Packard Instruments，Pangbourne，Berks，UK)測定各樣品摻入的放射活性。
CDK/細胞周期蛋白激酶分析考察化合物對CDK2/細胞周期蛋白E、CDK2/細胞周期蛋白A、CDK1/細胞周期蛋白B以及CDK4/細胞周期蛋白D1的抑制活性。His6-標記的重組人細胞周期蛋白-依賴性激酶CDK1/細胞周期蛋白B1、CDK2/細胞周期蛋白E、CDK2/細胞周期蛋白A以及CDK4利用桿狀病毒表達系統(tǒng)在sf9昆蟲細胞中表達。重組的細胞周期蛋白D1在E.coli中表達。利用金屬螯合親和色譜純化蛋白至大于90％的同質(zhì)性。利用重組CDK/細胞周期蛋白，在96-孔板中進行激酶分析。在分析緩沖液(25mM β-甘油磷酸，20mM MOPS，5mM EGTA，1mM DTT，1mM Na3VO3，pH 7.4)中進行分析，向其中加入2-4μg的活性酶以及適當?shù)牡孜?對CDK1和CDK2而言為純化的組蛋白H1，對于CDK4而言為重組的GST-視網(wǎng)膜母細胞癌蛋白(殘基773-928))。加入Mg/ATP混合物(15mM MgCl2+100μM ATP以及30-50kBq/孔的[γ-32P]-ATP)啟動反應，并將混合物按照需要在30℃孵育10-45分鐘。在冰上終止反應，然后濾過p81或GF/C濾板(對于CDK4)(Whatman Polyfiltronics，Kent，UK)。用75mM正磷酸水溶液洗滌3次后，干燥板，加入閃爍體，并在閃爍計數(shù)器(TopCount，Packard Instruments，Pangbourne，Berks，UK)上測量摻入的放射活性。用于激酶分析的化合物配制成10mM的DMSO儲存液并用分析緩沖液稀釋成10％DMSO的溶液。利用曲線擬合軟件(GraphPadPrism version 3.00 for Windows，GraphPad Software，San Diego California USA)分析數(shù)據(jù)以確定IC50值(50％抑制激酶活性的測試化合物的濃度)。
實施例9L6大鼠肌細胞和3T3小鼠脂肪細胞的分化將大鼠骨骼肌成肌細胞L6/G8.C5以2.4×105細胞/10cm培養(yǎng)皿的密度接種在包含青霉素/鏈霉素的DMEM 10％胎牛血清(FCS)中。當達到90％融合的時候，將培養(yǎng)基用αMEM替換，后者補充2％FCS和青霉素/鏈霉素。每48小時更新一次培養(yǎng)基，并且4-7天后形成了肌細胞。
小鼠前脂肪細胞3T3-F442A以9×105細胞/10cm培養(yǎng)皿的密度接種在包含青霉素/鏈霉素的DMEM 10％FCS中。當達到90％融合的時候，相同的培養(yǎng)基補充1μg/mL的胰島素。3-5天后(當大部分細胞分化)撤去胰島素，4天后，細胞可以使用。
糖原合成酶(GS)分析在10cm培養(yǎng)皿上的細胞(人胚腎(HEK)293細胞、L6大鼠肌細胞，或3T3小鼠脂肪細胞)用不同濃度的GSK3-抑制劑或DMSO溶媒處理90分鐘。去除培養(yǎng)基并將細胞用冰冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，然后在冰上在50mM HEPES，pH 7.5，10mM EDTA，100mM NaF，5mM DTT，蛋白酶抑制劑混合物(Sigma)中裂解。凍/融循環(huán)后，將樣品超聲10秒并在4℃在15,000g離心10分鐘。將裂解上清液在液氮上快速凍結(jié)并在-80℃儲存。在緩沖液(50mM Tris-HCl，pH 7.8，20mM EDTA，25mM NaF，5mM DTT，1％糖原，0.3mM UDP-葡萄糖和0.06μCi的[14C]-UDP-葡萄糖中在0.1或10mM葡萄糖-6-磷酸存在下分析裂解液的糖原合成酶活性。將反應在30℃進行30分鐘。將70μL的反應混合物(總體積90μL)轉(zhuǎn)移至GFC 96-孔濾板(底部用箔片密封)中，濾板包含140μL的96％乙醇。將GFC板在冰上孵育1小時并且然后用66％乙醇洗滌。向各孔中，加入100μL液體閃爍體，并利用閃爍計數(shù)器(Topcount，HP)測量樣品的放射活性。數(shù)據(jù)表示為相對于對照樣品的糖原合成酶活性比值增加的倍數(shù)。
實施例10表2總結(jié)了例示的化合物的生物活性。
實施例11測定了實施例化合物XIV對多種Ser/Thr激酶的固有的抑制常數(shù)(Ki)并總結(jié)在表3中。
實施例12實施例化合物XIV增加HEK293、大鼠肌細胞以及小鼠脂肪細胞中的糖原合酶的活性，利用酶的級分速率測定(濃度為0.1和10mM的葡萄糖-6-磷酸酶活性之間的比值)。在HEK293細胞以及脂肪細胞中的激活的實例顯示在表4中。
實施例化合物XIV增加HEK293細胞和3T3脂肪細胞中的GS活性。5μM XIV誘導的HEK293細胞中的GS激活可以與40mM LiCl誘導的激活具有可比性。在3T3脂肪細胞中，5μM XIV誘導的激活約2-倍高于由40mMLiCl誘導的激活。
從劑量效應曲線中計算出被評價的三種細胞系中XIV-誘導的糖原合酶的EC50值EC50(HEK293)＝1.5±0.6μM；EC50(L6肌細胞)＝4.0±1.5μM；EC50(3T3脂肪細胞)＝5.0±2.3μM。
實施例13化合物XIV的蛋白激酶系列的選擇性篩選包括在選擇性篩選中的29種激酶的名稱以及在各激酶情形下使用的ATP濃度，在表5中給出。激酶測定按照以前描述的方法進行[35，36]。
1μM的化合物XIV在29-種激酶系列(Dundee University)中進行篩選并且結(jié)果顯示在下表6中。
化合物XIV對GSK3具有高度選擇性。在使用的濃度條件下，只有兩種其他的激酶被輕微地抑制(約40％)-JNK和SAPK4。
實施例14β-聯(lián)蛋白蓄積以及轉(zhuǎn)錄激活與GSK3抑制有關(guān)的一種可能毒性是β-聯(lián)蛋白的蓄積，后者參與結(jié)腸癌[37]和黑素瘤[38]的發(fā)展。研究了在激活細胞糖原合酶有效的濃度的實施例化合物XIV對HEK293細胞中β-聯(lián)蛋白的內(nèi)源性水平的作用。化合物XIV(高達5μM)沒有顯著改變細胞β-聯(lián)蛋白的水平，沒有抑制在GSK3-特異性位點S33，37/T41的磷酸化，如圖1中所示。
此外，研究了化合物XIV對β-聯(lián)蛋白-依賴性轉(zhuǎn)錄活性，如在基于螢光素酶報告基因測定中測量。在用化合物XIV(高達10μM)處理的HEK293細胞中沒有觀察到誘導的β-聯(lián)蛋白轉(zhuǎn)錄活性。同時，LiCl誘導大量的β-聯(lián)蛋白-依賴性螢光素酶活性。這些結(jié)果暗示在糖原合酶激活需要的濃度條件下，化合物XIV不抑制β-聯(lián)蛋白的磷酸化并因此不誘導蛋白的蓄積或其轉(zhuǎn)錄活性。
β-聯(lián)蛋白-LEF/TCF調(diào)節(jié)的報告基因測定利用Lipofectamine Plus試劑(GibcobRL)，根據(jù)廠商的說明，HEK293細胞用或者β-聯(lián)蛋白-LEF/TCF-敏感性或β-聯(lián)蛋白-LEF/TCF-不敏感性報告基因載體(Upstate Biotechnology，Inc.)轉(zhuǎn)染。次天，將細胞胰蛋白酶化，洗滌到無血清的培養(yǎng)基中，計數(shù)并且以40,000細胞每孔接種到96-孔板中。在細胞附著之后，將LiCl或GSK-3抑制劑化合物加入到培養(yǎng)基中至需要的濃度。對照細胞為用DMSO溶媒處理的細胞。抑制劑加入16小時后，利用Steady-Glo螢光素酶測定系統(tǒng)(Promega)根據(jù)廠商的說明分析細胞的螢光素酶活性。
實施例15口服葡萄糖耐量測試(OGTT)對于OGTT，使用雄性ZDF fa/fa大鼠(Charles River，USA)，10-11周齡。禁食15小時后，動物經(jīng)靜脈給藥5mg/kg受試化合物在給藥溶媒中的溶液或給藥溶媒(10％DMSO，90％PEG-400)，只在-270和-30分鐘給藥。在0分鐘，大鼠經(jīng)口強飼2g/kg葡萄糖。在OGTT之前以及之后每15分鐘采集血漿樣品測定血糖。
化合物XIV顯著改善ZDF大鼠中的葡萄糖耐量，該化合物分別降低反應性和絕對性AUC的44和29％。
在不偏離本發(fā)明的范圍和精神情形下，描述的本發(fā)明方面的各種改變和變化對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言是顯而易見的。盡管本發(fā)明結(jié)合具體的優(yōu)選的實施方案進行了描述，應該理解為要求保護的本發(fā)明不應該過度地限制到所述的具體的實施方案。實際上，對化學領(lǐng)域或相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言明顯的實施本發(fā)明的多種修飾都包括在下述權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
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表1.實施例化合物



表2.實施例化合物的體外激酶活性以及細胞糖原合酶激活

aIC50(CDK2/E)/IC50(GSK3β)bHEK293細胞，[化合物]＝5μMcNA-在初級篩選中沒有活性(1μM的時候抑制＜50％)d沒有測定表3.實施例化合物XIV對GSK相對于CDK的選擇性

表4.實施例化合物XIV對細胞糖原合酶活性的激活

表5.蛋白激酶系列的描述

表6.實施例XIV(1μM)的激酶選擇性篩選

權(quán)利要求
1.式I的化合物，或其可藥用鹽， 其中Z1為N或CH；Z2和Z3各自獨立地為N或CR7；R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7各自獨立地為H、R8或R9；各R8獨立地為烴基；以及各R9獨立地為鹵素、NO2、烷氧基、CN、CF3、SO3H、SO2NR10R11、SO2R12、NR13R14、(CH2)aCOOR15、(CH2)bCONR16R17、(CH2)cCOR18或(CH2)dOH；a、b、c和d各自獨立地為0、1、2、3或4；R10-18各自獨立地為H或烷基；條件是當R1和R2都是H、Z1為CH；或者Z2為N；或Z1為CH且Z2為N的時候；則所述的化合物不是4-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-N-(3，4，5-三甲氧基苯基)-2-嘧啶胺或4-(5-(2-羥基乙基)-4-甲基噻唑-2-基)-N-(3，4，5-三甲氧基苯基)-2-嘧啶胺。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中各R8獨立地為C1-30烴基，任選包含至多12個選自N、S和O的雜原子，并任選帶有至多6個取代基，各取代基獨立地選自鹵素、NO2、CN、CF3、SO3H、SO2NH2、SO2Me、OH、NH2、COOH和CONH2。
3.權(quán)利要求1或2的化合物，其中各R8獨立地為烷基、芳基或雜環(huán)烷基。
4.權(quán)利要求1或2的化合物，其中各R9獨立地為鹵素、NO2、烷氧基、CN、CF3、SO3H、SO2NH2、SO2Me、OH、NH2、(CH2)aCOOR15、(CH2)dOH、CONH2或COR18。
5.上述權(quán)利要求中任一項的化合物，其中R1為H、烷基、芳基、(CH2)aCOOR15或OH；R2為H、(CH2)dOH、(CH2)aCOOR15、COR18或烷基；R3為鹵素、H、烷氧基、雜環(huán)烷基、烷基或OH；R4為H、NH2、OH、烷基、CF3或NO2；以及R5和R6都為H。
6.上述權(quán)利要求中任一項的化合物，其中R1為H、Me、Ph、CH2COOMe或OH；R2為H、(CH2)2OH、COOEt、COMe或Me；R3為Cl、H、OMe、N-嗎啉基、N-吡咯烷基、Me或OH；R4為H、NH2、OH、Me、CF3或NO2；以及R5和R6都為H。
7.權(quán)利要求1的化合物，其中Z1為CH且Z2和Z3各自獨立地為N或CR7。
8.權(quán)利要求7的化合物，其中Z2和Z3各自獨立地為CR7。
9.權(quán)利要求7或8的化合物，其中R1為烷基或OH；R2為烷基或COR18；R3為OH或鹵素；并且Z2和Z3都為CH。
10.權(quán)利要求9的化合物，其中R1為Me或OH，R2為COMe或Me，且R3為OH或Cl。
11.權(quán)利要求1的化合物，其中Z1為N且Z2和Z3各自獨立地為N或CR7。
12.權(quán)利要求11的化合物，其中Z2和Z3各自獨立地為CR7。
13.權(quán)利要求12的化合物，其中R1為烷基、芳基、OH或(CH2)aCOOR15；R2為COR18、H、COOR15或烷基；R3為鹵素、H、OH、烷基或嗎啉代；R4為H、NH2、OH、CF3或NO2；以及Z2和Z3都為CH。
14.權(quán)利要求13的化合物，其中R1為Me、Ph、OH或CH2COOMe；R2為COMe、H、COOEt或Me；以及R3為鹵素、H、OH、烷基或嗎啉代。
15.權(quán)利要求11的化合物，其中Z2為N且Z3為CR7。
16.權(quán)利要求15的化合物，其中R1為H、OH或烷基；R2為H、(CH2)dOH、烷基、(CH2)aCOOR15、COR18；R3為鹵素、烷氧基或雜環(huán)烷基；R4為H或烷基；以及Z3為CH。
17.權(quán)利要求16的化合物，其中R1為H、OH或Me；R2為H、(CH2)2OH、Me、COOEt、COMe；R3為鹵素、OMe或N-吡咯烷基；R4為H或Me；以及Z3為CH。
18.權(quán)利要求1的化合物，選自下列化合物1-{2-[2-(4-氯-苯基氨基)-嘧啶-4-基]-4-甲基-噻唑-5-基}-乙酮(4-氯-苯基)-[4-(4-甲基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基]-胺(4-氯-苯基)-[4-(4-苯基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基]-胺2-[2-(4-氯-苯基氨基)-嘧啶-4-基]-4-甲基-噻唑-5-羧酸乙基酯{2-[2-(4-氯-苯基氨基)-嘧啶-4-基]-噻唑-4-基}-乙酸甲基酯2-[2-(4-氯-苯基氨基)-嘧啶-4-基]-4-羥基-噻唑-5-羧酸乙基酯N-[4-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基]-苯-1，3-二胺3-[4-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基氨基]-苯酚[4-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基]-(3-三氟甲基-苯基)-胺(4-氯-3-三氟甲基-苯基)-[4-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基]-胺[4-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基]-(3-硝基-苯基)-胺(6-甲氧基-吡啶-3-基)-(4-噻唑-2-基-嘧啶-2-基)-胺(6-氯-吡啶-3-基)-(4-噻唑-2-基-嘧啶-2-基)-胺1-{2-[2-(6-氯-吡啶-3-基氨基)-嘧啶-4-基]-4-甲基-噻唑-5-基}-乙酮[4-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基]-(6-甲氧基-吡啶-3-基)-胺。(6-氯-吡啶-3-基)-[4-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基]-胺[4-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基]-(4-嗎啉-4-基-苯基)-胺[4-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基]-(4-甲基-3-硝基-苯基)-胺4-[4-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基氨基]-苯酚2-[2-(4-氯-苯基氨基)-吡啶-4-基]-5-甲基-噻唑-4-醇(6-吡咯烷-1-基-比啶-3-基)-(4-噻唑-2-基-嘧啶-2-基)-胺2-[2-(6-氯-吡啶-3-基氨基)-嘧啶-4-基]-4-羥基-噻唑-5-羧酸乙基酯2-[2-(6-氯-吡啶-3-基氨基)-嘧啶-4-基]-5-甲基-噻唑-4-醇2-[2-(6-氯-吡啶-3-基氨基)-嘧啶-4-基]-5-(2-羥基-乙基)-噻唑-4-醇(6-氯-5-甲基-吡啶-3-基)-(4-噻唑-2-基-嘧啶-2-基)-胺。
19.權(quán)利要求1的化合物，選自下列化合物2-[2-(4-氯-苯基氨基)-嘧啶-4-基]-4-羥基-噻唑-5-羧酸乙基酯；N-[4-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基]-苯-1，3-二胺3-[4-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基氨基]-苯酚[4-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基]-(3-三氟甲基-苯基)-胺(4-氯-3-三氟甲基-苯基)-[4-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基]-胺(6-甲氧基-吡啶-3-基)-(4-噻唑-2-基-嘧啶-2-基)-胺(6-氯-吡啶-3-基)-(4-噻唑-2-基-嘧啶-2-基)-胺[4-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-嘧啶-2-基]-(6-甲氧基-吡啶-3-基)-胺2-[2-(4-氯-苯基氨基)-吡啶-4-基]-5-甲基-噻唑-4-醇(6-吡咯烷-1-基-吡啶-3-基)-(4-噻唑-2-基-嘧啶-2-基)-胺2-[2-(6-氯-吡啶-3-基氨基)-嘧啶-4-基]-4-羥基-噻唑-5-羧酸乙基酯2-[2-(6-氯-吡啶-3-基氨基)-嘧啶-4-基]-5-甲基-噻唑-4-醇2-[2-(6-氯-吡啶-3-基氨基)-嘧啶-4-基]-5-(2-羥基-乙基)-噻唑-4-醇(6-氯-5-甲基-吡啶-3-基)-(4-噻唑-2-基-嘧啶-2-基)-胺。
20.權(quán)利要求1的化合物，選自下列化合物2-[2-(4-氯-苯基氨基)-嘧啶-4-基]-4-羥基-噻唑-5-羧酸乙基酯；(6-甲氧基-吡啶-3-基)-(4-噻唑-2-基-嘧啶-2-基)-胺；以及(6-氯-吡啶-3-基)-(4-噻唑-2-基-嘧啶-2-基)-胺2-[2-(4-氯-苯基氨基)-吡啶-4-基]-5-甲基-噻唑-4-醇(6-吡咯烷-1-基-吡啶-3-基)-(4-噻唑-2-基-嘧啶-2-基)-胺2-[2-(6-氯-吡啶-3-基氨基)-嘧啶-4-基]-4-羥基-噻唑-5-羧酸乙基酯2-[2-(6-氯-吡啶-3-基氨基)-嘧啶-4-基]-5-甲基-噻唑-4-醇2-[2-(6-氯-吡啶-3-基氨基)-嘧啶-4-基]-5-(2-羥基-乙基)-噻唑-4-醇(6-氯-5-甲基-吡啶-3-基)-(4-噻唑-2-基-嘧啶-2-基)-胺。
21.權(quán)利要求1的化合物，其為(6-氯-吡啶-3-基)-(4-噻唑-2-基-嘧啶-2-基)-胺。
22.一種藥物組合物，其包括上述權(quán)利要求中任一項的化合物并混合有可藥用載體、賦形劑或稀釋劑。
23.權(quán)利要求1-21中任一項的化合物在制備治療增生性疾病的藥物中的用途。
24.權(quán)利要求23的用途，其中增生性疾病是癌癥或白血病。
25.權(quán)利要求23的用途，其中增生性疾病是腎小球腎炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬或慢性阻塞性肺病。
26.權(quán)利要求1-21中任一項的化合物在制備治療病毒性疾病的藥物中的用途。
27.權(quán)利要求23的用途，其中病毒性疾病選自人巨細胞病毒(HCMV)、1型單純皰疹病毒(HSV-1)、1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)和水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)。
28.權(quán)利要求1-21中任一項的化合物在制備治療CNS疾病的藥物中的用途。
29.權(quán)利要求28的用途，其中CNS疾病為阿耳茨海默氏病或雙相性精神障礙。
30.權(quán)利要求1-21中任一項的化合物在制備治療脫發(fā)癥的藥物中的用途。
31.權(quán)利要求1-21中任一項的化合物在制備治療中風的藥物中的用途。
32.權(quán)利要求23-31中任一項的用途，其中所述化合物以足以抑制至少一種PLK酶的量給藥。
33.權(quán)利要求32的用途，其中PLK酶是PLK1。
34.權(quán)利要求23-31中任一項的用途，其中所述化合物以足以抑制至少一種CDK酶的量給藥。
35.權(quán)利要求34的用途，其中CDK酶為CDK1、CDK2、CDK3、CDK4、CDK6、CDK7、CDK8和/或CDK9。
36.權(quán)利要求23-31中任一項的用途，其中所述化合物以足以抑制aurora激酶的量給藥。
37.權(quán)利要求1-21中任一項的化合物在制備治療糖尿病的藥物中的用途。
38.權(quán)利要求37的用途，其中糖尿病為非胰島素依賴性糖尿病或II型糖尿病。
39.權(quán)利要求37或38的用途，其中所述化合物以足以抑制GSK的量給藥。
40.權(quán)利要求39的用途，其中所述化合物以足以抑制GSK3β的量給藥。
41.權(quán)利要求1-21中任一項的化合物在制備治療炎性疾病或感染性疾病的藥物中的用途。
42.權(quán)利要求1-21中任一項的化合物在用于鑒別其它候選化合物的測定中的用途，所述候選化合物能夠抑制細胞周期蛋白依賴性激酶、aurora激酶、GSK和PLK酶中的一種或多種。
43.權(quán)利要求38的用途，其中所述測定是競爭性結(jié)合測定。
44.一種制備權(quán)利要求1中限定的式I的化合物的方法，所述方法包括將式9化合物與式10化合物反應以形成式I化合物，其中R1-6如權(quán)利要求1中定義，
45.一種制備權(quán)利要求1中限定的式I的化合物的方法，所述方法包括將式15化合物與式3化合物反應以形成式I化合物，其中R1-6如權(quán)利要求1中定義，
全文摘要
本發(fā)明涉及式I的化合物，或其可藥用鹽，其中Z
文檔編號C07D417/14GK1914199SQ200580003960
公開日2007年2月14日 申請日期2005年2月7日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月6日
發(fā)明者肯尼思·鄧肯, 達倫·吉布森, 王淑東, 丹尼拉·齊勒瓦, 彼得·費希爾 申請人:西克拉塞爾有限公司