專利名稱：作為標(biāo)記的ns5a核苷酸序列變體的制作方法
背景技術(shù)：
丙型肝炎病毒(HCV)感染是一個(gè)嚴(yán)重的世界性的臨床難題。僅在美國(guó)，估計(jì)有400萬人臨床遭受丙型肝炎病毒的感染。HCV作為主要的非A非B型肝炎的病原體，主要通過使用被感染血液及血液制品輸血進(jìn)行傳播(Cuthbert et al.，1994，Clin.Microbiol.Rev.7505-532)。在二十世紀(jì)九十年代中期引入抗HCV篩選之前，HCV占美國(guó)輸血后感染肝炎病例的80-90％。在患有出血異?；蚵阅I衰竭的個(gè)體以及那些經(jīng)常接觸血液與血液制品的人群中也觀察到高比例的HCV感染。
HCV的急性感染可導(dǎo)致病毒持續(xù)復(fù)制，并有約90％的病例轉(zhuǎn)變?yōu)槁愿窝住?duì)很多患者而言，慢性HCV感染會(huì)導(dǎo)致進(jìn)行性肝損傷并發(fā)展為肝硬化。那些嚴(yán)重感染的患者在少至兩年內(nèi)即可發(fā)展為肝硬化——盡管時(shí)間跨度為10-20年更為典型。在30-50％的慢性HCV患者中，肝損傷可能會(huì)演變而導(dǎo)致肝細(xì)胞癌的發(fā)生。一般而言，肝細(xì)胞癌在晚期發(fā)病，需30年以上的時(shí)間形成(Bisceglie et al.，1995，Semin.Liver Dis.1564-69)。目前還不清楚病毒或宿主因子在決定疾病演變過程中的相對(duì)作用。
HCV是一種包膜病毒，包含大小約9.5kb的單股正鏈RNA基因組?；谄浠蚪M的組織構(gòu)成及病毒體性質(zhì)，HCV已被歸于黃病毒科中一個(gè)獨(dú)立的屬，該科還包括豬瘟病毒(pestiviruses)及黃病毒(Alter，1995，Semin.Liver Dis.155-14)。病毒的基因組由一個(gè)冗長(zhǎng)的5′非翻譯區(qū)(UTR)，一個(gè)編碼約3011個(gè)氨基酸的多蛋白前體的長(zhǎng)開放閱讀框，以及一個(gè)短的3′UTR組成。多蛋白前體同時(shí)被宿主與病毒的蛋白酶剪切生成成熟的病毒結(jié)構(gòu)蛋白與非結(jié)構(gòu)蛋白。HCV編碼兩種蛋白酶，一種是由NS2-NS3區(qū)編碼的鋅依賴的金屬蛋白酶，以及在NS3/NS4區(qū)編碼的絲氨酸蛋白酶。這些蛋白酶對(duì)于將前體多蛋白的特定區(qū)域切割成成熟肽而言是必需的。非結(jié)構(gòu)蛋白5的羧基部分，即NS5B，具有RNA依賴的RNA聚合酶活性。非結(jié)構(gòu)蛋白5，NS5B的羧基部分包含RNA依賴的RNA聚會(huì)酶。剩余非結(jié)構(gòu)蛋白，NS4B的功能，以及NS5A(非結(jié)構(gòu)蛋白5的氨基部分)的功能目前還不清楚。
α-干擾素(干擾素)是食品與藥物管理局批準(zhǔn)的用于治療慢性HCV感染的藥物。干擾素的療效借助于不同的細(xì)胞內(nèi)可誘導(dǎo)蛋白，包括雙鏈RNA激活的蛋白激酶(PKR)來實(shí)現(xiàn)(Gale et al.，1997，Virology230217-227)。只有8％到12％的攜帶HCV基因型1的患者對(duì)干擾素治療可產(chǎn)生持續(xù)性臨床病毒學(xué)應(yīng)答(Carithers et al.，1997，Hepatology2683S-88S；Lindsay，1997，Heptatology 2671S-77S)。近來，使用干擾素與鳥苷類似物及三氮唑核苷的聯(lián)合治療，在產(chǎn)生持續(xù)性生化及病毒學(xué)應(yīng)答方面的表現(xiàn)優(yōu)于單獨(dú)使用干擾素治療(Poynard et al.，1998，lancet3521426-1432)。然而，盡管在持續(xù)應(yīng)答的比例上有了顯著改善，但高達(dá)60％的高滴度HCV基因型1感染患者對(duì)聯(lián)合治療沒有應(yīng)答。例如，在被HCV-1b感染的患者中，應(yīng)答比例低于40％。在被原型，即美國(guó)基因型HCV-1a感染的患者中，相似的低應(yīng)答比例也曾有過報(bào)道(Mahaney et al.1994，Hepatology 201405-1411)。相比較而言，被HCV基因型-2感染的患者的應(yīng)答比例接近80％(Fried et al.，1995，Semin.Liver Dis.1582-91.)。已有研究表明，完整的HCV多蛋白的表達(dá)在人U2-OS骨肉瘤細(xì)胞中可抑制干擾素誘導(dǎo)的信號(hào)傳遞(Heim et al.，1999，J.Virol.738469-8475)。但沒有報(bào)道究竟是哪一種HCV蛋白在該效應(yīng)中發(fā)揮作用。
干擾素應(yīng)答與HCV非結(jié)構(gòu)5A(NS5A)序列之間的關(guān)系是有爭(zhēng)議的。在HCV各亞型之間，對(duì)干擾素治療的應(yīng)答并不相同，HCV-1b亞型對(duì)干擾素治療有顯著抗性(Alter et al.，1998，MMWR Recomm.Rep.47(RR-19)1-39)。比較從感染HCV的患者體內(nèi)獲得的抗干擾素與對(duì)干擾素敏感的病毒的全長(zhǎng)HCV核酸序列，發(fā)現(xiàn)錯(cuò)義置換對(duì)應(yīng)于NS5A羧基端(Enomoto et al.，1995，J.Clin.Invest.96224-230)。將所對(duì)應(yīng)的NS5A的40個(gè)氨基酸區(qū)域(位于HCV多蛋白的2209-2248位氨基酸)命名為干擾素敏感決定區(qū)，或ISDR(Enomoto et al.，1995)。ISDR位于NS5A蛋白與PKR結(jié)合并抑制PKR的功能的區(qū)域(Gale et al.，Mol.Cell Biol.，1998，185208-5218)。Enomoto等(1996，N.Eng.J.Med.33477-81)提出一個(gè)模型，其中對(duì)干擾素治療產(chǎn)生應(yīng)答的患者所感染的病毒在ISDR區(qū)存在多個(gè)置換(與對(duì)干擾素抗性的HCV 1b-J原型序列相比較)，而那些在干擾素治療無效的患者所感染的病毒在ISDR僅有極少置換。
在25個(gè)發(fā)表來源于抗干擾素及對(duì)干擾素敏感的病毒的ISDR序列的研究中，有9個(gè)支持Enomoto模型，結(jié)論如下在5％的顯著性水平上，數(shù)據(jù)提供了充分的證據(jù)，即對(duì)干擾素應(yīng)答與ISDR中的置換是獨(dú)立的(Enomotoet al.，1995，1996；Chayama et al.，1997，Hepatology，25745-749；Kurosaki etal.，1997，Hepatology 25750-753；Fukuda et al.，1998，J.Gastroenterol.Hepatol.13412-418；Saiz et al.，1998，J.Infect.Dis.177839-847；Murashimaet al.，1999，Scand.J.Infect.Dis.3127-32；Sarrazin et al.1999，J.Hepatol.301004-1013；Sakuma et al.，1999，J.Infect.Dis.1801001-1009)。其它16個(gè)研究不能對(duì)是否存在相關(guān)關(guān)系做出結(jié)論(Hofgartner et al.，1997，J.Med.Virol.53118-126；Khorsi et al.，1997，J.Hepatol.2772-77；Squadrito et al.，1997，Gastroenterology 113567-572；Zeuzem et al.，1997，Hepatology25740-744；Duverlie 15 et al.，1998，J.Gen.Virol.791373-1381；Franguel etal.，1998，Hepatology 281674-1679；Odeberg et al.，1998，J.Med.Virol.5633-38；Pawlotsky et al.，1998，J.Virol.722795-2805；Polyak et al.，1998，J.Virol.724288-4296；Rispeter et al.，1998，J.Hepatol.29352-361；Chunget al.，1999，J.Med.Virol.58353-358；Sarrazin et al.1999，J.Hepatol.301004-1013；Squadrito et al.，1999，J.Hepatol.301023-1027；Ibarrola et al.，1999，Am.J.Gastroenterol.942487-2495；Mihm et al.，1999，J.Med.Virol.58227-234；Arase et al.，1999，Intern.Med.38461-466)。有趣的是，在支持相關(guān)關(guān)系的9個(gè)研究中，有7個(gè)是基于從日本分離的HCV，而在沒有支持相關(guān)關(guān)系的16個(gè)研究中，有15個(gè)是基于從歐洲及北美分離到的樣品。盡管在北美及歐洲的研究中通常沒有發(fā)現(xiàn)干擾素應(yīng)答與ISDR序列之間存在具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著性的聯(lián)系，但有證據(jù)表明這種聯(lián)系確實(shí)存在。當(dāng)將那些單個(gè)研究中ISDR序列的中間體或者突變體類型綜合起來時(shí)，對(duì)干擾素的應(yīng)答率要高于那些來源于具有野生型ISDR序列的患者(Herion andHoofnagle，1997，Hepatology 25769-771)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)在被HCV-1a亞型感染的人類受試者中，HCVNS5A基因937位的核苷酸序列替換與被感染個(gè)體對(duì)干擾素治療的應(yīng)答之間存在顯著性聯(lián)系。特別地，感染了在NS5A基因937位包括一個(gè)導(dǎo)致NS5A蛋白的313位為纈氨酸的“G”的病毒個(gè)體，會(huì)有更多的可能性對(duì)干擾素治療產(chǎn)生持續(xù)性病毒學(xué)應(yīng)答。相反，感染了在NS5A基因937位包括一個(gè)導(dǎo)致NS5A蛋白的313位為異亮氨酸的“A”的病毒的個(gè)體，會(huì)有更多的可能性對(duì)干擾素治療產(chǎn)生無病毒學(xué)應(yīng)答(virologic non-response)。就我們所知，這是首次明確指出一個(gè)特定的核苷酸與氨基酸突變與對(duì)干擾素治療的應(yīng)答之間存在聯(lián)系。進(jìn)一步的，該特殊突變的位置并不在ISDR或NS5A蛋白的PKR結(jié)合區(qū)。
因此，本發(fā)明提供了預(yù)測(cè)感染HCV-1a的人類受試者對(duì)干擾素治療應(yīng)答的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括提供一段來源于人類受試者的HCV-1a多核苷酸，該多核苷酸含有包括NS5A基因937位核苷酸位點(diǎn)在內(nèi)的部分，以及確定937位的核苷酸是否為“G”，在937位存在“G”表明人類受試者有增加的可能對(duì)干擾素治療產(chǎn)生持續(xù)性病毒學(xué)應(yīng)答。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括提供一段來源于人類受試者的HCV-1a多肽，該多肽含有包括NS5A蛋白313位氨基酸位點(diǎn)在內(nèi)的部分，以及確定313位的氨基酸是否為纈氨酸，在313位存在纈氨酸表明人類受試者有增加的可能對(duì)干擾素治療產(chǎn)生持續(xù)性病毒學(xué)應(yīng)答。
本發(fā)明還提供治療感染HCV的人類受試者的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括提供一段來源于人類受試者的HCV-1a多核苷酸，該多核苷酸含有包括NS5A基因937位核苷酸位點(diǎn)在內(nèi)的部分，以及確定937位的核苷酸是否為“G”，如果在937位存在“G”，則對(duì)人類受試者使用干擾素進(jìn)行治療。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括提供一段來源于人類受試者的HCV-1a多肽，這段多肽含有包括NS5A蛋白313位氨基酸位點(diǎn)在內(nèi)的部分，以及確定313位的氨基酸是否為纈氨酸，如果在313位的氨基酸為纈氨酸，則對(duì)人類受試者使用干擾素進(jìn)行治療。
本發(fā)明還提供一種干擾素制備藥物以治療新型患者群體的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，該用途包括干擾素制備藥物以治療感染HCV的人類受試者的用途，其中在所述的感染HCV的人類受試者中，在HCV-1a多核苷酸NS5A基因的937位核苷酸是“G”。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該用途包括干擾素制備藥物以治療感染HCV的人類受試者的用途，其中在所述的感染HCV的人類受試者中，在HCV-1a蛋白的NS5A蛋白的313位氨基酸是纈氨酸。
在上述用途的優(yōu)選實(shí)施方案中，干擾素選自由Roferon-A、Pegasys、IntronA及Peg-Intron。
本發(fā)明還提供了可用于檢測(cè)HCV-1a的NS5A基因中937位核苷酸置換的寡核苷酸。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸的長(zhǎng)度介于14-35個(gè)核苷酸之間，與包括937位點(diǎn)在內(nèi)的NS5A基因區(qū)的某一條鏈基本互補(bǔ)。本發(fā)明更進(jìn)一步提供了用來預(yù)測(cè)感染HCV-1a的人類受試者對(duì)干擾素應(yīng)答的試劑盒。具體地，該試劑盒包括一種寡核苷酸和聚合酶，其可用于檢測(cè)HCV-1a的NS5A基因中937位核苷酸置換，其中，寡核苷酸的長(zhǎng)度介于14-35個(gè)核苷酸之間，并與包括937位點(diǎn)在內(nèi)的NS5A基因區(qū)的某一條鏈基本互補(bǔ)。
關(guān)于本發(fā)明的前述及其他優(yōu)點(diǎn)與特征及其實(shí)現(xiàn)方式，可通過參考后面的發(fā)明詳細(xì)描述以及結(jié)合舉例說明示例性實(shí)施方案的實(shí)施例將容易變得明顯。
短語“NS5A基因937位的核苷酸”是指位于具有在SEQ ID NO1中所示序列的HCV-1a NS5A cDNA或RNA的937位核苷酸的基因座，SEQ IDNO1作為對(duì)比的參考序列，其中SEQ ID NO1代表GenBank中登記號(hào)為M67463的HCV-1a基因組核苷酸序列中6264位核苷酸與7601位核苷酸位點(diǎn)之間的NS5A編碼區(qū)。
短語“NS5A蛋白313位的氨基酸”是指具有SEQ ID NO2中所示的序列的HCV-1a NS5A蛋白313位的氨基酸，SEQ ID NO2作為對(duì)比的參考序列，其中SEQ ID NO2代表GenBank中登記號(hào)為P26662的HCV-1a基因組多蛋白中1975位氨基酸與2420位氨基酸位點(diǎn)之間的NS5A蛋白的多肽序列。
術(shù)語“核苷酸置換”及“核苷酸變異”在本文中可替換使用，指的是在特定基因的參考核苷酸序列中位點(diǎn)的核苷酸改變。
術(shù)語“氨基酸突變”及“氨基酸置換”在本文中可替換使用，指由于編碼參考蛋白的參考核苷酸序列中核苷酸置換或變異而導(dǎo)致的參考蛋白序列位點(diǎn)上氨基酸改變。
術(shù)語“基因分型”是指確定特定基因座位上的核苷酸。
術(shù)語對(duì)干擾素治療的“應(yīng)答”是指對(duì)給藥試劑所期望的應(yīng)答。術(shù)語對(duì)干擾素治療的“持續(xù)性病毒學(xué)應(yīng)答”及“完全應(yīng)答”在本文中可替換使用，指在治療結(jié)束及治療結(jié)束后24周使用RT-PCR方法不會(huì)在感染的受試者的樣品中檢測(cè)到HCV RNA。術(shù)語對(duì)干擾素治療的“病毒無應(yīng)答”及“無應(yīng)答”在本文中可替換使用，指在治療過程中及治療結(jié)束使用RT-PCR方法始終可在感染的受試者的樣品中檢測(cè)到HCV RNA。
術(shù)語“樣品”或“生物學(xué)樣品”是指從個(gè)體分離的組織或流體樣品，包括，但不局限于，例如，組織切片、血漿、血清、全血、脊髓液、淋巴液、皮膚的外部切片、呼吸道、腸道及泌尿道、眼淚、唾液、奶汁、血細(xì)胞、腫瘤、器官。也包括體外細(xì)胞培養(yǎng)組分(包括，但不局限于，產(chǎn)生自培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞的條件培養(yǎng)基、推測(cè)被病毒感染的細(xì)胞、重組細(xì)胞及細(xì)胞組分)。
術(shù)語“干擾素”及“α-干擾素”在本文中可替換使用，指那些抑制病毒復(fù)制和細(xì)胞增殖并調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的具有高度種特異性的蛋白家族。典型適用的干擾素包括，但不局限于，重組α-2b干擾素，如獲自ScheringCorporation，Kenilworth，N.J.的IntronA干擾素，重組α-2a干擾素，如獲自Hoffmann-La Roche，Nutley，N.J.生產(chǎn)的Roferon-A干擾素，重組α-2C干擾素，如獲自Boehringer Ingelheim Pharmaceutical，Inc.，Ridgefield，Conn.的Beroforα2干擾素，α-n1干擾素，一種純化的天然α-干擾素的混合物，如獲自Sumitomo，Japan的Sumiferon或者獲自Glaxo Wellcome Ltd.，London，Great Britain的Wellferonα-n1干擾素(INS)，或者共有序列α-干擾素，如美國(guó)專利4,897,471與4,695,623中所述的(尤其是其中的實(shí)施例7、8或9)及獲自Amgen，Inc.，Newbury Park，Calif.的具體產(chǎn)品，或者是α-n3干擾素，一種由Interferon Sciences制備的天然α-干擾素的混合物，獲自PurdueFrederick Co.，Norwalk，Conn.，商品名為Alferon。優(yōu)選使用α-2a或α-2b干擾素。
術(shù)語“聚乙二醇化的α-干擾素”在本文中是指經(jīng)聚乙二醇修飾的α-干擾素，優(yōu)選α-2a和α-2b干擾素的綴合物。典型適用的聚乙二醇化的α-干擾素包括，但不局限于，Pegasys和Peg-Intron。
在本文中所用的術(shù)語“核酸”、“核苷酸”、“多核苷酸”及“寡核苷酸”是指引物、探針、待檢測(cè)的寡聚物片段，寡聚物對(duì)照及未標(biāo)記的封閉寡聚物，并且對(duì)多聚脫氧核糖核苷酸(含2-脫氧-D-核糖)、對(duì)多聚核糖核苷酸(含D-核糖)以及對(duì)任何其他類型多核苷酸而言是通用的，所述其他類型多核苷酸是N-糖苷化的嘌呤或嘧啶堿基、或修飾的嘌呤或嘧啶堿基。
核酸、核苷酸、多核苷酸或者寡核苷酸可以包括磷酸二酯鍵或修飾過的連接，如磷酸三酯、氨基磷酸酯、硅氧烷、碳酸酯、羧甲基酯、乙酰胺化物(acetamidate)、氨基甲酸酯、硫醚、橋聯(lián)氨基磷酸酯、橋聯(lián)亞甲基磷酸酯、硫代磷酸酯、磷酸甲酯、硫代磷酸酯、膦酸甲酯、二硫代磷酸酯、橋聯(lián)硫代磷酸酯或砜鍵合，以及這類鍵合的組合。
核酸、核苷酸、多核苷酸或者寡核苷酸可以包括五種生物學(xué)上存在的堿基(腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶及尿嘧啶)和/或除了五種生物學(xué)上存在的堿基的堿基。例如，本發(fā)明的多核苷酸可以包含至少一個(gè)修飾堿基部分，其選自，包括，但不局限于5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧羥甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-半乳糖queosine、肌苷、N6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖queosine、5’-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲基酯、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w、2，6-二氨基嘌呤及5-丙炔基嘧啶。
進(jìn)一步地，核酸、核苷酸、多核苷酸或者寡核苷酸可以包括一個(gè)或多個(gè)修飾的糖基部分，如阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木酮糖及己糖。
本發(fā)明不希望被核酸、核苷酸、多核苷酸或者寡核苷酸的來源所限制。核酸、核苷酸、多核苷酸或者寡核苷酸可以來源于人或非人類哺乳動(dòng)物、或者任何其它有機(jī)體、或者來源于任何重組來源、體外合成或化學(xué)合成。核酸、核苷酸、多核苷酸或者寡核苷酸可以是DNA、RNA、cDNA、DNA-RNA、鎖定核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、以及其雜合體或任何混合物；可以以雙鏈、單鏈或者部分雙鏈的形式存在。本發(fā)明的核酸包括純化或未純化的核酸及其片段，包括基因、染色體、質(zhì)粒，及生物材料如微生物——例如細(xì)菌、酵母、病毒、類病毒、霉菌、真菌、植物、動(dòng)物、人，諸如此類——的基因組。
術(shù)語核酸、核苷酸、多核苷酸及寡核苷酸間沒有刻意區(qū)分其長(zhǎng)度上的差異，這些術(shù)語可替換使用。這些術(shù)語包括雙鏈和單鏈DNA及雙鏈和單鏈RNA。
“相應(yīng)的”指與指定序列一致或者互補(bǔ)。
由于單核苷酸可以通過一個(gè)單核苷酸戊糖環(huán)上的5′磷酸與其相鄰單核苷酸上的3′氧通過磷酸二酯鍵的方式反應(yīng)生成寡核苷酸，因此如果其5′磷酸沒有與單核苷酸戊糖環(huán)上的3′氧相連，則該寡核苷酸的末端被稱為“5′端”，而如果其3′氧沒有與后面的單核苷酸戊糖環(huán)上的5′磷酸相連則為“3′端”。本文中所使用的核酸序列，即使是在一段較大的寡核苷酸內(nèi)部，也可以稱其具有5′及3′端。
當(dāng)兩個(gè)不同的、非重疊的寡核苷酸與同一條線性互補(bǔ)核酸序列的不同區(qū)域退火，而且一條寡核苷酸的3′端指向另一條的5′端時(shí)，則前者可稱為“上游”寡核苷酸，后者稱為“下游”寡核苷酸。
術(shù)語“引物”可以指一條以上的引物或引物的混合物，也可以指寡核苷酸——無論該寡核苷酸是天然存在的，如以純化的限制性消化物的形式，或是合成產(chǎn)生的，當(dāng)處于與核酸鏈互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物可以被催化合成的條件下時(shí)，引物可作為沿互補(bǔ)鏈的多核苷酸合成的起始點(diǎn)。這些條件典型包括，在合適的溫度，合適的緩沖液中(“緩沖液”包括是輔助因子，或者影響pH值、離子強(qiáng)度等的置換物)，四種不同的脫氧核苷三磷酸，誘導(dǎo)聚合反應(yīng)的試劑，如DNA聚合酶或者逆轉(zhuǎn)錄酶。優(yōu)選的引物是在擴(kuò)增反應(yīng)中具有最大效率的單鏈引物。
本文中所用的核酸序列的互補(bǔ)鏈?zhǔn)侵柑幱凇胺聪蚱叫嘘P(guān)系(antiparallelassociation)”的寡核苷酸，即當(dāng)與核酸序列比對(duì)時(shí)，一個(gè)序列的5′端與另一個(gè)序列的3′端配對(duì)。本發(fā)明的核酸可以包括那些在天然核酸中不常見的某些堿基，這些堿基包括，例如，肌苷、7-脫氮鳥嘌呤以及上述討論的堿基?；パa(bǔ)不需要完全匹配，穩(wěn)定的雙螺旋可以含有錯(cuò)配堿基對(duì)或不匹配的堿基。在核酸技術(shù)領(lǐng)域的熟練人員可憑以往經(jīng)驗(yàn)來考慮多個(gè)變量，包括例如，寡核苷酸的長(zhǎng)度、堿基組成及寡核苷酸序列、離子強(qiáng)度與錯(cuò)配堿基對(duì)的發(fā)生概率，從而判斷雙螺旋的穩(wěn)定性。
在本文中所用的術(shù)語“探針”是指能夠被檢測(cè)到的、由于探針中至少一段序列與區(qū)域中的一段序列互補(bǔ)而與核酸的區(qū)域形成雙螺旋結(jié)構(gòu)的寡核苷酸。優(yōu)選地，探針不含有與引物序列在5′核酸酶反應(yīng)中互補(bǔ)的序列。在下文將討論，探針可以是標(biāo)記的或未標(biāo)記的。探針的3′末端可以是“封閉的”以阻止探針結(jié)合到引物延伸產(chǎn)物?！胺忾]”可以通過使用非互補(bǔ)堿基，或者通過在最后一位核苷酸的3′羥基上添加化學(xué)部分，如生物素或磷酸基團(tuán)來實(shí)現(xiàn)，依賴于所選擇的部分，其通過還作為后續(xù)檢測(cè)的標(biāo)記或者俘獲附加在標(biāo)記上的核酸而實(shí)現(xiàn)雙重目的。封閉還可以通過除去3′-OH或者通過使用缺少3′-OH的核苷酸如雙脫氧核苷酸來實(shí)現(xiàn)。
本文中所用的術(shù)語“標(biāo)記”指能夠附加在核酸或蛋白上的、并能用來提供可檢測(cè)(任選可定量的)信號(hào)的任何原子或分子。通過熒光、放射性、比色法、重量分析法、X-射線衍射或吸收、磁性、酶活等諸如此類，標(biāo)記可以提供可檢測(cè)信號(hào)。本發(fā)明的便利的標(biāo)記包括那些利于寡核苷酸片段大小檢測(cè)的標(biāo)記物。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，標(biāo)記物是熒光染料。熒光標(biāo)記物可以包括帶負(fù)電荷染料，如熒光家族染料，或中性電荷染料，如羅丹明家族染料，或者帶正電荷的染料，如花菁家族染料。熒光家族類染料包括，例如，F(xiàn)AM、HEX、TET、JOE、NAN和ZOE。羅丹明家族染料包括Texas Red、ROX、R110、R6G和TAMRA。FAM、HEX、TET、JOE、NAN、ZOE、ROX、R110、R6G和TAMRA由Perkin-Elmer(Foster City，Calif.)銷售，Texas Red由Molecular Probes，Inc.(Eugene，OR)銷售。花菁家族染料包括Cy2、Cy3、Cy5和Cy7，由Amersham(Amersham Place，Little Chalfont，Buckinghamshire，England)銷售。
本文中所用的術(shù)語“淬滅劑”是指吸收熒光染料所發(fā)射的能量的化學(xué)部分，例如，當(dāng)淬滅劑與熒光染料連接到同一個(gè)多核苷酸時(shí)。該淬滅劑可以以其信號(hào)特征重新發(fā)射從熒光染料所吸收的能量，這樣淬滅劑也能夠作為“標(biāo)記物”。這種現(xiàn)象通常稱為熒光共振能量轉(zhuǎn)移或FRET。備選地，淬滅劑可以將從熒光染料所吸收的能量以熱能形式消耗。在FRET中常用的分子包括，例如，熒光素、FAM、JOE、羅丹明、R6G、TAMRA、ROX、DABCYL及EDANS。無論是作為標(biāo)記物的熒光染料還是淬滅劑是由其激發(fā)和發(fā)射光譜決定的，熒光染料與其是配對(duì)的。例如，F(xiàn)AM在波長(zhǎng)為488nm的光照下被最有效地激發(fā)，發(fā)射光譜范圍在500至650nm，在525nm處發(fā)射光達(dá)到最大值。FAM與例如作為淬滅劑的TAMRA共同使用，TAMRA在514nm處有激發(fā)最大值，F(xiàn)AM是合適的供體標(biāo)記物。示例性的將從熒光染料所吸收的能量消耗的非熒光淬滅劑包括Biosearch Technologies，Inc.(Novato，Calif.)銷售的Black Hole QuenchersTM。
本文中定義的“5′到3′核酸酶活性”是指模板特異性的核酸聚合酶活性，其包括傳統(tǒng)上與某些DNA聚合酶相關(guān)的5′-3′核酸外切酶活性——其中按順序方式將核苷酸從寡核苷酸的5′末端刪除(例如，E.coli DNA聚合酶I具有此活性而Klenow片段沒有)，或5′到3′核酸內(nèi)切酶活性，其中剪切在5′末端或兩個(gè)末端不止一個(gè)磷酸二酯鍵(核苷)處發(fā)生切割。盡管不希望被任何操作的特定理論所限制，在探針-模板雜交上5′到3′內(nèi)切酶活性依賴的剪切中優(yōu)選的底物為置換的單鏈核酸、叉樣結(jié)構(gòu)，在連接置換區(qū)域與鏈的堿基配對(duì)部分的磷酸二酯鍵上發(fā)生水解，如Holland等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 887276-80討論的，其全文結(jié)合于此作為參考。
本文中所用的術(shù)語“相鄰的”是指相對(duì)于位于模板核酸互補(bǔ)鏈上探針的引物的位置。引物與探針可以相距超過20個(gè)核苷酸，或1至約20個(gè)核苷酸，更優(yōu)選地，約1到10個(gè)核苷酸，或可以直接相互毗鄰，這在聚合作用非依賴型過程的檢測(cè)中是理想的。備選地，為了在聚合作用依賴過程中應(yīng)用，例如當(dāng)本發(fā)明的方法在PCR擴(kuò)增及本文教導(dǎo)的檢測(cè)方法中應(yīng)用時(shí)，“鄰接”可以是待擴(kuò)增序列內(nèi)的任意部分，引物下游的任意部分，這樣引物延伸可決定聚合酶的位置，從而使探針被剪切。
本文中所用的術(shù)語“熱穩(wěn)定的核酸聚合酶”是指當(dāng)與，例如，E.coli的核苷酸聚合酶相比較，對(duì)熱相對(duì)穩(wěn)定、而且催化核苷三磷酸聚合的酶。一般情況下，該酶從與靶序列退火的引物的3′末端起始合成反應(yīng)，并向模板的5′末端方向持續(xù)新鏈的合成，如果該酶具有5′到3′核酸酶活性，水解干涉，退火的探針以釋放標(biāo)記及未標(biāo)記探針片段，直至合成結(jié)束或者探針片段從靶序列上脫離。美國(guó)專利4,889,818描述了具有代表性的從水生棲熱菌(Thermus aquaticus)(Taq)中分離的熱穩(wěn)定酶，該酶在常規(guī)PCR中的使用方法在Saiki et al.，1988，Science 239487-91中有詳細(xì)說明。
Taq DNA聚合酶具有DNA合成依賴的、鏈置換的5′-3′核酸外切酶活性。參見Gelfand，在PCR Technology Principles and Applications for DNAAmplification，Erlich，Ed.，Stockton Press，N.Y.(1989)中第二章“Taq DNA聚合酶”部分。在溶液中，即使有的話，也僅有極少的探針發(fā)生降解。
術(shù)語核酸、引物和探針的“5′核酸酶反應(yīng)”是指當(dāng)引物用具有5′到3′核酸酶活性的核酸聚合酶延伸時(shí)，與核酸雜交的探針發(fā)生降解，詳細(xì)描述如下。此類反應(yīng)基于美國(guó)專利6,214,979、5,804,375、5,487,972和5,210,015中描述的反應(yīng)，其全文結(jié)合于此作為參考。
術(shù)語“靶核酸”是指能夠與引物和探針在5′核酸酶反應(yīng)中雜交并含有一個(gè)或多個(gè)核苷酸變異位點(diǎn)的核酸。
本文中所用的術(shù)語“嚴(yán)謹(jǐn)”或“嚴(yán)謹(jǐn)條件”是指在低離子強(qiáng)度及高溫下的雜交條件，這在本技術(shù)領(lǐng)域中是眾所周知的。參見，例如，Sambrooket al.，2001，Molecular CloningA Laboratory Manual，Third Edition，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York；CurrentProtocols in Molecular Biology(Ausubel et al.，ed.，J.Wiley & Sons Inc.，New York，1988)；Tijssen，1993“Overview of principles of hybridizationand the strategy of nucleic acid assays”(Elsevier)，其每一個(gè)結(jié)合于此作為參考。一般而言，在特定的離子強(qiáng)度及pH值的條件下，選擇低于指定序列熱融解點(diǎn)(Tm)約5-30℃的條件作為嚴(yán)謹(jǐn)條件。備選地，可選擇低于在特定的離子強(qiáng)度及pH值的條件下指定序列Tm約5-15℃的條件作為嚴(yán)謹(jǐn)條件。Tm是指50％的探針能與靶互補(bǔ)，與靶序列的雜交達(dá)到平衡狀態(tài)(由于靶序列在此處是過量的，達(dá)到Tm時(shí)，50％的探針被結(jié)合而處于平衡態(tài))時(shí)的溫度(在特定的離子強(qiáng)度、pH值及核酸濃度下)。例如，嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件是指鹽濃度低于約1.0M鈉(或其他鹽)離子；典型的，在約pH7.0至約pH8.3、對(duì)于短探針(例如，10到50個(gè)核苷酸)溫度至少為約25℃，對(duì)于長(zhǎng)探針(例如，超過50個(gè)核苷酸)溫度至少約55℃的條件，(嚴(yán)謹(jǐn)條件)為約0.01至約1M鈉離子濃度。在添加了例如甲酰胺的雜交去穩(wěn)定劑后，嚴(yán)謹(jǐn)條件也會(huì)發(fā)生變化。對(duì)于長(zhǎng)探針(例如，超過50個(gè)核苷酸)，示例性的非嚴(yán)謹(jǐn)或低嚴(yán)謹(jǐn)條件包括含20mM Tris，pH8.5、50mM KCl及2mM MgCl2的緩沖液以及25℃的反應(yīng)溫度。
本發(fā)明的實(shí)施，除非另有說明，將使用傳統(tǒng)的分子生物學(xué)技術(shù)、微生物學(xué)及重組DNA技術(shù)，其均在本技術(shù)領(lǐng)域熟練人員的掌握中。這些技術(shù)已經(jīng)在文獻(xiàn)中進(jìn)行充分闡述，參見例如Sambrook et al.，2001，MolecularCloningA Laboratory Manual，Third Edition，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，New York；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait，ed.，1984)、Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames & S.J.Higgins，eds.，1984)、A Practical Guide to Molecular Cloning(B.Perbal，1984)Methodsin Enzymology系列叢書(Academic Press，Inc.)。
HCV-1a全基因組核苷酸序列獲自GenBank，登記號(hào)M67463，位于核苷酸6264位與7601位之間的NS5A編碼區(qū)以SEQ ID NO1提供。最近發(fā)現(xiàn)的單核苷酸替換發(fā)生在937位點(diǎn)。G937A替換對(duì)應(yīng)編碼氨基酸中纈氨酸到異亮氨酸的改變。
本技術(shù)領(lǐng)域中已知有大量用于檢測(cè)核苷酸或氨基酸變異的技術(shù)，均可用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法。用于鑒定序列變異的具體方法并不是本發(fā)明的關(guān)鍵方面。盡管在性能、花費(fèi)及便利方面的考慮，將使得具體方法會(huì)比其他方法更合適，但清楚的是，任何能夠鑒定SEQ ID NO1中937位核苷酸或SEQ ID NO2中313位氨基酸的方法都能為實(shí)踐本發(fā)明提供需要的信息。這些技術(shù)可以是基于多核苷酸的或基于蛋白的。無論在哪種情況下，這些使用的技術(shù)都必須足夠靈敏，以便精確檢測(cè)出單核苷酸或氨基酸變異。
在基于多核苷酸的檢測(cè)方法中，通過鑒定置換位點(diǎn)，即SEQ ID NO1中核苷酸937位的核苷酸的存在而實(shí)現(xiàn)基因分型。任何類型的含HCV-1a多核苷酸的被HCV-1a感染個(gè)體的生物樣品均可用來確定基因型?？赏ㄟ^本技術(shù)領(lǐng)域中眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)RNA提取方法通過分離HCV RNA來進(jìn)行基因分型。RNA的擴(kuò)增可通過例如病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶，對(duì)靶RNA進(jìn)行第一次反轉(zhuǎn)錄，然后擴(kuò)增獲得的cDNA，或使用聯(lián)合的高溫反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)，如美國(guó)專利5,310,652、5,322,770、5,561,058、5,641,864與5,693,517中所述而進(jìn)行，每個(gè)結(jié)合于此作為參考(也可參見Myers andSigua，1995，PCR Strategies，見上，第五章)。已知本技術(shù)領(lǐng)域中有多種方法用于鑒定單一核苷酸位點(diǎn)上的核苷酸。
937位的核苷酸可以通過DNA測(cè)序方法鑒定，例如本技術(shù)領(lǐng)域中眾所周知的的鏈終止法(Sanger et al.，1977，Proc.Natl.Acad.Sci.745463-5467，其結(jié)合于此作為參考)。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)含有置換位點(diǎn)的該基因的亞序列(subsequence)進(jìn)行擴(kuò)增，克隆到穩(wěn)定的質(zhì)粒然后進(jìn)行測(cè)序，或者直接進(jìn)行測(cè)序?；赑CR的測(cè)序在美國(guó)專利5,075,216；Brow，PCRProtocols，1990(Innis et al.，eds.，Academic Press，San Diego)第24章；以及Gyllensten，PCR技術(shù)Technology，1989(Erlich，ed.，Stockton Press，NewYork)第5章中均有描述，每個(gè)結(jié)合于此作為參考。典型地，測(cè)序使用已經(jīng)商業(yè)化的，例如獲自PE Biosystems(FosterCity，Calif.)、Pharmacia(Piscataway，N.J.)、Genomyx Corp.(Foster City，Calif.)、LI-COR Biotech(Lincloln，Nebr.)、GeneSys technologies(Sauk City，Wis.)以及VisableGenetics，Inc.(Toronto，Canada)的自動(dòng)DNA測(cè)序儀來完成。
可通過使用基于擴(kuò)增的基因分型方法對(duì)937位核苷酸進(jìn)行鑒定?，F(xiàn)已闡述了多種核酸擴(kuò)增的方法，它們可用于能檢測(cè)出靶核酸中單個(gè)堿基的改變的檢測(cè)中。優(yōu)選的方法是本技術(shù)領(lǐng)域中目前眾所周知的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，如美國(guó)專利4,683,195、4,683,202和4,965,188中所描述；每個(gè)結(jié)合于此作為參考。大量發(fā)表描述PCR方法與應(yīng)用的文章的例子可以在PCRApplications，1999，(Innis et al.，eds.，Academic Press，San Diego)、PCRStrategies，1995，(Innis et al.，eds.，Academic Press，San Diego)，PCRProtocols，1990，(Innis et al.，eds.，Academic Press，San Diego)；和PCRTechnology，1989，(Erlich，ed.，Stockton Press，New York)中找到；每個(gè)結(jié)合于此作為參考。商家，例如PE Biosystems(Foster City，Calif.)銷售PCR試劑并發(fā)布PCR方案。
其他合適的擴(kuò)增方法包括連接酶鏈反應(yīng)(Wu和Wallace 1988，Genomics 4560-569)；鏈置換分析(Walker et al.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89392-396，Walker et al.1992，NucleicAcids Res.201691-1696，及美國(guó)專利5,455,166)；及幾種基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增體系，包括美國(guó)專利5,437,990、5,409,818與5,399,491所描述的方法；轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增體系(TAS)(Kwoh et al.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 861173-1177)；及自身維持的序列復(fù)制(3SR)(Guatelli et al.，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 871874-1878及WO92/08800)；每個(gè)結(jié)合于此作為參考。備選地，也可使用將探針擴(kuò)增到可檢測(cè)水平的方法，例如Qβ-復(fù)制酶擴(kuò)增(Kramer和Lizardi，1989，Nature 339401-402與Lomeli et al.，1989，Clin.Chem.351826-1831，均結(jié)合于此作為參考)。在Abramson和Myers，1993，Current Opinion inBiotechology，441-47中提供了關(guān)于已知擴(kuò)增方法的綜述，結(jié)合于此作為參考。
937位的核苷酸可以通過序列特異性擴(kuò)增或者引物延伸方法來鑒定，這些方法都是基于末端引物錯(cuò)配對(duì)DNA聚合酶在延伸引物能力上的抑制效應(yīng)。為了使用序列特異性擴(kuò)增或者基于延伸的方法來檢測(cè)一段序列，選擇與NS5A基因互補(bǔ)的引物，從而使3′末端核苷酸在置換位點(diǎn)進(jìn)行雜交。在存在待鑒定的特定變異時(shí)，引物在3′末端處與靶序列匹配，引物進(jìn)行延伸。在不存在特定變異時(shí)，引物與靶序列存在3′錯(cuò)配，引物延伸被終止，或者顯著減少。等位基因特異的擴(kuò)增或者基于延伸的方法在例如，美國(guó)專利5,137,806、5,595,890、5,639,611和美國(guó)專利4,851,331中有所描述，每個(gè)結(jié)合于此作為參考。通過基于序列特異擴(kuò)增的基因分型，鑒定置換僅需要檢測(cè)是否存在已擴(kuò)增的靶序列。在本技術(shù)領(lǐng)域中檢測(cè)已擴(kuò)增的靶序列的方法是眾所周知的。例如，凝膠電泳(參見Sambrook et al.，1989，見上)和上述廣泛用于檢測(cè)核酸存在的探針雜交分析。
備選的不使用探針的方法，此處指動(dòng)態(tài)PCR(kinetic-PCR)方法，即通過監(jiān)測(cè)反應(yīng)混合物中雙鏈DNA總量的增加來檢測(cè)所擴(kuò)增核酸的產(chǎn)生，在Higuchi et al.，1992，Bio/Technology，10413-417；Higuchi et al.，1993，Bio/Technology，111026-1030；Higuchi和Watson，PCR Applications，見上，第16章；美國(guó)專利5,994,056和歐洲專利申請(qǐng)487,218與512,334中有所描述，每個(gè)結(jié)合于此作為參考。雙鏈靶DNA的檢測(cè)依賴于溴化乙啶(EtBr)及其他DNA結(jié)合染料結(jié)合到雙鏈DNA上而發(fā)出的增強(qiáng)的熒光。由于靶序列的合成導(dǎo)致的雙鏈DNA的增加使結(jié)合到雙鏈DNA上的染料的量也增加，所伴隨的是可檢測(cè)到的熒光也增加。對(duì)使用動(dòng)態(tài)PCR方法進(jìn)行基因分型而言，使用一對(duì)特異于等位基因中一種的引物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，這樣每個(gè)擴(kuò)增可表明存在一個(gè)特定的等位基因。通過進(jìn)行兩次擴(kuò)增，一次使用特異于937位為G的引物，一次使用特異于937位為A的引物，可以確定樣品的基因型。
937位核苷酸可使用基于探針的方法來鑒定，這依賴于探針與核苷酸變異體所形成的雜交雙鏈體所導(dǎo)致的穩(wěn)定性的差異，其在互補(bǔ)程度的差異。在充分嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交條件下，只有在探針與完全匹配的靶序列之間才會(huì)形成穩(wěn)定的雙鏈體。可通過大量熟知方法中的任何一種來檢測(cè)穩(wěn)定的雜交雙鏈體的存在。一般而言，為了便于檢測(cè)，優(yōu)選雜交前擴(kuò)增核酸。然而，如果不擴(kuò)增也能獲得足夠的核酸時(shí)，則不必如此。
在一些實(shí)施方案中，位于937位點(diǎn)的核苷酸通過在序列特異性的雜交條件下，與含937位點(diǎn)在內(nèi)的NS5A基因區(qū)完全互補(bǔ)的寡核苷酸探針雜交來鑒定。選擇雜交序列的探針及序列特異性的雜交條件，以使置換位點(diǎn)的單個(gè)錯(cuò)配就能夠充分破壞雜交雙鏈體的穩(wěn)定性，導(dǎo)致其無法有效形成。這樣，在序列特異性的雜交條件下，只有在探針與完全互補(bǔ)序列之間才能形成穩(wěn)定雙鏈體。因此，長(zhǎng)度為14至60個(gè)核苷酸，優(yōu)選地，長(zhǎng)度為14至35個(gè)核苷酸，并與含937位點(diǎn)在內(nèi)的NS5A基因區(qū)完全互補(bǔ)的寡核苷酸均包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在其他實(shí)施方案中，位于937位點(diǎn)的核苷酸可通過在充分嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交條件下，與含937位點(diǎn)在內(nèi)的NS5A基因區(qū)基本互補(bǔ)的寡核苷酸進(jìn)行雜交來鑒定。在該實(shí)施方案中，當(dāng)保持足夠的嚴(yán)謹(jǐn)度可以排除與非靶序列之間形成穩(wěn)定的雙鏈體時(shí)，雜交條件可以充分寬松，以便與靶序列形成穩(wěn)定的雙鏈體。因此，長(zhǎng)度為14至60個(gè)核苷酸，優(yōu)選地，長(zhǎng)度為14至35個(gè)核苷酸，并與含937位點(diǎn)在內(nèi)的NS5A基因區(qū)基本互補(bǔ)的寡核苷酸均包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在雜交條件的優(yōu)化受限的檢測(cè)方案中，使用基本互補(bǔ)的，而非完全互補(bǔ)的寡核苷酸是理想的。例如，在典型的多靶固定探針的檢測(cè)方案中，將每個(gè)靶的探針固定在單一的固體支持物上。通過將含有靶DNA的溶液與固體支持物接觸而同時(shí)進(jìn)行雜交。由于所有的雜交都是在同樣的條件下進(jìn)行，因此無法對(duì)每個(gè)探針的雜交條件進(jìn)行個(gè)別優(yōu)化。當(dāng)檢測(cè)方案不允許調(diào)整雜交條件時(shí)，整合在探針中的錯(cuò)配可以用于調(diào)節(jié)雙鏈體的穩(wěn)定性。特定引入的錯(cuò)配對(duì)雙鏈體穩(wěn)定性的影響是眾所周知的，雙鏈體的穩(wěn)定性通?？梢詰{估計(jì)和經(jīng)驗(yàn)來常規(guī)判斷，如上所述。
適合在本發(fā)明基于探針的方法中使用的寡核苷酸，其包括一段與SEQID NO1的靶區(qū)或SEQ ID NO1的互補(bǔ)區(qū)基本互補(bǔ)或完全互補(bǔ)的雜交區(qū)，其中靶區(qū)包括937位點(diǎn)，可以根據(jù)本文提供的及本技術(shù)領(lǐng)域中眾所周知的指導(dǎo)來進(jìn)行選擇。同樣地，基于探針精確長(zhǎng)度及序列的合適的雜交條件，可以根據(jù)本文提供的及本技術(shù)領(lǐng)域中眾所周知的指導(dǎo)憑經(jīng)驗(yàn)來進(jìn)行選擇。應(yīng)用寡核苷酸探針檢測(cè)序列中的單堿基對(duì)差異，在例如，Conner et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sd.USA 80278-282，及美國(guó)專利5,468,613與5,604,099中有所描述，每個(gè)結(jié)合于此作為參考。
完全匹配與單堿基錯(cuò)配的雜交雙鏈體之間的穩(wěn)定性的比例變化依賴于雜交的寡核苷酸的長(zhǎng)度。由較短探針序列形成的雙鏈體在存在一個(gè)錯(cuò)配時(shí)會(huì)成比例地不穩(wěn)定。在實(shí)踐中，長(zhǎng)度為14至35個(gè)核苷酸的寡核苷酸在序列特異性檢測(cè)中是優(yōu)選的。另外，由于雜交的寡核苷酸末端由于熱能而處于不斷的隨機(jī)解離與再退火的過程中，因此無論哪個(gè)末端的錯(cuò)配對(duì)雜交雙鏈體穩(wěn)定性的影響都小于位于序列中間的錯(cuò)配。優(yōu)選地，為了分辯靶序列中的單堿基對(duì)變化，選擇那些與靶序列雜交時(shí)核苷酸置換位點(diǎn)存在于探針的中間區(qū)域的探針序列。
上述關(guān)于選擇與SEQ ID NO1雜交的探針序列的標(biāo)準(zhǔn)將應(yīng)用于探針的雜交區(qū)，即，探針中與靶序列雜交相關(guān)的部分。探針還可以結(jié)合另外的核酸序列，例如用于固定探針的poly-T尾，而不顯著改變探針的雜交特性。對(duì)于在本發(fā)明中的應(yīng)用，本技術(shù)領(lǐng)域中的熟練人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到結(jié)合另外核酸序列的探針基本上等同于不結(jié)合的探針，所述另外的核酸序列與靶序列不互補(bǔ)，因此不參與雜交。在用來測(cè)定NS5A基因型的基于探針的方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，擴(kuò)增含有置換位點(diǎn)的NS5A基因的核酸序列，然后在充分嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交條件下與探針雜交。通過探針與擴(kuò)增靶序列的結(jié)合模式可以推導(dǎo)出核苷酸序列。在該實(shí)施方案中，進(jìn)行擴(kuò)增的目的是為了提供足夠量的可用于探針雜交分析的核酸。因此，設(shè)計(jì)的引物可擴(kuò)增含置換位點(diǎn)的NS5A基因區(qū)域，而不管樣品中存在何種核苷酸。與不依賴于序列的擴(kuò)增可以通過使用與NS5A基因保守區(qū)雜交的引物來完成。
用于檢測(cè)探針與樣品中靶核酸序列所形成雜合體的合適的分析方案在本技術(shù)領(lǐng)域中是已知的，包括固定靶的方案及固定探針的分析方案。這些分析方案在美國(guó)專利5,310,893、5,451,512、5,468,613及5,604,099中有所描述；每個(gè)結(jié)合于此作為參考。此外，微芯片或微陣列技術(shù)也可應(yīng)用于本發(fā)明的基于探針的檢測(cè)方法中。從本質(zhì)上看，在微芯片中，大量的不同寡核苷酸探針被固定在陣列中的基質(zhì)或載體上，例如，硅芯片或者玻片。被分析的靶核酸序列可與固定在微芯片上的寡核苷酸探針接觸(Lipshutz etal.，1995，Biotechniques，19442-445)。備選地，將待研究的多個(gè)靶核酸序列固定在基質(zhì)上，探針陣列與固定的靶序列接觸(Drmanac et al.，1998，Nature Biotechnology，1654-58)。已經(jīng)開發(fā)了大量的結(jié)合一種或多種上述用來檢測(cè)單核苷酸突變技術(shù)的微芯片技術(shù)。微芯片技術(shù)，與計(jì)算機(jī)分析工具相結(jié)合，可進(jìn)行大規(guī)?？焖俸Y選。微芯片技術(shù)相對(duì)本發(fā)明的改進(jìn)對(duì)于那些可通過現(xiàn)有公開資料做出評(píng)估的本技術(shù)領(lǐng)域中的熟練人員來說是顯而易見的(Wilgenbus et al.，1999，J.Mol.Med.，77761-786)。
本發(fā)明中優(yōu)選的檢測(cè)核苷酸置換的基于探針的基因分型技術(shù)是“5′核酸酶反應(yīng)”，其實(shí)施方案在美國(guó)專利5,210,015、5,487,972和5,804,375，以及Holland et al.，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 887276-7280中有所描述，每個(gè)結(jié)合于此作為參考。用于進(jìn)行5′核酸酶反應(yīng)的試劑及設(shè)備，例如Roche Diagnostics的COBAS TAQMANTM系統(tǒng)，對(duì)本技術(shù)領(lǐng)域的熟練人員來說是熟悉的。
簡(jiǎn)言之，在5′核酸酶反應(yīng)中，在引物及探針與核酸的一條鏈雜交的條件下，將該核酸與引物及探針相接觸。這段核酸、引物及探針還與具有5′到3′核酸酶活性的核酸聚合酶相接觸。具有5′到3′核酸酶活性的核酸聚合酶能夠剪切與引物下游核酸雜交的探針。引物的3′末端提供核酸聚合酶的起始結(jié)合位點(diǎn)。一旦結(jié)合的聚合酶遇到探針的5′末端，聚合酶就可以從探針上切除片段。
引物及探針可以設(shè)計(jì)成其在核酸上退火位置很接近，這樣結(jié)合到引物3′末端的核酸聚合酶自動(dòng)與探針的5′末端接觸。在該過程中，不需要聚合作用將核酸聚合酶引入到位點(diǎn)以實(shí)現(xiàn)剪切。術(shù)語“不依賴聚合作用的剪切”指的就是該過程。
備選地，如果引物與探針在核酸上更遠(yuǎn)的間隔區(qū)域退火，則核酸聚合酶在遇到探針5′末端前必須進(jìn)行聚合作用。隨著聚合作用的進(jìn)行，聚合酶逐漸開始從探針5′末端剪切片段。剪切持續(xù)進(jìn)行，直至探針剩余部分達(dá)到無法穩(wěn)定結(jié)合的程度而從模板分子上解離。術(shù)語“依賴聚合作用的剪切”知道就是該過程。
不依賴聚合作用的剪切的一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于不必進(jìn)行核酸擴(kuò)增。在缺乏引物延伸時(shí)，核酸鏈實(shí)質(zhì)上是單鏈的。如果引物和探針相鄰地結(jié)合核酸，則可以發(fā)生寡核苷酸退火及片段剪切的連續(xù)循環(huán)。這樣，可以產(chǎn)生足夠量的片段，從而在不需要聚合作用的情況下也可進(jìn)行檢測(cè)。
無論在哪個(gè)過程中，都需要提供的樣品中含有核酸。包含在樣品中的核酸可以先反轉(zhuǎn)錄成cDNA，必要時(shí)，然后再使用任何合適的變性方法，包括本技術(shù)領(lǐng)域中熟練人員已知的物理的、化學(xué)的或酶學(xué)的方法進(jìn)行變性。優(yōu)選的分離鏈的物理方法包括加熱核酸直至其完全(＞99％)變性。典型的熱變性包括溫度范圍從約80℃到約105℃，時(shí)間從約1至10分鐘。作為變性的備選方法，核酸可以以單鏈形式存在于樣品中，例如，單鏈RNA或DNA病毒。
然后變性的核酸鏈與引物及探針在雜交條件下溫育，在該條件下，引物及探針能夠結(jié)合到核酸鏈上。在一些實(shí)施方案中，可以使用兩條引物來擴(kuò)增核酸。如本技術(shù)領(lǐng)域中所知，選擇兩個(gè)引物使得它們沿著核酸的相對(duì)位置是這樣的當(dāng)延伸產(chǎn)物從其模板(互補(bǔ)鏈)上分離時(shí)，從一個(gè)引物合成的延伸產(chǎn)物作為另一個(gè)引物延伸的模板，從而產(chǎn)生確定長(zhǎng)度的復(fù)制鏈。
由于典型地互補(bǔ)鏈比探針或者引物長(zhǎng)，因此鏈具有更多的接觸點(diǎn)，從而在任意給定的時(shí)間內(nèi)有更大的機(jī)會(huì)互相尋找到對(duì)方。因此高摩爾的過量探針及引物，有助于使平衡傾向引物與探針的退火，而不是模板之間的重新退火。
引物必須要足夠長(zhǎng)，從而能在聚合反應(yīng)試劑存在的情況下起始延伸產(chǎn)物的合成。引物的確切長(zhǎng)度及組成依賴于多種因素，包括退火反應(yīng)的溫度、引物的來源與組成、探針退火位點(diǎn)與引物退火位點(diǎn)的臨近程度以及引物探針的濃度比例。例如，由于序列的復(fù)雜性，通常寡核苷酸引物含有大約15-30個(gè)核苷酸，盡管也可能包含更多或更少的核苷酸。引物必須具有足夠的互補(bǔ)性去選擇性地與其各自的鏈退火并形成穩(wěn)定的雙鏈體。
選擇的每條引物要與核酸的鏈“實(shí)質(zhì)上”互補(bǔ)。引物不必反映模板的精確序列，但必須是足夠的互補(bǔ)，以與其各自的鏈選擇性地雜交。如果引物與其模板鏈能夠保持足夠的互補(bǔ)性并能與之形成穩(wěn)定的雙鏈體，則可以將非互補(bǔ)堿基或較長(zhǎng)的序列引入到引物中或位于引物末端。引物的非互補(bǔ)核苷酸序列可以包括限制性酶切位點(diǎn)。
有多種技術(shù)可用于在引物延伸的聚合作用達(dá)到該雙鏈體區(qū)之前，或者在不依賴聚合作用的過程中聚合酶附在上游寡核苷酸之前，增加探針與其互補(bǔ)核酸之間退火的可能性。短的引物分子一般需要更低的溫度與核酸形成足夠穩(wěn)定的雜交復(fù)合物。因此，將探針設(shè)計(jì)的比引物長(zhǎng)，這樣可以在比引物退火溫度更高的溫度下，使探針優(yōu)先與核酸退火。
也可以使用具有不同熱穩(wěn)定性的引物與探針。例如，選擇具有更高G/C含量的核苷酸組成的探針，結(jié)果，獲得比引物更高的熱穩(wěn)定性?；蛘呃?，可以將非常規(guī)DNA堿基摻入到引物或探針中，從而導(dǎo)致與只含有常規(guī)DNA堿基的引物或探針相比較，具有更大或更小的熱穩(wěn)定性。也可以改變熱循環(huán)的參數(shù)以利用探針和引物不同的熱穩(wěn)定性。例如，在熱循環(huán)中變性步驟之后，可引入一個(gè)允許探針結(jié)合而不允許引物結(jié)合的中間溫度，然后再將溫度進(jìn)一步降低以允許引物退火與延伸。
為了優(yōu)先使探針先于引物進(jìn)行結(jié)合，也可以使用相對(duì)于引物濃度而言過量的高摩爾的探針。這樣的探針濃度典型地是在比每種引物濃度高約2至20倍的范圍內(nèi)，后者一般是0.5-5×10-7M。
可通過任何合適的方法來制備引物與探針。制備特定序列的寡核苷酸的方法在本技術(shù)領(lǐng)域中是已知的，包括，例如，合適序列的克隆和限制性酶切及直接化學(xué)合成。化學(xué)合成方法可包括，例如Narang et al.，1979，Method in Enzymology，6890中描述的磷酸三酯法、Brown et al.，1979，Method in Enzymology 68109中介紹的磷酸二酯法、Beaucage et al.，1981，Tetrahedron Letters 221859中介紹的二乙基氨基磷酸酯法，及美國(guó)專利4,458,066中公開的固相支持法。此外，可在寡核苷酸中引入修飾，從而影響酶對(duì)寡核苷酸的作用。例如，引入修飾的磷酸二酯鍵(例如，硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、氨基磷酸酯或boranophosphate)，或者在探針中引入非亞磷酸(phosphorous acid)衍生物鍵接，從而抑制在所選位點(diǎn)進(jìn)行剪切；或者，例如，含有2′氨基修飾的糖可能使寡核苷酸的取代超過消化。
寡核苷酸引物的模板依賴的延伸反應(yīng)在存在足夠量的四種脫氧核糖核苷三磷酸(dATP、dGTP、dCTP與dTTP)或上述的類似物時(shí)，由聚合反應(yīng)試劑催化，反應(yīng)介質(zhì)由適量的鹽、金屬陽(yáng)離子及pH緩沖液體系組成。合適的聚合反應(yīng)試劑是已知催化引物和模板依賴的DNA合成并具有5′到3′核酸酶活性的酶。已知的DNA聚合酶包括，例如，大腸桿菌DNA聚合酶I、Tth DNA聚合酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)DNA聚合酶、Thermococcus littoralis DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶與Z05DNA聚合酶。使用這些DNA聚合酶催化DNA合成的反應(yīng)條件在本技術(shù)領(lǐng)域中是眾所周知的。為了應(yīng)用于本發(fā)明中，聚合反應(yīng)試劑必須能夠有效剪切寡核苷酸并釋放被標(biāo)記的片段，從而可以直接或間接產(chǎn)生信號(hào)。
合成的產(chǎn)物是由模板鏈與引物延伸鏈組成的雙鏈體分子。這種合成的副產(chǎn)物是由單、雙及更大核苷酸片段混合物組成的探針片段。變性、探針和引物退火、引物延伸及探針剪切的重復(fù)循環(huán)導(dǎo)致由引物確定的區(qū)間的指數(shù)式增加，標(biāo)記的片段也以指數(shù)形式產(chǎn)生。進(jìn)行足夠多的循環(huán)以獲得可檢測(cè)量的比背景信號(hào)通常高幾個(gè)數(shù)量級(jí)的探針片段。
在優(yōu)選的方法中，PCR反應(yīng)作為一個(gè)使用熱穩(wěn)定酶的自動(dòng)過程來進(jìn)行。在該過程中，反應(yīng)混合物循環(huán)地經(jīng)過變性步驟、探針和引物退火步驟及合成步驟，從而使剪切與置換與引物依賴的模板延伸反應(yīng)同時(shí)發(fā)生。可使用溫度循環(huán)儀，例如Applied Biosystems已商業(yè)化的專門設(shè)計(jì)為使用熱穩(wěn)定酶的儀器來進(jìn)行上述反應(yīng)步驟。
在該自動(dòng)化過程中，溫度穩(wěn)定的聚合酶是優(yōu)選的，這是因?yàn)樵赑CR循環(huán)過程中，將雙鏈延伸產(chǎn)物變性的優(yōu)選方式要將這些它們暴露在高溫中(大約95℃)。例如，美國(guó)專利4,889,818公開了一種從水生棲熱菌中分離的具有代表性的熱穩(wěn)定酶。其他具有代表性的溫度穩(wěn)定聚合酶包括，例如，從耐熱細(xì)菌黃棲熱菌(Thermus flavus)、紅棲熱菌(Thermus rubber)、嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(與其它列出的相比，其具有更低的最適溫度)、乳棲熱菌(Thermus lacteus)、紅色棲熱菌(Thermus rubens、海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)、Tbermococcus littoraiis及熾熱甲烷嗜熱菌(Methanothermus fervidus)中提取的聚合酶。
5′核酸酶反應(yīng)中的探針是任何能夠用來鑒定靶核酸基因型的寡核苷酸。典型地，探針包括與靶核酸區(qū)域相對(duì)應(yīng)的核苷酸序列。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明中的方法，該區(qū)域應(yīng)含有NS5A基因的937位點(diǎn)。
探針的核苷酸序列可以是任何足以在核酸酶反應(yīng)中產(chǎn)生片段的長(zhǎng)度。在某些的實(shí)施方案中，探針的核苷酸序列可以由至少6個(gè)核苷酸組成，通常小于140個(gè)核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，探針長(zhǎng)度在14至60個(gè)核苷酸之間。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，探針長(zhǎng)度在14至35個(gè)核苷酸之間。選擇的探針長(zhǎng)度要能夠提供足夠的熱力學(xué)穩(wěn)定性，以確保探針與靶序列在PCR退火步驟的溫度下能夠雜交。例如，具有非常規(guī)DNA堿基的探針可比那些具有常規(guī)DNA堿基的探針更長(zhǎng)或者更短。作為另一個(gè)實(shí)例，富含A/T序列的探針要比富含G/C序列的探針更長(zhǎng)一些。核苷酸變異位點(diǎn)可以位于探針核苷酸序列的任意位置。在優(yōu)選實(shí)施方案中，核苷酸變異位點(diǎn)不位于探針核酸序列的5′末端。
典型地，探針核酸序列與靶區(qū)域一致或者互補(bǔ)。但是，探針核酸序列可與靶核苷酸區(qū)域的同源性或互補(bǔ)性低于100％。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，探針核苷酸序列與靶核苷酸區(qū)域的互補(bǔ)性或同源性為99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，探針核苷酸序列與靶核苷酸區(qū)域在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交。在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，探針核苷酸序列與靶核苷酸區(qū)域在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交。
除了探針的核苷酸序列，探針還可以包含附加的核苷酸序列或者其它不干擾本發(fā)明方法的部分。在本發(fā)明的便利的實(shí)施方案中，探針可以包括附加的核苷酸序列或者其它促進(jìn)本發(fā)明方法的部分。例如，可以對(duì)探針3′末端進(jìn)行封閉，以防止不需要的擴(kuò)增引發(fā)。同樣，可以存在于探針中的部分用來使探針或者探針片段與靶核苷酸序列的雜交不穩(wěn)定。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，探針可包含一個(gè)標(biāo)記物。在便利的實(shí)施方案中，標(biāo)記物可以是利于檢測(cè)核酸酶反應(yīng)中產(chǎn)生的靶探針片段大小的標(biāo)記物。
將可通過分光光度、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)或者化學(xué)方法檢測(cè)的部分整合到探針中而對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記。當(dāng)然，將標(biāo)記物與寡核苷酸探針耦聯(lián)或鍵合的方法依賴于所用標(biāo)記物的類型及標(biāo)記物在探針中的位置。
適于檢測(cè)的各種標(biāo)記物及將其整合到探針中的方法在本技術(shù)領(lǐng)域中是已知的；包括，但不局限于，酶(例如，堿性磷酸酶和辣根過氧化物酶)與酶的底物、放射性原子、熒光染料、生色團(tuán)、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物、電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物，例如OriginTM(Igen)，具有特異結(jié)合配偶體的配體、或者任何其他可通過相互作用而增強(qiáng)、改變或降低信號(hào)的標(biāo)記物。當(dāng)然，由于核酸酶反應(yīng)通過熱循環(huán)儀來實(shí)現(xiàn)，因此標(biāo)記物應(yīng)能夠存在于該自動(dòng)化過程所需的溫度循環(huán)中存在。
在放射性原子中，32P是優(yōu)選的。將32P引入核酸中的方法在本技術(shù)領(lǐng)域中是已知的，包括，例如，使用激酶進(jìn)行5′標(biāo)記，或者通過切口平移隨機(jī)插入。典型地酶通過其活性進(jìn)行檢測(cè)。“特異結(jié)合配偶體”是指能夠高特異性地與配體分子結(jié)合的蛋白，如抗原與單克隆抗體之間的特異性結(jié)合。其他特異結(jié)合配偶體包括生物素與親和素或鏈親和素、IgG與蛋白A，以及本技術(shù)領(lǐng)域中已知的多種受體-配體結(jié)合物。應(yīng)理解以上描述并不表示將各種標(biāo)記物劃分到不同的種類中，因?yàn)橥瑯拥臉?biāo)記物可以在多種不同模式中使用。例如，125I可以作為放射性標(biāo)記物或者作為電子密試劑。HRP可以作為酶或者單克隆抗體的抗原。另外，為了達(dá)到所需效果，可以將多種標(biāo)記物組合使用。例如，可以用生物素標(biāo)記探針，而使用標(biāo)記125I的親和素或者使用標(biāo)記HRP的抗生物素單克隆抗體來檢測(cè)其存在。其他的改變和可能性對(duì)本技術(shù)領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員而言是顯而易見的，而且作為等價(jià)物包含在本發(fā)明的范圍中。
標(biāo)記物可以通過各種技術(shù)直接或者間接附加在寡核苷酸上。根據(jù)使用的標(biāo)記物的確切類型，可以使標(biāo)記物位于探針的5′或3′末端、位于探針核苷酸序列的內(nèi)部，或者具有各種長(zhǎng)度及組成的間隔臂以利于信號(hào)的相互作用。使用商品化獲得的亞磷酰胺試劑，通過適當(dāng)保護(hù)的亞磷酰胺可以產(chǎn)生在其中一個(gè)末端含有功能基團(tuán)(例如，硫醇或者伯胺)的寡聚物，并可通過，例如PCR ProtocolsA Guide to Methods and Applications，Innis et al.，等編輯Academic Press，Inc.，1990中描述的方法標(biāo)記它們。
引入寡核苷酸功能試劑的方法以將一個(gè)或者多個(gè)巰基、氨基或羥基部分引入到寡核苷酸探針序列中，典型地是在5′末端，在美國(guó)專利4,914,210中所描述。通過使用多核苷酸激酶及提供報(bào)告基團(tuán)的[γ-32P]ATP可引入5′磷酸基團(tuán)，作為放射性同位素。生物素可以通過使在合成過程中引入的氨基胸苷殘基或氨烷基接頭與生物素的N-羥基琥珀酰亞胺酯反應(yīng)而添加到5′末端。
3′末端的標(biāo)記物可以通過多核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶添加上理想的部分，例如，蛹蟲草菌素35S-dATP及生物素化的dUTP。
寡核苷酸衍生物也是可應(yīng)用的標(biāo)記物。例如，乙烯(etheno)-dA與乙烯-A是已知的熒光腺嘌呤核苷酸，可以整合到寡核苷酸探針上。同樣地，乙烯-dC是另一種可以用在探針合成中的類似物。通過PCR中聚合酶的5′到3′核酸酶活性作為DNA聚合酶延伸引物，含有這類核苷酸衍生物的探針可被水解以釋放出更多強(qiáng)熒光單核苷酸。
在實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，標(biāo)記物是利于寡核苷酸片段檢測(cè)的熒光。這些標(biāo)記物包括，但不限于，熒光素、多鹵熒光素，優(yōu)選的是六氯熒光素、香豆素、羅丹明、花菁、嗪、噻嗪與squaraines。在進(jìn)一步的優(yōu)選實(shí)施方案中，單個(gè)探針是使用熒光染料(即標(biāo)記物)與淬滅劑雙標(biāo)記的。當(dāng)探針完整時(shí)，標(biāo)記物的熒光被淬滅劑淬滅。而在標(biāo)記物與淬滅劑之間剪切探針將導(dǎo)致由標(biāo)記物發(fā)射的熒光更少地被淬滅?？梢詫?shí)現(xiàn)本發(fā)明中該方面的示例性組合是熒光染料羅丹明590和淬滅劑結(jié)晶紫。
NS5A基因937位點(diǎn)的核苷酸同一性可在相同分析中通過利用單一的5′核酸酶反應(yīng)在測(cè)定樣品中HCV類型或亞型(即HCV基因分型分析)而確定。在該實(shí)施方案中，用來檢測(cè)NS5A基因937位核苷酸置換的探針是與一種或多種在單個(gè)5′核酸酶反應(yīng)中用于HCV基因分型檢測(cè)(例如，與高序列多樣性的HCV基因組的5′UTR區(qū)雜交的探針)的探針的混合物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，每個(gè)單獨(dú)的探針均含有其自身獨(dú)特的標(biāo)記物(例如，獨(dú)特的熒光染料)，從而將其信號(hào)與單個(gè)5′核酸酶反應(yīng)中其他探針產(chǎn)生的信號(hào)進(jìn)行區(qū)分。
937位的核苷酸可以通過由5′核酸酶反應(yīng)衍生的名為后PCR(post-PCR)融解/退火分析進(jìn)行鑒定。典型地，5′核酸酶反應(yīng)中的雙標(biāo)記探針(即，探針包括熒光染料和淬滅劑)在實(shí)時(shí)或動(dòng)態(tài)PCR過程中以生長(zhǎng)曲線的形式產(chǎn)生熒光信號(hào)，由該曲線可以計(jì)算出Ct值，并用于獲得定量或定性運(yùn)算的結(jié)果。在該過程中，探針被具有5′核酸酶活性的酶剪切，產(chǎn)生各種DNA片段，其中一些仍然被熒光報(bào)告物所標(biāo)記。這些片段一旦產(chǎn)生，便不再參與信號(hào)的產(chǎn)生。然而，在某些情況下，全長(zhǎng)的完整雙標(biāo)記探針在PCR結(jié)束之后還有殘留。如果殘留的探針很充足，就可以用來通過融解步驟提供關(guān)于靶核酸的進(jìn)一步信息，在該步驟中，探針從靶核酸上解離，所導(dǎo)致的熒光改變用于測(cè)定探針與特定的靶核酸之間的融解溫度(Tm)，這種熒光的改變與序列的匹配及錯(cuò)配(即基因分型)相關(guān)。熒光的改變是由于熒光報(bào)告物與淬滅劑之間的距離的變化造成，所述距離的變化是由于在探針由不規(guī)則螺旋結(jié)構(gòu)及與靶核酸堿基配對(duì)的退火結(jié)構(gòu)之間的轉(zhuǎn)變而造成的。通過進(jìn)行不對(duì)稱PCR，其中產(chǎn)生與探針結(jié)合的鏈的引物的濃度過量，從而降低在PCR過程中被剪切的探針的量，并確保留下足夠的用于后PCR融解分析的探針。
937位核苷酸可以通過美國(guó)專利6,031,098中描述的受阻插入化合物(hindered intercalating compounds)或者試劑來測(cè)定，其全部?jī)?nèi)容結(jié)合于此作為參考。簡(jiǎn)言之，這些可具有可檢測(cè)標(biāo)記物或者能夠催化光解作用的化合物具有足夠的位阻，使得它們只能夠插入到存在堿基錯(cuò)配的核苷酸堿基之間，因此可用于檢測(cè)單核苷酸變異。
另一種用于檢測(cè)937位核苷酸的有用技術(shù)是質(zhì)譜分析(MS)。雖然與電噴射(Electrospray)/離子噴射(Ionspray)偶聯(lián)的液相色譜技術(shù)(LC-ESI/MS)也是一種重要的工具，但在核酸基因分型領(lǐng)域中最常用的MS技術(shù)已是基質(zhì)輔助激光解吸離子化法(MALDI-MS)。典型地，利用MS確定核酸序列是通過常規(guī)的DNA測(cè)序方法進(jìn)行的，例如利用引物與確定的脫氧核糖核苷酸及雙脫氧核糖核苷酸混合物、并通過MALDI檢測(cè)獲得的“梯狀條帶”的鏈終止法。在美國(guó)專利6,258,538(其全部?jī)?nèi)容結(jié)合于此作為參考)所描述的另一個(gè)方法中，靶核酸固定在固體支持物上。然后引物與靶核酸在待分析的核苷酸位點(diǎn)附近退火。在存在選擇的脫氧核糖核苷酸及雙脫氧核糖核苷酸混合物的情況下進(jìn)行引物延伸。然后通過質(zhì)譜分析所獲得的延伸及未延伸引物的混合物，從而測(cè)定待測(cè)位點(diǎn)的核苷酸的同一性。
基于蛋白的檢測(cè)技術(shù)也被證明是有用的，尤其是在本發(fā)明檢測(cè)HCV-1a的NS5A蛋白313位氨基酸的同一性方面。為了檢測(cè)氨基酸變異，可應(yīng)用蛋白質(zhì)測(cè)序技術(shù)。例如，NS5A蛋白或者其片段可以通過使用從被檢驗(yàn)個(gè)體分離的NS5A多核苷酸片段的重組表達(dá)進(jìn)行合成。優(yōu)選地，使用不超過100至150個(gè)堿基對(duì)，含有937位核苷酸的NS5A cDNA片段。然后可以通過常規(guī)的蛋白質(zhì)測(cè)序方法來測(cè)定肽的氨基酸序列。近年來開發(fā)的HPLC-顯微術(shù)串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(microscopy tandem mass spectrometry)也可用來測(cè)定氨基酸序列變異。在該技術(shù)中，對(duì)蛋白進(jìn)行蛋白酶消化，獲得的肽混合物通過反相色譜分離法進(jìn)行分離。然后進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜法，并對(duì)收集的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。參見Gatlin et al.，Anal.Chem.，72757-763(2000)。
其他有用的基于蛋白的檢測(cè)技術(shù)包括基于個(gè)體基因型特異抗體的免疫親和試驗(yàn)，即，依照本發(fā)明的特異于含有氨基酸置換的蛋白的抗體?？贵w可用于從樣品溶液中免疫沉淀特異的蛋白，或者對(duì)通過例如聚丙烯酰胺膠分離的蛋白進(jìn)行免疫印跡。免疫細(xì)胞化學(xué)法可用于檢測(cè)組織或細(xì)胞中特異的蛋白多態(tài)性。也可使用其他熟知的基于抗體的技術(shù)，包括，例如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、放射免疫測(cè)定法(RIA)、免疫放射分析(IRMA)及免疫酶測(cè)定法(IEMA)，包括用單克隆或者多克隆抗體進(jìn)行的三明治測(cè)定法。參見，例如，美國(guó)專利4,376,110與4,486,530，其結(jié)合于此作為參考。
本發(fā)明還涉及含有有用組分以實(shí)現(xiàn)本方法的試劑盒，容器單元?？捎玫脑噭┖锌珊杏糜跈z測(cè)NS5A基因置換937位點(diǎn)中937位核苷酸置換的寡核苷酸。在某些情況下，檢測(cè)探針可以固定在合適的支持膜上。試劑盒還包括用于擴(kuò)增含有置換位點(diǎn)的NS5A基因座區(qū)域的擴(kuò)增引物，因?yàn)檫@些引物在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中是有用的。備選地，有用的試劑盒可以包括一系列引物，其包含特異擴(kuò)增NS5A基因的序列特異性引物。試劑盒的其他任選組分包括此處所述的用于基因分型方法的附加試劑。例如，試劑盒還可包括催化引物延伸產(chǎn)物合成的試劑、底物核苷三磷酸、標(biāo)記和/或檢測(cè)核酸的工具(例如，如果標(biāo)記物是生物素，則是親和素-酶偶聯(lián)物，及酶的底物和色原)、用于擴(kuò)增或雜交反應(yīng)的合適緩沖液，以及實(shí)施本方法的說明書。
以下所述的本發(fā)明的實(shí)施例僅用于舉例說明目的，而不限制本發(fā)明的范圍。對(duì)本領(lǐng)域熟練人員來說，閱讀前述文字和以下實(shí)施例后，本發(fā)明的許多實(shí)施例均在實(shí)施例之后的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例Roferon臨床研究概述Roferon-A(IFN-α-2A)臨床試驗(yàn)N-139203/NV14524B是一個(gè)隨機(jī)的，多中心的III期臨床研究，完成于1997年7月。其目標(biāo)是比較Roferon-A(從6MIU到3MIU的生活制度)在治療慢性HCV患者中24周和48周的效率和安全性(參見表1)。
HCV基因型在患者中的分布如表2所示?；谑褂肧AS中l(wèi)ogistic回歸程序而得到的幾率應(yīng)答，在預(yù)研究檢測(cè)(病毒血癥、HCV基因型、病毒應(yīng)答、年齡、性別、種族、體表面積、疾病階段、組織學(xué)活動(dòng)指標(biāo)和ALT)中沒有差異。
收集生化(肝臟酶學(xué)檢測(cè)或ALT)和病毒學(xué)(PCR檢測(cè)的病毒負(fù)荷)檢測(cè)用于數(shù)據(jù)分析的時(shí)間窗口是0周(活性臨床治療的第一天)、12周、20周、24周、48周和72周。所有分析，包括圖表，列表和繪圖均通過SASPROC GLM程序進(jìn)行分析。在24周組的應(yīng)答率是15％，在48周的應(yīng)答率為19％，二者是統(tǒng)計(jì)學(xué)上相等的。
表1分組信息

表2基因型分布

序列分析概述對(duì)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的生物化學(xué)(ALT)和病毒學(xué)(PCR)應(yīng)答進(jìn)行繪圖，并用于評(píng)估治療結(jié)果(參見表3處理結(jié)果分類規(guī)則)。通過來源于Roferon臨床試驗(yàn)(NV14524)的貯存的患者血清，從遺傳學(xué)專業(yè)實(shí)驗(yàn)室(PGL，在Uppsala，Sweden)獲得患者病毒亞基因組NS5A區(qū)域不應(yīng)答(NR)或完全應(yīng)答(CR)的預(yù)處理和處理的序列。在分析中包括總數(shù)110個(gè)HCV-1b患者中的28個(gè)樣品(18NR，10CR)和總數(shù)182個(gè)HCV-1a患者中的24個(gè)樣品(13NR，11CR)。通過Silicon Graphics的MineSet構(gòu)建決策樹(decisiontree)，并根據(jù)處理結(jié)果對(duì)個(gè)體進(jìn)行分類。
表3IFN處理結(jié)果的種類


將NS5A區(qū)的氨基酸變化轉(zhuǎn)換為二元形式。備選地，用“0”表示不存在該殘基，用“1”表示存在該殘基，從而對(duì)真正的氨基酸序列記分，構(gòu)建蛋白的每個(gè)殘基位置各種可能氨基酸的表格，以代表序列數(shù)據(jù)。軟件對(duì)IFN處理產(chǎn)生的完全應(yīng)答或不應(yīng)答相關(guān)的突變進(jìn)行鑒定。在該樹中，以描述的每個(gè)分支到達(dá)“樹葉”的步長(zhǎng)來構(gòu)建規(guī)則。例如，在8個(gè)73位是纈氨酸而195位不是丙氨酸的HCV-1b序列中，所有的均是不應(yīng)答的。同樣，其它規(guī)則均寫在樹的所有“樹葉”上。決策樹構(gòu)建的一般分析策略是將數(shù)據(jù)分為兩部分，一部分用于構(gòu)建樹，而另一部分用于檢測(cè)樹。由于獲得NS5A序列數(shù)據(jù)的患者數(shù)目較少，因此所有的數(shù)據(jù)均用于構(gòu)建樹。當(dāng)將規(guī)則反過來應(yīng)用于數(shù)據(jù)時(shí)，錯(cuò)判率對(duì)HCV-1b而言為14％，對(duì)HCV-1a而言為4％。HCV-1a的詳細(xì)結(jié)果參見表4。
表4對(duì)NS5A-1a預(yù)測(cè)的評(píng)估

因此92％的313I＝NR
根據(jù)這些結(jié)果，在5.5倍更可能是不應(yīng)答患者(耐受干擾素治療)的HCV-1a患者中，氨基酸殘基313I(異亮氨酸)與NR的相關(guān)性是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的(Fischer exact test，p＜0.001)。而HCV-1b患者的序列模式(殘基73V & 195A)的觀察不是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的(卡方檢驗(yàn)，具有2個(gè)自由度的x2＝1.49)。
序列特異性擴(kuò)增/引物延伸通過改變一個(gè)引物3’端的堿基，可使一個(gè)核苷酸變異比另外一個(gè)得到優(yōu)先擴(kuò)增。為了優(yōu)先擴(kuò)增“A”變異體，最好選擇是在有義鏈上的上游引物末端用A代替G，從而使更不穩(wěn)定的A-C錯(cuò)配超過G-T錯(cuò)配。通過Northwestern University的Oligonucleotide Properties Calculator(http//www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html)軟件設(shè)計(jì)引物長(zhǎng)度，使每個(gè)引物的總Tm值約為65℃。在所有情況下都進(jìn)行了鹽濃度調(diào)整測(cè)定。上游引物的一個(gè)實(shí)例如下有義鏈5’-GATTCGCCCCAGCCCTGCCCA*-3’)(SEQ ID NO3)(星號(hào)表示937位的核苷酸)可通過Oligo Primer Analysis軟件，版本為6.32(Molecular BiologyInsights，Inc.)設(shè)計(jì)匹配的下游引物，這種引物的實(shí)例如下反義鏈5’-GGCCAAGGCAGTAGGTAGGGT-3’(SEQ ID NO4)為了優(yōu)先擴(kuò)增“G”變體，一個(gè)選擇是將靶DNA反義鏈上的下游引物設(shè)計(jì)為末端以C代替T，從而形成更不穩(wěn)定的C-A錯(cuò)配。為了使錯(cuò)配的末端堿基更不穩(wěn)定，可分別用叔-丁基-芐基-dA或叔-丁基-芐基-dC作為最后一個(gè)堿基，增加一個(gè)較大的基團(tuán)可增加空間位阻，從而使完全匹配模板比錯(cuò)配模板更優(yōu)先地被延伸。下游引物的一個(gè)實(shí)例如下反義鏈5’-GTAGTCCGGCCGCCGCGCCCAGAC*-3’(SEQ ID NO5)(星號(hào)表示937位的核苷酸)
通過Oligo 6.32設(shè)計(jì)的一個(gè)匹配上游引物的實(shí)例如下有義鏈5’-CATAGGTTTGCGCCCCCTTGC-3’(SEQ ID NO6)為了使某個(gè)變異比其他變異更優(yōu)先的被擴(kuò)增出來，擴(kuò)增條件應(yīng)盡可能嚴(yán)謹(jǐn)。這可通過仔細(xì)選擇熱循環(huán)條件來完成，特別是選擇退火/延伸溫度，以確保3’端完全匹配比3’端有一個(gè)堿基對(duì)錯(cuò)配更優(yōu)先擴(kuò)增。引物Tm設(shè)計(jì)在65℃附近，因此檢測(cè)了58-65℃的退火溫度，以確定利于目的核苷酸變異的最佳溫度。
典型的熱循環(huán)條件，如COBAS TaqMan 96儀器所用的條件為95℃20秒，58-65℃退火/延伸40秒，共擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增后，通過2.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。另外，在通過可檢測(cè)染料信號(hào)增加的熱循環(huán)儀，例如ABI PRISM 7700，進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)的擴(kuò)增中，可加入0.2x濃度的內(nèi)部嵌入染料Sybr Green。
典型的PCR master mix包括以下成分，以每100μl反應(yīng)液的終濃度表示ZO5 DNA聚合酶20個(gè)單位Tricine，pH8.0 100mMKOAc，pH7.5 125mM甘油 9.0％dATP 200μMdUTP 200μMdGTP 200μMdCTP 200μM引物125pmol引物225pmolUNG 1個(gè)單位5’核酸酶反應(yīng)通過5’核酸酶探針化學(xué)和仔細(xì)優(yōu)化使完全匹配模板比錯(cuò)配模板更利于切割的退火/延伸溫度可區(qū)分單堿基對(duì)錯(cuò)配。將含有報(bào)告染料(例如FAM)和淬滅染料(例如CY5)的5’核酸酶探針通常設(shè)計(jì)為其Tm比引物的Tm約高10℃，從而在引物延伸前利于探針與靶序列退火，然后對(duì)探針進(jìn)行切割。這種切割可將報(bào)告染料與淬滅染料分離，從而可檢測(cè)由報(bào)告染料散發(fā)的染料。在重復(fù)的PCR循環(huán)中，這些染料散發(fā)隨產(chǎn)生的擴(kuò)增子數(shù)目的增加而增加，可繪制成生長(zhǎng)曲線，從而表明熒光隨循環(huán)數(shù)的增加。探針與模板序列之間的錯(cuò)配可使這種結(jié)合不穩(wěn)定，從而對(duì)探針進(jìn)行切割。
區(qū)分“G”和“A”變體的5’核酸酶探針的實(shí)例如下反義鏈5’-FAM-CAGA(C/T)GGGCAGGGCTGGGGCGA-CY5-3’(SEQ ID NO7)如以上實(shí)施例所描述，將5’核酸酶探針以終濃度10pmol加到PCR反應(yīng)混合物中。該探針設(shè)計(jì)為Tm約為72℃，以在Tm約為65℃的引物之前進(jìn)行結(jié)合。也可通過Oligo 6.32軟件設(shè)計(jì)該探針區(qū)的匹配引物，實(shí)例如下有義鏈引物5’-GAGATGGGCACCATCACC-3’(SEQ ID NO8)反義鏈引物5’-GGCCAAAGTAGGTAGGGT-3’(SEQ ID NO9)使用與前述實(shí)施例相同的熱循環(huán)條件。
可使用可激活報(bào)告染料并測(cè)定隨后的熒光發(fā)射的熱循環(huán)儀，例如COBAS TaqMan 96或ABI PRISM 7700。
后PCR的融解分析另一種區(qū)分單堿基對(duì)變體間的方法是設(shè)計(jì)可在變異位點(diǎn)附近進(jìn)行擴(kuò)增的PCR引物，在PCR反應(yīng)后，利用可與目的區(qū)域退火的熒光標(biāo)記的探針產(chǎn)生融解曲線。典型地，將最后一輪擴(kuò)增后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在熒光標(biāo)記探針的存在下加熱到95℃進(jìn)行變性產(chǎn)生融解曲線。然后將溫度快速冷卻到40℃以使探針與同源的擴(kuò)增子區(qū)快速再退火。然后將溫度慢慢升到80℃，并在每個(gè)溫度步驟頻繁讀取熒光值。當(dāng)溫度達(dá)到使探針與擴(kuò)增子解離的點(diǎn)時(shí)，則標(biāo)記探針的熒光發(fā)生偏移，可對(duì)這種熒光的變化進(jìn)行檢測(cè)。探針與擴(kuò)增子的單堿基對(duì)錯(cuò)配使探針比完全匹配時(shí)在更早的溫度下發(fā)生解離或“融解”掉，從而通過其各自的融解溫度將兩個(gè)產(chǎn)物區(qū)分開?？赏ㄟ^5’核酸酶實(shí)施例中的PCR引物和探針檢測(cè)法產(chǎn)生融解曲線。
另外，另一種通過雜交探針化學(xué)進(jìn)行的PCR檢測(cè)法也可用于產(chǎn)生差異融解曲線，但在這種情況下，用兩條探針代替一條探針。第一條探針命名為“錨定”探針，設(shè)計(jì)為其Tm比第二條探針，即“感應(yīng)”探針的Tm高，錨定探針用3’末端供體染料，例如FAM合成。感應(yīng)探針5’末端標(biāo)記受體染料，例如LC640。在PCR退火過程中，這兩個(gè)探針設(shè)計(jì)為結(jié)合在目的區(qū)域，供體探針的3’末端與受體探針的5’末端間隔1-5個(gè)核苷酸。在該步驟中，熒光能量從FAM染料轉(zhuǎn)移到LC640受體染料中，因此對(duì)LC640染料的發(fā)散進(jìn)行測(cè)定。在PCR的下一個(gè)步驟中，升高溫度，以利于PCR產(chǎn)物的延伸及寡聚探針對(duì)的解離，保存探針用于PCR的后續(xù)循環(huán)中，并隨后產(chǎn)生融解曲線。在該情況下，三步PCR的溫度條件如下95℃變性步驟20秒58℃退火步驟20秒72℃延伸步驟40秒，共45循環(huán)這種PCR反應(yīng)必須在能夠激發(fā)FAM染料并能夠測(cè)定LC640染料散發(fā)的儀器上進(jìn)行，例如LightCycler2.0。
用兩條雜交探針作為錨定探針和感應(yīng)探針，而且也使用5’磷酸酶實(shí)施例中所描述的引物來區(qū)分兩個(gè)不同的NS5A變體的預(yù)實(shí)施例如下錨定探針5’-AGTCTCGGAGATTCGCCCC-FAM-3’(SEQ ID NO10)感應(yīng)探針5’-LC640-GCCCTGCCC(A/G)TCTG-3’(SEQ ID NO11)已經(jīng)設(shè)計(jì)錨定探針的Tm為62℃，而與擴(kuò)增子完全匹配的感應(yīng)探針的Tm設(shè)計(jì)為53℃。一個(gè)單堿基對(duì)錯(cuò)配可能使Tm值比完全匹配時(shí)至少低4℃。在這種情況下，錨定探針與感應(yīng)探針之間相隔一個(gè)單堿基對(duì)。
PCR測(cè)序可用5’核酸酶反應(yīng)實(shí)施例中所描述的引物(SEQ ID NO8和SEQ IDNO9)及上述PCR條件進(jìn)行PCR測(cè)序。
序列表<110>霍夫曼-拉羅奇有限公司<120>作為干擾素應(yīng)答標(biāo)記的NS5A核苷酸序列變體<130>case 22600<160>11<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1338<212>DNA<213>丙型肝炎病毒<400>1tcctggctaa gggacatctg ggactggata tgcgaggtgc tgagcgactt taagacctgg 60ctgaaagcca agctcatgcc acaactgcct gggattccct ttgtgtcctg ccagcgcggg120tatagggggg tctggcgagg agacggcatt atgcacactc gctgccactg tggagctgag180atcactggac atgtcaaaaa cgggacgatg aggatcgtcg gtcctaggac ctgcaagaac240atgtggagtg ggacgttctt cattaatgcc tacaccacgg gcccctgtac tccccttcct300gcgccgaact ataagttcgc gctgtggagg gtgtctgcag aggaatacgt ggagataagg360cgggtggggg acttccacta cgtatcgggc atgactactg acaatctcaa atgcccgtgc420cagatcccat cgcccgaatt tttcacagaa ttggacgggg tgcgcctaca taggtttgcg480cccccttgca agcccttgct gcgggaggag gtatcattca gagtaggact ccacgagtac540
ccggtggggt cgcaattacc ttgcgagccc gaaccggacg tagccgtgtt gacgtccatg 600ctcactgatc cctcccatat aacagcagag gcggccggga gaaggttggc gagagggtca 660cccccttcta tggccagctc ctcggctagc cagctgtccg ctccatctct caaggcaact 720tgcaccgcca accatgactc ccctgacgcc gagctcatag aggctaacct cctgtggagg 780caggagatgg gcggcaacat caccagggtt gagtcagaga acaaagtggt gattctggac 840tccttcgatc cgcttgtggc agaggaggat gagcgggagg tctccgtacc cgcagaaatt 900ctgcggaagt ctcggagatt cgccccagcc ctgcccgtct gggcgcggcc ggactacaac 960cccctgctag tagagacgtg gaaaaagcct gactacgaac cacctgtggt ccatggctgc1020ccgctaccac ctccacggtc ccctcctgtg cctccgcctc ggaaaaagcg tacggtggtc1080ctcaccgaat caaccctacc tactgccttg gccgagcttg ccaccaaaag ttttggcagc1140tcctcaactt ccggcattac gggcgacaat acgacaacat cctctgagcc cgccccttct1200ggctgccccc ccgactccga cgttgagtcc tattcttcca tgccccccct ggagggggag1260cctggggatc cggatctcag cgacgggtca tggtcgacgg tcagtagtgg ggccgacacg1320gaagatgtcg tgtgctgc 1338<210>2<211>446<212>PRT<213>丙型肝炎病毒<400>2Ser Trp Leu Arg Asp Ile Trp Asp Trp Ile Cys Glu Val Leu Ser Asp
1 5 10 15Phe Lys Thr Trp Leu Lys Ala Lys Leu Met Pro Gln Leu Pro Gly Ile20 25 30Pro Phe Val Ser Cys Gln Arg Gly Tyr Arg Gly Val Trp Arg Gly Asp35 40 45Gly Ile Met His Thr Arg Cys His Cys Gly Ala Glu Ile Thr Gly His50 55 60Val Lys Asn Gly Thr Met Arg Ile Val Gly Pro Arg Thr Cys Lys Asn65 70 75 80Met Trp Ser Gly Thr Phe Phe Ile Asn Ala Tyr Thr Thr Gly Pro Cys85 90 95Thr Pro Leu Pro Ala Pro Asn Tyr Lys Phe Ala Leu Trp Arg Val Ser100 105 110Ala Glu Glu Tyr Val Glu Ile Arg Arg Val Gly Asp Phe His Tyr Val115 120 125Ser Gly Met Thr Thr Asp Asn Leu Lys Cys Pro Cys Gln Ile Pro Ser
130 135 140Pro Glu Phe Phe Thr Glu Leu Asp Gly Val Arg Leu His Arg Phe Ala145 150 155 160Pro Pro Cys Lys Pro Leu Leu Arg Glu Glu Val Ser Phe Arg Val Gly165 170 175Leu His Glu Tyr Pro Val Gly Ser Gln Leu Pro Cys Glu Pro Glu Pro180 185 190Asp Val Ala Val Leu Thr Ser Met Leu Thr Asp Pro Ser His Ile Thr195 200 205Ala Glu Ala Ala Gly Arg Arg Leu Ala Arg Gly Ser Pro Pro Ser Met210 215 220Ala Ser Ser Ser Ala Ser Gln Leu Ser Ala Pro Ser Leu Lys Ala Thr225 230 235 240Cys Thr Ala Asn His Asp Ser Pro Asp Ala Glu Leu Ile Glu Ala Asn245 250 255Leu Leu Trp Arg Gln Glu Met Gly Gly Asn Ile Thr Arg Val Glu Ser
260 265 270Glu Asn Lys Val Val Ile Leu Asp Ser Phe Asp Pro Leu Val Ala Glu275 280 285Glu Asp Glu Arg Glu Val Ser Val Pro Ala Glu Ile Leu Arg Lys Ser290 295 300Arg Arg Phe Ala Pro Ala Leu Pro Val Trp Ala Arg Pro Asp Tyr Asn305 310 315 320Pro Leu Leu Val Glu Thr Trp Lys Lys Pro Asp Tyr Glu Pro Pro Val325 330 335Val His Gly Cys Pro Leu Pro Pro Pro Arg Ser Pro Pro Val Pro Pro340 345 350Pro Arg Lys Lys Arg Thr Val Val Leu Thr Glu Ser Thr Leu Pro Thr355 360 365Ala Leu Ala Glu Leu Ala Thr Lys Ser Phe Gly Ser Ser Ser Thr Ser370 375 380Gly Ile Thr Gly Asp Asn Thr Thr Thr Ser Ser Glu Pro Ala Pro Ser
385 390 395 400Gly Cys Pro Pro Asp Ser Asp Val Glu Ser Tyr Ser Ser Met Pro Pro405 410 415Leu Glu Gly Glu Pro Gly Asp Pro Asp Leu Ser Asp Gly Ser Trp Ser420 425 430Thr Val Ser Ser Gly Ala Asp Thr Glu Asp Val Val Cys Cys435 440 445<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>3gattcgcccc agccctgccc a 21
<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>4ggccaaggca gtaggtaggg t 21<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>5gtagtccggc cgccgcgccc agac24
<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>6cataggtttg cgcccccttg c 21<210>7<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述探針<220>
<221>misc_feature<222>(5)
<223>y是c或t/u<400>7cagaygggca gggctggggc ga 22<210>8<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>8gagatgggca ccatcacc 18<210>9<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>9ggccaaagta ggtagggt 18<210>10<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述探針<400>10agtctcggag attcgcccc 19<210>11<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述探針<220>
<221>misc_feature<222>(10)<223>r是a或g<400>11gccctgcccr tctg 1權(quán)利要求
1.一種預(yù)測(cè)感染HCV-1a的人類受試者對(duì)干擾素治療應(yīng)答的方法，包括a)提供來源于所述人類受試者的HCV-1a多核苷酸，其包含一個(gè)部分，所述部分包括NS5A基因937位的核苷酸，和b)測(cè)定所述937位的核苷酸是否是G，其中937位G的存在表明所述人類受試者對(duì)干擾素治療持續(xù)的病毒學(xué)應(yīng)答的增加的可能性。
2.干擾素在制備用于治療感染HCV的人類受試者的藥物中的應(yīng)用，其中在所述的感染HCV的人類受試者中，HCV-1a多核苷酸的NS5A基因的937位核苷酸是G。
3.權(quán)利要求1中的方法，其中NS5A基因937位核苷酸的檢測(cè)進(jìn)一步包含檢測(cè)感染人類受試者的HCV的毒株型或亞型。
4.權(quán)利要求1或3中的方法，其中所述的檢測(cè)步驟包含實(shí)施一種鑒定，所述鑒定能夠檢測(cè)NS5A基因的937位的單核苷酸置換。
5.權(quán)利要求1，3或4中的方法，其中所述鑒定或檢測(cè)步驟包含對(duì)包括937位核苷酸的NS5A基因的部分進(jìn)行測(cè)序。
6.權(quán)利要求1，3或4中的方法，其中所述鑒定或檢測(cè)步驟包含序列特異的擴(kuò)增或引物延伸檢測(cè)。
7.權(quán)利要求1，3或4中的方法，其中所述鑒定或檢測(cè)步驟包含5’核酸酶反應(yīng)檢測(cè)。
8.權(quán)利要求1，3或4中的方法，其中所述鑒定檢測(cè)步驟包含后-PCR融解分析檢測(cè)。
9.一種預(yù)測(cè)感染HCV-1a的人類受試者對(duì)干擾素治療應(yīng)答的方法，包括a)提供來源于所述人類受試者的HCV-1a多肽，其包含一個(gè)部分，所述部分包括NS5A蛋白313位的氨基酸，和b)測(cè)定所述313位的氨基酸是否是纈氨酸，其中313位纈氨酸的存在表明所述人類受試者對(duì)干擾素治療的持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答的增加的可能性。
10.干擾素在制備用于治療感染HCV的人類受試者的藥物的應(yīng)用，其中在所述的感染HCV的人類受試者中，HCV-1a蛋白的NS5A蛋白的313位氨基酸是纈氨酸。
11.權(quán)利要求2或權(quán)利要求10中的應(yīng)用，其中干擾素治療選自Roferon-A、Pegasys、IntronA或Peg-Intron。
12.一種預(yù)測(cè)感染HCV-1a的人類受試者對(duì)干擾素治療應(yīng)答的方法，包括a)提供來源于所述人類受試者的HCV-1a多核苷酸，其包含NS5A基因937位的核苷酸，和b)測(cè)定所述937位的核苷酸是否是A，其中937位A的存在表明所述人類受試者對(duì)干擾素治療病毒學(xué)無應(yīng)答的增加的可能性。
13.權(quán)利要求12中的方法，其中NS5A基因937位核苷酸的檢測(cè)進(jìn)一步包含檢測(cè)感染人類受試者的HCV的毒株型或亞型。
14.權(quán)利要求12中的方法，其中所述檢測(cè)步驟包含實(shí)施一種鑒定，所述鑒定能夠檢測(cè)NS5A基因937位單核苷酸置換。
15.權(quán)利要求12到14任何一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述鑒定或檢測(cè)步驟包含對(duì)包括937位核苷酸的NS5A基因的部分進(jìn)行測(cè)序。
16.權(quán)利要求12到14任何一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述鑒定或檢測(cè)步驟包含序列特異的擴(kuò)增或引物延伸檢測(cè)。
17.權(quán)利要求12到14任何一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述鑒定或檢測(cè)步驟包含5’核酸酶反應(yīng)檢測(cè)。
18.權(quán)利要求12到14任何一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述鑒定或檢測(cè)步驟包含后-PC融解分析檢測(cè)。
19.一種預(yù)測(cè)感染HCV-1a的人類受試者對(duì)干擾素治療應(yīng)答的方法，包括a)提供來源于所述人類受試者的HCV-1a多肽，其包含一個(gè)部分，所述部分包括NS5A蛋白313位的氨基酸，和b)測(cè)定所述313位的氨基酸是否是異亮氨酸，其中313位異亮氨酸的存在表明所述人類受試者對(duì)干擾素治療的病毒學(xué)無應(yīng)答的增加的可能性。
20.一種可用于檢測(cè)HCV-1a的NS5A基因937位核苷酸置換的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的長(zhǎng)度為14-35個(gè)核苷酸，且與包括937位核苷酸的NS5A基因區(qū)域的一條鏈基本互補(bǔ)。
21.權(quán)利要求20中的寡核苷酸，其中所述區(qū)域的范圍是從SEQ ID NO1的908位核苷酸到957位核苷酸。
22.權(quán)利要求20中的寡核苷酸，其選自SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO10或SEQ ID NO11。
23.一種用于預(yù)測(cè)感染HCV-1a的人類受試者對(duì)干擾素治療應(yīng)答的試劑盒，其包含權(quán)利要求20-22任何一項(xiàng)權(quán)利要求的寡核苷酸和聚合酶。
全文摘要
描述了用于預(yù)測(cè)個(gè)體對(duì)干擾素治療的應(yīng)答的方法和試劑，其用于測(cè)定HCV－1a NS5A基因937位的核苷酸變異。
文檔編號(hào)C07K14/18GK1693482SQ20051006852
公開日2005年11月9日 申請(qǐng)日期2005年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月29日
發(fā)明者安德魯·邁克爾·阿克里爾, 卡林娜·安娜·奧爾萊, 莫里斯·佩特森 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司