專利名稱：預(yù)防/治療hbv感染和hbv介導(dǎo)疾病的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含至少兩種乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、其片段和/或編碼它們的核苷酸的組合物，其中HBsAg在HBsAg S區(qū)和前S1區(qū)的乙型肝炎病毒(HBV)基因型不同并且組合物不包含HBV核心抗原(HBcAg)和編碼該抗原的核酸；本發(fā)明涉及包含這些組合物的藥物組合物，特別是疫苗以及它們在預(yù)防和治療HBV感染和HBV介導(dǎo)疾病中的用途。本發(fā)明還涉及制備用于治療性治療肝炎的患者特異性藥物的方法以及診斷HBV基因型的試劑盒。
全世界有超過2.5億人感染乙型肝炎病毒(HBV)。這些感染者的大部分表現(xiàn)出病理性結(jié)果，包括慢性肝功能不全、肝硬化和肝細(xì)胞癌(HCC)。對于為何一些人發(fā)展成急性HBV感染而另一些人沒有發(fā)展成急性HBV感染的原因了解甚少。臨床資料以及與其它慢性病毒感染的類似性強(qiáng)調(diào)了細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在控制病毒感染中的重要性，特別是包括細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞的免疫反應(yīng)。細(xì)胞毒T細(xì)胞反應(yīng)的誘導(dǎo)是消除急性HBV感染和預(yù)防慢性HBV感染的關(guān)鍵因素。病毒基因組還編碼包膜蛋白前S1、前S2和S抗原(HBsAg)、聚合酶和核心蛋白(HBcAg)。
慢性乙型肝炎是慢性遷延性和慢性活動性進(jìn)程的肝臟進(jìn)行性炎癥。慢性遷延性肝炎表現(xiàn)為限定在肝臟中的具有增加形成纖維組織的擴(kuò)大的門區(qū)浸潤；在臨床上遷延性肝炎的病征維持?jǐn)?shù)年(長達(dá)10年)，大約80％的病例為HBsAg陽性。發(fā)病機(jī)制可能是基于細(xì)胞免疫系統(tǒng)功能不全和持續(xù)性病毒感染。
乙型肝炎的小表面抗原(HBsAg)是一個226個氨基酸的蛋白質(zhì)(p24/gp27或S蛋白)，它是一個重要的HBV抗原，其自身裝配在20-30nm的脂蛋白顆粒中，其中100-150個亞單位通過多重分子間和分子內(nèi)二硫鍵交聯(lián)起來。來自不同亞型和基因型的HBV株的S蛋白的變異性是有限的。四個穩(wěn)定HBsAg亞型adw、ayw、adr和ayr涉及鄰近免疫顯性“a-決定簇”(包含殘基124-147的親水區(qū))的位置122和160的單一氨基酸互換。這些亞型先前未曾確定在HBV感染中具有任何生物學(xué)或發(fā)病機(jī)制上的差異。
從慢性HBsAg攜帶者血漿獲得的疫苗于1982年在聯(lián)邦德國第一次獲得批準(zhǔn)。自那次以后，疫苗可以通過遺傳技術(shù)生產(chǎn)并且用于危險人群的主動免疫。在接種前為血清反應(yīng)陰性的人群中有95％的人在一年后表現(xiàn)出免疫反應(yīng)。所使用的所有乙型肝炎疫苗包含高濃度的純化HBsAg蛋白質(zhì)(對應(yīng)于乙型肝炎病毒的非感染性外殼)并且不合病毒DNA或者是福爾馬林滅活的。
先有技術(shù)的缺點是在進(jìn)行免疫的人群中有至少5％為不表現(xiàn)出免疫反應(yīng)的“非反應(yīng)者”。此外，迄今為止在已知的疫苗中沒有一個能夠治療慢性遷延性肝炎。
WO 01/40279和WO 01/38498描述了基于乙型肝炎病毒基因型G的疫苗，但是兩個專利的說明書沒有提到不同基因型的組合。
Michel等，PNAS92(1995)，5307-5311和Mancini等，PNAS93(1996)，12496-12501涉及基于HBsAg的DNA疫苗。文件中沒有提到不同HBV基因型的HBsAg的組合。
因此本發(fā)明基于提供預(yù)防/治療HBV感染或HBV介導(dǎo)疾病改進(jìn)手段的問題。本發(fā)明還基于提供治療性治療肝炎的患者特異性藥物的問題。本發(fā)明進(jìn)一步的目標(biāo)是提供診斷HBV感染的改良試劑盒。
通過提供包含至少兩種乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、其片段和/或編碼它們的核酸的組合物來解決本發(fā)明潛在的問題，其中HBsAg在HBsAgS區(qū)和/或前S區(qū)的乙型肝炎病毒(HBV)基因型不同并且組合物不包含HBV核心抗原(HBcAg)或編碼該抗原的核酸。
本發(fā)明基于以下令人驚奇的發(fā)現(xiàn)在肝中組成型表達(dá)HBsAg亞型ayw的轉(zhuǎn)基因小鼠可以當(dāng)作評價針對慢性HBV感染的特異免疫治療方案的效率的潛伏期模型。此種小鼠因為持續(xù)性抗原血癥而產(chǎn)生大量HBsAg，并且它們基本上耐受HBsAg。一方面，本發(fā)明人現(xiàn)在已經(jīng)用其HBsAg基因型恰恰為轉(zhuǎn)基因小鼠基因型(ayw)的疫苗免疫了HBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠，另一方面，用包含與轉(zhuǎn)基因小鼠基因型不同的HBsAg基因型的疫苗免疫了HBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠。盡管用對應(yīng)于其自身HBsAg的HBsAg抗原重復(fù)免疫轉(zhuǎn)基因小鼠，卻沒有觀察到細(xì)胞毒T細(xì)胞反應(yīng)。相反，用不同于其自身基因型的HBsAg基因型免疫轉(zhuǎn)基因小鼠導(dǎo)致產(chǎn)生針對HBsAg的基因型特異和交叉反應(yīng)的細(xì)胞毒T細(xì)胞反應(yīng)。這表明天然存在的HBsAg變體可以通過引發(fā)交叉反應(yīng)性T細(xì)胞免疫而打破“耐受”。細(xì)胞毒T細(xì)胞免疫的活化導(dǎo)致HBsAg ayw抗原的降低并因此導(dǎo)致產(chǎn)生了相當(dāng)于HBV被有效控制的急性肝炎的肝特異性病癥和綜合征。由于HBsAg ayw抗原的氨基酸序列與HBsAg adw2抗原的氨基酸序列僅在少數(shù)位置不同，因此所觀察到的免疫反應(yīng)特別明顯。本發(fā)明已經(jīng)證實，甚至T細(xì)胞表位內(nèi)的氨基酸的少量保守交換會導(dǎo)致針對該表位的T細(xì)胞反應(yīng)的變化。
對蛋白質(zhì)抗原的T細(xì)胞反應(yīng)的特異性和有效性在多種水平受到控制，特別的決定性因素為(i)表位(或抗原肽)的蛋白水解釋放；(ii)抗原肽對主要組織相容性復(fù)合物(MHC)的遞呈糖蛋白的親和性；和(iii)對同一抗原不同表位的競爭性發(fā)展的T細(xì)胞反應(yīng)的負(fù)面干擾。蛋白質(zhì)抗原的天然變體(通過表位或表位側(cè)翼中關(guān)鍵序列的單個氨基酸交換或者通過新表位的產(chǎn)生)以下列四種方式誘導(dǎo)T細(xì)胞反應(yīng)(i)來自蛋白質(zhì)的抗原肽的更有效蛋白水解加工(釋放)；(ii)抗原肽與遞呈MHC分子的高親和性結(jié)合；(iii)通過與(i)和/或(ii)中提到的過程相類似的過程消除能夠減弱表位免疫原性的免疫顯性表位(免疫顯性表位抑制了對同一蛋白質(zhì)抗原不同表位的反應(yīng))；(iv)產(chǎn)生新表位。
在本發(fā)明上下文中已經(jīng)證明HBsAg天然變體(通過基因型所表現(xiàn)出來的)對其所刺激的T細(xì)胞反應(yīng)具有相對廣譜的特異性。
與本發(fā)明有關(guān)的術(shù)語“HBV基因型”意思是指乙型肝炎病毒基因組的全部。HBV基因型優(yōu)選通過全部測序和系統(tǒng)發(fā)生分析確定。當(dāng)前已知8個標(biāo)準(zhǔn)基因型。該8個基因型彼此的核苷酸變化為8％；見Bartholomeusz，Rev.Med.Virol.13(2003)，1-14。優(yōu)選地，HBV基因型A具有參考核酸序列Genbank X02763或者HBV基因型Aafr具有參考核酸序列GenbankAF297621。對于HBV基因型Ba，參考核酸序列為Genbank D00330并且對于基因型Bj參考核酸序列為AB073858。對于HBV基因型C，參考核酸序列為Genbank AY206389，并且對于基因型Caus，參考核酸序列為Genbank AB048704。對于基因型D，參考核酸序列為Genbank X02496。基因型E的參考核酸序列為X75657。基因型F的參考核酸序列為X69798?；蛐虶的參考核酸序列為AF160501并且基因型H的參考核酸序列為AY090454。
關(guān)于上面提到的基因型，在基因型和亞型之間存在一定的相關(guān)性，如下基因型A與亞型adw2、ayw1相關(guān)；基因型B與adw2、ayw1相關(guān)；基因型C與adw2、adrq+、adrq-、ayr、adr相關(guān)；基因型D與ayw2、ayw3、ayw4相關(guān)；基因型E與ayw4相關(guān)；基因型F與adw4q-、adw2和ayw4相關(guān)；基因型G與adw2相關(guān)且基因型H與adw4相關(guān)。
通過借助于單特異抗體例如抗d、抗y、抗r、抗a(w)的血清學(xué)方法確定感染患者的HBV亞型。可以以瓊脂凝膠擴(kuò)散測試形式或者放射免疫分析法形式實現(xiàn)確定；(“HBs Antigen Subtypes”，由Couroucé，A.M.，Holland，P.V.，Muller，J.Y.和Soulier，J.P.出版，Biblotheca Haematologica no.42，S.Karger，Basel，1976)。
還可以通過對來自患者血清的編碼HBsAg的DNA進(jìn)行測序來確定亞型。然后從所確定核酸序列得到HBsAg的氨基酸序列。然后通過如Magnius，L.O.和Norder，H.(“Subtypes，Genotypes and molecularepidemiology of the hepatitis B virus as reflected by sequence variability ofthe S-gene”Intervirology，38(1-2)24-34)所描述的位置122和160的氨基酸來確定亞型。
與本發(fā)明有關(guān)的表述“乙型肝炎病毒表面抗原”(HBsAg)指HBV的小表面抗原或者S蛋白(p24/gp27)。HBsAg還可以包括前S1蛋白結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，HBsAg由S蛋白和/或前S1蛋白結(jié)構(gòu)域組成。
關(guān)于HBsAg的編號，使用了依據(jù)Kidd-Ljunggren等人J.Gen.Virol.83(2002)，1267-1280的系統(tǒng)。
根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語“片段”包括HBsAg的片段。片段優(yōu)選包含至少5個氨基酸并且包含T細(xì)胞表位，優(yōu)選至少10個、特別地至少20個、更加特別地至少50個氨基酸。依照優(yōu)選實施方案，組合物包含至少2種HBsAg或2種其片段。此種組合物特別適宜用作基于多肽的疫苗。特別是在組合物包含來自不同HBV基因型HBsAg的2種片段的情況下，第一種和第二種片段共同具有至少10個氨基酸、優(yōu)選20個氨基酸但是彼此之間至少有一個氨基酸不同。
如上所提到，本發(fā)明基于這樣一種認(rèn)識，即不同基因型所產(chǎn)生抗原(HBsAg)中甚至十分小的差異會導(dǎo)致產(chǎn)生這樣一種修飾T細(xì)胞表位，所述的修飾T細(xì)胞表位彼此之間僅稍稍不同但能夠?qū)е耇細(xì)胞反應(yīng)極大變化。因此彼此之間至少一個氨基酸差異的兩種片段可以通過與已知HBsAg基因型的簡單序列比較容易地檢測。彼此間至少一個氨基酸不同的適宜片段可以用于本發(fā)明的組合物中。片段優(yōu)選包含至少一個T細(xì)胞表位，特別是人T細(xì)胞表位。確定T細(xì)胞表位的方法是已知的，例如Lauer等，J.Virol.76(2002)，6104-6113。
依據(jù)優(yōu)選的實施方案，組合物包含至少2種HBsAg和/或至少2種其片段。
優(yōu)選地還提供了至少包含第一種HBsAg或其片段和編碼第二種HBsAg或其片段的核酸的組合物，其中第一種和第二種HBsAg的HBV基因型不同。
依據(jù)進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案，組合物至少包含編碼2種HBsAg的2種核酸，其中HBsAg的HBV基因型不同。核酸還可以是編碼如上所定義片段的核酸。核酸可以是病毒DNA或合成DNA，合成DNA應(yīng)當(dāng)理解為包括含有修飾核苷間鍵的那些DNA序列。核酸還可以是RNA分子，所述RNA分子對于通過重組載體系統(tǒng)方式的表達(dá)是必需的。此外，依據(jù)本發(fā)明混合DNA/RNA分子也考慮作為核酸。
依據(jù)優(yōu)選實施方案，基因型選自已知基因型A、B、C、D、E、F、G和H。關(guān)于各個參考核酸序列可以參照上面定義部分。通常，通過與參考核酸序列具有8％核苷酸變異的方式確定基因型，也就是說與參考核酸序列具有至少92％同一性的核酸也被理解為與所定義一致的基因型。相對于參考核酸序列具有至少95％、特別是98％同一性是特別優(yōu)選的。相對于參考核酸序列的“同一性”在這里可以借助于已知方法進(jìn)行確定。一般使用具有考慮特殊需求的算法的特殊計算機(jī)程序。
首先，使用確定同一性的優(yōu)選方法產(chǎn)生了被比較序列間的最大一致性。確定同一性的計算機(jī)程序包括但不限于包括GAP在內(nèi)的GCG程序包(Deveroy，J等，Nucleic Acid Research 12(1984)，387；Genetics ComputerGroup University of Wisconsin，Medicine(WI))；和BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S.等，J.Mol.Biol.215(1990)，403-410)。BLASTX程序可以從國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)或其它來源(BLAST手冊，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda ND 22894；Altschul，S.等；見上)獲得。同樣可以使用已知的Smith-Waterman算法確定同一性。
用于核酸比較的優(yōu)選參數(shù)包括下列Needleman和Wunsch算法，J.Mol.Biol.48(1970)，443-453比較矩陣匹配＝+10錯配＝0開口罰分50開口長度罰分3同樣GAP程序也適宜使用上面的參數(shù)。在核酸序列比較中上面的參數(shù)是默認(rèn)參數(shù)。算法、開口罰分、開口延伸罰分和比較矩陣的另外實例包括程序手冊Wisconsin軟件包(版本9，1997年9月)中的那些實例。對其的選擇取決于所進(jìn)行的比較，同樣還取決于比較是否在序列對(當(dāng)使用GAP或Best Fit時)或者序列和大的序列數(shù)據(jù)銀行(當(dāng)使用FASTA或BLAST時)之間進(jìn)行。
依據(jù)上述算法的92％的一致性代表著與本發(fā)明序列具有92％的同一性。同樣適用于更高的同一性。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的組合物的特征在于變體編碼其活性基本上相當(dāng)于參考核酸序列所編碼聚合酶活性的聚合酶和/或變體編碼其免疫反應(yīng)性基本上相當(dāng)于參考核酸序列所編碼HBsAg免疫反應(yīng)性的HBsAg。
聚合酶活性在這里可以依據(jù)Kim等人Biochem.Mol.Biol.Int.1999；47(2)301-308確定。HBsAg免疫反應(yīng)性可以通過商業(yè)可得的抗原ELISA確定?！盎旧贤ㄟ^參考核酸所編碼HBsAg的免疫反應(yīng)性”意思是指抗體同參考HBsAg的結(jié)合基本上與抗體同變體所編碼HBsAg的結(jié)合親和性相同。
根據(jù)優(yōu)選實施方案，組合物包含至少3種、優(yōu)選至少5種不同HBsAg、其片段和/或編碼它們的核酸。
特別優(yōu)選地，組合物包含所有已知HBV基因型的HBsAg、其片段和/或編碼它們的核酸。
根據(jù)本發(fā)明組合物的進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案，編碼HBsAg或其片段的核酸存在于適于HBsAg在哺乳動物細(xì)胞(優(yōu)選人細(xì)胞)表達(dá)的啟動子控制下的載體中。如果組合物包含至少2種編碼HBsAg或其片段的核酸，則這些核酸可以存在于同一載體(雙元載體)中或者分別位于彼此不同的載體中。適宜載體例如質(zhì)粒、腺病毒、痘苗病毒、桿狀病毒、麻疹病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒。載體一般包括影響載體在所轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞中復(fù)制的復(fù)制源。
適宜啟動子可以是組成型啟動子和可誘導(dǎo)型啟動子。優(yōu)選啟動子為來自CMV和SC-40的啟動子。
上述組合物可以通過簡單混合各個成分得到，因此可以十分簡單地制備。適宜溶劑和載體取決于組合物(多肽和/或核酸)的性質(zhì)。原則上，優(yōu)選包含水的系統(tǒng)?？梢院铣芍苽浠蛲ㄟ^重組制備HBsAg或其片段。所制備多肽可通過色譜方法純化。
備選地，可以通過重組表達(dá)系統(tǒng)中編碼HBsAg或其片段的至少2種核酸的共表達(dá)而得到組合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知多種表達(dá)系統(tǒng)和方法；優(yōu)選地使用酵母作為宿主細(xì)胞，特別優(yōu)選地使用多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)。核酸可以存在于一個載體中或者分別存在于彼此分開的兩個載體中。適宜載體和啟動子如上所述。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，制備了包含本發(fā)明組合物和可藥用載體的藥用組合物?？伤幱幂d體是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。實例為鋁鹽、磷酸鈣、添加或不添加多糖的HBsAg凍干物、水包油乳劑、聚丙交酯共甘醇酸酯。如果此種載體本身不具有佐劑作用，則它們可以與另外的佐劑如脂質(zhì)A模擬物、免疫刺激性核苷酸或細(xì)菌毒素混合。
根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選為疫苗。根據(jù)本發(fā)明，藥物組合物、尤其是疫苗適宜治療性治療HBV感染或HBV介導(dǎo)疾病。藥物組合物、尤其是疫苗還適宜預(yù)防性治療HBV感染或HBV介導(dǎo)疾病。HBV感染尤其是慢性遷延性乙型肝炎感染。HBV介導(dǎo)疾病可以是急慢性乙型肝炎感染。另外的HBV介導(dǎo)疾病為肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌。疫苗適合施用于臨床不明顯HBV攜帶者，即未患有真正意義上的疾病但具有將來發(fā)展成HBV介導(dǎo)疾病的高危險性的攜帶者。
藥物組合物可以肌內(nèi)、皮下、真皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、粘膜或口服施用，但是此種施用僅僅為優(yōu)選的并且不是對施用方式的限制。
藥物組合物包含劑量范圍為0.1-1000μg HBsAg或其片段、優(yōu)選2.5-40μg HBsAg或其片段的至少2種HBsAg或其片段。
當(dāng)藥物組合物包含編碼HBsAg或其片段的核酸時，它們存在的劑量范圍為10-1000μg編碼HBsAg或其片段的核酸。
本發(fā)明的另一方面提供了制備用于治療性治療乙型肝炎的藥物的方法，其包括以下步驟a)確定患者所感染HBV的基因型；和b)提供包含至少一種HBV基因型的HBsAg、HBsAg片段或編碼HBsAg或其片段的核酸的藥物，其中HBV基因型不同于根據(jù)a)
所確定的患者內(nèi)HBV的基因型。
如上所述，本發(fā)明的重要的認(rèn)可是在慢性遷延性肝炎潛伏期模型中，已經(jīng)通過使用來自與轉(zhuǎn)基因動物基因型不同的HBV基因型的HBsAg處理轉(zhuǎn)基因動物實現(xiàn)了治療效果。
通過以下方法可以確定基因型對全HBV基因組或者至少編碼HBsAg的部分進(jìn)行測序以及系統(tǒng)發(fā)生分析、限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、多重PCR。
以本身已知的方式通過配制至少一種HBsAg、其片段或者編碼HBsAg或其片段的核酸實現(xiàn)藥物供應(yīng)。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了診斷HBV感染基因型的試劑盒。試劑盒包含至少2種HBsAg特異性結(jié)合物，其特征在于2種HBsAg特異性結(jié)合物是對不同HBV基因型特異的。至少2種HBsAg特異性結(jié)合物可以是HBsAg基因型特異性引物和/或特異性抗體。引物長度為10-30個核苷酸并且與各個基因型的已知HBsAg序列互補(bǔ)?？贵w可以是通過以下步驟得到的抗體，例如免疫實驗動物(例如具有對應(yīng)于目的HBsAg基因型的各個HBsAg的小鼠)、以本身已知的方式制備雜交瘤和篩選亞型特異性單克隆抗體。
附圖簡述

圖1HBsAg變體。(A)顯示了乙型肝炎小表面抗原(HBsAg)ayw(1)(對應(yīng)于基因型D)和adw2(2)(對應(yīng)于基因型A)的氨基酸序列。(B)來自HBsAg ayw和adw2的kb限制性表位序列。表位1(S208-215)僅由加工外源性HBsAg的細(xì)胞遞呈，而表位2(S190-197)僅由加工內(nèi)源性HBsAg的細(xì)胞遞呈。
圖2將表位1或表位2特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞系(CTLL)轉(zhuǎn)移入HBs轉(zhuǎn)基因(HBs-tg)宿主導(dǎo)致暫時性肝臟損傷。從pCI/SaywDNA免疫的B6小鼠取出脾細(xì)胞并且用同系基因RBL5細(xì)胞在體外再刺激，其中RBL5細(xì)胞已經(jīng)用Kb/S208-215結(jié)合肽1(ILSPFLPL)或Kb/S190-197結(jié)合肽2(VWLSVIWM)負(fù)載或用ConA刺激。以每只小鼠5×106個CD8+CTLL的量靜脈(i.v.)注射入HBs-tg小鼠并且測定平均血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平。
圖3免疫小鼠肝臟和脾臟內(nèi)存在HBsAg特異性CD8+T細(xì)胞的間接體內(nèi)證明。通過單次注射100μg pCI/SaywDNA肌內(nèi)免疫C57BL/6小鼠。在免疫后12天證明特異性CD8+T細(xì)胞的存在。用Kb/S208-215結(jié)合肽1(ILSPFLPL)或者Kb/S190-197結(jié)合肽2(VWLSVIWM)體外再次刺激分離肝臟單核細(xì)胞(MNC)和脾細(xì)胞4小時(在布雷菲爾德菌素A存在的情況下)。顯示了每組4-6只小鼠的CD8+IFNγ+T細(xì)胞/105CD8+T細(xì)胞的平均頻率±標(biāo)準(zhǔn)差(來自彼此獨立的兩個實驗)。
圖4在HBs-tg小鼠中HBsAg特異性CD8T細(xì)胞對表位1的反應(yīng)。用編碼HBsAg亞型ayw(pCI/Sayw)或adw2(pCI/Sadw2)的DNA疫苗或者用陰性對照載體pCI(沒有插入片段的載體)肌內(nèi)免疫在其肝臟中表達(dá)HbsAgayw的HBs-tg小鼠三次(免疫間隔為4周)。在最后一次免疫后12天從免疫小鼠中取出脾細(xì)胞并用RBL5細(xì)胞體外再次刺激4小時(在布雷菲爾德菌素A存在的情況下)，其中RBL5細(xì)胞是用ayw(RBL5/SPayw)或adw2(RBL5/SPadw2)亞型的HBsAg顆粒再刺激或者用HBsAgayw(ILSPFLPL)或HBsAgadw2(IVSPFIPL)的Kb/S208-215結(jié)合肽1再刺激。顯示了每組4-6只小鼠脾臟IFNγ+CD8+T細(xì)胞/105CD8+T細(xì)胞的平均數(shù)量±標(biāo)準(zhǔn)差(來自彼此獨立的兩個實驗)。
圖5在HBs-tg小鼠中HBsAg特異性CD8T細(xì)胞對表位1的反應(yīng)。從如圖4的圖例中所描述的已免疫小鼠中取出脾臟細(xì)胞，并且用同系基因RBL5/Sayw或RBL5/Sadw2轉(zhuǎn)染子或者HBsAgayw(VWLSVIWM)或HBsAgadw2(VWLSAIWM)的Kb/S190-197結(jié)合肽2再刺激。顯示了每組4只小鼠脾臟IFNγ+CD8+T細(xì)胞/105CD8+T細(xì)胞的平均數(shù)量±標(biāo)準(zhǔn)差。
圖6S208-215特異性CD8+T細(xì)胞在所免疫HBs-tg小鼠肝臟中存在的證明。用編碼HBsAgadw2的DNA疫苗(pCI/Sadw2)免疫轉(zhuǎn)基因HBs-tg小鼠三次(免疫間隔為4周)。在最后一次注射后12天從所免疫小鼠中取出肝臟和脾臟細(xì)胞并且用Kb/S208-215結(jié)合肽ILSPFLPL體外再刺激。顯示了每組4只小鼠脾臟IFNγ+CD8+T細(xì)胞/105CD8+T細(xì)胞的平均數(shù)量±標(biāo)準(zhǔn)差。
圖7用pCI/Sadw2DNA疫苗免疫的HBs-tg小鼠肝臟組織病理學(xué)。在B6小鼠(A，B)中沒有觀察到病理性的肝臟組織學(xué)。HBs-tg小鼠(C，D)表現(xiàn)為中等的細(xì)胞增大并且細(xì)胞質(zhì)表現(xiàn)出毛玻璃的外觀(D)。肝細(xì)胞的細(xì)胞核表現(xiàn)為中等程度的多形性。門管周浸潤罕見。用pCI/Sadw2DNA重復(fù)免疫引起嚴(yán)重的肝臟組織形態(tài)學(xué)改變(E-I)，這種改變與急性病毒性肝炎引起的改變相一致。位于小葉實質(zhì)(F)和門管周區(qū)(G)的炎性細(xì)胞浸潤包括Kupfer細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和少量多形核顆粒細(xì)胞。肝細(xì)胞出現(xiàn)水腫并且常常具有固縮核，這是凋亡早期階段的征兆(F，箭頭)。嗜酸小體(H，箭頭)，即凋亡的肝細(xì)胞普遍或者常常被病灶炎性細(xì)胞浸潤包圍。許多肝細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的空泡化(I，箭頭)。對福爾馬林固定并且用石蠟包埋的組織用HE染色。原始放大倍數(shù)A、C和E為10倍；B、D和F為40倍；G-I為63倍。
圖8HBs-tg小鼠中HBsAg特異性血清抗體反應(yīng)的誘導(dǎo)。用編碼HBsAgadw2(pCI/Sadw2)或HBsAgayw(pCI/Sayw)的DNA疫苗肌內(nèi)免疫B6小鼠和轉(zhuǎn)基因HBs-tg小鼠，3周后用相同的疫苗加強(qiáng)免疫。在最后一次注射后4周，測試血清樣品中的HBsAg抗原(A)或者HBsAg特異性抗體(B)。顯示了每組4-6只小鼠的平均抗體滴度(mIU/ml)和血清HBsAg水平(ng/ml)±標(biāo)準(zhǔn)差。
圖9在正常B6和HBsayw-tg小鼠中，HBsAg特異性CD8+T細(xì)胞對表位1(S208-215)和表位2(S190-197)的反應(yīng)。用亞型ayw或adw2的HBsAg蛋白質(zhì)顆粒(SP)肌內(nèi)免疫動物三次(免疫間隔為21天)。每個蛋白質(zhì)疫苗與作為佐劑的CpG寡核苷酸(ODN)或者RC-529混合。PBS用作陰性對照。在最后一次免疫后12天從動物中取出脾臟，然后將分離的脾細(xì)胞用預(yù)先用HBsAg特異性肽負(fù)載的RBL5細(xì)胞體外再刺激4小時(在布雷菲爾德菌素A存在的情況下)。為了實現(xiàn)該目的，使用了HBsAgayw(ILSPFLPL)或HBsAgadw2(IVSPFIPL)的Kb/S208-215結(jié)合肽1或者HBsAgayw(VWLSVIWM)或HBsAgadw2(VWLSAIWM)的Kb/S190-197結(jié)合肽2。顯示了每組4-6只小鼠脾臟IFNγ+CD8+T細(xì)胞/105CD8+T細(xì)胞的平均數(shù)量±標(biāo)準(zhǔn)差(來自彼此獨立的兩個實驗)。
圖10HBSayw-tg小鼠中HBsAg特異性CD8+T細(xì)胞對表位1(S208-215)的反應(yīng)。
A.用編碼單獨的HBsAg亞型ayw(pCI/Sayw)或三種亞型ayw(pCI/Sayw)、adw2(pCI/Sadw2)和adr(pCI/Sadr)的DNA疫苗或者陰性對照載體pCI(沒有插入片段的載體)肌內(nèi)免疫在其肝臟中表達(dá)HBsAgayw的HBs-tg小鼠3次(免疫間隔為4周)。在最后一次免疫后12天從動物中取出脾臟。將分離的脾細(xì)胞用預(yù)先用HBsAgayw(ILSPFLPL)或HBsAgadw2(IVSPFIPL)的Kb/S208-215結(jié)合肽1負(fù)載的RBL5細(xì)胞體外再刺激4小時(在布雷菲爾德菌素A存在的情況下)。顯示了每組4-6只小鼠脾臟IFNγ+CD8+T細(xì)胞/105CD8+T細(xì)胞的平均數(shù)量±標(biāo)準(zhǔn)差(來自彼此獨立的兩個實驗)。
B.用亞型ayw的HBsAg蛋白質(zhì)顆粒(SP)或亞型ayw、adw2和adr的HBsAg蛋白質(zhì)顆粒混合物肌內(nèi)免疫HBsayw-tg小鼠三次(免疫間隔為21天)。每個蛋白質(zhì)疫苗與作為佐劑的CpG寡核苷酸(ODN)或者RC-529(僅顯示了與亞型混合物的混合)混合。PBS用作陰性對照。在最后一次免疫后12天從動物中取出脾臟。將分離的脾細(xì)胞用預(yù)先用HBsAgayw(ILSPFLPL)或HBsAgadw2(IVSPFIPL)的Kb/S208-215結(jié)合肽1負(fù)載的RBL5細(xì)胞體外再刺激4小時(在布雷菲爾德菌素A存在的情況下)。顯示了每組4-6只小鼠脾臟IFNγ+CD8+T細(xì)胞/105CD8+T細(xì)胞的平均數(shù)量±標(biāo)準(zhǔn)差(來自彼此獨立的兩個實驗)。
圖11HBs-tg小鼠中HBsAg特異性血清抗體反應(yīng)的誘導(dǎo)。
用亞型ayw或adw2的HBsAg蛋白質(zhì)顆粒疫苗(SP)或亞型ayw、adw2和adr的HBsAg蛋白質(zhì)顆?；旌衔镆呙缂?nèi)免疫B6小鼠和轉(zhuǎn)基因HBs-tg小鼠，3周后用相同的疫苗加強(qiáng)免疫。蛋白質(zhì)疫苗包含作為佐劑的添加物CpG寡核苷酸(ODN)。在加強(qiáng)免疫注射后4周，測試血清樣品中的HBsAg抗原(A)和HBsAg特異性抗體(B)。顯示了每組4-6只小鼠的平均抗體滴度(mIU/ml)和血清HBsAg水平(ng/ml)±標(biāo)準(zhǔn)差。
本發(fā)明將在以下更加詳細(xì)地描述實施例。然而實施例不是旨在限制本發(fā)明。
實施例材料和方法概述正在研究的HBV亞型adw2對應(yīng)于基因型A。HBV亞型ayw對應(yīng)于基因型D。HBV亞型adr對應(yīng)于基因型C。
小鼠將C57BL/6Jbom(B6)小鼠(H-2b)置于標(biāo)準(zhǔn)的無病原體條件下。
C57BL/6J-TgN(Alb1HBV)44Bri轉(zhuǎn)基因(HBs-tg)小鼠、HBsAgayw(由具有保藏號V01460 J02203的HBV序列編碼)從Jackson實驗室(BarHarbour，ME)得到。使用8-16周齡的雌性和雄性小鼠。
細(xì)胞、重組HBsAg顆粒和抗原性HBsAg肽所使用的H-2b細(xì)胞系RBL5描述于[10]。制備了表達(dá)相似數(shù)量HBsAgayw和HBsAgadw2的穩(wěn)定RBL5轉(zhuǎn)染子(數(shù)據(jù)未顯示)。亞型ayw、adw2和adr的重組體HBsAg顆粒從Rhein Biotech GmbH(Düsseldorf，德國)得到。如所述[3]純化在多形漢遜酵母宿主RB10株中制備的HBsAg顆粒。合成的Kb結(jié)合S208-215ILSPFLPL(ayw)或IVSPFIPL(亞型adw2)肽和Kb結(jié)合S190-197VWLSVIWM(ayw)或VWLSAIWM(adw2)肽從JeriniBioTools(Berlin，德國)獲得。將肽以10mg/ml的濃度溶于DMSO溶液并在使用前用培養(yǎng)基稀釋。
質(zhì)粒和DNA免疫如所述[4；5]將HBsAgayw、HBsAgadw2和HBsAgadr克隆入pCI(Promega)和BMGneo載體。作為DNA疫苗，使用了表達(dá)HBsAgayw、HBsAgadw2和HBsAgadr同樣好的質(zhì)粒pCI/Sayw、pCI/Sadw2、pCI/Sadr。從來自用這些質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞中對HBsAg進(jìn)行的免疫沉淀證明了這一點(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，HBsAg表位免疫原性的不同不能解釋為由DNA疫苗所表達(dá)HBsAg的量不同或者轉(zhuǎn)染子不同。對于肌內(nèi)核酸免疫，如所述[4]將包含1μg/μl質(zhì)粒DNA的50μl PBS(磷酸緩沖鹽溶液)注射入每一脛骨前肌。通過注射包含1μg/μl pCI/Sayw、1μg/μl pCI/Sadw2和1μg/μlpCI/Sadr的50μl PBS實現(xiàn)HBsAg亞型混合物免疫。
用HBsAg蛋白質(zhì)顆粒免疫向每只小鼠皮下注射5μgHBsAg蛋白質(zhì)顆粒和溶于100μl PBS(磷酸緩沖鹽溶液)的30μg CpG寡核苷酸(ODN1826，MWG Biotech，Ebersberg，德國)或8μg RC-529(Corixa Corp.Settle，WA，美國)。對于用HBsAg亞型混合物進(jìn)行免疫，在一次中皮下注射5μgHBsAgayw、5μg HBsAgadw2和5μg HBsAgadr蛋白質(zhì)顆粒以及溶于100μl PBS的30μg CpG寡核苷酸佐劑或8μg RC-529。
特異性脾臟和肝臟CD8+-T細(xì)胞頻率的確定脾細(xì)胞懸液[1]和肝臟NPC(非實質(zhì))細(xì)胞制備描述于[6；7]。將脾細(xì)胞和肝臟NPC(1×106/ml)在具有5μg/μl HBsAg衍生肽或HBsAg表達(dá)轉(zhuǎn)染子(106/ml)或HBsAg顆粒負(fù)載的細(xì)胞的RPMI-1640培養(yǎng)基孵育1小時。然后加入5μg/μl的布雷菲爾德菌素A(BFA)(目錄號15870；Sigma)并且將培養(yǎng)物進(jìn)一步孵育4小時。收獲細(xì)胞并且用抗CD8 mAb對其表面進(jìn)行染色，然后固定、透性處理和細(xì)胞質(zhì)IFNγ染色。通過FACS分析確定CD8+IFNγ+CTL的頻率。顯示了105個脾臟或肝臟T細(xì)胞中CD8+IFNγ+T細(xì)胞的平均值。
特異性CD8+T細(xì)胞系的轉(zhuǎn)移從用pCI/SaywDNA疫苗免疫的B6小鼠脾臟獲得CD8+T細(xì)胞系。使用經(jīng)Kb/S208-215結(jié)合肽1(ILSPFLPL)或Kb/S190-197結(jié)合肽2(VWLSVIWM)負(fù)載的同系基因RBL5細(xì)胞體外再刺激脾細(xì)胞。在體外刺激大約2周的細(xì)胞系中，超過80％的CD8+T細(xì)胞具有預(yù)期的表位特異性，這如特異性IFNγ表達(dá)測試所證明。洗滌細(xì)胞并且用這些細(xì)胞系的5×106個細(xì)胞靜脈內(nèi)注射。對照細(xì)胞是從ConA刺激3天的培養(yǎng)物分離的非特異性CD8+T母細(xì)胞(blast)。
血清中轉(zhuǎn)氨酶、HBsAg和抗HBsAg抗體的確定通過在注射后一定時間點自尾靜脈抽取血液從各個免疫小鼠或?qū)φ招∈笾兄貜?fù)獲得血清抗體。使用Reflotron測試(目錄號745138；RocheDiagnostics GmbH)測定血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)活性。通過商業(yè)ELISA AUSZYME II測試(ABBOTT Laboratories，Wiesbaden，德國)測定轉(zhuǎn)基因小鼠血清中的HBsAg濃度。使用商業(yè)IMxAUSAB測試(目錄號7A39-20；Abbott，Wiesbaden，德國)測定抗HBsAg抗體。
使用6份標(biāo)準(zhǔn)血清定量抗體水平。將測試血清稀釋以致于所測定的OD值在標(biāo)準(zhǔn)血清1和6的數(shù)值之間。用血清稀釋倍數(shù)乘以所測定抗體水平(mIU/ml)得到此處所示數(shù)值。所給出的血清滴度對應(yīng)于4只單個小鼠的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
組織學(xué)薄的肝臟組織切片(＜3mm)用4％福爾馬林(pH 7.0)固定24小時并且用石蠟包埋。將2μm厚的石蠟切片用蘇木精-伊紅(H&E)染色。
HBsAg肽與Kb的結(jié)合如所述[8，9]，在3μM人β2m存在的條件下，將親和純化的MHC I類分子Kb與濃度遞增的測試肽和限定濃度(大約2nM)放射性標(biāo)記的VSVNP 52-59指示肽于18℃孵育48小時。然后，通過Sephadex G50柱凝膠過濾[8]確定肽與MHC I類分子的結(jié)合。放射性標(biāo)記的VSV NP 52-59肽位于排斥體積(MHC結(jié)合肽)和內(nèi)含體積(inclusion volume)(游離肽)。這可以通過γ放射光譜學(xué)測定，并且確定結(jié)合MHC分子的測試肽相對于測試肽總量的比例。確定了達(dá)到指示肽結(jié)合50％抑制所需要的測試肽濃度(IC50值)。IC50值越低，則測試肽的結(jié)合越好。為了防止配體耗盡，在所有結(jié)合實驗中使用的MHC體積足以實現(xiàn)至多15-25％結(jié)合。在這些條件下，IC50值接近于解離常數(shù)(Kd)。所有結(jié)合實驗均作為抑制實驗進(jìn)行。
實施例1表位1或表位2特異性Kb限制性CD8+T細(xì)胞系過繼轉(zhuǎn)移入HBs-tg B6小鼠導(dǎo)致肝臟損傷從使用pCI/Sayw質(zhì)粒DNA免疫的B6小鼠脾臟產(chǎn)生對HBsAg表位1或表位2(圖1B)特異性的短期CD8+T細(xì)胞。在這些細(xì)胞中有＞95％的細(xì)胞為CD8+，并且在這些CD8+T細(xì)胞中有＞80％的細(xì)胞能誘導(dǎo)表達(dá)IFNγ。將這些細(xì)胞系的5×106個細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移入在肝臟中從轉(zhuǎn)基因表達(dá)HBsAgayw的同類系B6宿主中導(dǎo)致急性肝損傷，如通過血清轉(zhuǎn)氨酶的短期且極大升高所示(圖2)。在轉(zhuǎn)移后5-6天，血清轉(zhuǎn)氨酶水平恢復(fù)正常，此時在宿主中檢測不到CD8+T細(xì)胞。轉(zhuǎn)移相同數(shù)量的多克隆(絲裂原刺激的)CD8+T母細(xì)胞沒有表現(xiàn)出肝損傷。因此，可以確定(i)在HBs-tg小鼠中特異性CD8+T細(xì)胞誘導(dǎo)肝損傷(如在[2]中所述)；(ii)在表達(dá)轉(zhuǎn)基因的肝臟中出現(xiàn)了通過內(nèi)源或外源HBsAg加工產(chǎn)生的HBsAg表位；和(iii)過繼轉(zhuǎn)移進(jìn)入的CD8+T細(xì)胞被迅速地從轉(zhuǎn)基因宿主中去除。所轉(zhuǎn)移的CD8+T細(xì)胞具有不同的HBsAg特異性，因此可以進(jìn)入肝臟并被原位活化，但是不能被穩(wěn)定吸引。
實施例2在脾臟和肝臟中觀察到識別HBsAg表位1和2的Kb限制性CTL開展了關(guān)于疫苗所致敏HBsAg特異性CD8+T細(xì)胞是否能夠進(jìn)入正?；虮磉_(dá)轉(zhuǎn)基因HBsAg(HBs-tg)的B6小鼠肝臟的研究(圖3)。從預(yù)先用pCI/Sayw疫苗免疫12-15天的B6小鼠中分離脾細(xì)胞和非實質(zhì)肝細(xì)胞(NPC)。從來自正常B6小鼠的脾臟和肝臟CD8+T細(xì)胞群中發(fā)現(xiàn)了表位1或表位2特異性的CD8+T細(xì)胞(圖3A)。雖然在肝臟CD8+T細(xì)胞群中HBsAg特異性CD8+T細(xì)胞的頻率高，但是它們的絕對值比脾臟中的小(數(shù)據(jù)未顯示)。相反，在用編碼HBsAgayw的DNA疫苗免疫的HBsAgaywtgB6小鼠中沒有CD8+T細(xì)胞反應(yīng)(圖3B)。用DNA疫苗三次加強(qiáng)免疫注射(間隔為3周)和用HBsAg抗原顆粒及寡核苷酸佐劑重復(fù)免疫均不能在HBs-tg小鼠中產(chǎn)生HBsAg特異性CD8+T細(xì)胞免疫(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，使用小鼠所耐受的相同HBsAg變體進(jìn)行接種的方案不能引發(fā)有效的抗病毒CD8+T細(xì)胞免疫。
實施3Kb限制性T細(xì)胞對HBsAgayw和HBsAgadw2變體的反應(yīng)具有226個氨基酸的HBV株HBsAgayw和HBsAgadw2蛋白質(zhì)不同之處在于16個氨基酸殘基(相應(yīng)的氨基酸同一性為93％)。所使用的HBsAgayw蛋白質(zhì)的序列與HBs-tg B6小鼠所表達(dá)的轉(zhuǎn)基因編碼的HBsAgayw的序列相同。所選擇的HBsAgayw和HBsAgadw2的Kb結(jié)合表位1和2的序列不同之處分別在于表位內(nèi)的1個和2個氨基酸殘基，但是它們的側(cè)翼序列是相同的(圖1A，1B)。HBsAgayw和HBsAgadw2的S208-215表位1存在2個位置的不同adw2中位置2上的纈氨酸(V)被亮氨酸(L)取代，并且位置6上的異亮氨酸(I)被亮氨酸(L)取代(圖1B)。表位1的Kb結(jié)合親和力相當(dāng)?shù)?；與表位的HBsAgayw變體相比，表位1的HBsAgadw2變體表現(xiàn)出更高的Kb結(jié)合親和力(表1)。相反，表位2的Kb結(jié)合親和力高(表1)。
表1免疫原性HBsAg表位對Kb的結(jié)合親和力
用pCI/Sayw或pCI/Sadw2DNA疫苗免疫的B6小鼠表現(xiàn)出對Kb結(jié)合表位1的CD8+T細(xì)胞反應(yīng)，這是在對已經(jīng)用HBsAgayw或HBsAgadw2顆粒或者用HBsAgayw或HBsAgadw2抗原肽S208-215負(fù)載的致敏脾臟CD8+T細(xì)胞進(jìn)行間接體內(nèi)再刺激5小時后觀察到的(圖4A，組2，3)。表位1的ayw和adw2變體交叉反應(yīng)，因為(i)通過pCI/Sayw或pCI/Sadw2能夠使表位1特異性CTL致敏；和(ii)已經(jīng)用HBsAgayw或HBsAgadw2顆?；蛘咭呀?jīng)用肽ILSPFLPL(ayw)或肽IVSPFIPL(adw2)負(fù)載的細(xì)胞向致敏CD8+T細(xì)胞遞呈表位1。因此，8-mer表位1內(nèi)的2個替代不能表現(xiàn)出有效的表位加工、Kb結(jié)合或遞呈。
已經(jīng)用pCI/SaywDNA疫苗致敏的CD8+T細(xì)胞識別HBsAgayw或HBsAgadw2的表位2(S190-197)(圖5A；組2)。這可以通過使用負(fù)載肽的細(xì)胞或者表達(dá)HBsAgayw的轉(zhuǎn)染子間接體內(nèi)再刺激5小時后得到證明。致敏CD8+T細(xì)胞不識別表達(dá)內(nèi)源性HBsAgadw2的轉(zhuǎn)染子。用pCI/Sadw2DNA疫苗免疫不能使表位2特異性T細(xì)胞致敏(圖5A，組3)。用pCI/Sadw2(而不是pCI/Sayw)DNA疫苗致敏的CD8+T細(xì)胞能夠識別轉(zhuǎn)染子所遞呈的表位/限制特異性未知的adw2特異性表位(圖5，組3)。因此第5位氨基酸的替換(將疏水的纈氨酸V交換成疏水的丙氨酸A)抑制表位2的產(chǎn)生，但是不抑制由Kb分子的遞呈[1]。
實施例4交叉反應(yīng)性Kb限制性CD8+T細(xì)胞對HBsAg表位1的反應(yīng)在HBs-tg B6小鼠中致敏HBs-tg B6小鼠在肝臟中從轉(zhuǎn)基因表達(dá)HBsAgayw。HBs-tg小鼠用HBsAgayw(pCI/Sayw)或HBsAgadw2(pCI/Sadw2)免疫(圖4，5B)。使用pCI/SaywDNA疫苗重復(fù)免疫HBs-tg B6小鼠沒有得到CD8+T細(xì)胞反應(yīng)(圖4，5B，組2)。相反，使用pCI/Sadw2DNA疫苗免疫HBs-tg B6小鼠則產(chǎn)生了對HBsAg的CD8+T細(xì)胞反應(yīng)(圖4B，組3)。這種交叉反應(yīng)性的CD8+T細(xì)胞反應(yīng)識別已經(jīng)用HBsAgayw或HBsAgadw2顆?；蛘哂帽砦?的肽形式的ayw或adw2變體負(fù)載的細(xì)胞(圖4B，組3)。這些CD8+T細(xì)胞不識別RBL5/Sayw轉(zhuǎn)染子或者Kb結(jié)合表位2S190-197(圖5B，組3)。CD8+T細(xì)胞表現(xiàn)出對由RBL5/Sadw2轉(zhuǎn)染子(而非RBL5/Sayw轉(zhuǎn)染子)遞呈的未確定決定簇的亞型特異性反應(yīng)(圖5B，組3)。這顯示HBsAg的天然變體能夠通過交叉反應(yīng)性T細(xì)胞免疫的致敏而“打破耐受”。
對于特異性CD8+T細(xì)胞群是否存在于已經(jīng)用pCI/Sadw2免疫的轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生抗原的肝臟中開展了研究。在已經(jīng)用pCI/Sadw2免疫的HBs-tg B6小鼠的脾臟和肝臟NMC中，特異性CD8+T細(xì)胞反應(yīng)性可以存在數(shù)月的時間階段(圖6)。因此，與過繼轉(zhuǎn)移的CD8+T細(xì)胞(圖2)相比，疫苗致敏的抗HBV特異性CD8+T細(xì)胞已經(jīng)進(jìn)入和表現(xiàn)出穩(wěn)定吸引進(jìn)入生產(chǎn)抗原的靶器官中達(dá)至少3個月。
實施例5表現(xiàn)出對HBsAg表位1具有特異性CD8+T細(xì)胞反應(yīng)性的已免疫HBs-tg小鼠肝臟的組織學(xué)HBsAg特異性CD8+T細(xì)胞在產(chǎn)生HBsAg的肝臟中誘導(dǎo)炎性反應(yīng)。未處理的B6小鼠表現(xiàn)出正常肝臟組織學(xué)(圖7A，B)。來自HBs-tg B6小鼠的肝細(xì)胞增大并且表現(xiàn)精細(xì)顆粒、淺色嗜酸性胞質(zhì)，這是在人HBV感染病例中觀察到的“毛玻璃肝細(xì)胞”的特征(圖7C，D)。沒有觀察到炎性細(xì)胞浸潤。
已經(jīng)用pCI/Sadw2(而非pCI/Sayw)DNA疫苗免疫的HBs-tg小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的肝臟組織病理學(xué)(圖7E)。在實質(zhì)(圖7F)和門管周(圖7G)區(qū)發(fā)現(xiàn)的炎性細(xì)胞浸潤主要由單核細(xì)胞組成(圖7F)。大量小的淋巴樣細(xì)胞分布于實質(zhì)和門管周區(qū)。局部化的炎性細(xì)胞群圍繞著凋亡肝細(xì)胞(圖7H)。與未處理HBs-tg小鼠相比，免疫的HBs-tg小鼠肝細(xì)胞的增大和水腫更甚。一些小的細(xì)胞核表現(xiàn)出濃縮的染色質(zhì)和核周暈(圖7F，箭頭)，這表明處于凋亡早期。此外，可觀察到多數(shù)Councilman小體、正在凋亡的肝細(xì)胞(圖7H，箭頭)。一些肝細(xì)胞出現(xiàn)核液泡化(圖7，箭頭)。沒有出現(xiàn)明顯的膽汁郁積。
實施例6HBs-tg小鼠中HBsAg特異性CD8+T細(xì)胞的致敏與抗原血癥的降低相關(guān)未處理HBs-tg小鼠表現(xiàn)出30-50ng/ml的HBsAg血清水平(圖8A)。在HBsAgadw2免疫后發(fā)展出對表位1具有交叉反應(yīng)性的CD+T細(xì)胞的小鼠表現(xiàn)出降低的抗原血癥(抗原水平范圍為5-15ng/ml)，而在HBsAgayw免疫后未發(fā)展出任何HBsAg特異性CD8+T細(xì)胞免疫的動物中抗原血癥水平?jīng)]有變化(圖8A)。因此，在免疫的轉(zhuǎn)基因小鼠中抗原血癥的部分控制與特異性CD8+T細(xì)胞的出現(xiàn)相關(guān)。
實施例7在已經(jīng)使用HBsAgadw2免疫的HBs-tg小鼠中出現(xiàn)了抗HBsAg血清抗體除了T細(xì)胞免疫以外，抗HBsAg體液免疫在監(jiān)測抗原血癥中也起著作用。在疫苗免疫的正常和轉(zhuǎn)基因小鼠中觀察到抗HBsAg血清抗體的存在。用pCL/Sayw或pCL/Sadw2DNA疫苗免疫正常(非轉(zhuǎn)基因)B6小鼠和同系基因HBs-tg B6小鼠兩次。在最后一次免疫2周后，使用能夠確定HBsAg不同亞型的ImxAUSAB測試(Abbott)確定對HBsAg特異性的血清抗體滴度。在已經(jīng)用pCL/Sayw或pCL/Sadw2質(zhì)粒DNA免疫的非轉(zhuǎn)基因小鼠中發(fā)展出高水平的抗HBsAg血清抗體，而HBs-tg小鼠僅在用pCL/Sadw2(而非pCL/Sayw)質(zhì)粒DNA免疫后表現(xiàn)出抗HBsAg的血清抗體反應(yīng)(圖8B)。在用HBsAgayw或HBsAgadw2顆粒免疫的小鼠中觀察到相似的抗體反應(yīng)(數(shù)據(jù)未顯示)。亞型特異性ELISA(使用HBsAgayw或HBsAgadw2顆粒包被的板)表明在正常小鼠中，由所有疫苗產(chǎn)生的＞95％的抗體反應(yīng)是針對HBsAg“a”決定簇的；在HBs-tg小鼠中，＞90％的抗體反應(yīng)是針對adw2特異性決定簇的(數(shù)據(jù)未顯示)。
實施例8在用HBsAg蛋白質(zhì)顆粒免疫的HBs-tg B6小鼠中針對HBsAg表位1的交叉反應(yīng)性Kb限制性CD8+T細(xì)胞反應(yīng)的有效致敏使用亞型ayw或者adw2的HBsAg蛋白質(zhì)顆粒免疫正常B6小鼠導(dǎo)致針對Kb結(jié)合表位1(S208-215)的CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)(圖9A)。因此可以看出，不論疫苗的性質(zhì)如何(蛋白質(zhì)顆粒或者DNA)，具有不同序列的表位能夠引發(fā)交叉反應(yīng)性T細(xì)胞反應(yīng)。與使用DNA疫苗免疫(圖5)相類似，使用亞型ayw的HBsAg蛋白質(zhì)顆粒接種B6小鼠引發(fā)了針對HBsAg Kb限制性表位2(S190-197)的CD8+T細(xì)胞反應(yīng)，而使用亞型adw2的HBsAg蛋白質(zhì)顆粒接種則不能引發(fā)這種反應(yīng)(圖9A)。
使用相當(dāng)于亞型ayw或者亞型adw2的HBsAg蛋白質(zhì)顆粒疫苗免疫HBsayw-tg小鼠。用HBsAgayw蛋白質(zhì)疫苗重復(fù)免疫后沒有產(chǎn)生CD8+T細(xì)胞反應(yīng)，而用異源HBsAgayw蛋白質(zhì)抗原免疫則產(chǎn)生了針對表位1的HBsAg特異性CD8+T細(xì)胞反應(yīng)(圖9B)。因此，表明HBsAg的天然變體能夠通過交叉反應(yīng)性T細(xì)胞反應(yīng)的引發(fā)和通過蛋白質(zhì)亞單位接種打破存在的耐受。
實施例9在用HBsAg天然變體混合物免疫的HBs-tg B6小鼠中針對HBsAg表位1的交叉反應(yīng)性Kb限制性CD8+T細(xì)胞反應(yīng)的有效致敏使用編碼三種HBsAg亞型ayw(pCI/Sayw)、adw2(pCI/Sadw2)和adr(pCI/Sadr)的DNA疫苗(圖10A)以及含有亞型ayw、adw2和adr混合物的HBsAg蛋白質(zhì)顆粒(圖10B)免疫HBsayw-tg小鼠。在用DNA和蛋白質(zhì)顆粒免疫后，HBsAg天然變體混合物均引發(fā)了針對表位1的交叉反應(yīng)性Kb限制性CD+T細(xì)胞反應(yīng)。
實施例10在用HBsAg天然變體混合物免疫之后，HBs-tg小鼠中抗原血癥降低在未處理HBs-tg小鼠中，觀察到30-50ng/ml的血清抗原水平。在用異源性HBsAg疫苗(HBsAgadw2)或者天然HBsAg變體混合物(HBsAgayw+HBsAgadw2+HBsAgadr)免疫之后發(fā)展出針對表位1的交叉反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞反應(yīng)的動物中，抗原血癥降低了(HBsAg水平為5-17ng/ml)。在單獨用同源性HBsAgayw免疫并且因此不能夠產(chǎn)生HBsAg特異性T細(xì)胞免疫的動物中，血清抗原數(shù)量沒有變化。使用HBsAg天然變體的混合物免疫相應(yīng)地導(dǎo)致抗原血癥降低。
實施例11用HBsAg天然變體的混合物免疫之后，HBs-tg小鼠中抗HBsAg血清抗體的誘導(dǎo)在用HBsAgayw、HBsAgadw2、HBsAgadr以及三種亞型的混合物免疫之后，正常B6小鼠出現(xiàn)明顯的抗體反應(yīng)(未顯示)。
研究了免疫之后HBs-tg小鼠中HBsAg特異性血清抗體的形成。HBs-tg小鼠僅在用天然HBsAg變體混合物或者用異源亞型adw2免疫之后才出現(xiàn)血清抗體反應(yīng)。在用同源性亞型ayw免疫之后沒有誘導(dǎo)抗HBsAg反應(yīng)。亞型特異性ELISA(使用HBsAgayw和HBsAgadw2蛋白質(zhì)顆粒包被的微量滴定板)表明在HBs-tg小鼠中＞90％的HBsAg特異性抗體反應(yīng)針對adw2特異性決定簇(數(shù)據(jù)未顯示)。
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<223>HBV亞型adw2/基因型A的HBsAg多肽<400>1Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln1 5 10 15Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu20 25 30Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ser Pro Val Cys35 40 45Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser50 55 60Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe65 70 75 80Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu leu Val85 90 95Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly100 105 110Ser Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala115 120 125Gln Gly Asn Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp130 135 140Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys145 150 155 160
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<223>HBV亞型ayw/基因型D的HBsAg多肽<400>2Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln1 5 10 15Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu20 25 30Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Thr Val Cys35 40 45Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser50 55 60Cys Pro Pro Thr Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe65 70 75 80Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu leu Val85 90 95Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly100 105 110Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Met Thr Thr Ala115 120 125Gln Gly Thr Ser Met Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp130 135 140Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys145 150 155 160Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu165 170 175
Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu180 185 190Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile195 200 205Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val210 215 220Tyr Ile225<210>3<211>8<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220>
<223>HBV亞型adw2HBsAg表位190-197<400>3Val Trp Leu Ser Ala Ile Trp Met1 5<210>4<211>8<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220>
<223>HBV亞型ayw HBsAg表位190-197<400>4Val Trp Leu Ser Ala Ile Trp Met1 5<210>5<211>8<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220>
<223>HBV亞型adw2HBsAg表位208-215<400>5Ile Val Ser Pro Phe Ile Pro Leu1 5<210>6<211>8<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220>
<223>HBV亞型ayw HBsAg表位208-215<400>6Ile Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu1 5<210>7<211>225<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220>
<223>HBV亞型adr/基因型C的HBsAg多肽<400>7Met Glu Asn Thr Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln1 5 10 15Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu20 25 30Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ala Pro Ala Cys35 40 45Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Leu Thr Ser50 55 60Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe65 70 75 80Ile Ile Phe Leu Phe Thr Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu leu Val85 90 95Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly100 105 110Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala115 120 125Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp130 135 140Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg145 150 155 160Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu165 170 175Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu180 185 190Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile195 200 205Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val210 215 220
Tyr Ile22權(quán)利要求
1.包含至少2種乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、其片段和/或編碼它們的核酸的組合物，其中HBsAg在HBsAg S區(qū)或前S1區(qū)的乙型肝炎病毒(HBV)基因型不同，并且組合物不包含HBV核心抗原(HBcAg)或編碼該抗原的核酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于組合物包含至少2種HBsAg和/或至少2種其片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組合物，其特征在于HBsAg的片段包含至少5個氨基酸并且含有T細(xì)胞表位，優(yōu)選地為至少10個、特別是至少20個、更加特別是至少50個氨基酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的組合物，其特征在于片段包含HBsAg的“A決定簇”。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項所述的組合物，其特征在于第一種和第二種片段共同具有至少10個氨基酸、優(yōu)選至少20個氨基酸，但彼此至少有一個氨基酸不同。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于組合物包含至少2種編碼HBsAg或其片段的核酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任意一項所述的組合物，其特征在于基因型選自A、B、C、D、E、F、G或H。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物，其特征在于(i)HBV基因型A具有與Genbank X02763相一致的參考核酸序列、與Genbank AF297621相一致的參考核酸序列或者其核苷酸序列具有至少92％同一性的它們的變體；(ii)HBV基因型B具有與Genbank D00330相一致的參考核酸序列、與Genbank AB073858相一致的參考核酸序列或者其核苷酸序列具有至少92％同一性的它們的變體；(iii))HBV基因型C具有與Genbank AY206389相一致的參考核酸序列、與Genbank AB048704相一致的參考核酸序列或者其核苷酸序列具有至少92％同一性的它們的變體；(iv)HBV基因型D具有與Genbank X02496相一致的參考核酸序列或者其核苷酸序列具有至少92％同一性的其變體；(v)HBV基因型E具有與Genbank X75657相一致的參考核酸序列或者其核苷酸序列具有至少92％同一性的其變體；(vi)HBV基因型F具有與Genbank X69798相一致的參考核酸序列或者其核苷酸序列具有至少92％同一性的其變體；(vii)HBV基因型G具有與Genbank AF160501相一致的參考核酸序列或者其核苷酸序列具有至少92％同一性的其變體；和(viii)HBV基因型H具有與Genbank AY090454相一致的參考核酸序列或者其核苷酸序列具有至少92％同一性的其變體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其特征在于變體編碼其活性基本上相當(dāng)于參考核酸序列所編碼聚合酶活性的聚合酶和/或變體編碼其免疫反應(yīng)性基本上相當(dāng)于參考核酸序列所編碼HBsAg免疫反應(yīng)性的HBsAg。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任意一項所述的組合物，其特征在于組合物包含至少3種、優(yōu)選5種不同的HBsAg、其片段和/或編碼它們的核酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任意一項所述的組合物，其特征在于組合物包含全部已知HBV基因型的HBsAg、其片段和/或編碼它們的核酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任意一項所述的組合物，其特征在于編碼HBsAg或其片段的核酸存在于載體中，其中所述載體處于適于HBsAg在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的啟動子的控制下。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的組合物，其特征在于載體選自質(zhì)粒、腺病毒、痘苗病毒、桿狀病毒、麻疹病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的組合物，其特征在于啟動子選自組成型啟動子和可誘導(dǎo)型啟動子。
15.制備根據(jù)權(quán)利要求1-14中任意一項所述組合物的方法，其包括將各個成分混合的步驟。
16.制備根據(jù)權(quán)利要求1-14中任意一項所述組合物的方法，其包括至少2種編碼HBsAg或其片段的核酸在宿主細(xì)胞、優(yōu)選酵母細(xì)胞、特別是多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)中共表達(dá)。
17.藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-14中任意一項所述的組合物和可藥用載體。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-14中任意一項所述的組合物的用途，其用于治療性治療HBV感染或HBV介導(dǎo)疾病。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-14中任意一項所述的組合物的用途，其用于預(yù)防性治療HBV感染或HBV介導(dǎo)疾病。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或19所述的用途，其特征在于HBV感染是慢性遷延性乙型肝炎。
21.根據(jù)權(quán)利要求18或19所述的用途，其特征在于HBV介導(dǎo)疾病是急慢性乙型肝炎感染、肝硬化或原發(fā)性肝細(xì)胞癌。
22.根據(jù)權(quán)利要求18-21中任意一項所述的用途，其特征在于組合物通過肌內(nèi)、皮下、真皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、粘膜或口服施用。
23.制備用于治療性治療乙型肝炎的藥物的方法，其包括a)確定患者所感染HBV的基因型；和b)提供包含至少一種HBV基因型的HBsAg、其片段或編碼HBsAg的核酸的藥物，其中所述的基因型與根據(jù)a)所確定的患者的HBV基因型不同。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于基因型通過PCR方法確定。
25.包含至少2種HBsAg特異性結(jié)合物的用于診斷HBV感染的基因型的試劑盒，其特征在于2種HBsAg特異性結(jié)合物是對不同HBV基因型特異的。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的試劑盒，其特征在于2種HBsAg特異性結(jié)合物是引物和/或抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含至少2種乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、其片段和/或編碼它們的核酸的組合物，其中HBsAg在S區(qū)和/或前S1區(qū)的HBV基因型不同并且組合物不包含HBV核心抗原(HBcAg)或編碼該抗原的核酸；以及涉及藥物組合物，特別是包含那些用于預(yù)防/治療HBV感染或HBV介導(dǎo)疾病的組合物的疫苗。本發(fā)明還涉及制備用于治療性治療乙型肝炎的患者特異性藥物的方法。
文檔編號C07K14/02GK1874787SQ200480031744
公開日2006年12月6日 申請日期2004年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月29日
發(fā)明者K·梅爾貝爾 申請人:萊因新生物技術(shù)工藝和產(chǎn)品有限公司