專利名稱：標(biāo)記有多個(gè)熒光團(tuán)的寡核苷酸的制作方法
優(yōu)先權(quán)聲明本申請(qǐng)要求于2003年11月19日提交的US臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào)60/523,263的權(quán)益，它的全文內(nèi)容在本說明書中作為參考。
背景技術(shù)：
本發(fā)明大體上涉及標(biāo)記有多個(gè)光譜相同或相似的染料和任選標(biāo)記有一種或者多種淬滅染料的寡核苷酸，以及產(chǎn)生標(biāo)記的寡核苷酸的方法和標(biāo)記的寡核苷酸作為高靈敏度核酸檢測(cè)的引物或探針的各種應(yīng)用，包括實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。
核酸聚合物比如DNA和RNA對(duì)遺傳信息從一個(gè)世代傳遞到下一世代以及在所有活生物體的常規(guī)功能中是關(guān)鍵的。因此這些分子是集中研究的目標(biāo)，已經(jīng)發(fā)展了許多研究這些分子的技術(shù)。這些方法包括但是不限于鑒定給定樣品中特定的多核苷酸序列存在的方法，和設(shè)計(jì)用來測(cè)量給定樣品中原始存在的特定的核酸分子數(shù)量的方法。
這些技術(shù)的實(shí)際用途包括鑒定特定的種類和基于寡核苷酸序列相似性鑒定各種類之間的關(guān)系。其它的應(yīng)用包括通過鑒定給定樣品中作為給定病理指征的特定序列而診斷疾病。其它的應(yīng)用，無法一一提到，包括鑒定發(fā)展特定病變的傾向的個(gè)體，以及根據(jù)給定病人的基因組中特定多核苷酸的存在評(píng)估提出的治療方案的效力。
用于研究和操作寡核苷酸最廣泛使用和最強(qiáng)大的技術(shù)之一是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。PCR是提供體外擴(kuò)增特定核酸的方法的引物延伸反應(yīng)。這個(gè)技術(shù)在1987年首次描述。PCR可以在單個(gè)酶促反應(yīng)混合物中在以小時(shí)計(jì)的時(shí)間以內(nèi)產(chǎn)生DNA模板百萬(wàn)倍的拷貝，使得研究人員能確定靶DNA的大小和序列。這種DNA擴(kuò)增技術(shù)已經(jīng)廣泛用于克隆及其他分子生物學(xué)操作。關(guān)于PCR另外的討論提供于Mullis等，MethodsEnzymol.(1987)；和Saiki等，Science(1985)。
在PCR中，待擴(kuò)增的DNA特定段稱為“靶序列”。靶序列的復(fù)制是首先將互補(bǔ)的“引物”結(jié)合到靶多核苷酸的單鏈部分。特別有用的一種基于PCR的技術(shù)是定量PCR(qPCR)。簡(jiǎn)單地說，它的機(jī)制是基于PCR以指數(shù)方式擴(kuò)增靶DNA的事實(shí)。通過運(yùn)行PCR反應(yīng)和測(cè)量在擴(kuò)增反應(yīng)期間給定時(shí)間點(diǎn)DNA拷貝的總數(shù)，可以倒推計(jì)算起始DNA材料的數(shù)量。
已經(jīng)發(fā)展了各種無需停止PCR運(yùn)行甚至無需在給定的PCR運(yùn)行過程中對(duì)反應(yīng)取樣而確定PCR產(chǎn)物的數(shù)量的方法。一種這樣的方法通過測(cè)量各DNA合成循環(huán)產(chǎn)物的數(shù)量實(shí)時(shí)追蹤PCR過程。這種方法稱為實(shí)時(shí)PCR(RT-PCR)。由于其靈敏度高和可以對(duì)仍然在PCR熱循環(huán)儀中的樣品進(jìn)行測(cè)量，已經(jīng)發(fā)展了各種基于熒光的分析方法來監(jiān)測(cè)PCR產(chǎn)物形成。已經(jīng)發(fā)展了眾多用于實(shí)時(shí)PCR(RT-PCR)的儀器和方法。實(shí)時(shí)PCR儀器通常是建立在熱循環(huán)儀基礎(chǔ)上的熒光計(jì)。市場(chǎng)上可買到的實(shí)時(shí)PCR儀器包括ABI的Prism 7700，Roche的LightCycler，MJ Research的Opticon，BioRad的iCycler IQ，和Stratagene的MX 4000。
通過與其雜交而用于鑒定給定核酸序列，但是不起擴(kuò)增所述給定序列作用的寡核苷酸可以稱為“探針”。探針也在PCR反應(yīng)中具有實(shí)用性，其中它們用來以信號(hào)表示多核苷酸的擴(kuò)增。
考慮到寡核苷酸的重要性和這些分子可以各種方式影響人、動(dòng)物和植物壽命，存在對(duì)于研究和操作寡核苷酸更有效的方法，包括用于有效產(chǎn)生標(biāo)記的寡核苷酸的新技術(shù)的需求。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供標(biāo)記的寡核苷酸及有效生產(chǎn)和使用這些標(biāo)記的寡核苷酸的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明提供可用于分析中的標(biāo)記寡核苷酸的方法，所述分析例如被設(shè)計(jì)成鑒定樣品中給定多核苷酸存在的分析，或擴(kuò)增給定樣品中給定寡核苷酸或多核苷酸的數(shù)量的分析。本發(fā)明提供使用這些類型的標(biāo)記的寡核苷酸的方法。
一個(gè)實(shí)施方案包括標(biāo)記有至少兩種激發(fā)波長(zhǎng)彼此在15nm以內(nèi)的光度分子的寡核苷酸。在一些實(shí)施方案中，直到至少兩種光度分子作為切割的結(jié)果被永久性彼此分離，標(biāo)記的寡核苷酸才產(chǎn)生相對(duì)多的光譜信號(hào)。
一個(gè)實(shí)施方案是標(biāo)記有兩種光譜相似或相同的光度分子的寡核苷酸，所述光度分子是熒光的。當(dāng)至少兩種所述分子作為寡核苷酸切割的結(jié)果被永久性彼此分開時(shí)，來自熒光分子的可檢測(cè)的發(fā)射增加。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)寡核苷酸雜交到靶寡核苷酸序列時(shí)，連接到寡核苷酸的至少兩種熒光分子產(chǎn)生的熒光信號(hào)增加。
一個(gè)實(shí)施方案是標(biāo)記有至少兩種光度分子的寡核苷酸，其中寡核苷酸序列基本上缺乏二級(jí)結(jié)構(gòu)比如發(fā)夾環(huán)和莖環(huán)結(jié)構(gòu)。
一個(gè)實(shí)施方案包括標(biāo)記有光度分子的寡核苷酸，該光度分子具有相同或相似的光譜特性并分別連接在所述寡核苷酸的5′和3′末端。在這種實(shí)施方案的一個(gè)變體中，一種染料連接在磷酸骨架5′末端，而另一種染料連接在磷酸骨架3′末端。
在一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸適于用作引物，其包含至少兩種光譜相同或相似的熒光染料和任選包含一種或者多種熒光淬滅染料。在一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸適于用作標(biāo)記的引物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，熒光分子可以連接到核苷的堿基，或連接到磷酸骨架5′末端與堿基的組合。
在一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸標(biāo)記有至少兩種光譜相同或相似的熒光染料。寡核苷酸可以是用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的引物，其包含例如連接到磷酸骨架5′末端和核苷例如胸腺嘧啶核苷酸的堿基的光譜相似或相同的熒光染料。
一個(gè)實(shí)施方案包括產(chǎn)生標(biāo)記有至少兩種光度分子的寡核苷酸的方法，其中所述光度分子是相似或相同的。當(dāng)至少兩種光度分子中至少兩種被彼此永久性分開時(shí)，使用其中一些方法產(chǎn)生的標(biāo)記的寡核苷酸產(chǎn)生更多可檢測(cè)信號(hào)。
另一個(gè)實(shí)施方案包括利用標(biāo)記有至少兩種光度分子的寡核苷酸的方法，所述分子的激發(fā)波長(zhǎng)彼此在15nm以內(nèi)。
其它的實(shí)施方案包括根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案標(biāo)記的寡核苷酸的應(yīng)用。這些應(yīng)用包括但是不限于，分析包含在各種環(huán)境中的核酸序列的生物樣品的試驗(yàn)。一個(gè)示例性應(yīng)用包括熒光原位雜交(FISH)，其中本發(fā)明標(biāo)記的寡核苷酸能被用于定位例如活細(xì)胞，固定的組織或染色體樣品中具有生物學(xué)重要性的靶核酸并測(cè)定其相對(duì)豐度。
其它的實(shí)施方案包括在基于溶液或基于芯片的陣列檢測(cè)系統(tǒng)使用標(biāo)記有多個(gè)染料的寡核苷酸，和在基礎(chǔ)研究和疾病診斷中定量與疾病相關(guān)的基因的差異表達(dá)。
其它的實(shí)施方案包括適于制造根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案標(biāo)記的寡核苷酸的方法和試劑盒。這些試劑盒可以用于檢測(cè)擴(kuò)增的寡核苷酸序列，所述檢測(cè)包括等溫?cái)U(kuò)增，連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等等。
各種實(shí)施方案適于伴隨PCR通過使用寡核苷酸-抗體結(jié)合物來檢測(cè)核酸之外的生物分子，其中抗體特異于待檢測(cè)的生物分子。
本發(fā)明另外的形式，實(shí)施方案，目的，功能和方面通過此處包含的描述將變得一目了然。
附圖和表格簡(jiǎn)述

圖1是典型的實(shí)時(shí)PCR運(yùn)行的示意擴(kuò)增圖，顯示與實(shí)時(shí)PCR相關(guān)的一些參數(shù)。
圖2A顯示使用PCR擴(kuò)增MCG基因時(shí)收集的數(shù)據(jù)的圖。使用6-ROX-標(biāo)記的探針在質(zhì)粒DNA的各種起始濃度收集這些數(shù)據(jù)。(實(shí)施例2)圖2B顯示使用PCR擴(kuò)增MCG基因時(shí)收集的數(shù)據(jù)的圖。使用6CR110標(biāo)記的探針在人基因組DNA的各種濃度收集這些數(shù)據(jù)。(實(shí)施例3)。
圖2C顯示使用PCR擴(kuò)增MCG基因收集的數(shù)據(jù)的圖。使用6CR110標(biāo)記的探針在人cDNA的各種濃度收集這些數(shù)據(jù)。(實(shí)施例3)。
圖2D顯示使用非磺酸化花青素標(biāo)記的探針擴(kuò)增自100,000拷貝質(zhì)粒DNA的MCG基因的擴(kuò)增圖。(實(shí)施例2)圖3A顯示通過比較TaqMan探針和根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案制造的探針收集的數(shù)據(jù)。TaqMan探針在5′末端標(biāo)記有JOE，在3′末端標(biāo)記有TAMRA；本發(fā)明的探針具有與TaqMan探針相同的寡核苷酸序列，但是其在5′和3′末端標(biāo)記有R6G。(實(shí)施例4)圖3B顯示TaqMan探針與根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案生產(chǎn)的探針比較的結(jié)果。TaqMan探針在5′末端標(biāo)記FAM，在3′末端標(biāo)記TAMRA；本發(fā)明的探針具有與TaqMan探針相同的寡核苷酸序列，但是其在5′和3′末端皆標(biāo)記有6-CR110。(實(shí)施例4)圖3C顯示TaqMan探針與根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案生產(chǎn)的探針比較的結(jié)果。來自ABI的具有未公開的序列的TaqMan探針在5′末端標(biāo)記有FAM，在3′末端標(biāo)記有MGB和淬滅劑；本發(fā)明的探針在5′和3′末端皆標(biāo)記有6CR110。(實(shí)施例4)
圖4A顯示末端標(biāo)記有兩分子5-CR110的GAPDH探針在S1消化前后的吸收光譜(SEQ ID No.3，實(shí)施例5)。
圖4B顯示在5’末端標(biāo)記有一個(gè)5CR110分子的GAPDH探針(SEQID No.10)在S1消化前后的吸收光譜(實(shí)施例5)。
圖4C顯示在3’末端標(biāo)記有一個(gè)5CR110分子的GAPDH探針(SEQID No.11)在S1消化前后的吸收光譜(實(shí)施例5)。
圖4D顯示使用4A、4B和4C中使用的三種探針收集的擴(kuò)增圖。(實(shí)施例6)。
圖5A顯示標(biāo)記有兩個(gè)6-CR110分子的線狀和莖環(huán)GAPDH探針的吸收光譜。該圖說明了莖環(huán)結(jié)構(gòu)促進(jìn)6-CR110二聚體的形成。(實(shí)施例7)。
圖5B顯示標(biāo)記有兩個(gè)6-TAMRA分子的線狀和莖環(huán)GAPDH探針的吸收光譜。這些數(shù)據(jù)說明了莖環(huán)結(jié)構(gòu)強(qiáng)烈地促進(jìn)6-TAMRA二聚體的形成。(實(shí)施例7)。
圖5C顯示標(biāo)記有兩個(gè)6-ROX分子的線狀和莖環(huán)GAPDH探針的吸收光譜。該圖所示的數(shù)據(jù)說明了莖環(huán)結(jié)構(gòu)強(qiáng)烈地促進(jìn)6-ROX二聚體的形成。(實(shí)施例7)。
圖6A描述了實(shí)時(shí)PCR中雙6-CR110標(biāo)記的線狀探針和莖環(huán)探針在各種探針濃度時(shí)性能比較的結(jié)果。該圖說明線狀探針比形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的探針產(chǎn)生明顯更強(qiáng)的信號(hào)。(實(shí)施例8)。
圖6B描述了實(shí)時(shí)PCR中雙6-TAMRA標(biāo)記的線狀探針和莖環(huán)探針在各種探針濃度時(shí)性能的比較。該圖說明線狀探針比形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的探針產(chǎn)生明顯更強(qiáng)的信號(hào)。(實(shí)施例8)。
圖6C描述了實(shí)時(shí)PCR中雙6-ROX標(biāo)記的線狀探針和莖環(huán)探針在各種探針濃度時(shí)性能的比較。該圖說明線狀探針比形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的探針產(chǎn)生明顯更強(qiáng)的信號(hào)。(實(shí)施例8)。
圖7示例了涉及使用信標(biāo)探針的核酸檢測(cè)的化學(xué)平衡。(實(shí)施例8)。
圖8A描述了分別標(biāo)記有FAM/FAM，F(xiàn)AM/CR110和CR110/CR110染料對(duì)組合的三種探針的光譜。(實(shí)施例9)。
圖8B示例了用圖8A描述的探針檢測(cè)的GAPDH基因的擴(kuò)增圖。(實(shí)施例9)。
圖9A示例了通過PCR擴(kuò)增GAPDH基因和用雙5-CR110標(biāo)記的GAPDH正向引物(SEQ ID NO15)檢測(cè)產(chǎn)物所收集的數(shù)據(jù)。(實(shí)施例10)。
圖9B示例了通過PCR擴(kuò)增GAPDH基因和用雙5-CR110標(biāo)記的GAPDH正向引物(SEQ ID NO16)檢測(cè)產(chǎn)物所收集的數(shù)據(jù)。(實(shí)施例10)。
圖9C示例了通過PCR擴(kuò)增GAPDH基因和用雙5-CR110標(biāo)記的GAPDH反向引物(SEQ ID NO17)檢測(cè)產(chǎn)物所收集的數(shù)據(jù)。(實(shí)施例10)。
圖9D示例了通過PCR擴(kuò)增GAPDH基因和用雙5-CR110標(biāo)記的正向引物(SEQ ID No.15)和5′末端5-CR110單標(biāo)記的相同正向引物(SEQ ID No.18)檢測(cè)產(chǎn)物所收集的數(shù)據(jù)。該圖顯示只有雙標(biāo)記的寡核苷酸能作為熒光探針。(實(shí)施例10)。
圖9E是通過PCR擴(kuò)增GAPDH基因和用雙5-CR110標(biāo)記的正向引物(SEQ ID No 16)和3′末端單標(biāo)記的相同的正向引物(SEQ No 19)檢測(cè)產(chǎn)物所收集的數(shù)據(jù)的比較。該圖顯示只有雙標(biāo)記的寡核苷酸能作為熒光探針。(實(shí)施例10)。
圖9F示例可以允許5′G用作LUX引物中的淬滅劑的可能的二級(jí)結(jié)構(gòu)。該圖還說明本發(fā)明一些實(shí)施方案的熒光引物可以通過不同于使LUX引物起作用的機(jī)制運(yùn)行。(實(shí)施例10)。
圖10示例了模式雌激素受體的SNP分型。(實(shí)施例11)。
圖11示例了通過PCR擴(kuò)增HCV基因和使用雙ROX標(biāo)記的探針(SEQ ID No.33)檢測(cè)產(chǎn)物所收集的數(shù)據(jù)。如圖所示，通過用酶處理產(chǎn)物增強(qiáng)了信號(hào)，該酶顯示出沒有外切(exominus)活性，比如Taq DNA聚合酶。(實(shí)施例12)。
表1說明書全文中參考的一些序列以及適于實(shí)施一些實(shí)施方案的連接分子結(jié)構(gòu)的簡(jiǎn)明列表。
表2活性基團(tuán)的部分列表，包括可用于一些實(shí)施方案中將標(biāo)記分子和淬火分子連接到寡核苷酸的親電基團(tuán)和親核基團(tuán)。
序列表附頁(yè)詳細(xì)列出一些序列。
發(fā)明詳述為促進(jìn)對(duì)本發(fā)明原理的理解，現(xiàn)參照這里描述的實(shí)施方案并使用特定的術(shù)語(yǔ)加以說明。然而應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的范圍不限于此。對(duì)于此處描述的裝置、系統(tǒng)、治療方法和本發(fā)明原理的進(jìn)一步應(yīng)用的任何改變和進(jìn)一步修改對(duì)本發(fā)明所述技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是通常可以預(yù)料到的。雖然本發(fā)明的一些方面可以依據(jù)具體或一般理論或原理來論述，但本發(fā)明絕不受這些理論或原理的約束。這樣的討論完全是說明性的而不是限制性的。
因?yàn)楹怂峋酆衔镌诂F(xiàn)代醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)中起著關(guān)鍵的作用，已經(jīng)發(fā)展了多種試劑包括熒光染料用于檢測(cè)、測(cè)序和測(cè)量核酸聚合物的方法中。同樣，已經(jīng)發(fā)展了多種方法使用這些染料來產(chǎn)生更靈敏的核酸分析。一個(gè)集中研究的領(lǐng)域是開發(fā)高度靈敏的分析，以測(cè)量通過PCR產(chǎn)生的核酸聚合物的積累。
通過PCR的DNA擴(kuò)增可能是相當(dāng)復(fù)雜的，因?yàn)樵摲椒ㄊ茉S多因素的影響。一種影響PCR的因素是隨著反應(yīng)進(jìn)行，起始組分比如dNTP、引物、Mg2+的有效濃度逐漸耗盡。另一個(gè)因素是累積的最終產(chǎn)物的抑制作用。在PCR進(jìn)行過程中，這些組分彼此以相互關(guān)連的動(dòng)態(tài)方式互相作用。通常DNA擴(kuò)增包含三個(gè)連續(xù)的階段指數(shù)期，線性期和平臺(tái)期。各階段是不同的，并可以顯示出與其它兩個(gè)階段不同的擴(kuò)增效率。實(shí)際上只有在指數(shù)期收集的數(shù)據(jù)可用于可靠地估計(jì)靶寡核苷酸的起始濃度。
一種通常使用熒光分子實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR的方法已知商業(yè)上稱作TaqMan分析。TaqMan分析利用Taq聚合酶的5’核酸外切酶活性以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)DNA擴(kuò)增。關(guān)于這個(gè)公知分析的進(jìn)一步討論在Holland等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1991)；Lee等，Nucleic Acids Res.(1993)；和US專利5,210,015；5,538,848；6,258,569和5,691,146中有提供。TaqMan分析通過雜交和隨后切割熒光探針(“TaqMan”探針)在擴(kuò)增反應(yīng)過程中檢測(cè)積累的PCR產(chǎn)物。所述探針是寡核苷酸，其序列與待檢測(cè)的靶DNA互補(bǔ)。所述探針標(biāo)記有單個(gè)熒光報(bào)告染料和單個(gè)熒光淬滅劑。報(bào)告染料和淬滅染料以通常大約15到大約60個(gè)核苷酸的間隔連接到寡核苷酸，以獲得最理想的熒光淬滅和5′核酸外切酶活性。染料可以連接到核苷酸堿基或寡核苷酸骨架或兩者的組合。通常，報(bào)告標(biāo)記/供體標(biāo)記之一連接到磷酸骨架3′末端，另一個(gè)連接到磷酸骨架的5′末端。淬滅劑可以是非熒光染料或合適波長(zhǎng)的熒光染料。在兩種情況下，通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)發(fā)生結(jié)合到探針的熒光團(tuán)的淬滅。
為了簡(jiǎn)要論述如何選擇熒光團(tuán)/淬滅劑對(duì)和設(shè)計(jì)顯示出最佳性能的TaqMan探針，回顧一些基本的光物理學(xué)是有益的。首先，當(dāng)染料接受來自外源足夠能量的光子時(shí)，其被電激發(fā)到單線激發(fā)態(tài)。激發(fā)態(tài)存在有限的時(shí)間，其間電子能量被部分損耗到分子的振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)模式中。結(jié)果，當(dāng)染料發(fā)射光子時(shí)，光子的能量較低，因此分子發(fā)射的光子波長(zhǎng)比分子吸收的光子波長(zhǎng)更長(zhǎng)。激發(fā)或吸收與發(fā)射之間能量或波長(zhǎng)的差異被稱作斯托克斯位移(Stockes shift)，并且在熒光染料中是常見的。其次，基于FRET的淬滅受Foster能量共振轉(zhuǎn)移理論的約束，其表明光能量轉(zhuǎn)移效率與供體發(fā)射光譜和受體吸收光譜的重疊正相關(guān)。進(jìn)一步討論提供在Foster，Ann.Phys.(1948)；和Stryer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1967)。斯托克斯位移和光譜重疊要求的組合必須使熒光供體和受體是不同的染料。即使供體和淬滅劑分子兩者都是熒光染料，上述要求也是必須的。
事實(shí)上，同時(shí)也是熒光染料的淬滅分子應(yīng)理想地選擇為發(fā)射波長(zhǎng)比供體(報(bào)告)染料的發(fā)射波長(zhǎng)顯著更長(zhǎng)。使用這種組合確保暗背景。附加的靈敏度增益可以通過使用選擇性阻斷淬滅分子發(fā)射的全部或大多數(shù)信號(hào)的濾光器而實(shí)現(xiàn)。為獲得最佳性能，淬滅劑優(yōu)選選自它們自己是完全非熒光的分子。事實(shí)上，獲得TaqMan分析的低或零背景已經(jīng)是相當(dāng)多的研究工作的焦點(diǎn)。為這一目的，已經(jīng)開發(fā)了許多非熒光淬滅分子。公知的市場(chǎng)上可買到的非熒光淬滅劑包括，例如，來自Biosearch的黑洞淬滅劑(Black Hole Quencher)(BHQ)染料，其是非熒光偶氮染料，來自Epoch的Eclipse Dark淬滅劑(DQ)(Eurogentec目錄號(hào)OL-0273-DQ02)，和來自Integrated DNA Technologies的IOWABLACK(IWB)。這些分子的進(jìn)一步討論提供在Johansson，M.K.等，J.Am.Chem.，Soc.，(2002)。這些及類似的非熒光淬滅劑通過抑制本底熒光提高TaqMan探針的靈敏度，從而增加酶切割探針后的信號(hào)增益。這些受歡迎的供體/受體對(duì)(用于TaqMan探針設(shè)計(jì)的熒光團(tuán)/淬滅劑對(duì))的例子包括FAM/TAMRA，VIC/BHQ 1，HEX/BHQ2和TET/DHQ等。
除上述的光譜重疊必要條件之外，對(duì)基于FRET的熒光淬滅關(guān)鍵的第二參數(shù)是供體及受體之間的距離。FRET取決于分子間距離的六次冪的倒數(shù)(inverse sixth power)。
在與靶核酸雜交前，典型的TaqMan探針具有無規(guī)則構(gòu)型，其中供體及淬滅劑能移動(dòng)到彼此足夠接近以發(fā)生有效的FRET。由于它們的彼此接近和它們的光譜特性，報(bào)告分子被淬滅，因此探針是無熒光的。在與擴(kuò)增的靶DNA區(qū)段雜交后，探針被延伸，結(jié)果變成發(fā)熒光的，這是因?yàn)楣w和淬滅劑之間距離的增加使得FRET能量轉(zhuǎn)移不會(huì)發(fā)生。可選擇的，并通常優(yōu)選的是，探針在擴(kuò)增過程中被例如具有5′外切核酸酶活性的聚合酶消化。消化使得供體染料與淬滅劑完全地分離開，從而進(jìn)一步減少淬滅和增強(qiáng)來自供體染料的熒光信號(hào)。隨著在PCR擴(kuò)增的過程中產(chǎn)生更多DNA拷貝，更多探針被雜交然后被切割，這繼而增加了熒光信號(hào)。這種方案的一個(gè)變體是使用雙酶系統(tǒng)。在這種系統(tǒng)中一種酶負(fù)責(zé)聚合寡核苷酸，而第二種酶負(fù)責(zé)從PCR產(chǎn)物切割報(bào)告染料。一種這樣利用這種策略的市場(chǎng)上可買到的產(chǎn)品是來自Stratagene的Full Velocity試劑盒。
利用FRET產(chǎn)生具有良好的信噪比信號(hào)的探針設(shè)計(jì)的另一個(gè)變體描述在US專利No.6,492,346。這個(gè)變體采用共價(jià)連接到寡核苷酸探針內(nèi)3′末端，5′末端或任何其它位置的小溝結(jié)合劑(MGB)。含有MGB的探針可以具有比不使用MGBs的探針更短的核苷酸序列而仍然顯示出非常有效的熒光淬滅。此外，相對(duì)于被某些其它的不選擇性結(jié)合到小溝的標(biāo)記分子標(biāo)記的探針，標(biāo)記有MGB的探針往往具有改進(jìn)的特異性、效率和針對(duì)錯(cuò)配增強(qiáng)的識(shí)別率。
另一個(gè)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的方法使用所謂的“分子信標(biāo)探針(beaconprobe)”，其是US專利Nos.5,925,517；和5,118,801和5,312,728的主題。分子信標(biāo)探針具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)，包括中央靶識(shí)別序列(環(huán)區(qū))，其側(cè)翼為一對(duì)互補(bǔ)的彼此雜交形成莖狀結(jié)構(gòu)的3′和5′末端序列。熒光供體染料和淬滅分子分別連接到3′和5′末端。在缺少互補(bǔ)靶序列的情況下，信標(biāo)探針保持其閉合的構(gòu)型，供體染料的熒光通過FRET被淬滅染料淬滅。在與靶序列雜交后，信標(biāo)探針伸展為開放構(gòu)型，從而分離供體染料和淬滅劑，并增加供體染料的熒光信號(hào)。隨著在PCR反應(yīng)過程中產(chǎn)生另外的靶DNA拷貝，更多信標(biāo)探針通過雜交到靶DNA而采用開放構(gòu)型，并因而增加熒光信號(hào)。這個(gè)技術(shù)的進(jìn)一步討論提供于Tyagi等，Nature Biotechnol.(1996)。TaqMan探針在PCR過程中通過酶裂解而被“消耗”，與此不同，分子信標(biāo)探針貫穿DNA擴(kuò)增過程保持化學(xué)性質(zhì)不變；僅僅信標(biāo)探針的構(gòu)型從閉合形式(莖環(huán))改變?yōu)殚_放形式。
信標(biāo)探針的兩種構(gòu)型-開放和閉合-彼此存在于動(dòng)態(tài)平衡中。在PCR過程中，平衡取決于各對(duì)互補(bǔ)鏈之間三個(gè)競(jìng)爭(zhēng)的雜交反應(yīng)。三個(gè)平衡存在于1)靶DNA的兩條互補(bǔ)鏈之間；2)探針互補(bǔ)的3′和5′末端(莖)之間；和3)探針的靶識(shí)別序列(環(huán))和靶序列之間。只有第三個(gè)雜交反應(yīng)偏好開放的信標(biāo)構(gòu)型，因此只有一個(gè)反應(yīng)產(chǎn)生可檢測(cè)的熒光信號(hào)。第一個(gè)和第二個(gè)雜交反應(yīng)皆偏好閉合的信標(biāo)構(gòu)型，從而減少熒光信號(hào)。由于競(jìng)爭(zhēng)性雜交交互作用(1和2)，即使當(dāng)兩者被標(biāo)記相同或相似的供體/淬滅染料對(duì)時(shí)，在核酸檢測(cè)中分子信標(biāo)探針本質(zhì)上不如標(biāo)記的TaqMan探針靈敏。然而，如果具有5′核酸外切酶活性的酶用于所述反應(yīng)，則雜交到靶序列的信標(biāo)探針也可以如TaqMan探針一樣從寡核苷酸中切割掉。在這種情況下，信標(biāo)探針變成事實(shí)上的TaqMan探針。
另一個(gè)方法公開在US專利6,174,670，這種方法使用能量轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，其中在兩個(gè)雜交探針之間發(fā)生能量轉(zhuǎn)移。例如，第一個(gè)探針是在3′末端標(biāo)記熒光供體染料，而第二探針是在5′末端標(biāo)記受體染料。第二引物上的受體分子以比第一個(gè)引物上的供體染料更長(zhǎng)的波長(zhǎng)發(fā)射能量。當(dāng)應(yīng)用于PCR時(shí)，兩個(gè)探針以首尾相連的排列方式雜交到靶DNA的兩個(gè)互補(bǔ)鏈之一。因?yàn)闊o論兩個(gè)供體和受體染料位置如何，F(xiàn)RET發(fā)生在這兩個(gè)分子之間。因此，通過測(cè)量受體染料的熒光發(fā)射，可以將熒光強(qiáng)度與隨著PCR進(jìn)行所產(chǎn)生的靶DNA的數(shù)量相關(guān)聯(lián)。
另一個(gè)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的方法公開在US專利6,635,427。這個(gè)方法使用內(nèi)部鳥嘌呤核苷(G)核苷酸作為連接到寡核苷酸探針的單個(gè)報(bào)告染料的淬滅劑(受體)。在缺少靶序列的情況下，鳥嘌呤核苷核苷酸，其通常策略上被置于報(bào)告染料位置旁邊，淬滅報(bào)告染料的熒光。在與靶序列雜交后，由鳥嘌呤核苷引起的淬滅減少，導(dǎo)致熒光信號(hào)的增加。
還可以通過使用在摻入擴(kuò)增產(chǎn)物后變成發(fā)熒光的熒光引物而監(jiān)測(cè)PCR。使用標(biāo)記有供體/淬滅染料對(duì)的信標(biāo)樣發(fā)夾引物的這樣一種方法商業(yè)上已知稱為Ampliphore，并公開在US專利5,866,336。在雜交到其靶DNA序列前，引物以閉合的發(fā)夾構(gòu)型存在，其通過FRET淬滅供體染料的熒光。一旦雜交到靶DNA序列并摻入到擴(kuò)增產(chǎn)物中，引物具有延伸的開放構(gòu)型，而引物因?yàn)镕RET被降低而變成發(fā)熒光的。為了獲得引物所需的特異性以及保持必要的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，信標(biāo)樣引物通常是相當(dāng)長(zhǎng)的。探針的長(zhǎng)度對(duì)引物設(shè)計(jì)構(gòu)成限制，并增加合成引物的成本。
監(jiān)測(cè)PCR的另一個(gè)方法使用已知商業(yè)上稱為L(zhǎng)UX引物的引物。該技術(shù)的進(jìn)一步討論提供于Nazarenko等，Nucleic Acid Research(2002)；和Marras等，Nucleic Acid Research(2002)。LUX引物標(biāo)記有單個(gè)熒光染料(供體分子)，策略上置于內(nèi)部鳥嘌呤(G)核苷酸附近以用于淬滅染料的熒光。由于染料和其附近的G核苷酸之間的相互作用，游離態(tài)的標(biāo)記引物是非發(fā)熒光的或弱熒光的。當(dāng)引物被延伸，G核苷酸內(nèi)化到雙鏈DNA中，熒光淬滅被降低或消除，來自供體分子的熒光信號(hào)增加。LUX引物的優(yōu)點(diǎn)是其設(shè)計(jì)相對(duì)簡(jiǎn)單。LUX系統(tǒng)的一個(gè)問題是其要求在染料連接位點(diǎn)(通常胸腺密啶核苷)附近存在G核苷酸，這限制了引物設(shè)計(jì)的選擇。此外，通過G的熒光淬滅只在選定波長(zhǎng)的極少數(shù)染料中有效。對(duì)引物序列的限制和尤其是不能與更長(zhǎng)波長(zhǎng)的染料相容使得難以開發(fā)多重PCR用的一組LUX引物。
最近，BD Biosciences開發(fā)了基于熒光的用于RT-PCR的引物試劑盒，已知商品名為DNAzyme。這個(gè)方法使用熒光寡核苷酸和引物的組合，并公開在US專利申請(qǐng)公開號(hào)2001/0001063中。除用于延伸反應(yīng)的正常啟動(dòng)序列之外，引物序列之一編碼在引物延伸過程中切割熒光寡核苷酸的酶。其結(jié)果，如同TaqMan分析一樣是熒光信號(hào)的增加。用于引物試劑盒的熒光寡核苷酸在設(shè)計(jì)上類似于典型的TaqMan探針，除了前者不具有互補(bǔ)到靶序列的序列，結(jié)果這個(gè)技術(shù)缺少基于TaqMan分析的特異性。此外，由于需要編碼必需的酶，DNAzyme引物很容易超過50個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。需要更長(zhǎng)的核苷酸增加了引物的制造成本。
熒光探針與熒光引物相比一個(gè)主要的優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)自探針的熒光信號(hào)只來自于探針和靶之間的雜交。由于錯(cuò)誤引發(fā)或引物二聚體假象而產(chǎn)生信號(hào)的非特異擴(kuò)增通常不發(fā)生在探針中，但這種情況有時(shí)候發(fā)生在引物中，不產(chǎn)生有用信號(hào)。熒光探針可以標(biāo)記有不同的可區(qū)分的報(bào)告染料。通過使用數(shù)個(gè)各自標(biāo)記有獨(dú)特的報(bào)告染料的探針，可以在單個(gè)PCR反應(yīng)中檢測(cè)具有不同序列的多個(gè)靶的擴(kuò)增。這個(gè)方法通常稱為多重PCR。熒光探針的開發(fā)也可能避免PCR后加工，從而消除交叉污染的可能性，而這是臨床診斷和法醫(yī)學(xué)應(yīng)用的關(guān)鍵因素。
熒光探針的一個(gè)缺點(diǎn)是它們的成本。熒光寡核苷酸至少比相應(yīng)未標(biāo)記的寡核苷酸貴10倍。此外，探針設(shè)計(jì)相對(duì)復(fù)雜，通常在構(gòu)建合適的探針時(shí)需要考慮許多因素，比如探針的長(zhǎng)度，退火溫度，和淬滅劑與熒光團(tuán)適當(dāng)?shù)墓庾V匹配。
與熒光寡核苷酸探針特別是TaqMan探針相比較，熒光引物趨向于產(chǎn)生弱的信號(hào)，因?yàn)樗鼈冊(cè)赑CR過程中不被切割以永久性將報(bào)告染料與淬滅劑分開。另外，從錯(cuò)誤引發(fā)和引物二聚體的形成所得到的非特異性PCR產(chǎn)物也有助于增加分析的噪聲。出于這些原因，在用于實(shí)時(shí)定量PCR中，通常相對(duì)于熒光引物而言優(yōu)選熒光探針。
已經(jīng)開發(fā)了許多的方法用于標(biāo)記寡核苷酸。通常熒光供體染料和淬滅劑以分步方式連接到寡核苷酸。這些方法通常需要昂貴的試劑和復(fù)雜的保護(hù)法保護(hù)步驟，而收率卻通常相當(dāng)?shù)?。而且，染料和淬滅劑的選擇以及它們連接到寡核苷酸的順序是受限制的和固定的，這部分因?yàn)椴皇撬械娜玖峡梢阅褪芄押塑账岷铣傻目量袒瘜W(xué)條件。
通常通過以下兩種方法之一將染料摻入寡核苷酸中1)通過在自動(dòng)合成過程中使用染料改性的核苷或脫氧核苷亞磷酰胺；或2)在合成后通過將胺或硫醇改性的核苷酸或脫氧核苷酸與胺或硫醇的活性染料反應(yīng)而標(biāo)記。例如，通過用連接到CPG固相支持物的TAMRA標(biāo)記的改性劑開始，通常合成在3′和5′末端標(biāo)記有FAM/TAMRA染料對(duì)的寡核苷酸，隨后連續(xù)積累剩余的寡核苷酸。在最后偶聯(lián)步驟通過標(biāo)準(zhǔn)的亞磷酰胺化學(xué)作用將供體染料FAM連接到寡聚物。這個(gè)方法具有兩個(gè)缺點(diǎn)首先，染料標(biāo)記的亞磷酰胺成本高；第二，其減少TAMRA的淬滅能力，因?yàn)橐话阏f來羅丹明染料，尤其是TARMA在標(biāo)準(zhǔn)寡核苷酸合成條件下是不穩(wěn)定的。為解決這個(gè)問題，常規(guī)的做法是避免一開始使用連接到CPG支持物的TAMRA。一種方法是用保護(hù)的3′-氨基-改性劑連接的CPG開始合成，供體染料FAM照常在自動(dòng)合成的最后步驟通過標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺化學(xué)作用連接到5′-末端。在隨后從固相支持物切割寡核苷酸和3′-胺去保護(hù)步驟之后，胺改性的寡核苷酸與TAMRA琥珀酰亞胺基酯反應(yīng)。為保證探針或引物的性能，在第二個(gè)染料連接反應(yīng)之前后使用HPLC或聚丙烯酰胺凝膠電泳的純化步驟是必須的。探針和引物的設(shè)計(jì)帶來的限制和固定以及標(biāo)記化學(xué)作用的性質(zhì)使得這些熒光寡核苷酸的制造非常昂貴。
使用標(biāo)記的寡核苷酸的一種越來越重要的PCR分析類型是實(shí)時(shí)PCR。實(shí)時(shí)PCR監(jiān)測(cè)的一個(gè)重要的參數(shù)是所謂閾循環(huán)點(diǎn)，或Ct值。Ct值是PCR產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到基線以上的預(yù)先設(shè)定值所需要的反應(yīng)循環(huán)的理論數(shù)。樣品中靶DNA的濃度越高，Ct值越小。圖1顯示代表性的擴(kuò)增圖，并定義用于定量分析的術(shù)語(yǔ)。擴(kuò)增圖是熒光信號(hào)對(duì)循環(huán)數(shù)的圖。在PCR的初始循環(huán)中，熒光信號(hào)幾乎沒有改變。這個(gè)相對(duì)的“平坦區(qū)“定義擴(kuò)增圖的基線?；€以上熒光的增加顯示檢測(cè)到積累的PCR產(chǎn)物。初始靶拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)與Ct值以線性方式負(fù)相關(guān)，這個(gè)關(guān)系形成實(shí)時(shí)定量PCR的數(shù)學(xué)基礎(chǔ)。
此處使用的一些術(shù)語(yǔ)的定義術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”和“寡聚物”是可互換使用的，指核酸，2′-脫氧核酸，肽核酸(PNA)，鎖核酸(LNA)及包括吡唑嘧啶的其他非天然核酸的序列。一般來說，寡核苷酸的長(zhǎng)度要適合作為引物或探針。大多數(shù)的寡核苷酸是通常小于100個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的多核苷酸，許多小于50個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，一些寡核苷酸包含25個(gè)或更少的核苷酸。關(guān)于術(shù)語(yǔ)更詳盡的討論，可以參考下列文獻(xiàn)Kutyavin，I.等，N.A.R.30，20024952-4959；和He J.& Seela F.，N.A.R.30，20025485-5496和其中的參考文獻(xiàn)。
“引物”是指能夠用作起點(diǎn)沿著互補(bǔ)鏈延伸的寡核苷酸。通常在PCR使用一組引物，一個(gè)正向的和一個(gè)反向的。正向引物包含與靶核酸的一條鏈互補(bǔ)的序列，并沿著這條鏈引導(dǎo)合成。同樣，反向引物包含與靶核酸的相反鏈互補(bǔ)的序列，并沿著靶核酸的相反鏈引導(dǎo)合成。
“探針”是指含有與靶核酸區(qū)域互補(bǔ)的序列的標(biāo)記的寡核苷酸，其中標(biāo)記的寡核苷酸與靶序列退火并產(chǎn)生表明靶區(qū)域存在的信號(hào)。探針通常在3′末端是封閉的，不延伸入產(chǎn)物中。
術(shù)語(yǔ)“光度標(biāo)記分子”是指由于分子的物理或化學(xué)環(huán)境變化而產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)變化并用于標(biāo)記另一分子的分子。所述變化可以是吸收的光的量或吸收的光的波長(zhǎng)。光度分子包括，例如，在一個(gè)波長(zhǎng)處吸收光而在另一波長(zhǎng)處發(fā)光的熒光染料分子。在光度標(biāo)記分子為熒光染料的情形下，所述分子也可以顯示出發(fā)射的光量的變化或發(fā)射的光波長(zhǎng)的變化。
術(shù)語(yǔ)“活性基團(tuán)”是指可以用于將各種標(biāo)記基團(tuán)包括熒光團(tuán)和淬滅分子連接到寡核苷酸的化學(xué)部分。用于將染料連接到寡聚物的活性基團(tuán)的選擇通常取決于寡聚物上待標(biāo)記的官能團(tuán)。
例如染料分子的活性基團(tuán)與寡聚物的官能團(tuán)之間的鍵形成反應(yīng)通常是親核試劑和親電試劑之間的反應(yīng)。因此，活性基團(tuán)可以是親核試劑或親電子試劑，而相應(yīng)的官能團(tuán)可以是親電試劑或親核試劑。親電子試劑/親核試劑對(duì)非窮舉的的列表可以在表2中找到。對(duì)于活性對(duì)的進(jìn)一步討論參考US專利6,130,101。
存在于寡聚物上典型的官能團(tuán)包括但是不限于，胺，硫醇，醇，酚，醛，酮，肼，羥胺，二取代的胺，鹵化物，或羧酸。寡聚物上更典型的官能團(tuán)是胺，硫醇，醇，醛或酮。
連接到染料分子的常見的活性基團(tuán)包括但是不限于丙烯酰胺，羧酸的活化酯，?；B氮，酰基腈，醛，烷基鹵，胺，酸酐，苯胺，芳基鹵，疊氮化物，氮丙啶，羧酸，鹵乙酰胺，鹵三嗪，肼，酰肼，亞胺酯，異氰酸酯，異硫氰酸酯，馬來酰亞胺，亞磷酰胺，磺酰鹵或硫醇。其它的活性基團(tuán)包括琥珀酰亞胺基酯，胺，鹵乙酰胺，肼，異硫氰酸酯，馬來酰亞胺，或亞磷酰胺。存在于寡核苷酸上的官能團(tuán)是胺，一種染料上的常用活性基團(tuán)用于將染料連接到寡核苷酸，其是琥珀酰亞胺酯。
下面是用于包括染料的各種試劑的一些縮寫5-CR110指5-羧基羅丹明110；6-CR110指6-羧基羅丹明110；5-FAM指5-羧基熒光素；6-FAM指6-羧基熒光素；5-R6G指5-羅丹明6G；5-ROX指5-羧基-X-羅丹明；6-ROX指6-羧基-X-羅丹明；5-TAMRA指5-羧基四甲基-羅丹明；6-TAMRA指6-羧基四甲基-羅丹明；JOE指2′，7′-二甲氧基-4′，5′-二氯-6-羧基熒光素。
對(duì)本發(fā)明來說術(shù)語(yǔ)“光譜相似的染料”，指可以具有或不具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)但是具有相似的激發(fā)和/或激發(fā)譜性質(zhì)的熒光染料。然而所述染料的發(fā)射光譜可以相似或可以不相似。這樣一對(duì)的例子是5-FAM和5-CR110。5-FAM吸收/發(fā)射波長(zhǎng)在495/519nm，而5-CR110吸收/發(fā)射波長(zhǎng)在502/524nm處。對(duì)本發(fā)明來說，差異在15nm以內(nèi)的吸收或激發(fā)波長(zhǎng)被認(rèn)為是相似的。
術(shù)語(yǔ)“光譜相同的染料”指可以具有或不具有相同化學(xué)結(jié)構(gòu)但是發(fā)射譜或激發(fā)或發(fā)射和激發(fā)譜兩者在光譜上不可區(qū)分的熒光染料。
術(shù)語(yǔ)“相同的染料”指化學(xué)和光譜相同的熒光染料。
術(shù)語(yǔ)“報(bào)告染料”或“熒光報(bào)告染料”指在分析過程中其熒光被監(jiān)測(cè)的熒光染料。當(dāng)淬滅染料也用于標(biāo)記相同的生物分子時(shí)，報(bào)告染料可以稱為供體染料，而淬滅染料有時(shí)可以稱為受體，受體染料或受體分子。
此處使用的術(shù)語(yǔ)“淬滅”指降低分子產(chǎn)生的信號(hào)，其包括但是不限于將分子產(chǎn)生的信號(hào)減少到零或低于檢出極限。因此，給定分子可以被例如另一分子“淬滅”，但仍然產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)，即使分子被淬滅時(shí)由淬滅的分子產(chǎn)生的信號(hào)小于分子未被淬滅時(shí)的信號(hào)。
術(shù)語(yǔ)“淬滅劑”或“淬滅染料”或“淬滅分子”指染料或等同的分子，比如鳥嘌呤核苷(G)或2′-脫氧鳥嘌呤核苷(dG)，其能夠減少熒光報(bào)告染料或供體染料的熒光。淬滅染料可以是熒光染料或非熒光染料。當(dāng)淬滅劑是熒光染料時(shí)，其熒光波長(zhǎng)通?；旧喜煌趫?bào)告染料的波長(zhǎng)，并且通常在分析過程中不監(jiān)測(cè)淬滅劑熒光。
本發(fā)明的一些實(shí)施方案公開了構(gòu)建熒光寡核苷酸的方法和它們作為引物和探針在核酸檢測(cè)中的應(yīng)用，特別是在實(shí)時(shí)qPCR中的核酸檢測(cè)。與現(xiàn)有的技術(shù)相比較，一些實(shí)施方案的熒光寡核苷酸顯著更容易制造并基本上比許多市場(chǎng)上可買到的技術(shù)更靈敏。此外，不同于常規(guī)的熒光寡核苷酸，比如TaqMan探針，其報(bào)告染料的選擇被伴隨的淬滅染料的可用性所限制，本發(fā)明各種實(shí)施方案的寡核苷酸可以基本上適應(yīng)任何波長(zhǎng)的熒光染料。這種染料選擇的靈活性利于不同熒光波長(zhǎng)的熒光引物或探針的合成并允許在單管形式中進(jìn)行多重檢測(cè)。
一些實(shí)施方案是探針，所述探針是標(biāo)記有多個(gè)光譜相同或相似的熒光染料的單鏈寡核苷酸。所述探針可以進(jìn)一步標(biāo)記有一種或者多種淬滅劑。在缺少靶序列的情況下，探針呈現(xiàn)無規(guī)卷曲構(gòu)型，并且是非熒光僅僅弱熒光的。通常，無規(guī)卷曲構(gòu)型的寡核苷酸基本上不含使寡核苷酸的兩個(gè)末端彼此接近的二級(jí)結(jié)構(gòu)。相反，具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的寡核苷酸探針的例子是所謂分子信標(biāo)探針。
在存在靶序列的情況下，各種實(shí)施方案的探針容易地雜交到靶序列。在具有5′核酸外切酶活性的特定試劑或酶類存在的情況下，染料分子隨后從寡核苷酸上切割。切割導(dǎo)致染料分子永久性分離，使得熒光大大增加。
熒光最大的增加取決于通過5′外切核酸酶或等同的核酸酶對(duì)連接各相鄰染料對(duì)的磷酸骨架的可切割性。當(dāng)染料連接位點(diǎn)彼此太接近時(shí)，可能阻礙寡核苷酸雜交到靶和影響5′外切酶核酸活性。另一方面，當(dāng)染料連接位點(diǎn)彼此過分遠(yuǎn)離，本底熒光可能會(huì)高。因此，為在探針/靶雜交之后在缺少靶序列和最適合的5′外切核酸酶活性的情況下獲得最小的熒光本底，各相鄰染料對(duì)的連接位點(diǎn)應(yīng)該分開3到60個(gè)核苷酸，優(yōu)選12到35個(gè)核苷酸，以及最優(yōu)選15到25個(gè)核苷酸。
用于這些實(shí)施方案有用的酶包括Taq聚合酶或獨(dú)立外切核酸酶或可以在兩個(gè)標(biāo)記的分子之間切割的任何其它的酶。在一些實(shí)施方案中，永久性分開標(biāo)記分子基本上增加熒光發(fā)射。
與摻入到根據(jù)本發(fā)明標(biāo)記的寡聚物中的多標(biāo)記分子相反，熒光探針比如US專利5,538,848公開的TaqMan探針，US專利5,925,517公開的分子信標(biāo)和US專利6,174,670公開的Hyb探針只包含單個(gè)熒光報(bào)告分子。結(jié)果，目前可獲得的探針可以產(chǎn)生的最大熒光信號(hào)是通過單個(gè)熒光團(tuán)產(chǎn)生的信號(hào)。另一方面，本發(fā)明各種實(shí)施方案的探針包括至少兩種染料。因此，與靶序列雜交和切割本發(fā)明的探針導(dǎo)致從多重?zé)晒馊玖袭a(chǎn)生信號(hào)。因此，本發(fā)明各種實(shí)施方案的探針能夠產(chǎn)生比根據(jù)現(xiàn)用的方法制造的探針產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)許多倍的熒光信號(hào)。
圖3A示例了用TagMan探針(JOE作為熒光團(tuán)，TAMRA作為淬滅劑)檢測(cè)的典型MCG基因擴(kuò)增反應(yīng)的動(dòng)態(tài)熒光測(cè)量和用根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案制造的探針檢測(cè)的相同反應(yīng)的動(dòng)態(tài)熒光測(cè)量的比較結(jié)果。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案制造的探針在兩個(gè)末端被標(biāo)記有兩個(gè)R6G染料(參見實(shí)施例4)。在兩個(gè)分析中使用相同的序列。
圖3A的數(shù)據(jù)示例來自雙標(biāo)記的探針的熒光信號(hào)是使用TaqMan探針測(cè)量的信號(hào)的兩倍。令人吃驚的是觀察到標(biāo)記有兩個(gè)或更多光譜相同或相似的熒光團(tuán)的寡核苷酸被充分淬滅(沒有形成染料聚集物)，通過切割探針使熒光團(tuán)彼此分離產(chǎn)生超過本底足夠高的信號(hào)以用于追蹤DNA的擴(kuò)增。因?yàn)閷?duì)寡核苷酸的這一觀察是如此出乎意料，申請(qǐng)人尋找對(duì)使用熒光染料測(cè)量另一生物聚合物多肽水平的技術(shù)的解釋。
有時(shí)蛋白質(zhì)被標(biāo)記帶熒光染料標(biāo)簽的抗體。在這些分析中常見的是將兩個(gè)或更多相同的熒光團(tuán)連接到單個(gè)多肽。添加各染料分子增加標(biāo)記的蛋白質(zhì)的總熒光，盡管由于熒光淬滅與染料的物理接觸有關(guān)，隨染料數(shù)的熒光增加可能不是線性的。在蛋白質(zhì)標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中，只有當(dāng)過量染料分子連接到蛋白質(zhì)時(shí)才發(fā)生顯著的熒光淬滅。在這樣的情況下，淬滅通常是染料分子間物理相互作用即染料聚集的結(jié)果。這個(gè)技術(shù)的進(jìn)一步討論提供在Haugland，RP Handbook of Fluorescent Probesand Research Products 第9版，第20-74頁(yè)和其中的參考文獻(xiàn)。
與相對(duì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽相反，缺乏互補(bǔ)的內(nèi)部序列的寡核苷酸預(yù)計(jì)呈現(xiàn)無結(jié)構(gòu)的、解開的、延伸結(jié)構(gòu)。這個(gè)構(gòu)型通常稱為無規(guī)卷曲，特征為缺少可容易定義的內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)。據(jù)信寡核苷酸采用無規(guī)卷曲構(gòu)型以使由于分子高度帶負(fù)電荷的磷酸骨架產(chǎn)生的分子間電斥力最小化。結(jié)果，用于標(biāo)記，例如，具有基本上無規(guī)卷曲形狀的寡核苷酸的染料不能預(yù)期彼此互相作用并且不能預(yù)計(jì)顯示熒光信號(hào)淬滅。因此，根據(jù)對(duì)蛋白質(zhì)標(biāo)記和寡核苷酸結(jié)構(gòu)的普遍認(rèn)識(shí)，將可以預(yù)期本發(fā)明各種實(shí)施方案的寡核苷酸將顯示太少的熒光淬滅，而不能用于檢測(cè)給定樣品中寡核苷酸的存在或水平。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的教導(dǎo)，可以預(yù)期這些分子的本底熒光太高以致它們不能用于監(jiān)測(cè)實(shí)時(shí)PCR。實(shí)際上，研究人員竭盡全力設(shè)計(jì)精細(xì)的寡聚物結(jié)構(gòu)來安放置標(biāo)記熒光團(tuán)從而促進(jìn)熒光團(tuán)聚集以淬滅熒光。例如，兩個(gè)US專利6,150,097和6,037,137提到根據(jù)分子信標(biāo)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)PCR探針的可能性，該結(jié)構(gòu)導(dǎo)致兩個(gè)報(bào)告熒光團(tuán)彼此物理接觸。
另一個(gè)來自使用本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的出乎意料的觀察是促進(jìn)染料聚集的寡核苷酸二級(jí)結(jié)構(gòu)是不必要的和不希望的。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)相同的報(bào)告染料的聚集不僅是不必要的，而且在許多情況下對(duì)實(shí)時(shí)PCR探針的性能有害。本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的探針，其具有最簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)，通常比根據(jù)許多現(xiàn)有技術(shù)公開的方法制造的探針更加靈敏。另外，設(shè)計(jì)具有復(fù)雜的內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)的探針通常比基本上缺乏內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)的探針更難以設(shè)計(jì)和制造。
已經(jīng)廣泛報(bào)道的是某些熒光或非熒光染料趨向于形成基態(tài)復(fù)合物。在水溶劑中高濃度下或當(dāng)分子在彼此非常接近的范圍以內(nèi)時(shí)，極可能形成這些復(fù)合物。有關(guān)的進(jìn)一步討論提供于West等，J Phys Chem(1965)；Rohatgi等，J Phys Chem(1966)；Rohatgi等，Chem Phys Lett(1971)；和Khairutdinov等，J Phys Chem.(1997)。
在兩個(gè)相同的染料之間形成同型二聚體，或在不同染料之間形成異源二聚體導(dǎo)致染料吸收光譜明顯的改變。這被認(rèn)為是染料激發(fā)態(tài)能量偶合的結(jié)果。在兩個(gè)熒光染料之間或熒光染料和非熒光染料之間形成的稱作H二聚體的特定類型二聚體特征為染料最大吸收的藍(lán)移和熒光淬滅。已經(jīng)利用由于形成H二聚體產(chǎn)生的熒光淬滅構(gòu)造熒光肽酶底物。這個(gè)主題進(jìn)一步的討論提供于Packard等，Proc.Natl.Acad.Sci.(1996)；Geoghegan等，Bioconjugate Chem(2000)；Tyagi等，Nat.Biotech(1998)；Bernacchi等，Nucleic Acids Res.(2001)；Marras等，Nucleic Acids Res.(2002)；Johansson等，J.Am.Chem.Soc.(2002)；US專利6,037,1376和150,097。
在所有前面提到過的參考文獻(xiàn)中，標(biāo)記的肽或寡核苷酸的構(gòu)建方式能保證分子物理上彼此足夠接近，從而來自供體染料的信號(hào)在酶促切割前被淬滅。對(duì)于肽酶底物，和分子信標(biāo)探針而言，在它們雜交到其靶序列以前明顯是這種情況。例如，US專利6,037,137公開的熒光肽需要所謂的“構(gòu)型決定區(qū)域”，其在肽中引入彎曲，使得染料對(duì)被保持非常接近用于有效的“接觸熒光淬滅”。同樣，US專利號(hào)6,150,097和6,037,137公開了具有連接到一個(gè)末端的熒光報(bào)告染料和連接到另一個(gè)末端的淬滅染料的分子信標(biāo)?？蛇x擇地，這些探針具有連接到一個(gè)末端的報(bào)告染料和連接到另一個(gè)末端相同的報(bào)告染料，其中所述染料對(duì)處于物理接觸以實(shí)現(xiàn)熒光淬滅。在這種方法的變體中，報(bào)道一個(gè)基團(tuán)通過用熒光團(tuán)和高度疏水的淬滅劑標(biāo)記線狀寡核苷酸而實(shí)現(xiàn)接觸淬滅，所述淬滅劑利于與熒光團(tuán)形成異源二聚體。參見，Johansson等，J.Am Chem.Soc.(2002)。
與這些方法相反，本發(fā)明一些實(shí)施方案的寡核苷酸探針基本上缺乏可清楚限定的導(dǎo)致探針呈現(xiàn)特別剛性構(gòu)型的二級(jí)結(jié)構(gòu)或其它的構(gòu)型決定結(jié)構(gòu)。此外，不必要形成促進(jìn)包含兩種或更多熒光報(bào)告染料的本發(fā)明許多實(shí)施方案的探針中的染料之間物理“接觸”的二聚體或其它的結(jié)構(gòu)。
缺少各種實(shí)施方案的染料對(duì)之間的鄰近淬滅，通過在酶消化前后雙標(biāo)記的探針的吸收譜沒有顯著變化來顯示。參見，例如，圖4A的跡線29對(duì)比28，和實(shí)施例5進(jìn)一步討論?？傮w波長(zhǎng)從跡線28到跡線29的少量偏移不同于光譜形狀或輪廓的變化，是由染料經(jīng)歷的微環(huán)境的差異所引起。這被稱為“溶劑效應(yīng)”。標(biāo)記有雙CR110的探針(跡線29)和在5′(圖4B的跡線31)或在3′(圖4C的跡線33)標(biāo)記有單個(gè)CR110的相同序列的另一寡核苷酸幾乎可重疊的光譜證實(shí)了溶劑效應(yīng)。在這種情況下染料經(jīng)歷相似的溶劑效應(yīng)。再次，雙標(biāo)記的探針和兩個(gè)單標(biāo)記的寡核苷酸之間吸收光譜的相似性表明在雙標(biāo)記的探針上基本上沒有染料聚集。
為說明在二聚體形成后的光譜變化，本發(fā)明人合成了三種具有環(huán)序列的分子信標(biāo)探針，所述序列與線性探針的序列相同。一個(gè)信標(biāo)探針在3′和5′末端標(biāo)記有兩個(gè)5-CR110染料(SEQ ID No 12)，另一信標(biāo)探針在3′和5′末端標(biāo)記有兩個(gè)5-TAMRA染料(SEQ ID No 13)。另一信標(biāo)探針在3′和5′末端標(biāo)記有兩個(gè)5-ROX染料(SEQ ID No 14)。如圖5A，5B和5C所示和進(jìn)一步詳見實(shí)施例7。所有信標(biāo)探針的吸收光譜(跡線38，40，和42)與線性探針的吸收光譜(跡線37，39，和41)顯著不同，各自形成新的較短波長(zhǎng)的峰，這是H二聚體形成的特征。關(guān)于上述內(nèi)容更詳細(xì)的討論請(qǐng)參見Blackman等，Biochemistry(2002)；Packard等，Proc.Natl.Acad.Sci.(1996)。在S1核酸酶消化后，光譜變回到游離染料的光譜。盡管標(biāo)記有兩個(gè)報(bào)告染料的信標(biāo)探針的熒光作為形成染料二聚體的結(jié)果被很好地淬滅，探針檢測(cè)核酸的靈敏度相對(duì)較低。圖6A，6B和6C比較了分別根據(jù)本發(fā)明的各種實(shí)施方案各自標(biāo)記有兩個(gè)相同的染料5-CR110，5-TAMRA，5-ROX的分子信標(biāo)和線性探針之間的動(dòng)態(tài)熒光測(cè)量。
數(shù)據(jù)表明根據(jù)本發(fā)明各種實(shí)施方案制備的探針通常比相應(yīng)的信標(biāo)探針靈敏2-10倍。信標(biāo)探針的靈敏性顯著較弱可以依據(jù)PCR檢測(cè)過程中存在的競(jìng)爭(zhēng)平衡來解釋。如圖7所示，(詳見實(shí)施例8)，存在著三種競(jìng)爭(zhēng)平衡，它們分別介于1)單鏈靶DNA和雙鏈靶DNA之間(KA)；2)開放構(gòu)型的信標(biāo)和閉合構(gòu)型的信標(biāo)之間(KB)；和3)探針靶雜交產(chǎn)物和兩個(gè)反應(yīng)物之間，單鏈靶DNA和無規(guī)則構(gòu)型(Kc)的信標(biāo)之間(KC)。
形成探針-靶雜交物分開兩個(gè)染料，結(jié)果產(chǎn)生熒光信號(hào)。顯然，單鏈靶DNA濃度越高和無規(guī)卷曲構(gòu)型的探針的量越大，Kc平衡會(huì)向形成探針靶雜交產(chǎn)物移動(dòng)越多，從而增加熒光信號(hào)。然而，在給定PCR循環(huán)數(shù)和因此給定單鏈靶DNA濃度下，形成的雜交物的量與處于無規(guī)則構(gòu)型的探針的濃度成比例，所述探針與閉合構(gòu)型的信標(biāo)處于平衡。因此，閉合信標(biāo)構(gòu)型的真正存在降低可形成雜交產(chǎn)物的處于無規(guī)則構(gòu)型的探針的濃度，而這降低熒光信號(hào)的強(qiáng)度。另外，在探針末端并列放置一對(duì)染料以形成二聚體可能增加莖環(huán)結(jié)構(gòu)的熔解溫度，進(jìn)一步穩(wěn)定閉合的構(gòu)型并使得熒光探針-靶雜交物的形成更為不利。
如果具有5′核酸外切酶活性的酶用于反應(yīng)中，可以改進(jìn)信標(biāo)探針的熒光信號(hào)；在形成探針-靶雜交物之后，5′核酸外切酶切割探針并產(chǎn)生不可逆的穩(wěn)定熒光信號(hào)。信標(biāo)的閉合構(gòu)型和無規(guī)則構(gòu)型之間的平衡減緩熒光產(chǎn)物形成的速率。在各PCR循環(huán)的時(shí)間范圍以內(nèi)，通常10-30秒，僅僅形成一小部分熱力學(xué)允許量的切割產(chǎn)物，導(dǎo)致如圖6A，6B和6C所示相對(duì)弱的信號(hào)(詳見實(shí)施例8)。另一方面，根據(jù)本發(fā)明各種實(shí)施方案的同型雙標(biāo)記的探針保持開放的無規(guī)則構(gòu)型，因此可以容易地形成熒光探針-靶雜交物。雜交的探針被5′核酸外切酶切割進(jìn)一步增強(qiáng)信號(hào)，因?yàn)槠洚a(chǎn)生不可逆的去淬滅的穩(wěn)定的熒光產(chǎn)物。
本發(fā)明一些實(shí)施方案的探針與比如TaqMan探針之間的主要區(qū)別是，本發(fā)明許多實(shí)施方案的探針具有兩個(gè)或更多報(bào)告染料，而TaqMan探針僅僅具有單個(gè)報(bào)告染料和單個(gè)淬滅劑。盡管淬滅劑本身還可以是熒光染料，比如FAM/TAMRA供體/淬滅劑對(duì)中的TAMRA，只檢測(cè)供體染料FAM的發(fā)射，并且只有它的熒光信號(hào)與產(chǎn)生的DNA的量有關(guān)。在TaqMan分析中，淬滅劑的熒光或者被忽略或者甚至檢測(cè)不到。使用TaqMan探針的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)依賴于基于FRET的熒光淬滅供體熒光團(tuán)以降低分析中的本底信號(hào)。在雜交到靶DNA和/或探針被5-外切核酸酶活性水解切割前，供體的熒光被淬滅，因此檢測(cè)不到信號(hào)或只檢測(cè)到非常弱的信號(hào)。在探針雜交和/或探針的酶切割之后，供體的熒光被釋放，因此檢測(cè)到對(duì)應(yīng)于產(chǎn)生的DNA的量增加的正信號(hào)。
因?yàn)榭梢允褂肨aqMan產(chǎn)生的最大信號(hào)通過單個(gè)供體分子產(chǎn)生，TaqMan探針的凈信號(hào)增益(最終的性能)很大程度上由探針切割前熒光團(tuán)的熒光淬滅效率和探針切割后熒光團(tuán)的熒光收率來測(cè)定。因此，在TaqMan分析中理想的是，淬滅劑將完全淬滅供體的熒光直到報(bào)告分子從寡核苷酸上切割。完全淬滅通常是保證實(shí)時(shí)PCR分析以暗背景開始所需要的。如前面討論的，根據(jù)公知的FRET原理，基于FRET的淬滅效率與供體分子發(fā)射光譜和受體(淬滅劑)分子吸收光譜的重疊正相關(guān)。關(guān)于FRET更詳細(xì)的討論可以參考例如Foster，Ann.Phys.(1948)；Stryer等，和Proc.Natl.Acad.Sci.(1967)。
此外，鑒于染料的熒光發(fā)射波長(zhǎng)總是比其吸收波長(zhǎng)更長(zhǎng)(正如其斯托克斯位移所定義)，給定染料分子最好的淬滅分子必須是不同的染料。這是因?yàn)榇銣鐒┑奈展庾V必須與供體的發(fā)射光譜匹配。實(shí)際上，供體染料的斯托克斯位移越大，供體染料越好，因?yàn)楣w其后能在其最大吸收被激發(fā)而不與其發(fā)射相抵觸。這是用于增加信號(hào)輸出的第二種方法的理論基礎(chǔ)?？紤]到基于FRET淬滅的原理，具有大斯托克斯位移的供體染料的優(yōu)點(diǎn)，以及對(duì)基于FRET淬滅最大化的需求，必須選擇發(fā)射波長(zhǎng)基本上不同于供體染料發(fā)射波長(zhǎng)的淬滅劑。
總之，根據(jù)FRET的基本原理和其在構(gòu)建包括引物和探針的寡核苷酸中的廣泛使用，現(xiàn)有技術(shù)看起來教導(dǎo)遠(yuǎn)離本發(fā)明的各種實(shí)施方案。
因此，與用同型雙標(biāo)記FAM或者磺酸化的Cy5的探針得到的結(jié)果所顯示的引用技術(shù)比較，本發(fā)明的實(shí)施方案是非顯而易見的。FAM和Cy5是兩種最廣泛使用的報(bào)告染料。然而，這些染料中沒有一個(gè)產(chǎn)生顯示顯著的信號(hào)變化和低本底熒光的同型雙標(biāo)記的探針(數(shù)據(jù)未顯示)。實(shí)際上，為了增加TaqMan探針的靈敏度，大多數(shù)的商業(yè)計(jì)劃聚焦在更有效淬滅劑的開發(fā)，特別是基于非熒光染料的淬滅劑。市場(chǎng)上可買到的高效率非熒光淬滅劑的例子包括來自BioSearch公司的基于偶氮染料的BHQ淬滅劑，來自Amersham公司的多硝基花青染料，和來自Molecular Probes的基于羅丹明的YSQ染料。
根據(jù)各種實(shí)施方案標(biāo)記有兩種報(bào)告染料的探針不必設(shè)計(jì)成將染料分子安置為彼此物理鄰近。然而，聚集更可能發(fā)生在標(biāo)記有多重染料分子和任選的淬滅分子的探針之間，而不是發(fā)生在標(biāo)記有單個(gè)報(bào)告分子和淬滅分子的相同寡核苷酸序列之間。因此，根據(jù)本發(fā)明各種實(shí)施方案的至少一些標(biāo)記有至少兩種信號(hào)染料(和任選標(biāo)記有一種或者多種淬滅分子)的寡核苷酸可以在染料作為探針切割的結(jié)果而永久性分離后，顯示出低本底熒光和高信號(hào)輸出，因?yàn)槊抗押塑账峋哂写罅啃盘?hào)分子。
優(yōu)選，在一些實(shí)施方案中，寡核苷酸標(biāo)記有多個(gè)光譜相同或相似的熒光染料。熒光報(bào)告染料的混合物可以用于標(biāo)記特定的探針，只要所述染料具有相似的吸收或者激發(fā)光譜以便它們?nèi)勘粏渭ぐl(fā)光有效激發(fā)。例如，本發(fā)明的探針可以包括Cy3(Glen Research，Sterling，VA)和TAMRA(Biotium公司，Hayward，CA)，其中兩者具有相似的光譜并可以在540nm有效激發(fā)。作為另一個(gè)實(shí)施例，特定的探針可以包括CR110和FAM，其中兩者也都具有相似的光譜并可以被488nm氬氣激光束很好地激發(fā)。盡管標(biāo)記有混合染料的探針相對(duì)更難合成，但在某些情況下如果這樣的混合染料在與靶序列雜交前促進(jìn)熒光淬滅，則其是有利的。例如，本發(fā)明的探針可以標(biāo)記有一種具有凈負(fù)電荷的染料和另一種具有相似光譜但是帶凈正電荷的染料的混合物。具有相反電荷的染料的混合物可以促進(jìn)熒光淬滅。給染料附加電荷的方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。例如，可以通過磺化給染料添加負(fù)電荷，而正電荷可以通過向染料添加仲胺，叔胺或季胺而在染料上產(chǎn)生。這些分子更詳細(xì)的討論參考Mujumdar等，1993，Bioconjugate Chem。
更優(yōu)選，本發(fā)明一些實(shí)施方案的探針為標(biāo)記有多個(gè)相同熒光染料分子的寡核苷酸。因?yàn)槿玖峡稍趩蝹€(gè)步驟結(jié)合到寡核苷酸，因此寡核苷酸探針具有容易和經(jīng)濟(jì)制造的優(yōu)點(diǎn)。在20世紀(jì)80年代進(jìn)行了廣泛的研究工作以開發(fā)有效標(biāo)記核酸的技術(shù)。這些技術(shù)被充分記錄。這一主題更詳細(xì)的討論參見以下文獻(xiàn)Connolly等，Nucleic AcidsRes.(1985)；Dreyer等，Proc.Natl.Acad.Sci.(1985)；Nelson等，Nucleic Acids Res.(1989)；Sproat等，Nucleic Acids Res.(1987)和Zuckerman等，Nucleic Acids Res.(1987)。
具有報(bào)告子/淬滅染料對(duì)的現(xiàn)有技術(shù)的探針需要單獨(dú)的標(biāo)記步驟和昂貴的試劑。例如，第一種標(biāo)記物，染料或者淬滅劑通常連接到寡核苷酸，連接的方式或者通過用連接到CPG固相支持物的已保護(hù)的染料開始寡核苷酸合成，或者通過在寡核苷酸合成過程中使用染料標(biāo)記的核苷(或者2′-脫氧核苷)亞磷酰胺而摻入染料。第二種淬滅劑或染料分子通過在標(biāo)準(zhǔn)寡聚物合成過程中使用染料標(biāo)記的或者淬滅劑標(biāo)記的核苷亞磷酰胺而連接到寡核苷酸?？蛇x的并且更常見的，第二染料或者淬滅分子連接到寡聚物，其方式是首先在寡聚物合成過程中向寡聚物中摻入氨基，然后將琥珀酰亞胺酯染料或者淬滅劑與胺改性的寡聚物反應(yīng)。與這種多步驟標(biāo)記操作相反，本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的探針包含多個(gè)相同的染料。用單個(gè)染料標(biāo)記僅僅要求單個(gè)染料標(biāo)記步驟，通常在緩沖液中將活性形式的染料與含有所需數(shù)量的能夠與染料反應(yīng)的活性基團(tuán)的寡核苷酸混合1-2小時(shí)。通常，首先通過標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺化學(xué)作用使用市場(chǎng)上可買到的試劑向寡核苷酸中引入活性基團(tuán)。
最優(yōu)選，本發(fā)明一些實(shí)施方案的探針是標(biāo)記有兩個(gè)相同的熒光染料的寡核苷酸，所述染料的熒光被淬滅而不形成染料聚集物。優(yōu)選，染料分別連接到寡核苷酸的3′和5′末端。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)染料通過柔性脂肪族接頭連接到磷酸骨架3′末端，而另一相同的染料通過另一柔性脂肪族接頭連接到磷酸骨架的5′末端。柔性接頭是C2到C30直鏈或者分支的、飽和或不飽和的烴鏈，任選由雜原子，芳基，低級(jí)烷基，低級(jí)羥基烷基和低級(jí)烷氧基取代。優(yōu)選，接頭是C4到C12直鏈或者分支的飽和烴鏈，任選由雜原子，低級(jí)烷基和低級(jí)羥基烷基取代。
在發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，標(biāo)記有多個(gè)報(bào)告染料和淬滅劑的探針進(jìn)一步包括核酸結(jié)合基團(tuán)。核酸結(jié)合基團(tuán)的例子包括小溝結(jié)合劑(MGB)，核酸嵌入劑(interculator)和多胺。在核酸結(jié)合基團(tuán)被摻入到本發(fā)明各種實(shí)施方案的探針中的情況下，探針的寡核苷酸序列可以被變短并仍然產(chǎn)生有用信號(hào)。較短的探針意味著降低制造成本。向寡核苷酸探針或引物中引入核酸結(jié)合基團(tuán)的方法的記錄很全面，參見例如US專利Nos.5,801,155；6,472,153；6,486,308；6,492,346和多種公開物，例如Afonina等，N.A.R.(1997)；Kumar，等，N.A.R.(1998)和Kutyavin等，N.A.R.(2000)。優(yōu)選，核酸結(jié)合基團(tuán)是小溝結(jié)合劑(MGB)。優(yōu)選，包含核酸結(jié)合基團(tuán)的探針標(biāo)記有兩個(gè)或更多相同的報(bào)告染料。更優(yōu)選，包含核酸結(jié)合基團(tuán)的探針標(biāo)記有兩個(gè)相同的染料，其可以物理上彼此接觸或不接觸。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，寡核苷酸探針包括多個(gè)熒光報(bào)告染料，其中至少一些報(bào)告染料連接到G核苷酸或位于標(biāo)記的寡核苷酸內(nèi)接近G核苷酸。在這種安排中，最靠近G核苷酸的染料或染料分子的熒光在寡聚物雜交到其互補(bǔ)序列以前被淬滅。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，引物是包含多個(gè)光譜相同或相似的熒光報(bào)告染料的單鏈線狀寡核苷酸。在缺少靶序列的情況下，上述引物具有無規(guī)卷曲構(gòu)型并且沒有熒光或弱熒光。無規(guī)卷曲構(gòu)型的寡核苷酸引物基本上缺乏內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)。基本上缺乏內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)的寡核苷酸不容易形成二級(jí)結(jié)構(gòu)比如莖環(huán)，發(fā)夾等等。
一旦標(biāo)記有光度分子比如熒光分子的引物被引入到擴(kuò)增產(chǎn)物中，由于擴(kuò)增產(chǎn)物更加延伸的構(gòu)型，熒光團(tuán)被進(jìn)一步彼此分隔，因此來自光度分子的熒光信號(hào)增加。當(dāng)根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案制造引物時(shí)，每個(gè)引物包括至少兩個(gè)熒光團(tuán)。因此，根據(jù)本發(fā)明制造的引物可用于分析互補(bǔ)的寡核苷酸，其靈敏度比使用僅僅標(biāo)記有單個(gè)信號(hào)分子的引物的分析更大。
在與靶序列雜交和隨后摻入到擴(kuò)增產(chǎn)物中后，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案制造的一些引物的熒光增加。因此，本發(fā)明一些實(shí)施方案的引物的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是當(dāng)寡聚物上的多個(gè)染料分子雜交到其靶時(shí)產(chǎn)生信號(hào)。因?yàn)槊總€(gè)寡核苷酸有至少兩個(gè)信號(hào)分子，它們產(chǎn)生的信號(hào)大于只有連接到其上的單個(gè)染料分子的引物產(chǎn)生的信號(hào)。這幫助使得根據(jù)本發(fā)明方法制造的一些引物成為比現(xiàn)有技術(shù)僅僅包括單個(gè)信號(hào)分子的引物更靈敏的核酸檢測(cè)器。
染料分子通常通過脂肪族接頭連接到核苷酸的堿基或連接到磷酸骨架5′末端和寡核苷酸的堿基的組合。染料連接位點(diǎn)被隔開，其方式是為了在雜交前獲得最大的熒光淬滅和在雜交和摻入到擴(kuò)增產(chǎn)物之后獲得最大的熒光。通常，任何兩個(gè)鄰近的熒光標(biāo)記的核苷酸對(duì)之間或5′末端和鄰近的熒光標(biāo)記的核苷酸之間最適合的間隔是10到50個(gè)核苷酸；優(yōu)選，距離大約15到30個(gè)核苷酸；最優(yōu)選，距離為大約15到25個(gè)核苷酸。
在一個(gè)實(shí)施方案中是標(biāo)記有兩個(gè)光譜相同或相似的熒光染料的引物。通常，一個(gè)染料通過接頭連接到5′末端或其附近，而另一染料通過另一接頭連接到3′末端或其附近。優(yōu)選，一個(gè)染料通過接頭并且以適當(dāng)?shù)木嚯x連接到磷酸骨架的5′末端，而另一染料通過另一接頭連接到核苷酸比如T的堿基。通常，接頭分子C2到C12直鏈或分支的飽和烴鏈，任選被雜原子，芳基，低級(jí)烷基和低級(jí)羥基烷基取代。所述兩個(gè)染料分子可以分開大約15到大約25個(gè)堿基。
在一個(gè)實(shí)施方案中，引物是標(biāo)記有兩個(gè)相同染料的直鏈寡核苷酸，其中一個(gè)染料通過接頭連接到磷酸骨架5′末端而另一染料通過另一接頭連接到3′末端或其附近的核苷酸T的堿基。所述接頭是C4到C12直鏈或分支的飽和烴鏈，任選被雜原子，低級(jí)烷基和低級(jí)羥基烷基取代。根據(jù)本發(fā)明標(biāo)記有兩個(gè)相同染料的熒光引物比現(xiàn)有技術(shù)的引物容易制造得多。當(dāng)供體染料和淬滅分子需要在單獨(dú)步驟使用昂貴的試劑連接時(shí)，或需要合成長(zhǎng)的低得率核苷酸以形成所需的發(fā)夾結(jié)構(gòu)時(shí)尤其如此。
相似的，根據(jù)本發(fā)明各種實(shí)施方案制造的引物比許多現(xiàn)在使用的方法制造的引物要便宜。與合成包含具有不同化學(xué)性質(zhì)的標(biāo)記分子的引物需要多步驟標(biāo)記操作相反，包含兩個(gè)相同染料的引物僅僅需要單個(gè)染料標(biāo)記步驟。通常，本發(fā)明各種實(shí)施方案的標(biāo)記的寡核苷酸可以通過將活性形式的染料與引物在合適的緩沖液中混合1-2小時(shí)而制造，所述引物含有兩個(gè)能夠與該染料反應(yīng)的活性基團(tuán)?；钚曰鶊F(tuán)首先通過標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺化學(xué)作用使用市場(chǎng)上可買到的試劑引入到寡聚物中。
根據(jù)本發(fā)明各種實(shí)施方案的熒光寡核苷酸的主要優(yōu)點(diǎn)是可以自由使用實(shí)質(zhì)上任何類型和任何波長(zhǎng)的熒光染料而不必須將報(bào)告染料與特定的淬滅劑匹配。如此可能是因?yàn)橐恍?shí)施方案看來不依賴標(biāo)準(zhǔn)的基于FRET的熒光淬滅以產(chǎn)生具有可用信號(hào)的分析。用于本發(fā)明的合適類型的熒光染料包括，但是不限于，香豆素，呫噸染料，花青素，芘，苯乙烯基染料，BODIPY染料，芪和其衍生物；廣泛使用的羅丹明，熒光素和對(duì)甲氨基酚屬于呫噸染料類型。優(yōu)選染料包括中性染料分子和具有離域正或負(fù)電荷的染料分子。中性染料是不帶有任何電荷的染料，或帶有等量正電荷和負(fù)電荷的染料，后一種類型的中性染料也稱為兼性染料。中性染料的例子包含但是不限于如以下代表性的結(jié)構(gòu)所示的BODIPY染料，羅丹明，兼性花青染料，和其衍生物
四甲基羅丹明 其中R是活性基團(tuán)。
具有離域正電荷的染料例子包括但是不限于如以下代表性的結(jié)構(gòu)所示的rosamines，花青素，和其衍生物 花青素 四甲基rosamine其中R是活性基團(tuán)。
具有離域負(fù)電荷的染料的例子包括但是不限于如下面代表性的結(jié)構(gòu)所示的熒光素和試鹵靈衍生物
熒光素 試鹵靈其中R是活性基團(tuán)。
或者，一些實(shí)施方案的寡核苷酸標(biāo)記有帶負(fù)電荷染料和帶正電荷染料的組合，其中帶負(fù)電荷的染料和帶正電荷的染料的數(shù)量比例近似1∶1。帶負(fù)電荷的染料的例子包括熒光素衍生物和磺酸化染料，比如US專利5,696,157；6,130,101；5,268,486；和6,133,445，和US專利申請(qǐng)UA2002006479A1和UA20020077487A1中描述的那些。帶正電荷的染料的例子包括上述rosamine染料和花青染料以及使用標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)作用以叔胺或季胺改性的染料。
在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，用于合成上述寡核苷酸的合適的染料包括能量轉(zhuǎn)移染料，比如US專利5,800,996；6,479,303B1；和6,545,164B1，以及國(guó)際公開WO 00/13026描述的那些。標(biāo)記有不同的能量轉(zhuǎn)移染料和非能量轉(zhuǎn)移染料的探針或引物的組合能被用于在單個(gè)封閉管中的多重檢測(cè)。
用于各種實(shí)施方案的合適的染料包括但是不限于具有以下結(jié)構(gòu)的羅丹明呫噸染料 其中R1，R2，R3和R4獨(dú)立地是H，F(xiàn)，Cl，C1-C18烷基或C2-C18烯基；R5是H；R10，R11，R12和R13獨(dú)立地是H，C1-C18烷基，或C2-C18烯基，任選取代以活性基團(tuán)；所述結(jié)構(gòu)還包括0到4個(gè)另外的飽和或不飽和5或6元環(huán)，選自R1結(jié)合R11，R2結(jié)合R13，R3結(jié)合R10，和R4；所述各另外的環(huán)可以被一個(gè)或多個(gè)低級(jí)烷基取代；Q是CO2-或SO3-或活性基團(tuán)；R7和R8獨(dú)立地是H，F(xiàn)，Cl，或活性基團(tuán)；R6和R9獨(dú)立地是H，F(xiàn)，Cl。用于將這些及其他染料和淬滅劑連接到寡核苷酸的合適的活性基團(tuán)包括，但是不限于如表2所列的親電子試劑和親核試劑，及定義部分所列舉的其他基團(tuán)。用于連接光度分子和淬滅劑的其它方式包括脂肪族的接頭基團(tuán)。
其它用于各種實(shí)施方案的染料包括但是不限于具有以下結(jié)構(gòu)的花青染料 其中R1，和R2獨(dú)立地選自H，F(xiàn)，Cl，Br，CN，羧酸基團(tuán)，羧酰胺，磺酸酯，磺酰胺，低級(jí)烷基基團(tuán)，或至少一種另外的稠合芳環(huán)，所述另外的稠環(huán)包括獨(dú)立地選自以下的原子C，N，O和S，活性基團(tuán)，用H或活性基團(tuán)取代的低級(jí)烷氧基；R3和R4獨(dú)立地是用H或活性基團(tuán)取代的低級(jí)烷基；X和Y獨(dú)立地選自O(shè)，S，NR5和CR6R7；R5，R6，和R7其中R5，R6和R7，R5獨(dú)立地選自H，C1到C18烷基；以及“橋”是甲烷或聚甲炔基(polymethine group)。適于將所述分子連接到寡核苷酸的活性基團(tuán)包括但是不限于表2列舉的親核和親電子基團(tuán)和其定義部分列舉的其他基團(tuán)。除各種活性基團(tuán)之外，合適的染料和淬滅分子也可以通過例如脂肪族的接頭連接到寡核苷酸。
或者，合適的染料是能量轉(zhuǎn)移染料，其中染料對(duì)之一是羅丹明染料或花青素染料。
實(shí)施例實(shí)施例1寡核苷酸合成和標(biāo)記材料和儀器所有的無水溶劑和亞磷酰胺試劑包括核苷亞磷酰胺和保護(hù)的接頭購(gòu)自Proligo，Boulder，CO或Glen Research，Sterling，VA。所有未標(biāo)記的和胺改性的的寡核苷酸在Applied Biosciences(Foster City，CA)的Expedite 8909寡聚物合成儀上合成。
未標(biāo)記的寡核苷酸的合成所有未標(biāo)記的寡核苷酸(引物)的合成是在帶有玻璃珠孔徑大小500 的CPG支持物上以保護(hù)的核苷開始。遵循廠家提供的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程進(jìn)行去保護(hù)、偶聯(lián)和氧化步驟。通過將CPG珠子在氫氧化銨中55℃溫育16-18小時(shí)而從CPG支持物切除寡核苷酸和去保護(hù)。一旦從固相支持物切離，寡核苷酸通過SpeedVac濃縮以除去過量氨氣，然后將粗產(chǎn)物通過Sephadex G-25柱或C18反相柱體而純化。如有必要，用HPLC進(jìn)行最終純化(參見下面的純化)。
胺改性的寡核苷酸的合成通過使用CPG支持的氨基改性劑和含有保護(hù)的胺的合適的亞磷酰胺試劑在正常的自動(dòng)寡聚物合成過程中合成胺改性的寡核苷酸。
可以使用具有不同間隔臂的各種市場(chǎng)上可買到的CPG支持的氨基改性劑。可以向這些產(chǎn)物的3′末端引入氨基。CPG支持的氨基改性劑，3′-氨基-改性劑C7CPG用于表1所列的一些實(shí)施例中，并且其具有如下結(jié)構(gòu) (具有L1間隔基)其中，F(xiàn)moc和DMT分別是胺和羥基的保護(hù)基團(tuán)，以及“琥珀酰-lcaa”是固相支持物和改性劑之間的間隔基。堿不穩(wěn)定的Fmoc基團(tuán)在銨處理過程中被除去，以從CPG支持物上除去寡聚物。試劑在胺基和3′末端磷酸之間引入7碳分支間隔基。供參考目的，本發(fā)明人將這個(gè)間隔基稱作L1。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，固相支持體上有許多其它形式的改性劑試劑用于引入具有不同間隔基的胺，或引入胺以外的不同活性基團(tuán)。
含有胺的亞磷酰胺試劑包括保護(hù)的氨基脫氧核苷和保護(hù)的氨基改性劑的亞磷酰胺。最廣泛使用同時(shí)也最便宜的保護(hù)的氨基脫氧核苷的亞磷酰胺是三氟乙酰氨基-2′-脫氧胸腺嘧啶的亞磷酰胺，或氨基改性劑C6dT，其在表1給出的一些實(shí)施例中用于制造T改性的寡核苷酸。如下顯示的是氨基改性劑C6dT的結(jié)構(gòu) (具有L2間隔基)這個(gè)試劑在dT和胺基之間或dT和染料之間引入10原子的直鏈脂肪族間隔基。供參考目的，本發(fā)明人將這個(gè)間隔基稱作L2。
或者，在自動(dòng)合成的最后步驟使用保護(hù)的胺的亞磷酰胺可引入胺到5′末端。兩種氨基改性劑試劑，5′-氨基-改性劑C6-TFA和5′-氨基-改性劑C12用于合成本說明書公開的5′-末端標(biāo)記的寡核苷酸。結(jié)構(gòu)如下所示 (具有L3間隔基)
(具有L4間隔基)供參考目的，5′-氨基-改性劑C6-TFA的直鏈6-碳間隔基稱為L(zhǎng)3，類似地5′-氨基-改性劑C12的直鏈12-碳間隔基稱為L(zhǎng)4。
有許多其它形式的改性劑試劑可用于引入具有不同間隔基的胺，或引入胺以外的不同活性基團(tuán)。
染料標(biāo)記的寡核苷酸的合成通過向以～1mg/ml溶解在0.1M NaHCO3(pH 8.5)中的氨基寡聚物添加～40mg/ml琥珀酰亞胺酯染料(Biotium公司，Hayward，CA)的DMF溶液，和在室溫下渦旋振蕩所述溶液大約2小時(shí)而進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)。染料NHS酯對(duì)寡聚物中的各氨基的摩爾比為大約20-40∶1。未反應(yīng)的染料通過Sephadex G-25離心柱被有效的除去。因此獲得的粗產(chǎn)物通過HPLC進(jìn)行進(jìn)一步純化(見下文)。
標(biāo)記的寡核苷酸的純化在Hitachi D7000 HPLC系統(tǒng)上通過反相HPLC純化標(biāo)記的寡核苷酸。
通常的HPLC條件柱C18 YMC ODS-A 5μm 12nm 150×4.6mm，或C18 Microsorb 5μm 30nm 200×4.6。
柱溫度45℃梯度在20min到30min內(nèi)以1ml/min從10％B到50％B。
A100mM TEAA PH7.0；B100％CH3CN。
測(cè)定標(biāo)記程度在分光光度計(jì)上測(cè)量純化的染料標(biāo)記的寡核苷酸從230nm到700nm的吸收，其中測(cè)定染料的λmax(Amax)和A260。染料的濃度通過測(cè)量Amax值而測(cè)定，而寡核苷酸濃度根據(jù)染料在260nm的吸收后的A260相乘而計(jì)算。染料與寡聚物濃度的比率定義了標(biāo)記程度(DOL)。在本發(fā)明人的試驗(yàn)中，單標(biāo)記的DOL接近1(如圖4B和4C)，而雙標(biāo)記則接近2(如圖4A)。根據(jù)這一計(jì)算，本發(fā)明人總結(jié)出本發(fā)明詳述的雙標(biāo)記或單標(biāo)記的探針或引物通常純度大于90到95％。
實(shí)施例2使用雙標(biāo)記的探針監(jiān)測(cè)MCG基因擴(kuò)增這個(gè)實(shí)施例的第一組實(shí)驗(yàn)顯示雙6-ROX標(biāo)記的探針在RT-PCR檢測(cè)MCG基因中的應(yīng)用。擴(kuò)增在含有10mM Tris(pH 8.0)，50mM KCl，3.5mM MgCl2，2mM各dNTP，和1單位AmpliTaq Gold(ABI，F(xiàn)osterCity，CA)的20μl反應(yīng)溶液中進(jìn)行。以0.5μM正向引物5′-TCAAGAGGTGCCACGTCTCC-3′(SEQ ID No.4)，0.5μM反向引物5′-CTGATCTGTCTCAGGACTCTGACACTGT-3′(SEQ ID No.5)擴(kuò)增pTOPO質(zhì)粒中的MCG基因片段(SEQ ID No.25)。雙6-ROX-標(biāo)記的MCG 探針，5′-(6-ROX-L3-CAGCACAACT ACGCAGCGCCTCC-(L1-6-ROX)-3′(SEQ ID 6，參見表1)用于以下反應(yīng)。加熱方案設(shè)定為95℃，7分鐘，隨后為95℃15秒和60℃20秒的50次循環(huán)。在60℃步驟時(shí)測(cè)量熒光。對(duì)模板進(jìn)行系列10倍稀釋以產(chǎn)生擴(kuò)增圖的滴定曲線。圖2A顯示以107個(gè)拷貝模板開始上述反應(yīng)的擴(kuò)增圖(跡線1)直至101個(gè)拷貝模板開始上述反應(yīng)的擴(kuò)增圖(跡線7)。兩個(gè)NTC(無模板對(duì)照，跡線8和9)也顯示在圖中。插圖顯示Ct值與起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)反相關(guān)(跡線10)。
在第二組實(shí)驗(yàn)中，探針(SEQ ID No 36)用非磺酸化花青素染料雙標(biāo)記，實(shí)驗(yàn)在兩個(gè)模板濃度100,000拷貝(跡線151)和0拷貝(跡線152)下進(jìn)行。所有其它的試劑和條件同第一組實(shí)驗(yàn)。這組實(shí)驗(yàn)顯示雙花青素標(biāo)記的探針在RT-PCR檢測(cè)MCG基因中的應(yīng)用。
實(shí)施例3使用6-CR110雙標(biāo)記的探針監(jiān)測(cè)從復(fù)雜模板擴(kuò)增MCG和GAPDH基因如實(shí)施例2的操作從人基因組DNA擴(kuò)增MCG基因片段，除了(1)6-CR110探針，5′-(6CR110-L3)-CAGCACAACT ACGCAGCGCCTCC-(L1-6-CR110)-3′(SEQ ID NO.7，參見表1)和(2)使用系列10倍稀釋的人DNA。圖2B顯示以105個(gè)拷貝人DNA開始上述反應(yīng)的擴(kuò)增圖(跡線11)直至101個(gè)拷貝人DNA開始上述反應(yīng)的擴(kuò)增圖(跡線15)。NTC(跡線16)也顯示在圖中。插圖顯示Ct值與起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)反相關(guān)(跡線17)。
如上所述使用cDNA作為模板進(jìn)行另一個(gè)滴定(圖2C)，除了使用GAPDH引物，5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′(SEQ ID No.1)和5′-GAAGATGGTGATGGGATTTTC-3′(SEQ ID No.2)，和GAPDH探針，5′-(6CR110-L3-)CAAGCTTCCCGTTCTCAGC(-L1-6CR110)-3′(SEQ IDNo.21)。以0.2μl人腦cDNA(Invitrogen，Carlsbad，CA)開始，進(jìn)行系列2倍稀釋。所有PCR反應(yīng)在10μl體系中進(jìn)行。加熱方案為95℃(7分鐘)，45次循環(huán)的95℃(15秒)和56℃(20秒)。
實(shí)施例4TaqMan探針與本發(fā)明雙標(biāo)記的探針的比較從含有GAPDH基因片段(SEQ ID NO.24，表1)的pTOPO質(zhì)粒使用正向引物5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′(SEQ ID NO.1，表1)和反向引物5′-GAAGATGGTGATGGGATTTTC-3′(SEQ ID NO.2，表1)擴(kuò)增GAPDH基因片段。以JOE作為報(bào)告染料和TAMRA作為淬滅劑的TaqMan探針5′-(6-JOE-L3-)CAAGCTTCCCGTTCTCAGC(-L1-6-TAMAR)-3′SEQ ID NO.8，參見表1)或本發(fā)明雙標(biāo)記5-R6G的探針(5′-(5-R6G-L3-)CAAGCTTCCCGTTCTCAGC(-L1-5-R6G)-3′SEQID No.9，參見表1)用于監(jiān)測(cè)該反應(yīng)，反應(yīng)條件與實(shí)施例2中相同，除了退火/延伸溫度降低至56℃。
所有的擴(kuò)增反應(yīng)以一百萬(wàn)個(gè)拷貝模板，和各探針濃度分別125nM，250nM和500nM進(jìn)行。如圖3A所示，根據(jù)本發(fā)明制造的探針信號(hào)強(qiáng)度是相應(yīng)TagMan探針的兩倍(跡線18對(duì)比21，跡線19對(duì)比22，和跡線20對(duì)比23)。R6G和JOE具有可比較的光譜以及相似的熒光子產(chǎn)率和消光系數(shù)。因此，觀察到的兩個(gè)探針之間的性能差異不是由于染料本身而是反映本發(fā)明探針的優(yōu)良設(shè)計(jì)。
制造5′末端具有FAM和3′末端具有TAMRA的FAM標(biāo)記的MCG TaqMan探針，并與具有相同序列的雙標(biāo)記的CR110探針(5′-(6CR110-L3-)CAGCACAACT ACGCAGCGCC TCC(-L1-6CR110)-3′(SEQ ID NO.7)在PCR中相比較。圖3B顯示分別為1000nM(跡線115對(duì)比跡線119)，500nM(跡線116對(duì)比跡線120)，250nM跡線117對(duì)比跡線121)，和125nM(跡線118對(duì)比跡線122)的上述同型雙標(biāo)記的CR 110探針與TaqMan探針的擴(kuò)增圖。所有的擴(kuò)增從一百萬(wàn)個(gè)拷貝含有MCG片段的質(zhì)粒開始。在飽和濃度(1000nM)，同型雙標(biāo)記的探針比TaqMan探針的信號(hào)強(qiáng)度強(qiáng)60％。雙標(biāo)記的CR110探針使用TaqMan探針的一半濃度而獲得相同信號(hào)強(qiáng)度。
現(xiàn)在由ABI以引物和探針的20x混合物形式提供FAM標(biāo)記的cMyc TaqMan探針。探針具有未公開的序列并包括位于其3′末端的MGB。對(duì)TaqMan探針和雙標(biāo)記CR110的探針(5′-(6CR110-L3-)CAGCACAACT ACGCAGCGCC TCC(-L1-6CR110)-3′(SEQ ID NO.7)進(jìn)行比較。圖3C顯示所述TaqMan探針(跡線110)和1000nM(跡線111)，500nM(跡線112)，250nM(跡線113)和125nM(跡線114)的同型雙標(biāo)記的CR110探針的擴(kuò)增圖。所有的擴(kuò)增使用相同濃度的來自Invitrogen的人腦cDNA。在飽和濃度(1000nM)，同型雙標(biāo)記的探針比TaqMan探針的信號(hào)強(qiáng)度強(qiáng)。摻入MGB可以進(jìn)一步提高本發(fā)明探針的性能。
實(shí)施例5雙染料標(biāo)記的和單染料標(biāo)記的寡核苷酸的UV/Vis吸收光譜以及其S1核酸酶消化的寡核苷酸這個(gè)實(shí)驗(yàn)的目的是證明在根據(jù)本發(fā)明標(biāo)記有兩個(gè)報(bào)告染料的寡核苷酸的染料之間沒有物理接觸。為了證明染料不必彼此接觸，本發(fā)明人合成了3種相同序列的CR110-標(biāo)記的寡核苷酸1)在3′和5′雙標(biāo)記的GAPDH探針(SEQ ID No.3，表1)；2)在5′單標(biāo)記的GAPDH探針序列(SEQ ID No.7，表1)；以及3)在3′單標(biāo)記的GAPDH探針序列(SEQ IDNo.8，表1)。兩個(gè)單標(biāo)記的寡核苷酸被制備用作對(duì)照。
S1緩沖液中的三種標(biāo)記的寡核苷酸的光譜分別顯示在圖4A(跡線29)，4B(跡線31)以及4C(跡線33)。為評(píng)價(jià)染料的光譜怎樣受到染料周圍微環(huán)境的影響，用S1消化標(biāo)記的寡核苷酸然后測(cè)量光譜(圖4A(跡線28)，4B(跡線30)和4C(跡線32))。通過添加20單位S1核酸酶(Promega，Madison，WI)到含有250到500nM探針的S1緩沖液(50mM乙酸鈉(pH 4.5)，280mM NaCl，和4.5mM ZnSO4)的100μl反應(yīng)溶液中而進(jìn)行消化。S1消化幾乎在添加S1后立刻完成，可以通過后面的UV/Vis吸收光譜的變化而證實(shí)。然而，在37℃溫育1小時(shí)后測(cè)量光譜以保證完全消化。
如圖所示，所有的三種標(biāo)記的寡核苷酸在可見光波長(zhǎng)范圍具有幾乎相同的吸收光譜，表明雙標(biāo)記的探針沒有染料聚集物，其特征通常為吸收光譜形狀或分布圖的顯著變化(參見實(shí)施例7)。雙標(biāo)記的探針的形狀(圖4A，跡線29)和消化探針的形狀(圖4A，跡線28)相仿的事實(shí)進(jìn)一步證明沒有形成染料二聚體。從跡線29到跡線28總體波長(zhǎng)的輕微位移，與吸收峰值形狀的改變相反，是由于染料周圍微環(huán)境的差異，類似于溶劑效應(yīng)。可以預(yù)料，這個(gè)“溶劑效應(yīng)”對(duì)于所有的三種標(biāo)記的寡核苷酸是相似的(圖4A跡線28對(duì)比跡線29；圖4B跡線30對(duì)比跡線31；和圖4C跡線32對(duì)比跡線33)。
實(shí)施例6用同型雙標(biāo)記的探針和兩個(gè)單標(biāo)記的對(duì)照寡核苷酸監(jiān)測(cè)的GAPDH的擴(kuò)增這個(gè)實(shí)驗(yàn)的目的是證明本發(fā)明探針的優(yōu)越性能不是由于采用的染料任何的獨(dú)特性，而是在于新穎的探針設(shè)計(jì)。本發(fā)明人合成三種標(biāo)記的寡核苷酸，它們均具有相同的GAPDH探針序列1)用5-CR110在3′和5末端雙標(biāo)記的GAPDH寡聚物(SEQ ID NO.3，表1)；2)用5-CR110在5′末端單標(biāo)記的GAPDH寡聚物(SEQ ID NO.10，表1)；和3)用5-CR110在3′末端單標(biāo)記的GAPDH寡聚物(SEQ ID NO.11，表1)。然后測(cè)試標(biāo)記的寡核苷酸作為潛在的探針，使用與實(shí)施例3相同的條件，用于擴(kuò)增GAPDH基因片段的實(shí)用性。
圖4D顯示使用3種標(biāo)記的寡核苷酸作為潛在的探針擴(kuò)增GAPDH基因的動(dòng)態(tài)圖。雙標(biāo)記的探針產(chǎn)生典型的動(dòng)態(tài)圖(圖4D跡線34)，而在相同擴(kuò)增條件下兩種單標(biāo)記的寡核苷酸不對(duì)應(yīng)于擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)(圖4D跡線35和36)。所有三個(gè)反應(yīng)的成功的基因擴(kuò)增通過瓊脂糖凝膠電泳使用溴化乙錠作為染色劑證實(shí)。因此，缺乏來自單標(biāo)記的寡核苷酸的反應(yīng)不是由缺少擴(kuò)增產(chǎn)物引起的。這些結(jié)果提示根據(jù)本發(fā)明各種實(shí)施方案制造的探針的優(yōu)良性能是探針設(shè)計(jì)新穎的結(jié)果。改進(jìn)不是由染料的獨(dú)特性質(zhì)或單獨(dú)的染料連接到寡核苷酸的方式或通過染料和寡核苷酸之間的相互作用引起的。
實(shí)施例7本發(fā)明同型雙標(biāo)記的探針與相似的分子信標(biāo)探針的光譜比較這里本發(fā)明人比較本發(fā)明具有報(bào)告染料的雙標(biāo)記的探針與根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)具有物理上接觸的染料對(duì)的探針的吸收光譜。目的是進(jìn)一步證明與現(xiàn)有技術(shù)的探針不同，本發(fā)明雙標(biāo)記的探針不形成染料聚集物。
合成3′和5′末端分別具有胺基的GAPDH莖環(huán)序列，5′-(Am-L3-)CCAAGCGGCTGAGAACGGGAAGCTTGGCTTGG(-L1-Am)-3′，其中在下面劃線的核苷酸表示形成莖的序列。然后這個(gè)胺改性的序列通過分別與6-CR110(SEQ ID No 12，表1))，6-TAMRA(SEQID No 13，表1)和6-ROX(SEQ ID No 14，表1)的琥珀酰亞胺酯反應(yīng)，用于合成三種同型雙標(biāo)記的分子信標(biāo)探針。同樣，本發(fā)明三種對(duì)應(yīng)的同型雙標(biāo)記的探針通過將雙胺改性的序列(Am-L3-)CAAGCTTCCCGTTCTCAGC(-L1-Am)分別與6-CR 110((SEQ ID No 21，表1)，6-TAMRA(SEQ ID No 22，表1)和6-ROX(SEQ ID No 23，表1)的琥珀酰亞胺酯反應(yīng)而制造。以～0.5μM在10mM Tris緩沖液(pH 8.0)中、25℃下和Shimadzu 1201 UV/Vis光譜儀上測(cè)量本發(fā)明的上述莖環(huán)探針和其對(duì)應(yīng)物的光譜。為比較的方便，各對(duì)信標(biāo)探針和本發(fā)明的對(duì)應(yīng)探針分別顯示在圖5A，5B和5C中。所有同型雙標(biāo)記的信標(biāo)探針顯示較短的波長(zhǎng)肩峰，其表明形成染料二聚體(Blackman等，2002，Biochemistry；Packard等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.)。另一方面，本發(fā)明的探針光譜類似于單標(biāo)記的寡核苷酸或消化的標(biāo)記的寡核苷酸的光譜(參見實(shí)施例5)。
實(shí)施例8本發(fā)明雙標(biāo)記的探針與對(duì)應(yīng)的同型雙標(biāo)記的信標(biāo)探針信號(hào)強(qiáng)度的比較這個(gè)實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明同型雙標(biāo)記的探針比對(duì)應(yīng)的雙標(biāo)記的信標(biāo)探針要靈敏數(shù)倍。
使用與實(shí)施例4相同的引物和條件自含有GAPDH基因片段(SEQID No.24)的pTOPO質(zhì)粒擴(kuò)增GAPDH基因。來自實(shí)施例7的六種探針各自(三種本發(fā)明同型雙標(biāo)記的探針和三種對(duì)應(yīng)的信標(biāo)探針)以四種不同探針濃度125nM，250nM，500nM和1mM用于擴(kuò)增反應(yīng)。進(jìn)行額外的擴(kuò)增循環(huán)以保證所有的反應(yīng)完全。此外，凝膠電泳顯示所有三個(gè)反應(yīng)形成等量的擴(kuò)增PCR產(chǎn)物。本發(fā)明同型雙標(biāo)記的探針和有關(guān)的信標(biāo)探針各對(duì)的動(dòng)態(tài)圖分別示在圖6A，6B和6C。
圖6A，6B和6C的數(shù)據(jù)清楚地顯示本發(fā)明的探針比對(duì)應(yīng)的信標(biāo)探針在相同濃度使用時(shí)要靈敏數(shù)倍。圖中還顯示信標(biāo)探針即使在1mM濃度也沒有變得完全飽和，而本發(fā)明有關(guān)探針顯示在250nM或附近飽和。這種滯后的飽和是由于開放和閉合的信標(biāo)構(gòu)型之間的平衡，其使得在給定時(shí)刻只有探針總數(shù)的一小部分有效與靶序列雜交(圖7)。
實(shí)施例9標(biāo)記有FAM和CR110混合物的探針這個(gè)實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明的寡核苷酸可以標(biāo)記有報(bào)告染料的混合物。
為合成標(biāo)記有單個(gè)6-FAM和單個(gè)6-CR110的探針，將雙胺改性的GAPDH探針序列5′-(Am-L3-)CAAGCTTCCCGTTCTCAGC(-L1-Am)-3′與6-FAM SE和6-CR110 SE的1∶1混合物反應(yīng)。標(biāo)記反應(yīng)產(chǎn)生四種雙標(biāo)記的產(chǎn)物1)5′-(6-FAM-L3-)CAAGCTTCCCGTTCTCAGC(-L1-6-FAM)-3′；2)5′-(6-FAM-L3-)CAAGCTTCCCGTTC予TCAGC(-L1-6-CR110)-3′；3)5′-(6-CR110-L3-)CAAGCTTCCCGTTCTCAGC(-L1-6-FAM)-3′；4)5′-(6-CR110-L3-)CAAGCTTCCCGTTCTCAGC(-L1-6-CR110)-3′。產(chǎn)物通過C18RP HPLC純化，對(duì)應(yīng)于產(chǎn)物1)和4)的峰通過比較單獨(dú)制備產(chǎn)物的HPLC保留時(shí)間而鑒定。在產(chǎn)物1)和產(chǎn)物4)的保留時(shí)間之間的峰被分配為那些兩個(gè)異型雙標(biāo)記的探針，收集級(jí)分并通過UV/Vis分光術(shù)分析。圖8A顯示產(chǎn)物1)(跡線80)，產(chǎn)物2)和3)(跡線81)和產(chǎn)物4)(跡線82)的UV/Vis譜。異型雙標(biāo)記的探針(產(chǎn)物2)和3)的光譜落入兩個(gè)同型雙標(biāo)記的探針的光譜之間，正如預(yù)料的那樣。分離的探針然后被用作在與實(shí)施例4使用的相同條件下擴(kuò)增GAPDH基因的探針。圖8B顯示使用分離的探針擴(kuò)增GAPDH基因的動(dòng)態(tài)圖。
或者，異型雙標(biāo)記的寡核苷酸可以經(jīng)由合成基于FRET的探針或引物的傳統(tǒng)方法通過在單獨(dú)的步驟中連接染料而制造。然而，這個(gè)實(shí)施例描述的合成步驟可以作為迅速篩選最適合染料對(duì)的途徑，所述染料對(duì)可產(chǎn)生標(biāo)記的寡核苷酸的最佳性能。
實(shí)施例10同型雙標(biāo)記的引物這些實(shí)驗(yàn)顯示了本發(fā)明的寡核苷酸作為監(jiān)測(cè)RT-PCR的熒光引物的應(yīng)用。
在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，用于GAPDH基因擴(kuò)增的熒光正向引物(5′-(5-CR 110-L3-)GAAGGTGAAGGTCGGAGT(-L2-5-CR110)C-3′，SEQNo.15，表1)通過將5-CR110SE與雙胺改性的引物5′-(Am-L3-)GAAGGTGAAGGTCGGAGT(-L2-Am)C-3′反應(yīng)而合成，其中一個(gè)胺通過C6脂肪族接頭連接到5′磷酸，而另一胺通過10原子的脂肪族接頭連接到NO.18脫氧核苷dT的堿基(合成細(xì)節(jié)參見實(shí)施例1)。使用與實(shí)施例4中相同的條件進(jìn)行GAPDH基因擴(kuò)增，除了1)不使用探針；2)正向引物被上述同型雙標(biāo)記的熒光引物取代；和3)使用三種模板拷貝數(shù)一百萬(wàn)，一千和零(對(duì)照)。圖9A顯示擴(kuò)增分布圖，其中跡線87，88和89分別代表模板拷貝為一百萬(wàn)，一千和NTC。
在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明人合成與上述正向熒光引物相同的另一雙標(biāo)記的熒光引物，除了恰好在5′末端刪除G，(5′-(5-CR110-L3-)AAGGTGAAGGTCGGAGT(-L2-5-CR 110)C-3′，SEQ ID No 16，表1)。相似的，使用與第一個(gè)實(shí)驗(yàn)相同的三種模板拷貝數(shù)進(jìn)行PCR反應(yīng)。圖9B顯示擴(kuò)增分布圖，其中跡線90，91，和92分別代表模板拷貝數(shù)為一百萬(wàn)，一千和零。結(jié)果表明本發(fā)明同型雙標(biāo)記的引物的成功應(yīng)用不是由于G核苷酸相關(guān)的熒光淬滅/去淬滅，LUX引物的工作機(jī)制(Nazarenko等，2002，Nucleic Acid Research)。
在第三個(gè)實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明人通過將5-CR110 SE與雙胺改性的反向引物5′-(Am-L2-)GAAGATGGTGATGGGATT(-L2Am)TC-3′反應(yīng)而合成了同型雙標(biāo)記的反向引物5′-(5-CR110-L3-)GAAGATGGTGATGGGATT(-L35-CR110)TC-3′(SEQNo 17，表1)，其中一個(gè)胺通過C6脂肪族接頭連接到5′磷酸，而另一胺通過10原子脂肪族接頭連接到NO.18核苷酸dT的堿基。相似的，使用與第一個(gè)實(shí)驗(yàn)相同的條件擴(kuò)增GAPDH基因，除了1)使用一般的正向引物和2)使用上述同型雙標(biāo)記的反向引物。圖9C顯示擴(kuò)增分布圖，其中跡線93，94，和95分別代表模板拷貝數(shù)為一百萬(wàn)，一千和零。來自第一個(gè)和第二個(gè)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)表明無論是正向引物還是反向引物可以根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行熒光標(biāo)記用于檢測(cè)核酸。
為排除由染料與和靶雜交前后的寡核苷酸之間相互作用的差異引起同型雙標(biāo)記的引物熒光淬滅/去淬滅的可能性，本發(fā)明人合成了兩種對(duì)照引物，一種具有單個(gè)5′末端標(biāo)記物(5′-(5-CR110-L3-)GAAGGTGAAG GTCGGAGTC-3′，SEQ No 18，表1)，另一種具有通過10原子接頭連接到No.17dT的堿基的單個(gè)5-CR110(5′-(AAGGTGAAGG TCGGAGT(-L2-5-CR110)C)-3′，SEQ No19，表1)。如圖9D和9E所示，5′末端標(biāo)記的引物(圖9D的跡線97)或dT-標(biāo)記的引物(圖9E的跡線99)都沒有對(duì)PCR反應(yīng)作出反應(yīng)，盡管終產(chǎn)物的凝膠電泳顯示兩個(gè)PCR反應(yīng)都正常進(jìn)行。
在另一個(gè)對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明人合成了具有染料5-CR110通過10原子的柔性接頭連接到No.18dT核苷酸的單標(biāo)記的正向引物(5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGT(-L2-5-CR110)C-3′，SEQ No 20，表1)。與實(shí)驗(yàn)1)和3)的同型雙標(biāo)記的引物類似，當(dāng)該引物被引入PCR產(chǎn)物后其的確對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)作出反應(yīng)。對(duì)于這一觀察可能的解釋是，恰好5′末端的dG核苷酸可以成環(huán)至3′末端上方以淬火熒光團(tuán)，正如LUX引物中的情形一樣(圖9F)。為檢測(cè)這個(gè)假說，本發(fā)明人合成了單標(biāo)記的正向引物，其5′-末端dG被除去(5′-AAGGTGAAGGTCGGAGT(-L2-5-CR110)C-3′，SEQ No 19，表1)。如圖9E所示，該引物不能對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)作出反應(yīng)。這個(gè)結(jié)果，加上本實(shí)施例第二個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，表明在缺少核苷酸G相關(guān)的熒光下，本發(fā)明淬滅/去淬滅的熒光寡核苷酸需要至少兩種報(bào)告染料。
實(shí)施例11利用一對(duì)同型雙標(biāo)記探針的SNP分型Tapp等人顯示使用一對(duì)TaqMan探針進(jìn)行SNP分型，該探針各自對(duì)于在雌激素受體基因密碼子10的C到T的轉(zhuǎn)換分別標(biāo)記有FAM和TET。這個(gè)實(shí)驗(yàn)證明一對(duì)AllGlo標(biāo)記有CR110或R6G、分別代替FAM和TET的探針，同樣能實(shí)現(xiàn)上述目的。
SNP分型反應(yīng)在20μl反應(yīng)體系中進(jìn)行，包含10mM Tris(pH 8.0)，50mM KCl，3.5mM MgCl2，2mM各dNTP，1單位AmpliTaq Gold(ABI，F(xiàn)oster City，CA)，0.5μM正向引物5′-CCACGGACCATGACCATGA-3′(SEQ ID NO.26)，0.5μM反向引物5′-TCTTGAGCTGCGGACGGT-3′(SEQ ID NO.27)，0.2μMERcodon10C探針，5′-(6-CR110-L3-CCAAAGCATCCGGGATGGCC(-L1-6-CR110)-3′(SEQ ID No.28)，2μM ERcodon10T探針，5′-(5-R6G-L3-CCAAAGCATCTGGGATGGCC(-L1-5-R6G)-3′(SEQ IDNo.29)，和待分型的模式質(zhì)粒DNA。反應(yīng)圖設(shè)定在95℃7分鐘，隨后95℃15秒和60℃20秒進(jìn)行50次循環(huán)。在60℃步驟同時(shí)測(cè)量來自FAM和TET通道的熒光。純合子CC模型基因型的組成為106拷貝的質(zhì)粒pER(C)，含有位于雌激素受體基因密碼子10側(cè)翼的106bp插入物的pTOPO質(zhì)粒，其中SNP是C(SEQ ID No.30)；純合子TT模型基因型的組成為106拷貝的質(zhì)粒pER(T)，含有雌激素受體基因密碼子10側(cè)翼的106bp插入物的pTOPO質(zhì)粒，其中SNP是T(SEQ ID No.31)；雜合子CT基因型的組成為0.5×105拷貝的pER(C)和0.5×105拷貝的pER(T)。三種基因型顯示三種相異的擴(kuò)增分布圖模式，這些模式如下純合子CC有高CR110信號(hào)(跡線131，圖10A)和非常低的R6G信號(hào)(跡線132，圖10A)；純合子TT具有低CR 110信號(hào)(跡線135，圖10C)和高R6G信號(hào)(跡線136，圖10C)；雜合子CT具有中等水平CR 110信號(hào)(跡線133，圖10B)和中等水平R6G信號(hào)(跡線134，圖10B)。
實(shí)施例12使用Exo-DNA聚合酶的擴(kuò)增這個(gè)實(shí)驗(yàn)證明exo-DNA聚合酶在實(shí)時(shí)PCR中的應(yīng)用，其中通過雜交代替切割探針而監(jiān)測(cè)所述熒光信號(hào)。擴(kuò)增在含有預(yù)混合的緩沖液和Titanium Taq(BD Biosciences，Mountain View，CA)的20μl反應(yīng)溶液中進(jìn)行。擴(kuò)增pTOPO質(zhì)粒中的HCV基因片段(SEQ ID 32)，使用2μM正向引物5′-GCACGAATCCTAAACCTCAAAA-3′(SEQ IDNo.33)，0.2μM反向引物5′-GGCAACAAGTAAACTCCACCAA-3′(SEQ ID No.34)。終濃度0.5μM的雙6-ROX-標(biāo)記的HCV探針，5′-(6-ROX-L3-ATCTGACCACCGCCCGGGAAC-(-L1-6-ROX)-3′(SEQ IDNo.35)被用于各反應(yīng)中。加熱方案設(shè)定為95℃2分鐘，隨后95℃15秒，60℃20秒和72℃5分鐘運(yùn)行50次循環(huán)。在60℃步驟測(cè)量熒光。對(duì)模板進(jìn)行系列10倍稀釋以產(chǎn)生擴(kuò)增圖的滴定曲線。圖12顯示以106拷貝的模板(跡線140)直到1個(gè)拷貝的模板(跡線146)開始的上述反應(yīng)的擴(kuò)增圖。NTC(無模板對(duì)照，跡線148)也顯示在圖中。插入物顯示Ct值與起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)反相關(guān)(跡線148)。
本說明書中引用的所有的公開物，專利，和專利申請(qǐng)?jiān)诖颂幰鲄⒖?，正如各公開物，專利，或?qū)＠暾?qǐng)被特定和單獨(dú)地指定以其全文引作參考和闡述一樣。
除非特別鑒定為相反的結(jié)果，此處使用所有的術(shù)語(yǔ)用來包括其標(biāo)準(zhǔn)的和通常的專業(yè)名詞。此外，盡管此處描述和示例了具有特定的組分和步驟的診斷測(cè)試和醫(yī)療裝置的各種實(shí)施方案，應(yīng)當(dāng)理解可能的情況下任何選定的實(shí)施方案可以包括另一個(gè)實(shí)施方案中描述的一種或者多種特定的組分和/或步驟。
另外，所有此處陳述的操作理論，證據(jù)，或發(fā)現(xiàn)意在進(jìn)一步增強(qiáng)對(duì)本發(fā)明的理解，而不是用于使本發(fā)明的范圍依賴于這樣的理論，證據(jù)或發(fā)現(xiàn)。
雖然本發(fā)明已經(jīng)在附圖和前面的描述中有詳細(xì)的說明和描述，但這些應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為在性質(zhì)上是說明性的而不是限制性的，應(yīng)該理解只顯示和描述了優(yōu)選實(shí)施方案，而本發(fā)明精神的范圍內(nèi)所有的改變和修改都是應(yīng)該得到保護(hù)的。雖然本發(fā)明使用特定的實(shí)施例，和理論論據(jù)，蛋白質(zhì)和DNA序列，解釋和例證，來說明本發(fā)明，然而這些實(shí)施例，論據(jù)，示例，序列，解釋和相關(guān)的討論不應(yīng)以任何方式被認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明的限制。說明書的摘要被包括在內(nèi)是為了便于檢索本文件的目的，摘要不是發(fā)明概述，其不應(yīng)用于解釋或限制權(quán)利要求書或說明書。
序列表(1)GENERAL INFORMATION(iii)NUMBER OF SEQUENCES36(2)INFORMATION FOR SEQ ID NO1(i)SEQUENCE CHARACTERISTICS(A)LENGTH19bases(B)TYPEnucleic acid(C)STRANDEDNESSsingle-stranded(D)TOPOLOGYlinear(xi)SEQUENCE DESCRIPTIONSEQ ID NO1gaaggtgaag gtcggagtc(2)INFORMATION FOR SEQ ID NO2(i)SEQUENCE CHARACTERISTICS(A)LENGTH20bases(B)TYPEnucleic acid(C)STRANDEDNESSsingle-stranded(D)TOPOLOGYlinear(xi)SEQUENCE DESCRIPTIONSEQ ID NO2gaagatggtg atgggatttc(2)INFORMATION FOR SEQ ID NO3(i)SEQUENCE CHARACTERISTICS(A)LENGTH19bases(B)TYPEnucleic acid(C)STRANDEDNESSsingle-stranded(D)TOPOLOGYlinear(E)OTHER INFORMATION5CR110labeled at 5′-and 3′-terminal amines(xi)SEQUENCE DESCRIPTIONSEQ ID NO3caagcttccc gttctcagc(3)INFORMATION FOR SEQ ID NO4(i)SEQUENCE CHARACTERISTICS(A)LENGTH20bases(B)TYPEnucleic acid(C)STRANDEDNESSsingle-stranded(D)TOPOLOGYlinear(xi)SEQUENCE DESCRIPTIONSEQ ID NO4tcaagaggtg ccacgtctcc(2)INFORMATION FOR SEQ ID NO5
(i)SEQUENCE CHARACTERISTICS(A)LENGTH28bases(B)TYPEnucleic acid(C)STRANDEDNESSsingle-stranded(D)TOPOLOGYlinear(xi)SEQUENCE DESCRIPTIONSEQ ID NO5ctgatctgtc tcaggactct gacactgt(2)INFORMATION FOR SEQ ID NO6(i)SEQUENCE CHARACTERISTICS(A)LENGTH23bases(B)TYP Enucleic acid(C)STRANDEDNESSsingle-stranded(D)TOPOLOGYlinear(E)OTHER INFORMATION6ROX labeled at 5′-and 3′-terminal amines(xi)SEQUENCE DESCRIPT IONSEQ ID NO6cagcacaact acgcagcgcc tcc(2)INFORMATION FOR SEQ ID NO7(i)SEQUENCE CHARACTERISTICS(A)LENGTH23bases(B)TYPEnucleic acid(C)STRANDEDNESSsingle-stranded(D)TOPOLOGYlinear(E)OTHER INFORMATION6CR110 labeled at 5′-and 3′-terminal amine(xi)SEQUENCE DESCRIPTIONSEQ ID NO7cagcacaact acgcagcgcc tcc(2)INFORMATION FOR SEQ ID NO8(i)SEQUENCE CHARACTERISTICS(A)LENGTH19bases(B)TYPEnucleic acid(C)STRANDEDNESSsingle-stranded(D)TOPOLOGYlinear(E)OTHER INFORMATIONJOE labeled at 5′-terminal amine andTAMRA at at 3′-terminal amine(xi)SEQUENCE DESCRIPTIONSEQ ID NO8caagcttccc gttctcagc(2)INFORMATION FOR SEQ ID NO9(i)SEQUENCE CHARACTERISTICS(A)LENGTH19bases
(B)TYPEnucleic acid(C)STRANDEDNESSsingle-stranded(D)TOPOLOGYlinear(E)OTHER INFORMATION5R6G labeled at 5′-and 3′-terminal amine(xi)SEQUENCE DESCRIPTIONSEQ ID NO9caagcttccc gttctcagc(2)INFORMATION FOR SEQ ID NO10(i)SEQUENCE CHARACTERISTICS(A)LENGTH19bases(B)TYPEnucleic acid(C)STRANDEDNESSsingle-stranded(D)TOPOLOGYlinear(E)OTHER INFORMATION5CR110 labeled at 5′-terminal amines(xi)SEQUENCE DESCRIPTIONSEQ ID NO10caagcttccc gttctcagc(2)INFORMATION FOR SEQ ID NO11(i)SEQUENCE CHARACTERISTICS(A)LENGTH19bases(B)TYPEnucleic acid(C)STRANDEDNESSsingle-stranded(D)TOPOLOGYlinear(E)OTHER INFORMATION5CR 110 labeled at 3′-terminal amines(xi)SEQUENCE DESCRIPTIONSEQ ID NO11caagcttccc gttctcagc(2)INFORMATION FOR SEQ ID NO12(i)SEQUENCE CHARACTERISTICS(A)LENGTH32bases(B)TYPEnucleic acid(C)STRANDEDNESSsingle-stranded(D)TOPOLOGYstem loop(E)OTHERINFORMATION6CR110 labeled at 5′-and 3′-terminalamines(xi)SEQUENCE DESCRIPTIONSEQ ID NO12ccaagcggct gagaacggga agcttggctt gg(2)INFORMATION FOR SEQ ID NO13(i)SEQUENCE CHARACTERISTICS(A)LENGTH32bases(B)TYPEnucleic acid
(C)STRANDEDNESSsingle-stranded(D)TOPOLOGYstem loop(E)OTHER INFORMATION6TAMRA labeled at 5′-and 3′-terminalamines(xi)SEQUENCE DESCRIPTIONSEQ ID NO13ccaagcggct gagaacggga agcttggctt gg(2)INFORMATION FOR SEQ ID NO14(i)SEQUENCE CHARACTERISTICS(A)LENGTH32bases(B)TYPEnucleic acid(C)STRANDEDNESSsingle-stranded(D)TOPOLOGYstem loop(E)OTHER INFORMATION6ROX labeled at 5′-and 3′-terminal amines(xi)SEQUENCE DESCRIPTIONSEQ ID NO14ccaagcggct gagaacggga agcttggctt gg(2)INFORMATION FOR SEQ ID NO15(i)SEQUENCE CHARACTERISTICS(A)LENGTH19bases(B)TYPEnucleic acid(C)STRANDEDNESSsingle-stranded(D)TO POLOGYlinear(E)OTHER INFORMATION5CR110 Labeled at 5′-end amine and #18dT(xi)SEQUENCE DESCRIPTIONSEQ ID NO15gaaggtgaag gtcggagtc(2)INFORMATION FOR SEQ ID NO16(i)SEQUENCE CHARACTERISTICS(A)LENGTH18bases(B)TYPEnucleic acid(C)STRANDEDNESSsingle-stranded(D)TOPOLOGYlinear(E)OTHER INFORMATION5CR110 Labeled at 5′-terminal amine and#17 base of dT(xi)SEQUENCE DESCRIPTIONSEQ ID NO16aaggtgaagg tcggagtc(2)IN FORMATION FOR SEQ ID NO17(i)SEQUENCE CHARACTERISTICS(A)LENGTH20bases(B)TYPEnucleic acid
(C)STRANDEDNESSsingle-stranded(D)TOPOLOGYlinear(E)OTHER INFORMATION5CR110 labeled at 5′-terminal amine and# 17base of dT(xi)SEQUENCE DESCRIPTIONSEQ ID NO17gaagatggtg atgggatttc(2)INFORMATION FOR SEQ ID NO18(i)SEQUENCE CHARACTERISTICS(A)LENGTH19bases(B)TYPEnucleic acid(C)STRANDEDNESSsingle-stranded(D)TOPOLOGYlinear(E)OTHER INFORMATION5CR110 labeled at 5′-terminal amine(xi)SEQUENCE DESCRIPTIONSEQ ID NO18gaaggtgaag gtcggagtc(2)INFORMATION FOR SEQ ID NO19(i)SEQUENCE CHARACTERISTICS(A)LENGTH18bases(B)TYPEnucleic acid(C)STRANDEDNESSsingle-stranded(D)TOPOLOGYlinear(E)OTHER INFORMATION5CR110 labeled at #17 dT(xi)SEQUENCE DESCRIPTIONSEQ ID NO19aaggtgaagg tcggagtc(2)INFORMATION FOR SEQ ID NO20(i)SEQUENCE CHARACTERISTICS(A)LENGTH19bases(B)TYPEnucleic acid(C)STRANDEDNESSsingle-stranded(D)TOPOLOGYlinear(E)OTHER INFORMATION5CR110 Labeled at #18 dT(xi)SEQUENCE DESCRIPTIONSEQ ID NO20gaaggtgaag gtcggagtc(2)INFORMATION FOR SEQ ID NO21(i)SEQUENCE CHARACTERISTICS(A)LENGTH19bases(B)TYPEnucleic acid(C)STRANDEDNESSsingle-stranded(D)TOPOLOGYlinear
(E)OTHER INFORMATION6CR110 labeled at 5′-and 3′-terminal amines(xi)SEQUENCE DESCRIPTIONSEQ ID NO21caagcttccc gttctcagc(2)INFORMATION FOR SEQ ID NO22(i)SEQUENCE CHARACTERISTICS(A)LENGTH19bases(B)TYPEnucleic acid(C)STRANDEDNESSsingle-stranded(D)TOPOLOGYlinear(E)OTHER INFORMATION6TAMRA labeled at 5′-and 3′-terminalamines(xi)SEQUENCE DESCRIPTIONSEQ ID NO22caagcttccc gttctcagc(2)INFORMATION FOR SEQ ID NO23(i)SEQUENCE CHARACTERISTICS(A)LENGTH19bases(B)TYPEnucleic acid(C)STRANDEDNESSsingle-stranded(D)TOPOLOGYlinear(E)OTHER INFORMATION6ROX labeled at 5′-and 3′-terminal amines(xi)SEQUENCE DESCRIPTIONSEQ ID NO23caagcttccc gttctcagc(2)INFORMATION FOR SEQ ID NO24(i)SEQUENCE CHARACTERISTICS(A)LENGTH226bases(B)TYPEnucleic acid(C)STRANDEDNESSdouble-stranded(D)TOPOLOGYlinear(xi)SEQUENCE DESCRIPTIONSEQ ID NO24gaaggtgaag gtcggagtca acggatttgg tcgtattggg cgcctggtca ccagggctgc 60ttttaactct ggtaaagtgg atattgttgc catcaatgac cccttcattg acctcaacta 120catggtttac atgttccaat atgattccac ccatggcaaa ttccatggca ccgtcaaggc 180tgagaacggg aagcttgtca tcaatggaaa tcccatcacc atcttc226(2)INFORMATION FOR SEQ ID NO25(i)SEQUENCE CHARACTERISTICS(A)LENGTH181bases(B)TYPEnucleic acid(C)STRANDEDNESSdouble-stranded(D)TOPOLOGYlinear
(xi)SEQUENCE DESCRIPTIONSEQ ID NO25tcaagaggtg ccacgtctcc acacatcagc acaactacgc agcgcctccc tccactcgga 60aggactatcc tgctgccaag agggtcaagt tggacagtgt cagagtcctg agacagatca 120g 121(2)INFORMATION FOR SEQ ID NO26(i)SEQUENCE CHARACTERISTICS(A)LENGTH19bases(B)TYPEnucleic acid(C)STRANDEDNESSsingle-stranded(D)TOPOLOGYlinear(xi)SEQUENCE DESCRIPTIONSEQ ID NO26ccacggacca tgaccatga(2)INFORMATION FOR SEQ ID NO27(i)SEQUENCE CHARACTERISTICS(A)LENGTH18bases(B)TYPEnucleic acid(C)STRANDEDN ESSsingle-stranded(D)TOPOLOGYlinear(xi)SEQUENCE DESCRIPTIONSEQ ID NO27tcttgagctg cggacggt(2)INFORMATION FOR SEQ ID NO28(i)SEQUENCE CHARACTERISTICS(A)LENGTH20bases(B)TYPEnucleic acid(C)STRANDEDNESSsingle-stranded(D)TOPOLOGYlinear(E)OTHER IN FORMATION6CR110 labeled at 5′-and 3′-terminal amines(xi)SEQUENCE DESCRIPTIONSEQ ID NO28ccaaagcatc cgggatggcc(2)INFORMATION FOR SEQ ID NO29(i)SEQUENCE CHARACTERISTICS(A)LENGTH20bases(B)TYPEnucleic acid(C)STRANDEDNESSsingle-stranded(D)TOPOLOGYlinear(E)OTHER INFORMATION5-R6G labeled at 5′-and 3′-terminal amines(xi)SEQUENCE DESCRIPTIONSEQ ID NO29ccaaagcatc tgggatggcc
(2)INFORMATION FOR SEQ ID NO30(i)SEQUENCE CHARACTERISTICS(A)LENGTH106bases(B)TYPEnucleic acid(C)STRANDEDNESSdouble-stranded(D)TOPOLOGYlinear(xi)SEQUENCE DESCRIPTIONSEQ ID NO30ccacggacca tgaccatgac cctccacacc aaagcatccg ggatggccct actgcatcag 60atccaaggga acgagctgga gcccctgaac cgtccgcagc tcaaga106(2)INFORMATION FOR SEQ ID NO31(i)SEQUENCE CHARACTERISTICS(A)LENGTH106bases(B)TYPEnucleic acid(C)STRANDEDNESSdouble-stranded(D)TOPOLOGYlinear(xi)SEQUENCE DESCRIPTIONSEQ ID NO31ccacggacca tgaccatgac cctccacacc aaagcatctg ggatggccct actgcatcag 60atccaaggga acgagctgga gcccctgaac cgtccgcagc tcaaga106(2)INFORMATION FOR SEQ ID NO32(i)SEQUENCE CHARACTERISTICS(A)LENGTH109bases(B)TYPEnucleic acid(C)STRANDEDNESSdouble-stranded(D)TOPOLOGYlinear(xi)SEQUENCE DESCRIPTIONSEQ ID NO32gcacgaatcc taaacctcaa agaaaaacca aacgtaacac caaccgccgc ccacaggacg 60tcaagttccc gggcggtggt cagatcgttg gtggagttta cctgttgcc 109(2)INFORMATION FOR SEQ ID NO33(i)SEQUENCE CHARACTERISTICS(A)LENGTH22bases(B)TYPEnucleic acid(C)STRANDEDNESSsingle-stranded(D)TOPOLOGYlinear(xi)SEQUENCE DESCRIPTIONSEQ ID NO33gcacgaatcc taaacctcaa aa(2)INFORMATION FOR SEQ ID NO34(i)SEQUENCE CHARACTERISTICS(A)LENGTH22bases(B)TYPEnucleic acid(C)STRANDEDNESSsingle-stranded
(D)TOPOLOGYlinear(xi)SEQUENCE DESCRIPTIONSEQ ID NO34ggcaacaagt aaactccacc aa(2)INFORMATION FOR SEQ ID NO35(i)SEQUENCE CHARACTERISTICS(A)LENGTH21bases(B)TYPEnucleic acid(C)STRANDEDNESSsingle-stranded(D)TOPOLOGYlinear(E)OTHER INFORMATION6ROX labeled at 5′-and 3′-terminal amines(xi)SEQUENCE DESCRIPTIONSEQ ID NO35atctgaccac cgcccgggaa c(2)INFORMATION FOR SEQ ID NO36(i)SEQUENCE CHARACTERISTICS(A)LENGTH23bases(B)TYPEnucleic acid(C)STRANDEDNESSsingle-stranded(D)TOPOLOGYlinear(E)OTHER INFORMATIONnon-sulfonated Cy-5 labeled at 5′-and 3′-terminal amines(xi)SEQUENCE DESCRIPTIONSEQ ID NO36cagcacaact acgcagcgcc tcc62001-2314335v.1


權(quán)利要求
1.一種標(biāo)記的寡核苷酸，包括雜交到靶多核苷酸序列的寡核苷酸序列；和至少兩種連接到所述寡核苷酸的光度標(biāo)記分子；其中所述至少兩種光度標(biāo)記分子的激發(fā)波長(zhǎng)彼此在15nm以內(nèi)。
2.權(quán)利要求1的標(biāo)記的寡核苷酸，其中所述光度標(biāo)記分子中的至少兩種當(dāng)它們彼此分開時(shí)產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)改變。
3.權(quán)利要求2的標(biāo)記的寡核苷酸，其中當(dāng)所述標(biāo)記的寡核苷酸在至少兩種光度分子之間的位置被切割時(shí)，所述至少兩種光度分子彼此分開。
4.權(quán)利要求2的標(biāo)記的寡核苷酸，其中當(dāng)所述標(biāo)記的寡核苷酸雜交到靶序列時(shí)，所述至少兩種光度分子彼此分開。
5.權(quán)利要求2的標(biāo)記的寡核苷酸，其中當(dāng)所述標(biāo)記的寡核苷酸摻入到多核苷酸時(shí)，所述至少兩種光度標(biāo)記分子彼此分開。
6.權(quán)利要求2的標(biāo)記的寡核苷酸，其中所述兩種光度分子在從所述標(biāo)記的寡核苷酸上切割時(shí)彼此分開。
7.權(quán)利要求1的標(biāo)記的寡核苷酸，其中所述至少兩種光度標(biāo)記分子是熒光分子。
8.權(quán)利要求1的標(biāo)記的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸上任意對(duì)的所述光度標(biāo)記分子彼此分開大約3到大約60個(gè)核苷酸。
9.權(quán)利要求1的標(biāo)記的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸上任意對(duì)的所述光度標(biāo)記分子彼此分開大約12到大約35個(gè)核苷酸。
10.權(quán)利要求1的標(biāo)記的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸上任意對(duì)的所述光度標(biāo)記分子彼此分開大約15到大約25個(gè)核苷酸。
11.權(quán)利要求1的標(biāo)記的寡核苷酸，還包括至少一種連接到所述寡核苷酸的淬滅分子，其中當(dāng)所述至少兩種光度標(biāo)記分子連接到所述寡核苷酸時(shí)，所述淬滅分子淬滅由所述至少兩種光度標(biāo)記分子產(chǎn)生的信號(hào)。
12.權(quán)利要求1的標(biāo)記的寡核苷酸，其中所述至少兩種光度標(biāo)記分子中的至少一種是熒光染料，選自具有離域正電荷的染料，具有離域負(fù)電荷的染料，和具有等量正負(fù)電荷的染料。
13.權(quán)利要求1的標(biāo)記的寡核苷酸，其中所述至少兩種光度標(biāo)記分子中的至少一種是選自BODIPY，具有離域正電荷的花青素染料和兼性花青素染料的染料。
14.權(quán)利要求1的標(biāo)記的寡核苷酸，其中所述至少兩種光度標(biāo)記分子中的至少一種是呫噸染料分子。
15.權(quán)利要求1的標(biāo)記的寡核苷酸，其中所述至少兩種光度標(biāo)記分子中的至少一種是非磺酸化花青素染料分子。
16.權(quán)利要求1的標(biāo)記的寡核苷酸，其中所述至少兩種光度標(biāo)記分子中的至少一種是選自CR110，CR6G，TAMRA和ROX的染料。
17.權(quán)利要求1的標(biāo)記的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸還包括至少一種小溝結(jié)合劑(MGB)。
18.權(quán)利要求1的標(biāo)記的寡核苷酸，包括所述寡核苷酸中的至少一個(gè)胍核苷酸，其中所述至少兩種光度標(biāo)記分子中的至少一種足夠靠近所述胍核苷酸，以便當(dāng)所述寡核苷酸沒有雜交到所述靶寡核苷酸時(shí)由至少一種標(biāo)記分子產(chǎn)生的信號(hào)被淬滅。
19.權(quán)利要求1的標(biāo)記的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸具有5′-末端和3′-末端；其中所述至少兩種光度標(biāo)記分子中的一種連接到所述寡核苷酸的5′-末端；其中所述至少兩種光度標(biāo)記分子中的另一種連接到所述寡核苷酸的3′-末端。
20.權(quán)利要求16的標(biāo)記的寡核苷酸，其中連接到所述寡核苷酸分子的5′-末端和3′-末端的所述光度標(biāo)記分子通過柔性脂肪族接頭連接到所述寡核苷酸。
21.權(quán)利要求1的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸序列基本沒有內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)。
22.權(quán)利要求1的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸適合用作探針。
23.權(quán)利要求1的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸適合用作多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)中的引物。
24.權(quán)利要求23的寡核苷酸，其中所述多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)選自PCR，多重PCR；實(shí)時(shí)PCR，定量PCR和實(shí)時(shí)定量PCR。
25.一種標(biāo)記寡核苷酸的方法，包括提供雜交到靶多核苷酸序列的寡核苷酸序列；和將至少兩種光度標(biāo)記分子連接到所述寡核苷酸，其中所述至少兩種光度標(biāo)記分子的激發(fā)波長(zhǎng)彼此在15nm以內(nèi)。
26.權(quán)利要求25的標(biāo)記寡核苷酸的方法，其中所述至少兩種光度標(biāo)記分子是熒光分子。
27.權(quán)利要求25的標(biāo)記寡核苷酸的方法，其中所述寡核苷酸上任意對(duì)的所述光度標(biāo)記分子彼此分開大約3到大約60個(gè)核苷酸。
28.權(quán)利要求25的標(biāo)記寡核苷酸的方法，其中所述寡核苷酸上任意對(duì)的所述光度標(biāo)記分子彼此分開大約12到大約35個(gè)核苷酸。
29.權(quán)利要求25的標(biāo)記寡核苷酸的方法，其中所述寡核苷酸上任意對(duì)的所述光度標(biāo)記分子彼此分開大約15到大約25個(gè)核苷酸。
30.權(quán)利要求25的標(biāo)記寡核苷酸的方法，還包括將至少一種淬滅分子連接到所述寡核苷酸，其中當(dāng)所述至少兩種光度標(biāo)記分子連接到所述寡核苷酸時(shí)，所述淬滅分子淬滅由所述至少兩種光度標(biāo)記分子產(chǎn)生的信號(hào)。
31.權(quán)利要求25的標(biāo)記寡核苷酸的方法，其中所述至少兩種光度標(biāo)記分子中的至少一種是熒光染料，選自具有離域正電荷的染料，具有離域負(fù)電荷的染料，和具有等量正負(fù)電荷的染料。
32.權(quán)利要求25的標(biāo)記寡核苷酸的方法，其中所述至少兩種光度標(biāo)記分子中的至少一種是選自BODIPY，具有離域正電荷的花青素染料和兼性花青素染料的染料。
33.權(quán)利要求25的標(biāo)記寡核苷酸的方法，其中所述至少兩種光度標(biāo)記分子中的至少一種是呫噸染料分子。
34.權(quán)利要求25的標(biāo)記寡核苷酸的方法，其中所述至少兩種光度標(biāo)記分子中的至少一種是非磺酸化花青素染料分子。
35.權(quán)利要求25的標(biāo)記寡核苷酸的方法，其中所述至少兩種光度標(biāo)記分子中的至少一種是選自CR110，CR6G，TAMRA和ROX的染料。
36.權(quán)利要求25的標(biāo)記寡核苷酸的方法，其中所述方法還包括將至少一種小溝結(jié)合劑(MGB)連接到所述寡核苷酸。
37.權(quán)利要求25的標(biāo)記寡核苷酸的方法，包括在所述寡核苷酸中提供至少一個(gè)胍核苷酸，其中所述至少兩種光度標(biāo)記分子中的至少一種足夠靠近所述胍核苷酸，以便當(dāng)所述寡核苷酸沒有雜交到所述靶寡核苷酸時(shí)由至少一種標(biāo)記分子產(chǎn)生的信號(hào)被淬滅。
38.權(quán)利要求25的標(biāo)記寡核苷酸的方法，其中所述寡核苷酸具有5′-末端和3′-末端；進(jìn)一步包括將所述至少兩種光度標(biāo)記分子中的一種連接到所述寡核苷酸的5′-末端；而將所述至少兩種光度標(biāo)記分子中的另一種連接到所述寡核苷酸的3′-末端。
39.權(quán)利要求25的標(biāo)記寡核苷酸的方法，其中連接到所述寡核苷酸分子的5′-末端和3′-末端的所述光度標(biāo)記分子通過柔性脂肪族接頭連接到所述寡核苷酸。
40.權(quán)利要求25的標(biāo)記寡核苷酸的方法，其中所述寡核苷酸序列基本沒有內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)。
41.權(quán)利要求25的標(biāo)記寡核苷酸的方法，進(jìn)一步包括使用所述寡核苷酸作為引物探針。
42.權(quán)利要求25的標(biāo)記寡核苷酸的方法，進(jìn)一步包括使用所述寡核苷酸作為多核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)中的引物。
43.一種標(biāo)記寡核苷酸的試劑盒，包括適合雜交到靶多核苷酸序列的寡核苷酸序列；和至少兩種適合連接到所述寡核苷酸的光度標(biāo)記分子，其中所述至少兩種光度標(biāo)記分子的激發(fā)波長(zhǎng)彼此在15nm以內(nèi)。
44.權(quán)利要求43的標(biāo)記寡核苷酸的試劑盒，其中至少兩種光度標(biāo)記分子中的至少一種選自具有離域正電荷的染料，具有離域負(fù)電荷的染料，和具有等量正負(fù)電荷的染料。
45.權(quán)利要求43的標(biāo)記寡核苷酸的試劑盒，其中所述至少兩種光度標(biāo)記分子中的至少一種選自BODIPY，具有離域正電荷的花青素染料和兼性花青素染料。
46.權(quán)利要求43的標(biāo)記寡核苷酸的試劑盒，其中所述至少兩種光度標(biāo)記分子中的至少一種是呫噸染料分子。
47.權(quán)利要求43的標(biāo)記寡核苷酸的試劑盒，其中所述至少兩種光度標(biāo)記分子中的至少一種是非磺酸化花青素染料分子。
48.權(quán)利要求43的標(biāo)記寡核苷酸的試劑盒，其中所述至少兩種光度標(biāo)記分子中的至少一種是選自CR110，CR6G，TAMRA和ROX的染料。
49.權(quán)利要求43的標(biāo)記寡核苷酸的試劑盒，其中所述試劑盒還包括小溝結(jié)合劑(MGB)。
50.使用標(biāo)記的寡核苷酸的方法，包括以下步驟提供標(biāo)記的寡核苷酸，其中所述標(biāo)記的寡核苷酸包括適合雜交到靶多核苷酸序列的寡核苷酸序列；至少兩種光度標(biāo)記分子，其中所述至少兩種光度標(biāo)記分子的激發(fā)波長(zhǎng)彼此在15nm以內(nèi)，其中所述光度標(biāo)記分子連接到所述寡核苷酸；將所述標(biāo)記的寡核苷酸與樣品接觸。
51.權(quán)利要求50的使用標(biāo)記的寡核苷酸的方法，其中所述樣品選自組織提取物，細(xì)胞提取物，體液，體外核酸合成反應(yīng)和PCR反應(yīng)混合物。
52.權(quán)利要求50的使用標(biāo)記的寡核苷酸的方法，其中所述標(biāo)記的寡核苷酸用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)中，其中反應(yīng)選自PCR，多重PCR，實(shí)時(shí)PCR，定量PCR，和實(shí)時(shí)定量PCR。
53.權(quán)利要求50的使用標(biāo)記的寡核苷酸的方法，其中所述寡核苷酸是用于鑒定樣品中核酸聚合物靶序列存在的探針。
54.權(quán)利要求50的使用標(biāo)記的寡核苷酸的方法，其中所述樣品應(yīng)用于核酸芯片。
全文摘要
本發(fā)明的實(shí)施方案公開了設(shè)計(jì)標(biāo)記的核酸探針和引物的新方法，其通過用多個(gè)光譜相同的或相似的染料和任選用一種或者多種淬滅染料標(biāo)記寡核苷酸。當(dāng)標(biāo)記的染料彼此分開時(shí)，根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方案標(biāo)記的寡核苷酸顯示出信號(hào)例如熒光信號(hào)的可檢測(cè)的增加。分離染料的方法包括切割標(biāo)記的寡核苷酸，包括使用具有5′－核酸外切酶活性的酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸引物可以在雜交到靶序列和摻入到擴(kuò)增產(chǎn)物后發(fā)熒光。本發(fā)明的核酸探針和引物具有廣泛的應(yīng)用，從靶核酸序列的一般檢測(cè)到臨床診斷。包含本發(fā)明許多實(shí)施方案的核酸探針和引物的寡核苷酸的主要優(yōu)點(diǎn)是其合成的簡(jiǎn)便性，光譜通用性和優(yōu)異的熒光信號(hào)。
文檔編號(hào)C07H21/04GK101076537SQ200480040647
公開日2007年11月21日 申請(qǐng)日期2004年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月19日
發(fā)明者毛飛, 忻星 申請(qǐng)人:阿萊洛吉克生物科學(xué)公司