專利名稱：從乳酸乳球菌發(fā)酵液中分離乳酸鏈球菌素的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及微生物產(chǎn)物的分離方法，具體講涉及一種利用膜對乳酸乳球菌發(fā)酵液進行濃縮，分離乳酸鏈球菌素的方法。
背景技術：
乳酸鏈球菌素是由某些乳酸乳球菌(Lactococcus Lactis)產(chǎn)生的一種小分子肽，分子量約為3510Da。這種菌對許多革蘭氏陽性菌，尤其對引起食品腐敗的芽孢桿菌、梭菌、葡萄球菌、利斯特氏菌等有強烈抑制作用，而乳酸鏈球菌素可被人所消化，故乳酸鏈球菌素作為食品防腐劑具有天然無毒的特點，廣泛用于乳制品、罐裝食品、肉制品和飲料的防腐保鮮劑。
楊博等人對乳鏈菌肽的最佳發(fā)酵條件進行了研究，其使用的菌株為乳鏈菌肽生產(chǎn)菌株(Lactococus lactis subsp.lactis)Y-72，檢測菌為黃色微球菌(Micrococcus flavus)NCIB 8166由中科院微生物研究所提供；發(fā)酵培養(yǎng)基為大豆蛋白胨1.0％，牛肉膏0.25％，酵母膏0.25％，Na2HPO4·12HO21.5％，MgSO4·7H2O0.012％，自然PH值；乳鏈菌肽效價檢測培養(yǎng)基為胰蛋白胨0.8％，酵母膏0.5％，NaCl0.5％，NaHPO4·12H2O0.2％，瓊脂1.5％，PH6.8；所用試劑為乳鏈菌肽標準品Aplin & Barrett LTD生產(chǎn)，胰蛋白胨Oxoid LTD生產(chǎn)；多胨日本產(chǎn)，其他培養(yǎng)基為北京市海淀區(qū)微生物培養(yǎng)基制品廠生產(chǎn)；其使用方法為菌體生長測定用721型分光光度計在600nm處測定；乳鏈菌肽效價的測定采用瓊脂擴散法，測發(fā)酵液在檢測平板上產(chǎn)生抑菌圈的大小，用乳鏈菌肽標準品作對照，根據(jù)有關公式計算被測液的效價。作者從碳源種類、碳源濃度、氮源、磷源、磷源發(fā)酵量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)方式、接種量及Y-72發(fā)酵動力學方面對發(fā)酵條件進行了研究(乳鏈菌肽的最佳發(fā)酵條件大連輕工業(yè)學院學報第18卷第1期，1999、365-69)。
近年來，人們探索用吸附劑吸附提取乳酸鏈球菌素的方法，Coventry等人用硅酸鈣抗粘劑，從乳酸乳球菌的發(fā)酵液中吸附乳酸鏈球菌素，但由于該法得到的是吸附復合物，解吸困難。
Janes等人用硅酸作吸附劑從乳酸乳球菌的發(fā)酵液中吸附乳酸鏈球菌素時，得到的是吸附復合液，解吸仍困難。
00129928.X號中國專利申請披露了一種從乳酸乳球菌的發(fā)酵液中吸附乳鏈菌肽的方法，其中記載的方法包括用酸將乳酸乳球菌發(fā)酵產(chǎn)生的含有乳鏈菌肽的發(fā)酵液調(diào)PH至1.8-3.5，于70-100℃下加熱1-60分鐘，殺死細菌并使乳鏈菌肽完全釋放于發(fā)酵液中；隨后，在20-50℃下加入為發(fā)酵液體積0.1-5％的吸附劑進行吸附，保溫攪拌0.5-3小時，制成吸附劑-乳鏈菌肽復合物；制成的吸附劑-乳鏈菌肽復合物的沉淀用蒸餾水洗滌兩次，然后用10％-20％發(fā)酵液體積的解吸附劑進行解吸附，使用的解吸附劑為聚乙二醇與有機酸鹽或無機酸鹽的水溶液，在20-40℃下攪拌5-60分鐘進行解吸附。該方法需吸附、解吸附，加入吸附劑和解吸附劑，生產(chǎn)工藝復雜，成本高，所需產(chǎn)物活性易破壞，耗能高，活性保持低，效率低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種生產(chǎn)工藝簡單、成本低、收率高，活性保持高，分離效果好的乳酸鏈球菌素的分離提取方法。
為達到發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種從發(fā)酵液中分離乳酸鏈球菌素的方法，包括釋放乳酸鏈球菌素、分離和噴霧干燥，所說分離為采用膜過濾的方法分別將分子量大于和小于乳酸鏈球菌素的分子量的物質(zhì)從發(fā)酵液中分離出去。
其中在溫度10-55℃和壓力0.5-2.5MPa條件下，采用無機膜或管式膜過濾從發(fā)酵液中去除菌體和固體等分子量比乳酸鏈球菌素分子量大的物質(zhì)，其中無機膜或管式膜的孔徑為10-60萬，優(yōu)選為15-50萬；溫度優(yōu)選為15-45℃，最優(yōu)選為25-40℃。
在溫度10-55℃和壓力0.5-2.5MPa條件下，用卷式膜從發(fā)酵液中去除分子量比乳酸鏈球菌素分子量小的物質(zhì)，其中卷式膜孔徑為0.2～4萬，優(yōu)選為1.5-3萬；溫度優(yōu)選為15-45℃，最優(yōu)選為25-40℃。
超濾后的發(fā)酵液濃縮物，濃度為100,000-500,000IU/ml，加入填料固體食鹽，使噴霧干燥后食鹽含量為10-50％，在噴霧干燥器上進行噴霧干燥，熱風進口溫度為120-180℃，出口溫度為70-100℃，即得粉末狀食品級的乳酸鏈球菌素產(chǎn)品。
注乳酸鏈球菌素即是乳鏈菌肽nisin。
具體實施例方式
另有說明除外，本發(fā)明所使用的無機或管式膜系以金屬氧化物、陶瓷等為原料制作，壽命較長，膜主件主要由國外供應，國內(nèi)組裝。制造商有Cerrer(法國)、TOK(日本)、Norton(美國)、Mitsui(日本)、Nipongaishi(日本)，Sfec(法國)、Corning(美國)、DDS(丹麥)等公司。
卷式膜為有機材料制作，主要有聚砜、聚醚砜、聚丙烯腈、聚偏氟乙烯、醋酸纖維素等各種材料，膜材主件一般由國外公司進口，在國內(nèi)進行組裝和配套，性能比較優(yōu)越。制造商主要有Pall(美國)、Amicon(美國)、HAYWARD(美國)等公司。
實施例1本實施例中，從乳酸乳球菌發(fā)酵液中提取乳酸鏈球菌素的具體步驟如下1)釋放乳酸鏈球菌素首先取200000ml乳酸乳球菌發(fā)酵產(chǎn)生的含有乳酸鏈球菌素的發(fā)酵液，用濃鹽酸調(diào)pH至1.8，于70℃下加熱60分鐘，使乳酸鏈球菌素完全釋放于發(fā)酵液中；2)膜過濾發(fā)酵液在溫度為15℃，操作壓力為0.5MPa通過無機膜過濾而得到去除菌體和固體等分子量比乳酸鏈球菌素分子量大的物質(zhì)的發(fā)酵液，其中膜的孔徑為60萬；3)卷式膜超濾步驟2)所得到的發(fā)酵液在溫度為10℃，操作壓力為0.5MPa通過卷式膜超濾，去除分子量比乳酸鏈球菌素分子量小的物質(zhì)，得到濃度為100,000IU/ml發(fā)酵液濃縮物，其中卷式膜的孔徑為4萬；4)噴霧干燥上述超濾后的發(fā)酵液濃縮物，加入填料固體食鹽，使噴霧干燥后食鹽含量為30％，在噴霧干燥器上進行噴霧干燥，熱風進口溫度為120℃，出口溫度為70℃，即得粉末狀食品級的乳酸鏈球菌素產(chǎn)品。
其中無機膜組件為Cerrer(法國)制造，卷式膜組件為HAYWARD(美國)制造。
經(jīng)過測試，整個流程乳酸鏈球菌素的收率為89％。
實施例2
本實施例中，從乳酸乳球菌發(fā)酵液中提取乳酸鏈球菌素的具體步驟如下1)釋放乳酸鏈球菌素首先取200000ml乳酸乳球菌發(fā)酵產(chǎn)生的含有乳酸鏈球菌素的發(fā)酵液用濃硫酸調(diào)pH至3.5，于100℃加熱1分鐘，使乳酸鏈球菌素完全釋放于發(fā)酵液中；2)膜過濾發(fā)酵液在溫度為20℃，操作壓力為1.5MPa通過無機膜過濾而得到去除了菌體和固體等分子量比乳酸鏈球菌素分子量大的物質(zhì)的發(fā)酵液，其中膜的孔徑為15萬；3)卷式膜超濾步驟2)所得到的發(fā)酵液在溫度為25℃，操作壓力為2.5MPa通過卷式膜超濾，去除分子量比乳酸鏈球菌素分子量小的物質(zhì)，得到濃度為200,000IU/ml發(fā)酵液濃縮物，其中卷式膜的孔徑為1.5萬；4)噴霧干燥上述超濾后的發(fā)酵液濃縮物，加入填料固體食鹽，使噴霧干燥后食鹽含量為40％，在噴霧干燥器上進行噴霧干燥，熱風進口溫度為150℃，出口溫度為80℃，即得粉末狀食品級的乳酸鏈球菌素產(chǎn)品。
其中無機膜組件為TOK(日本)制造，卷式膜組件為Amicon(美國)制造。
經(jīng)過測試，整個流程乳酸鏈球菌素的收率為87％。
實施例3本實施例中，從乳酸乳球菌發(fā)酵液中提取乳酸鏈球菌素的具體步驟如下
1)釋放乳酸鏈球菌素首先取200000ml乳酸乳球菌發(fā)酵產(chǎn)生的含有乳酸鏈球菌素的發(fā)酵液用濃鹽酸調(diào)PH至2.0，于80℃加熱30分鐘，使乳酸鏈球菌素完全釋放于發(fā)酵液中；2)膜過濾發(fā)酵液在溫度為25℃，操作壓力為1.0MPa通過無機膜過濾而得到去除了菌體和固體等分子量比乳酸鏈球菌素分子量大的物質(zhì)的發(fā)酵液，其中膜的孔徑為20萬；3)卷式膜超濾步驟2)所得到的發(fā)酵液在溫度為55℃，操作壓力為1.5MPa通過卷式膜超濾，去除分子量比乳酸鏈球菌素分子量小的物質(zhì)，得到濃度為300,000IU/ml發(fā)酵液濃縮物，其中卷式超濾膜的孔徑為1萬；4)噴霧干燥上述超濾后的發(fā)酵液濃縮物，加入填料固體食鹽，使噴霧干燥后食鹽含量為50％，在噴霧干燥器上進行噴霧干燥，熱風進口溫度為180℃，出口溫度為100℃，即得粉末狀食品級的乳酸鏈球菌素產(chǎn)品。
其中無機膜組件為Norton(美國)制造，卷式膜組件為HAYWARD(美國)制造。
經(jīng)過測試，整個流程乳酸鏈球菌素的收率為85％。
實施例4本實施例中，從乳酸乳球菌發(fā)酵液中提取乳酸鏈球菌素的具體步驟如下1)釋放乳酸鏈球菌素首先取200000ml乳酸乳球菌發(fā)酵產(chǎn)生的含有乳酸鏈球菌素的發(fā)酵液用濃鹽酸調(diào)PH至2.5，于85℃加熱20分鐘，使乳酸鏈球菌素完全釋放于發(fā)酵液中；2)膜過濾發(fā)酵液在溫度為30℃，操作壓力為1.2MPa通過管式膜過濾而得到去除了菌體和固體等分子量比乳酸鏈球菌素分子量大的物質(zhì)的發(fā)酵液，其中膜的孔徑為10萬；3)卷式膜超濾步驟2)所得到的發(fā)酵液在溫度為20℃，操作壓力為1.0MPa通過卷式膜超濾，去除分子量比乳酸鏈球菌素分子量小的物質(zhì)，得到濃度為500,000IU/ml發(fā)酵液濃縮物，其中卷式膜的孔徑為2萬；4)噴霧干燥上述超濾后的發(fā)酵液濃縮物，加入填料固體食鹽，使噴霧干燥后食鹽含量為10％，在噴霧干燥器上進行噴霧干燥，熱風進口溫度為160℃，出口溫度為90℃，即得粉末狀食品級的乳酸鏈球菌素產(chǎn)品。
其中無機膜組件為Mitsui(日本)制造，卷式膜組件為Pall(美國)制造。
經(jīng)過測試，整個流程乳酸鏈球菌素的收率為87％。
實施例5本實施例中，從乳酸乳球菌發(fā)酵液中提取乳酸鏈球菌素的具體步驟如下1)釋放乳酸鏈球菌素首先取200000ml乳酸乳球菌發(fā)酵產(chǎn)生的含有乳酸鏈球菌素的發(fā)酵液用濃硫酸調(diào)pH至3.0，于90℃加熱45分鐘，使乳酸鏈球菌素完全釋放于發(fā)酵液中；
2)膜過濾發(fā)酵液在溫度為55℃，操作壓力為0.5MPa通過管式膜過濾而得到去除了菌體和固體等分子量比乳酸鏈球菌素分子量大的物質(zhì)的發(fā)酵液，其中膜的孔徑為30萬；3)卷式膜超濾步驟2)所得到的發(fā)酵液在溫度為18℃，操作壓力為2.0MPa通過卷式膜超濾，去除分子量比乳酸鏈球菌素分子量小的物質(zhì)，得到濃度為400,000IU/ml發(fā)酵液濃縮物，其中卷式膜的孔徑為3萬；4)噴霧干燥上述超濾后的發(fā)酵液濃縮物，加入填料固體食鹽，使噴霧干燥后食鹽含量為50％。在噴霧干燥器上進行噴霧干燥，熱風進口溫度為165℃，出口溫度為85℃，即得粉末狀食品級的乳酸鏈球菌素產(chǎn)品。
其中無機膜組件為Nipongaishi(日本)制造，卷式膜組件為Amicon(美國)制造。
經(jīng)過測試，整個流程乳酸鏈球菌素的收率為85％。
實施例6本實施例中，從乳酸乳球菌發(fā)酵液中提取乳酸鏈球菌素的具體步驟如下1)釋放乳酸鏈球菌素首先取200000ml乳酸乳球菌發(fā)酵產(chǎn)生的含有乳酸鏈球菌素的發(fā)酵液用濃鹽酸調(diào)pH至3.5，于100℃加熱1分鐘，使乳酸鏈球菌素完全釋放于發(fā)酵液中；2)膜過濾發(fā)酵液在溫度為10℃，操作壓力為1.5MPa通過無機膜過濾而得到去除了菌體和固體等分子量比乳酸鏈球菌素分子量大的物質(zhì)的發(fā)酵液，其中膜的孔徑為45萬；3)卷式膜超濾步驟2)所得到的發(fā)酵液在溫度為30℃，操作壓力為1.2MPa通過卷式膜超濾，去除分子量比乳酸鏈球菌素分子量小的物質(zhì)，得到濃度為250,000IU/ml發(fā)酵液濃縮物，其中卷式膜的孔徑為2.5萬；4)噴霧干燥上述超濾后的發(fā)酵液濃縮物，在加入填料固體食鹽，使噴霧干燥后食鹽含量為20％，在噴霧干燥器上進行噴霧干燥，熱風進口溫度為150℃，出口溫度為80℃，即得粉末狀食品級的乳酸鏈球菌素產(chǎn)品。
其中無機膜組件為DDS(丹麥)制造，卷式膜組件為HAYWARD(美國)制造。
經(jīng)過測試，整個流程乳酸鏈球菌素的收率為86％。
實施例7本實施例中，從乳酸乳球菌發(fā)酵液中提取乳酸鏈球菌素的具體步驟如下1)釋放乳酸鏈球菌素首先取200000ml乳酸乳球菌發(fā)酵產(chǎn)生的含有乳酸鏈球菌素的發(fā)酵液用濃硫酸調(diào)pH至3.5，于100℃加熱1分鐘，使乳酸鏈球菌素完全釋放于發(fā)酵液中；2)膜過濾發(fā)酵液在溫度為10℃，操作壓力為1.6MPa通過無機膜過濾而得到去除了菌體和固體等分子量比乳酸鏈球菌素分子量大的物質(zhì)的發(fā)酵液，其中膜的孔徑為50萬；
3)卷式膜超濾步驟2)所得到的發(fā)酵液在溫度為40℃，操作壓力為2.5MPa通過卷式膜超濾，去除分子量比乳酸鏈球菌素分子量小的物質(zhì)，得到濃度為350,000IU/ml發(fā)酵液濃縮物，其中卷式膜的孔徑為1.5萬；4)噴霧干燥上述超濾后的發(fā)酵液濃縮物，在加入填料固體食鹽，使噴霧干燥后食鹽含量為45％，在噴霧干燥器上進行噴霧干燥，熱風進口溫度為150℃，出口溫度為80℃，即得粉末狀食品級的乳酸鏈球菌素產(chǎn)品。
其中無機膜組件為Corning(美國)制造，卷式膜組件為Amicon(美國)制造。
經(jīng)過測試，整個流程乳酸鏈球菌素的收率為85％。
本發(fā)明提供的從發(fā)酵液中分離提取乳酸鏈球菌素的方法，由于采用無機膜過濾和卷式膜超濾，生產(chǎn)工藝簡單、成本大大降低，且對目標產(chǎn)物無破壞，活性保持高。
其中收率計算方法總收率％＝成品效價×成品重量/發(fā)酵液效價×發(fā)酵液體積×％。
權利要求
1.一種從發(fā)酵液中分離乳酸鏈球菌素的方法，所述方法包括釋放乳酸鏈球菌素、分離和噴霧干燥，其特征在于所說分離為采用膜過濾的方法分別將分子量大于和小于乳酸鏈球菌素的分子量的物質(zhì)從發(fā)酵液中分離出去。
2.權利要求1的分離乳酸鏈球菌素的方法，其特征在于在溫度10-55℃和壓力0.5-2.5MPa條件下，采用無機膜或管式膜過濾從發(fā)酵液中去除菌體和固體等分子量比乳酸鏈球菌素分子量大的物質(zhì)；用卷式膜超濾從發(fā)酵液中去除分子量比乳酸鏈球菌素分子量小的物質(zhì)，得到濃度為100,000-500,000IU/ml發(fā)酵液濃縮物。
3.根據(jù)權利要求2所述的分離乳酸鏈球菌素的方法，其特征在于無機膜或管式膜的孔徑為10-60萬。
4.根據(jù)權利要求3所述的分離乳酸鏈球菌素的方法，其特征在于無機膜或管式膜的孔徑為15-50萬。
5.根據(jù)權利要求2所述的分離乳酸鏈球菌素的方法，其特征在于溫度為15-45℃。
6.根據(jù)權利要求5所述的分離乳酸鏈球菌素的方法，其特征在于溫度為25-40℃。
7.根據(jù)權利要求2所述的分離乳酸鏈球菌素的方法，其特征在于卷式膜的孔徑為0.2-4萬。
8.根據(jù)權利要求7所述的分離乳酸鏈球菌素的方法，其特征在于卷式膜的孔徑為1.5-3萬。
9.根據(jù)權利要求1所述的分離乳酸鏈球菌素的方法，其特征在于超濾后的發(fā)酵液濃縮物，加入填料固體食鹽，使噴霧干燥后食鹽含量為10-50％，在噴霧干燥器上進行噴霧干燥，熱風進口溫度為120-180℃，出口溫度為70-100℃，即得粉末狀食品級的乳酸鏈球菌素產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明公開了從發(fā)酵液中分離提取乳酸鏈球菌素的方法，包括釋放乳酸鏈球菌素、分離和噴霧干燥，在溫度10－55℃和壓力0.5－2.5MPa條件下，采用無機膜或管式膜過濾從發(fā)酵液中去除菌體和固體等分子量比乳酸鏈球菌素分子量大的物質(zhì)；用卷式膜超濾從發(fā)酵液中去除分子量比乳酸鏈球菌素分子量小的物質(zhì)，得到發(fā)酵液濃縮物。該方法生產(chǎn)工藝簡單、成本低、收率高，活性保持高，分離效果好。
文檔編號C07K14/315GK1687110SQ20051006648
公開日2005年10月26日 申請日期2005年4月26日 優(yōu)先權日2005年4月26日
發(fā)明者沈顏新, 范悠然 申請人:浙江銀象生物工程有限公司