專利名稱：聚合寡核苷酸前體藥物的制作方法
相關(guān)申請的交叉參考
本申請要求2003年4月13日提交的美國臨時(shí)專利申請No.60/462,070的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容在此引入作為參考。
發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明涉及用作治療藥物的聚合寡核苷酸前體藥物。同樣也提供了此種前體藥物的成分和用法。

背景技術(shù)：
眾所周知大多數(shù)多細(xì)胞生物的身體狀態(tài)，包括大部分的疾病狀態(tài)，受蛋白質(zhì)的影響。這種蛋白質(zhì)，直接作用或通過它們的酶或者其它功能進(jìn)行作用，決定動(dòng)物和人的大部分的疾病和調(diào)節(jié)功能。對于疾病病癥，經(jīng)典治療通常集中在與這些蛋白質(zhì)相互作用上來努力調(diào)節(jié)它們的發(fā)病或疾病增強(qiáng)功能。在較新的治療方法中，目的為調(diào)節(jié)這些蛋白質(zhì)的實(shí)際產(chǎn)量。通過干涉蛋白質(zhì)的產(chǎn)量，可獲得最大的治療作用和最小的副作用。因此這些治療方法通常的目標(biāo)是干涉或調(diào)節(jié)基因表達(dá)，而其將導(dǎo)致產(chǎn)生不希望的蛋白質(zhì)。
一種抑制特異基因表達(dá)的方法是利用寡核苷酸，特別是與特異性靶信使RNA(mRNA)序列互補(bǔ)的寡核苷酸。通常，互補(bǔ)于基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的核酸序列(例如mRNA)稱為“反義的”，且與轉(zhuǎn)錄本具有相同的序列或成為轉(zhuǎn)錄本的核酸序列稱為“正義的”。參見，例如，Crooke，1992，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol，32329-376。反義寡核苷酸可選擇雜交于全部的或基因的一部分，從而以這樣的方式調(diào)節(jié)基因表達(dá)。轉(zhuǎn)錄因子與雙鏈DNA在轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中相互作用。寡核苷酸可用作轉(zhuǎn)錄因子的競爭性抑制劑來調(diào)節(jié)它們的作用。一些最近的報(bào)告描述了這些相互作用(參見Bielinska，A.，等，1990，Science，250997-1000；和Wu，H.，等.，1990，Gene 89203-209)。
正在發(fā)展分子策略來下調(diào)不需要的基因表達(dá)。最近，通過利用修飾的寡核苷酸化合物已經(jīng)發(fā)展成有前途的針對這些疾病如病毒感染、炎性的和遺傳性紊亂以及重要腫瘤的治療方法。反義DNAs是第一個(gè)被考慮作為直接針對天然存在的核酸的烷化互補(bǔ)寡脫氧核苷酸(Belikova等，Tetrahedron Lett.373557-3562，1967)。Zamecnik和Stephenson最先建議將合成的反義寡核苷酸用于治療的目的。(Zamecnik & Stephenson，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，75285-289；Zamecnik & Stephenson，1978，Proc.Natl.Acatl.Sci.U.S.A.，75280-284)。他們報(bào)道說利用互補(bǔ)于Rous肉瘤病毒的RNA的寡核苷酸13-聚體抑制細(xì)胞培養(yǎng)物中病毒的生長。其后，許多的其它研究已被公開顯示反義寡核苷酸抑制病毒生長的體外效果，例如，水皰性口腔炎病毒(Leonetti等.，1988，Gene，72323)，單純皰疹病毒(Smith等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.832787)，以及流感病毒(Seroa；等，1987，Nucleic Acids Res.159909)。
寡核苷酸也已被用于尤其是診斷試驗(yàn)，研究藥物中例如在PCR技術(shù)及其它實(shí)驗(yàn)方法中的引物。寡核苷酸可常規(guī)合成包括適于目的應(yīng)用的特性。因此許多的化學(xué)修飾已被引入到寡聚化合物中來提高它們作為研究藥物以及作為治療實(shí)體在診斷學(xué)中的用途。
盡管寡核苷酸，特別是反義寡核苷酸具有作為治療藥物的前景，它們對核酶非常敏感且可在它們進(jìn)入目的細(xì)胞之前或之后被快速地降解，使得未修飾的反義寡核苷酸不適用于體內(nèi)系統(tǒng)。因?yàn)樨?fù)責(zé)降解的酶位于大多數(shù)組織中，對寡核苷酸的修飾已被進(jìn)行以試圖穩(wěn)定化合物以及解決這些問題。最廣泛的測試修飾已在寡核苷酸化合物的主鏈部分進(jìn)行。通常參見Uhlmann和Peymann，1990，Chemical Reviews 90，第545-561頁且參考文獻(xiàn)在此引入。在進(jìn)行的許多不同的主鏈中，僅僅硫代磷酸酯顯示顯著的反義活性。參見例如，Padmapriya和Agrawal，1993，Bioorg.& Med.Chenu.Lett.3761。雖然向?qū)胫麈溋蛟訙p緩了酶降解速率，其同樣同時(shí)增加了毒性。添加硫原子的另一個(gè)缺點(diǎn)是其將主鏈由非手性轉(zhuǎn)變?yōu)槭中圆⑶耶a(chǎn)生2n非對映體。此可能引起進(jìn)一步的副作用。該反義寡核苷酸的更進(jìn)一步的缺點(diǎn)是它們可能在磷酸基上攜帶負(fù)電荷，從而抑制其穿過主要親脂性細(xì)胞膜的能力?；衔锉３衷诩?xì)胞外面越久，其降解越多，進(jìn)而導(dǎo)致較少的活性化合物達(dá)到目標(biāo)。該反義化合物進(jìn)一步的缺點(diǎn)是寡核苷酸傾向于形成次級和高階的溶液結(jié)構(gòu)。一旦這些結(jié)構(gòu)形成，它們成為各種酶、蛋白質(zhì)、RNA和DNA結(jié)合的靶。此導(dǎo)致非特異性的副作用并且降低活性物質(zhì)結(jié)合于mRNA的量。其它改善寡核苷酸療法的嘗試包括添加連接部分和聚乙二醇。參見例如，Kawaguchi，等，Stability，Specific Binding Activity，and Plasma Concentration in Mice of an Oligodeoxynucleotide Modified at5′-Terminal with Poly(ethylene glycol)，Biol.Pharm.Bull.，18(3)474-476(1995)，以及US專利No.4,904,582。在這兩個(gè)實(shí)例中，修飾涉及利用本質(zhì)上穩(wěn)定的連接部分來穩(wěn)定化寡核苷酸抵抗降解以及增加細(xì)胞滲透性。然而，這兩種努力未能提供任何的效果。
由于現(xiàn)有方法的不足，人們需要改善對核酶降解的穩(wěn)定性和抗性以及減少毒性和增加對寡核苷酸化合物的mRNA的結(jié)合親合性。
目前的寡核苷酸療法是昂貴的。這主要地取決于降解問題。因此，確實(shí)需要保護(hù)反義寡核苷酸化合物抵抗降解，預(yù)防高階結(jié)構(gòu)的形成并且同時(shí)輸送充分量的活性反義寡核苷酸化合物到達(dá)目標(biāo)。本發(fā)明提供了這些改進(jìn)。
發(fā)明概述 在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了式(I)的寡核苷酸前體藥物
其中 R1和R2獨(dú)立地為H或聚合物殘基； L1和L4獨(dú)立地為選擇的可釋放的連接部分； L2和L3獨(dú)立地為選擇的間隔基團(tuán)； X1為核苷酸殘基或寡核苷酸殘基； m，n，o和p獨(dú)立地為零或正整數(shù)，條件是(o+n)或(p+m)≥2。
本發(fā)明的另一方面包括當(dāng)R1和/或R2為聚合物殘基時(shí)形成的雙功能化合物，包括如在這里描述的α和ω末端連接基團(tuán)使得兩個(gè)寡核苷酸連接于所提供的聚合物遞送系統(tǒng)。此實(shí)施方案的實(shí)例包括通過各自的3′-，5′-末端基團(tuán)連接于聚合物系統(tǒng)的寡核苷酸，例如3′-雙寡核苷酸共軛物或5’-雙寡核苷酸共軛物，或通過第一寡核苷酸的3′-末端連接于第二寡核苷酸的5′末端形成的共軛物。此種聚合物共軛物的實(shí)例圖示在下式(i)，(ii)，(iii)和(iv)中
雙-3’-寡核苷酸，
雙-5’-寡核苷酸，
雙-5’，3’-寡核苷酸，和
雙-3’，5’-寡核苷酸 其中所有的變化如上所述。
對本發(fā)明而言，術(shù)語“殘基”應(yīng)理解為生物學(xué)活性化合物的部分即寡核苷酸，更具體地為反義寡核苷酸，其經(jīng)歷取代反應(yīng)后仍保持的部分，其中前體藥物載體已經(jīng)連接。
對本發(fā)明來說，術(shù)語“聚合物殘基”或“PEG殘基”應(yīng)理解為經(jīng)歷與修飾的寡核苷酸化合物反應(yīng)后仍保持的聚合物或PEG的部分。
對本發(fā)明來說，術(shù)語“烷基”應(yīng)理解為包括直鏈的，支鏈的，取代的，例如鹵素-，烷氧基-，硝基-，C1-12烷基，C3-8環(huán)烷基或取代的環(huán)烷基，等等。
對本發(fā)明來說，術(shù)語“取代的”應(yīng)理解為包括添加或替換一或多個(gè)包含在功能團(tuán)或具有一或多個(gè)不同原子的化合物內(nèi)的原子。
對本發(fā)明來說，取代的烷基包括羧基烷基，氨基烷基，二烷基氨基，羥烷基和硫代烷基；取代的烯基包括羧基烯基，氨基烯基，二烯基氨基，羥基烯基和硫代烯基；取代的炔基包括羧基炔基，氨基炔基，二炔基氨基，羥基炔基和硫代炔基；取代的環(huán)烷基包括諸如4-氯環(huán)己基部分；芳基包括萘基部分；取代的芳基包括諸如3-溴-苯基部分；芳烷基包括諸如甲苯酰基部分；雜烷基包括諸如乙基噻吩部分；取代的雜烷基包括部分諸如3-甲氧基-噻吩部分；烷氧基包括諸如甲氧基部分；以及苯氧基包括諸如3-硝基苯氧基部分。鹵代-應(yīng)理解為包括氟代，氯代，碘代和溴代。
術(shù)語“充分量”或“有效量”在本發(fā)明中是指達(dá)到本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的治療效果的量。
本發(fā)明的一些主要優(yōu)點(diǎn)包括已證明具有增加的對核酸酶降解的穩(wěn)定性和抗性，增加的可溶性，增加的細(xì)胞透性以及減少的毒性的新的聚合寡核苷酸前體藥物。
本發(fā)明化合物的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是多種的聚合物前體藥物平臺可釋放地連接于修飾的寡核苷酸化合物。此優(yōu)點(diǎn)可以使技術(shù)人員設(shè)計(jì)藥物共軛物，其可以被處理來包括聚合物殘基之間的不同部分以及可影響前體藥物水解速率的連接的寡核苷酸。技術(shù)人員因此能夠來包括允許調(diào)節(jié)前體藥物水解速率的取代基。
本發(fā)明也提供了化合物的制備以及諸如在治療癌或惡性腫瘤方法中使用方法，以及在這里描述的共軛物。本發(fā)明的聚合物寡核苷酸前體藥物可考慮與任何其它適當(dāng)?shù)目拱┧幬镆黄?同時(shí)和/或依次)施用。



圖1圖解了制備化合物3和5的PEGylated寡核苷酸的方法。
圖2圖解了制備化合物7和9的PEGylated寡核苷酸的方法。
圖3圖解了制備化合物11，12(SEQ ID NO1)和14(SEQ ID NO1)的PEGylated寡核苷酸的方法。
圖4圖解了制備化合物16(SEQ ID NO1)的PEGylated寡核苷酸的方法。
圖5圖解了由AS 1(SEQ ID NO2)，AS2(SEQ ID NO3)和AS3(SEQ ID NO4)制備化合物17(SEQ ID NO2)，18(SEQ ID NO3)和19(SEQ ID NO4)的PEGylated寡核苷酸的方法。
圖6圖解了制備化合物21(SEQ ID NO1)和22(SEQ ID NO2)的PEGylated寡核苷酸的方法。
圖7圖解了制備化合物24(SEQ ID NO1)和26(SEQ ID NO1)的PEGylated寡核苷酸的方法。
圖8圖解了由AS1(SEQ ID NO2)，AS2(SEQ ID NO3)和AS3(SEQ ID NO4)制備化合物28(SEQ ID NO1)，29(SEQ ID NO2)，30(SEQ ID NO3)和31(SEQ ID NO4)的PEGylated寡核苷酸的方法。
圖9圖解了制備化合物33(SEQ ID NO1)和35(SEQ ID NO1)的PEGylated寡核苷酸的方法。
圖10圖解了化合物14和化合物28對PC3細(xì)胞生長的抑制作用。將0.4×104個(gè)細(xì)胞接種在96-孔平皿中，在Opti-MEM中用化合物14或化合物28(400nM)和Lipofectin(15μg/ml)的復(fù)合物處理24小時(shí)然后在無復(fù)合物的完全培養(yǎng)基中處理。每天測定細(xì)胞活力，以及測定570nm處的吸光率。數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差；n＝4。曲線如下 對照用◆和點(diǎn)曲線標(biāo)記； 400nM處的化合物28用和實(shí)線曲線標(biāo)記； 400nM處的化合物14用▲和虛曲線標(biāo)記； 400nM處的化合物28用

和虛曲線標(biāo)記； 200nM處的化合物14用■和點(diǎn)曲線標(biāo)記。
附圖11A提供了通過化合物14和化合物28寡核苷酸產(chǎn)生的ROS產(chǎn)量的概要(由流細(xì)胞計(jì)數(shù)法分析)，通過檢測細(xì)胞-滲透性2′，7′-二氫二氯熒光素雙乙酸鹽氧化為熒光2′，7′-二氯熒光素(DCF)。PC3細(xì)胞用寡核苷酸(400nM)/Lipofectin(15μg/ml)復(fù)合物處理24小時(shí)，并且3天后如所描述的進(jìn)行測定。平均熒光信道的增加倍數(shù)用未處理的細(xì)胞進(jìn)行校正。實(shí)驗(yàn)并行重復(fù)三次且數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(n＝3)。
附圖11B提供了由化合物14和化合物28寡核苷酸產(chǎn)生的ROS產(chǎn)量(由流細(xì)胞計(jì)數(shù)法分析)的概要，通過檢測氫化溴乙非啶(HE)氧化為溴乙非啶(E)，其隨后插入到具有可通過流式細(xì)胞術(shù)檢測熒光的DNA中進(jìn)行。用寡核苷酸(400nM)/Lipofectin(15μg/ml)復(fù)合物處理PC3細(xì)胞24小時(shí)，3天后如所描述的進(jìn)行測定。平均熒光信道的增加倍數(shù)用未處理的細(xì)胞進(jìn)行校正。實(shí)驗(yàn)并行重復(fù)三次且數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(n＝3)。
圖12是證明在Lipofectin存在下化合物14抑制bcl-2蛋白質(zhì)表達(dá)的Western印跡結(jié)果。PC3細(xì)胞用化合物14寡核苷酸(200，400和800nM)在Lipofectin存在下(+Lipo)和缺乏(-Lipo)時(shí)在Opti-MEM中處理24小時(shí)，然后在完全培養(yǎng)基中進(jìn)一步處理67小時(shí)。通過物質(zhì)和方法部分中描述的Western印跡法分析蛋白質(zhì)樣品(30-40μg的蛋白質(zhì)/泳道)，用微管蛋白用作對照蛋白質(zhì)種類?！癈”表示對照。
發(fā)明詳述 相應(yīng)地，本發(fā)明提供了具有許多實(shí)際用途包括，用作診斷和分析試劑，作為體外和體內(nèi)的分析和研究手段，以及作為治療藥物的聚合物-連接的寡核苷酸前體藥物。為了更充分地理解本發(fā)明的范圍，下列對術(shù)語進(jìn)行定義。技術(shù)人員將理解術(shù)語“核酸”或“核苷酸”是指脫氧核糖核酸(“DNA”)，核糖核酸(“RNA”)，無論單鏈或雙鏈，除非另作說明，及其任意的化學(xué)修飾。“寡核苷酸”通常是相對短的多核苷酸，例如，從約2到約200個(gè)核苷酸的大小，或更優(yōu)選地由約10到約30個(gè)核苷酸的長度。本發(fā)明的寡核苷酸通常是合成的核酸，且是單鏈的，除非另作說明。術(shù)語“多核苷酸”和“多核酸”在這里可用作同義詞。
本發(fā)明對寡核苷酸的修飾任選地包括，例如，用官能團(tuán)或部分添加或取代所選擇的核苷酸，使寡核苷酸共價(jià)連接于理想的聚合物，和/或添加或取代功能性部分，使寡核苷酸加入額外的電荷，極化性，氫鍵，靜電作用和功能性。這些修飾包括，但不限于，2′-位置糖修飾，5-位置嘧啶修飾，8-位置嘌呤修飾，環(huán)外胺的修飾，4-硫尿苷取代，5-溴或5-碘尿嘧啶取代，主鏈修飾，甲基化，堿基對組合諸如異堿基異胞嘧啶和異胍，及其類似的組合。寡核苷酸修飾還可以包括3′和5′修飾諸如封端。
在這里使用的術(shù)語“反義”，是指核苷酸序列互補(bǔ)于編碼基因產(chǎn)物或編碼對照序列的特異性DNA或RNA序列。術(shù)語“反義鏈”是指互補(bǔ)于“正義”鏈的核酸鏈。在正常的細(xì)胞代謝中，DNA分子的正義鏈?zhǔn)蔷幋a多肽和/或其它基因產(chǎn)物的鏈。正義鏈用作模板用于信使RNA(“mRNA”)轉(zhuǎn)錄本(反義鏈)的合成，其隨后直接合成所有的編碼基因產(chǎn)物。反義核酸分子可通過任意本領(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生，包括通過在反方向連接目的基因到允許互補(bǔ)鏈合成的病毒啟動(dòng)子進(jìn)行的合成。一旦導(dǎo)入到細(xì)胞中，此轉(zhuǎn)錄鏈與由細(xì)胞產(chǎn)生的天然序列結(jié)合來形成雙鏈體。此雙鏈體然后阻斷進(jìn)一步轉(zhuǎn)錄或翻譯。在此方式中，可產(chǎn)生突變的表型?！柏?fù)″或(-)同樣是本領(lǐng)域公知的是指反義鏈，且“正的”或(+)同樣是本領(lǐng)域公知的指正義鏈。
例如，如果打算下調(diào)細(xì)胞中mRNA轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)，則將反義寡核苷酸導(dǎo)入到細(xì)胞中。一旦導(dǎo)入到細(xì)胞中，反義寡核苷酸與相應(yīng)的mRNA序列通過Watson-Crick結(jié)合進(jìn)行雜交形成異雙倍體。一旦形成雙鏈，由結(jié)合mRNA的序列編碼的蛋白質(zhì)的翻譯被抑制。因此，反義寡核苷酸在本領(lǐng)域中也用作通常連接標(biāo)簽或標(biāo)記的探針，例如，雜交探針，以及用來提供特異性細(xì)胞產(chǎn)物或遺傳調(diào)控元件表達(dá)的精確下調(diào)從而用于研究和治療兩種目的。
對本發(fā)明而言，單數(shù)或復(fù)數(shù)的應(yīng)用并非是對參考術(shù)語或目標(biāo)數(shù)值的限制。因此，細(xì)胞，聚合物或藥物的單數(shù)的應(yīng)用不意味僅僅治療一個(gè)細(xì)胞，僅僅一個(gè)分子被制備或使用，和/或僅僅一種藥物被使用，且復(fù)數(shù)的應(yīng)用不排除應(yīng)用于單個(gè)參考術(shù)語，除非明確地說明。
對本發(fā)明而言，術(shù)語“殘基”應(yīng)理解為是指生物學(xué)活性物質(zhì)的部分，諸如寡核苷酸，其已經(jīng)進(jìn)行反應(yīng)后仍保持，其中前體藥物載體部分已通過修飾例如，有效的羥基或氨基進(jìn)行連接，來分別形成例如酯或酰胺基。
A.寡核苷酸的描述 本發(fā)明的一個(gè)特征是提供改進(jìn)的核苷酸或寡核苷酸聚合共軛物。在這里描述的聚合物運(yùn)輸系統(tǒng)不限于單個(gè)種類的寡核苷酸但，反而，是指與多種的此類部分一起作用，可以理解聚合物運(yùn)輸系統(tǒng)可連接于一或多種3′-或5′-末端，通常核苷酸的PO4或SO4基團(tuán)。核苷酸序列在這里使用常規(guī)的命名法進(jìn)行描述，其中序列從左至右閱讀，由5′-末端到3′-末端(5′-→3′-)。
X1-3表示相同的或不同的核苷酸或寡核苷酸殘基，其對本發(fā)明來說包括寡脫氧核苷酸殘基。更優(yōu)選地，X1-3是獨(dú)立選擇的反義寡核苷酸殘基或反義寡脫氧核苷酸殘基。
可單獨(dú)或作為寡核苷酸(10-1,000個(gè)核苷酸)的一部分使用的潛在核苷酸的非-限制性實(shí)例包括

其中 M是O或S； B1和B2獨(dú)立地選自A(腺嘌呤)，G(鳥嘌呤)，C(胞嘧啶)，T(胸腺嘧啶)，U(尿嘧啶)和修飾的堿基，包括下面顯示的和普通技術(shù)人員所公知的； R100和R101獨(dú)立地選自H，OR′其中R’是H，C1-6烷基，取代的烷基，硝基，鹵素，芳基等等。
用于本發(fā)明方法的一些寡核苷酸和寡脫氧核苷酸包括，但不限于，下列 具有天然磷酸二酯主鏈或硫代磷酸酯主鏈或任意其它修飾主鏈類似物的寡核苷酸和寡脫氧核苷酸； LNA(鎖核酸)； PNA(具有肽主鏈的核酸)； 三環(huán)-DNA； decoy ODN(雙鏈寡核苷酸)； RNA(催化的RNA序列)； 核酶； spiegelmers(L-構(gòu)象的寡核苷酸)； CpG寡聚物，等等，諸如公開在 Tides 2002，Oligonucleotide and Peptide Technology Conferences，May 6-8，2002，Las Vegas，NV以及 Oligonucleotide & Peptide Technologies，18th & 19th November2003，Hamburg，Germany，其內(nèi)容在此引入作為參考。
本發(fā)明的寡核苷酸可任選地包括任意適當(dāng)?shù)谋绢I(lǐng)域已知的核苷酸類似物和衍生物，包括下面表1所列舉的。

優(yōu)選地，反義寡核苷酸下調(diào)參與腫瘤細(xì)胞針對抗癌治療抗性的蛋白質(zhì)。例如，蛋白質(zhì)BCL-2抑制細(xì)胞色素-C和細(xì)胞凋亡激發(fā)因子從線粒體的釋放并且因此預(yù)防細(xì)胞凋亡的發(fā)生。具有高水平BCL-2的癌細(xì)胞因此對化療或放射治療非常有抗性。US專利No.6,414,134，引入作為參考，描述了下調(diào)節(jié)與大量腫瘤細(xì)胞對抗癌治療的抗性有關(guān)的蛋白Bcl-2的反義寡核苷酸，例如，包括前列腺癌細(xì)胞，骨髓瘤細(xì)胞及其它腫瘤細(xì)胞。根據(jù)上述US專利，bcl-2基因被認(rèn)為主要是通過延長腫瘤細(xì)胞存活而不是通過促進(jìn)細(xì)胞分裂有助于癌的發(fā)病。美國專利No.6,414,134描述了17到35個(gè)堿基長的反義寡核苷酸，其互補(bǔ)于bcl-2mRNA，并且包括具有序列TACCGCGTGC GACCCTC(SEQ IDNO5)的核酸分子。這些優(yōu)選地包括至少一個(gè)硫代磷酸酯鍵。
其它本領(lǐng)域已知的各公司作為通過反義寡核苷酸下調(diào)節(jié)用于癌治療目標(biāo)的細(xì)胞蛋白，概括在下表中。
表2
適于下調(diào)節(jié)與癌細(xì)胞存活相關(guān)的蛋白質(zhì)的表達(dá)諸如bcl-2表達(dá)的反義寡核苷酸，包括從約2到兩百個(gè)核苷酸密碼子的寡核苷酸；更優(yōu)選地十個(gè)到四十個(gè)密碼子；以及最優(yōu)選地約17到20個(gè)密碼子。寡核苷酸優(yōu)選地選自互補(bǔ)于沿著bcl-2的前mRNA的關(guān)鍵位點(diǎn)的那些寡核苷酸，諸如翻譯起始位點(diǎn)，供體和剪接位點(diǎn)，或轉(zhuǎn)運(yùn)或降解位點(diǎn)。
在這些關(guān)鍵的位點(diǎn)阻斷翻譯阻止功能性bcl-2基因產(chǎn)物的形成。然而，應(yīng)能理解，包括互補(bǔ)或基本上互補(bǔ)于抑制細(xì)胞增殖的bcl-2前mRNA或mRNA的寡核苷酸的反密碼寡聚物的任意組合或亞組合適于用在本發(fā)明中。例如，互補(bǔ)于bcl-2 RNA的連續(xù)或非-連續(xù)延伸的序列部分的寡脫氧核苷酸可抑制細(xì)胞增殖，并且將因此適用于本發(fā)明方法中。
適用于下調(diào)節(jié)bcl-2表達(dá)的寡核苷酸同樣包括互補(bǔ)或基本上互補(bǔ)于側(cè)接關(guān)鍵的或其它沿著bcl-2 mRNA的位點(diǎn)的序列部分的寡核苷酸。側(cè)接序列部分優(yōu)選地約兩個(gè)到約一百個(gè)堿基，在沿著bcl-2 mRNA的上述位點(diǎn)的上游或下游。這些位點(diǎn)優(yōu)選地約五個(gè)到約二十個(gè)密碼子長。優(yōu)選的寡核苷酸互補(bǔ)于通常在其它基因的前mRNA或mRNA中不常發(fā)現(xiàn)的前mRNA或mRNA的序列部分，以最小化寡核苷酸與編碼其它基因的前mRNA或mRNA鏈的同源性。
大量優(yōu)選的反義或互補(bǔ)的，下調(diào)節(jié)bcl-2的寡核苷酸列舉在下表3中。

應(yīng)能理解可使用的反義寡核苷酸含有更或較少的取代的核苷酸，和/或沿著bcl-2mRNA鏈在相對于上述表3中所列舉的3′或5′方向進(jìn)一步延伸。
優(yōu)選地，用于本發(fā)明前體藥物的反義寡核苷酸與Genasense(a/k/a奧利默森鈉(oblimersen sodium)，Genta Inc.生產(chǎn)的，Berkeley Heights，NJ)具有相同的或基本上類似的核苷酸序列。Genasense是18-聚體的硫代磷酸酯反義寡核苷酸，TCTCCCAGCGTGCGCCAT(SEQ ID NO1)，也即互補(bǔ)于人bcl-2mRNA的起始序列的最初的六個(gè)密碼子(人bcl-2mRNA是本領(lǐng)域已知的，并且在美國專利6,414,134中描述為SEQ IDNO19，在這里引入作為參考)。美國食品與藥品管理局(FDA)已經(jīng)在2000年8月授予Genasense孤兒藥資格，并且已經(jīng)接受Genasense在癌癥治療中的新藥申請(NDA)。NDA主張Genasense與氮烯唑胺結(jié)合用于以前沒有接收化療的黑色素瘤患者的治療。此外，F(xiàn)DA授予了該申請的優(yōu)先審核，其在2004年6月8號當(dāng)天或之前提出了上市申請。參見Chi等，2001，Clinical Cancer Research Vol.7，3920-3927，引入作為參考，證明了Genasense在前列腺癌早期臨床試驗(yàn)中聯(lián)合治療的活性。本發(fā)明的前體藥物具有與天然的(未修飾的)18-聚體所認(rèn)識的相同應(yīng)用。
Genasense已被表明下調(diào)節(jié)Bcl-2蛋白質(zhì)的產(chǎn)量以及增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對治療的敏感性并且最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。大量研究報(bào)道在用Genasense與抗癌藥物結(jié)合治療中產(chǎn)生希望的結(jié)果。Genasense與氮烯唑胺組合對黑色素瘤患者的I/II階段試驗(yàn)顯示出希望的活性并且正在進(jìn)行階段III多信道試驗(yàn)。此外，Genasense，與米托蒽醌結(jié)合用于激素抗性前列腺癌患者顯示出期望的結(jié)果。Kim等，2001，Id。
反義寡核苷酸諸如Genasense與聚合物的偶聯(lián)作為本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的例子。
在一個(gè)任選的實(shí)施方案中，其它適當(dāng)?shù)姆戳x寡核苷酸包括 T-C-T-C-C-C-A-G-C-G-T-G-C-G-C-C-A-T；(化合物13-SEQ IDNO1) T-C-T-C-C-C-A-G-C-A-T-G-T-G-C-C-A-T；(化合物36-SEQ IDNO2) A-T-C-C-T-A-A-G-C-G-T-G-C-G-C-C-T-T；(化合物37-SEQ IDNO3)和 T-C-T-C-C-C-A-G-X-G-T-G-X-G-C-C-A-T，(化合物38-SEQ IDNO4) 以及在實(shí)施例中的那些反義寡核苷酸。
B.式(I) 在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供了式(I)寡核苷酸前體藥物
其中 R1和R2獨(dú)立地為H或聚合物殘基； L1和L4獨(dú)立地為選擇的可釋放連接部分； L2和L3獨(dú)立地為選擇的間隔基團(tuán)； X1為核苷酸殘基或寡核苷酸殘基；m，n，o和p獨(dú)立地為零或正整數(shù)，條件是(o+n)或(p+m)≥2。
本發(fā)明的聚合物運(yùn)輸系統(tǒng)在某種程度上基于R1和R2的最少一個(gè)，優(yōu)選地為聚合物殘基，任選地具有在這里命名為A的封端基團(tuán)。合適的封端基團(tuán)包括，例如，OH，NH2，SH，CO2H，C1-6烷基，以及含有諸如如下基團(tuán)的寡核苷酸
其中X2和X3與X1相同或?yàn)榱硪环N核苷酸或寡核苷酸殘基。
優(yōu)選的封端基團(tuán)(II)和(III)允許下式(i)，(ii)，(iii)和(iv)的組合物形成
雙-3’-寡核苷酸，
雙-5’-寡核苷酸，
雙-5’，3’-寡核苷酸，和
雙-3’，5’-寡核苷酸， 其中所有的變化如上面描述。
在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，L4為選自下式的可釋放連接部分
其中 Y1-25獨(dú)立地選自O(shè)，S或NR9； R6-7，R9-13，R16-25和R27-41獨(dú)立地選自氫，C1-6烷基，C3-12分支的烷基，C3-8環(huán)烷基，C1-6取代的烷基，C3-8取代的環(huán)烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，C1-6雜烷基，取代的C1-6雜烷基，C1-6烷氧基，苯氧基和C1-6雜烷氧基； Ar為形成多-取代芬香烴或多-取代雜環(huán)基團(tuán)的部分； L5-12獨(dú)立地為雙功能的間隔基； Z選自主動(dòng)運(yùn)輸?shù)桨屑?xì)胞中的部分，疏水性部分，雙功能的連接部分及其組合； c，h，k，l，r，s，v，w，v′，w′，c′，和h′獨(dú)立地為選擇的正整數(shù)； a，e，g，j，t，z，a′，z′，e′和g′獨(dú)立地為零或正整數(shù)；和 b，d，f，i，u，q，b′，d′和f獨(dú)立地為零或一。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，L1為選自下式的可釋放連接部分
其中 Y1’-Y25’獨(dú)立地選自O(shè)，S或NR9； R6′-7′，R9′-13′，R16′-25′，和R27′-41′獨(dú)立地選自氫，C1-6烷基，C3-12分支的烷基，C3-8環(huán)烷基，C1-6取代的烷基，C3-8取代的環(huán)烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，C1-6雜烷基，取代的C1-6雜烷基，C1-6烷氧基，苯氧基和C1-6雜烷氧基；和 L5′-12’獨(dú)立地為雙功能的間隔基。
在本發(fā)明一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，L5-12獨(dú)立地為雙功能的間隔基，選自 -(CH2)3-， -C(O)NH(CH2)3-， -NH(CH2)3-， -(CR55R56)sO(CR57R58)tC(O)- -NR59(CH2)′(OCH2CH2)′NH- -(CH2CH2)sNH- -O(CR55R56)sNH- -NR59(CR57R58)tC(O)NH(CR55R56)sC(O)- -O(CH2)sOC(O)- -NR59(CR55R56)sC(O)- -NR59(CH2)t(OCH2CH2)sNHC(O)- -NR59(OCH2CH2)sOC(O)- -O(CR55R56)sNHC(O)- -O(CR55R56)sOC(O)- (OCH2CH2)sNHC(O)-
且L5′-12’獨(dú)立地為雙功能的間隔基，選自 -(CH2)3-， -(CH2)3NH-C(O)， -(CH2)3NH-， -C(O)(CR57′R58′)s′O(CR55′R56′)t′ -NH(CH2CH2O)S’(CH2)t′NR59′-， -NH(CH2CH2O)s′-， -NH(CR55′R56′)s′O-， -C(O)(CR55′R56′)s′NHC(O)(CR57′R58′)t′NR59′-， -(O)O(CH2)s′O-， -C(O)(CR55′R56′)s′NR59′-， -C(O)NH(CH2CH2O)s′(CH2)t′NR59′-， -C(O)O-(CH2CH2O)s′NR59′-， -C(O)NH(CR55′R56′)s′O-， -C(O)O(CR55′R56′)s′O-， -C(O)NH(CH2CH2O)s′-，
其中 R55-R59且R55′-59′獨(dú)立地選自氫，C1-6烷基，C3-12分支的烷基，C3-8環(huán)烷基，C1-6取代的烷基，C3-8取代的環(huán)烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，C1-6雜烷基，取代的C1-6雜烷基，C1-6烷氧基，苯氧基和C1-6雜烷氧基；和 R60和R60選自氫，C1-6烷基，C3-12分支的烷基，C3-8環(huán)烷基，C1-6取代的烷基，C3-8取代的環(huán)烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，C1-6雜烷基，取代的C1-6雜烷基，C1-6烷氧基，苯氧基和C1-6雜烷氧基，NO2，鹵烷基和鹵素；和 s′和t′各自為正整數(shù)。
在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，L2和L3獨(dú)立地為具有大約1到大約60個(gè)碳原子和約1到約10個(gè)雜原子的間隔基。優(yōu)選地，L2和L3獨(dú)立地為具有約2到約10個(gè)碳原子和約1到約6個(gè)雜原子的間隔基。最優(yōu)選的，L3選自下式 -Q(CR50R51)q′-， -Q(CR50R51)q′O(CR52R53)r′ -Q(CH2CH2O)q′(CR52R53)r′-， -QCR50R51)q′NHC(O)(CR52R53)r′-，
和 -Q(CH2)q′-S-S-(CH2)r′-；和 最優(yōu)選地，L2選自 -(CR50′R51′)q′Q′-， -(CR52′R53′)r′O(CR50′R51′)q′Q′- -(CR52′R53′)r′(OCH2CH2)Q′-， -(CR52′R53′)r′C(O)NH(CR50′R51′)q′Q′-
和 -(CH2)-S-S-(CH2)q’Q- 其中 Q和Q′獨(dú)立地選自O(shè)，S或NH； R50-53和R50′-53′獨(dú)立地選自氫，C1-6烷基，C3-12分支的烷基，C3-8環(huán)烷基，C1-6取代的烷基，C3-8取代的環(huán)烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，C1-6雜烷基，取代的C1-6雜烷基，C1-6烷氧基，苯氧基和C1-6雜烷氧基； R54和R54′選自氫，C1-6烷基，C3-12分支的烷基，C3-8環(huán)烷基，C1-6取代的烷基，C3-8取代的環(huán)烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，C1-6雜烷基，取代的C1-6雜烷基，C1-6烷氧基，苯氧基，C1-6雜烷氧基，NO2，鹵烷基和鹵素；和 q′和r′各自為正整數(shù)。
包括本發(fā)明通式的其它變化，以下為優(yōu)選的 Y1-25和Y1′-25′獨(dú)立地選自基團(tuán)O，S或NR9； R6-7，R9-13，R16-25，R27-41，和R6′-7′，R9′-13′，R16′-25′，和R27′-41′獨(dú)立地選自基團(tuán)氫，C1-6烷基，C3-8環(huán)烷基，芳基，芳烷基，和C1-6雜烷基； c，h，k，l，r，s，v，w，v′，w′，c′，和h′為一； a，e，g，j，t，z，a′，z′，e′和g′獨(dú)立地為零或一；和 b，d，f，i，u，q，b′，d′和f獨(dú)立地為零或一。
在本發(fā)明又一優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供了式(Ia)的化合物
其中 L2為間隔基； X1為核苷酸或寡核苷酸殘基； u’為正整數(shù)；和 T為分支聚合物，其優(yōu)選地選自在PCT公開號WO02/065988和WO02/066066中描述的那些化合物，其內(nèi)容在此引入作為參考。這些通式中，下列的為優(yōu)選的

其中 D’是一個(gè)

其中R61為聚合物殘基諸如R1所定義的，當(dāng)R61顯示在兩個(gè)末端上具有取代時(shí)該聚合物可以是雙功能的；所有的其它變化如上所述。
為進(jìn)行說明，非-限定的式(Ia)化合物為
其中所有的變化如上所述。
式(Ia)的另一方面包括雙功能的化合物，其在當(dāng)聚合物殘基(R61)包括兩個(gè)α和ω末端連接基使得至少四個(gè)寡核苷酸被遞送時(shí)形成的。
這些聚合共軛物的實(shí)例如式(vi)和(vii)所說明的
其中所有的變化如上所述。
在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，L2和L3獨(dú)立地為具有大約1到大約60個(gè)碳原子和約1到約10個(gè)雜原子的間隔基。優(yōu)選地，L2和L3獨(dú)立地為具有約2到約10個(gè)碳原子和約1到約6個(gè)雜原子的間隔基。最優(yōu)選的，L3選自下式 -Q(CR50R51)q′-， -Q(CR50R51)q′O(CR52R53)r′ -Q(CH2CH2O)q′(CR52R53)r′-， -Q(CR50R51)q′NHC(O)(CR52R53)r′-，
和 -Q(CH2)q’-S-S-(CH2)r′-；和 最優(yōu)選地，L2選自 -(CR50′R51′)q′Q′-， -(CR52′R53′)r′O(CR50′R51′)q′Q′- -(CR52′R53′)r′(OCH2CH2)Q′， -(CR52′R53′)r′C(O)NH(CR50′R51′)q′Q′-
和 -(CH2)-S-S-(CH2)q′Q- 其中 Q和Q′獨(dú)立地選自O(shè)，S或NH； R50-53和R50′-53′獨(dú)立地選自氫，C1-6烷基，C3-12分支的烷基，C3-8環(huán)烷基，C1-6取代的烷基，C3-8取代的環(huán)烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，C1-6雜烷基，取代的C1-6雜烷基，C1-6烷氧基，苯氧基和C1-6雜烷氧基； R54和R54′獨(dú)立地選自氫，C1-6烷基，C3-12分支的烷基，C3-8環(huán)烷基，C1-6取代的烷基，C3-8取代的環(huán)烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，C1-6雜烷基，取代的C1-6雜烷基，C1-6烷氧基，苯氧基，C1-6雜烷氧基，NO2，鹵烷基和鹵素；和 q′和r′各自為正整數(shù)。
關(guān)于包括本發(fā)明通式的變化，以下的為優(yōu)選的 Y1-25和Y1′-25′獨(dú)立地選自基團(tuán)O，S或NR9； R6-7，R9-13，R16-25，R27-41，和R6′-7′，R9′-13′，R16′-25′，和R27′-41′獨(dú)立地選自氫，C1-6烷基，C3-8環(huán)烷基，芳基，芳烷基，和C1-6雜烷基； c，h，k，l，r，s，v，w，v′，w′，c′，和h′為一； a，e，g，j，t，z，a′，z′，e′和g′獨(dú)立地為零或一；和 b，d，f，i，u，q，b′，d′和f獨(dú)立地為零或一。
C.Ar部分的描述 在本發(fā)明的特定方面，能夠看出Ar部分是其當(dāng)包含在式(I)內(nèi)時(shí)形成多-取代芳香烴或多-取代雜環(huán)基團(tuán)的部分。主要特征是Ar部分本質(zhì)上是芳香族的。通常，對芳香烴而言，π電子必須共享在環(huán)狀分子平面的上或下方的“電子云”內(nèi)。此外，π電子的數(shù)目必須滿足休克爾規(guī)則(4n+2)。普通技術(shù)人員能夠理解無數(shù)的部分將滿足式(I)部分的芳香烴的要求且因此適于在這里使用。
一些尤其優(yōu)選的芳香基包括
其中R62-67獨(dú)立地選自與定義的R6相同的基團(tuán)。
其它優(yōu)選的芳香烴部分包括，但不限于
其中E和E’獨(dú)立地為CR68或NR69；且J為O，S或NR70，其中R68-70選自與定義R6相同的基團(tuán)或氰基，硝基，羧基，?；?，取代的?；螋然榛Ｎ搴土h(huán)的異構(gòu)體也被考慮以及苯并-和二苯并-系統(tǒng)及其相關(guān)的同源物也被考慮在內(nèi)。普通技術(shù)人員能夠理解芳香環(huán)可任選地用雜原子諸如O，S，NR9等取代。只要其符合休克爾規(guī)則。
此外，芳香族的或雜環(huán)結(jié)構(gòu)可任選地用鹵素和/或如本領(lǐng)域通常理解的側(cè)鏈取代。
D.聚醚 關(guān)于式(I)能夠看出其中的R1和R2為聚合部分諸如聚醚。這些聚合物的合適實(shí)例包括聚乙二醇，其基本上是非-抗原性的。同樣有用的為聚丙二醇，諸如通常在USNo.5,643,575，5,919,455和6,113,906描述的。其它對本發(fā)明方法有用的PEG描述在Shearwater Polymers，Inc.catalog″Polyethylene Glycol and Derivatives 2001″中。每一內(nèi)容引入作為參考。R1和R2優(yōu)選地為PEG衍生物，例如-O-(CH2CH2O)x-。在此方面，R1-2獨(dú)立地選自 J-O-(CH2CH2O)n， -J-O-(CH2CH2O)n，-CH2C(O)-O-， J-O-(CH2CH2O)n′-CH2CH2NR48-， J-O-(CH2CH2O)n-CH2CH2SH， -O-C(O)CH2-O-(CH2CH2O)n’-CH2C(O)-O-， -NR48CH2CH2-O-(CH2CH2O)n’-CH2CH2NR48-， -SHCH2CH2-O-(CH2CH2O)n′-CH2CH2SH-， 其中 n’為選擇的聚合度，使得加權(quán)平均分子量為至少約2,000Da到約136,000Da； R48選自氫，C1-6烷基，C3-12分支的烷基，C3-8環(huán)烷基，C1-6取代的烷基，C3-8取代的環(huán)烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，C1-6雜烷基，取代的C1-6雜烷基，C1-6烷氧基，苯氧基和C1-6雜烷氧基；和 J為封端基團(tuán)諸如甲基或互補(bǔ)連接基團(tuán)其可以提供雙功能的聚合物。
盡管PAO’s和PEG’s在加權(quán)平均分子量上基本上可以改變，優(yōu)選地，在本發(fā)明的大多數(shù)方面，R1和R2獨(dú)立地具有約2,000Da到約136,000Da的加權(quán)平均分子量。更優(yōu)選地，R1和R2獨(dú)立地具有約3,000Da到約100,000Da的加權(quán)平均分子量，最優(yōu)選具有約5,000Da到約40,000Da加權(quán)平均分子量。
在這里包括的聚合物優(yōu)選地室溫下是水溶性的。此種聚合物非-限制性的例子包括聚醚同聚物諸如聚乙二醇(PEG)或聚丙烯乙二醇，聚氧乙烯化多元醇，其共聚物及其嵌段共聚物，只要保持嵌段共聚物的水溶性。
E 寡核苷酸聚合物共軛物的合成 通常制備前體藥物是通過如下步驟制備的 a)將式 R2-L4-離去基團(tuán) 的化合物 與式 H-L3-X1的化合物 在足以形成下式前體藥物的條件下反應(yīng) R2-L4-L3-X1， 其中 R2是聚合物殘基； L4是可釋放的連接部分； L2為間隔基； X1為核苷酸或寡核苷酸殘基。
在本發(fā)明的這個(gè)方面，優(yōu)選使用激活的聚合物其已含有所連接的可釋放接頭。合適組合的非限制性的例子包括在美國專利Nos.6,624,142，6,303,569，5,965,119，6,566,506.5,965,119，6,303,569，6,624,142，和6,180,095描述的基于可釋放PEG的運(yùn)輸系統(tǒng)。每一內(nèi)容在這里引入作為參考。
特定的實(shí)例包括但不限于，
可以理解聚合物部分的分子量可以根據(jù)技術(shù)人員的需要進(jìn)行變化。
然后上面所示的聚合物的可釋放接頭與修飾的寡聚物在足以允許共軛物形成的條件下反應(yīng)。
如上所述的任意核苷酸或寡核苷酸可在5′-或3′-末端磷酸酯或硫代磷酸酯中的一個(gè)利用常規(guī)技術(shù)功能化，諸如利用亞磷酰胺法連接目的烷基-氨基或其它基團(tuán)到末端磷酸上。例如，連接被保護(hù)的(Fmoc)氨基烷基，生成的化合物被氧化、去保護(hù)和純化。
特異性寡核苷酸聚合共軛物或前體藥物的合成描述在實(shí)施例中。任選地，可通過下述來制備 1)將激活的PEG聚合物與保護(hù)的雙功能可釋放的連接基團(tuán)在合適的偶聯(lián)條件下反應(yīng)來形成第一中間體， 2)用合適的活化基團(tuán)諸如NHS酯去保護(hù)和激活步驟1)的中間體，和 3)將步驟2)的激活中間體與在PBS緩沖系統(tǒng)中的修飾寡核苷酸反應(yīng)來獲得目的寡核苷酸聚合物前體藥物。
活化聚合物的非-限制性實(shí)例包括二-琥珀酰碳酸酯活化的PEG(SC-PEG)，二-四氫噻唑-2-硫酮激活的PEG(T-PEG)，N-羥基鄰苯二酰胺基碳酸酯激活的PEG(BSC-PEG)，(通常參見USSN 09/823,296，其內(nèi)容在這里引入作為參考)，琥珀酰琥珀酸酯激活的PEG(SS-PEG)和單-激活的PEG，諸如例如參見上述的2001Shearwater目錄。
激活的PEG聚合物與保護(hù)的雙功能可釋放連接基團(tuán)的偶聯(lián)可在偶聯(lián)劑的存在下進(jìn)行。合適偶聯(lián)劑的非-限制性列舉包括1，3-二異丙基碳二亞胺(DIPC)，任意合適的二烷基碳二亞胺，2-鹵素-1-烷基-吡啶鹵化物(Mukaiyama試劑)，1-(3二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)，丙烷膦酸環(huán)酸酐(PPACA)和苯基二氯磷酸酯等等。其可獲自，例如商業(yè)來源諸如Sigma-Aldrich Chemical，或利用已知技術(shù)進(jìn)行合成。
優(yōu)選地取代基在惰性溶劑諸如四氫呋喃(THF)，乙腈(CH3CN)，二氯甲烷(DCM)，氯仿(CHCl3)，二甲基甲酰胺(DMF)或其混合物中以及在0℃至22℃(室溫)下反應(yīng)。
修飾的寡核苷酸與PEG-可釋放接頭的偶聯(lián)可在約7.4-8.5pH的PBS緩沖系統(tǒng)中進(jìn)行。技術(shù)人員能夠理解在這里描述的前體藥物的合成，同樣包括使用通常的實(shí)驗(yàn)室條件，即，諸如在實(shí)施例中描述的溶劑，溫度，偶聯(lián)劑等等。
與選擇的合成無關(guān)，由在這里描述的合成技術(shù)產(chǎn)生的一些優(yōu)選化合物包括


表示寡核苷酸和末端磷酸酯修飾的點(diǎn)且mPEG為CH3-O-(CH2-CH2-O)x-；其中x是選自約10到約2300的正整數(shù)。
本發(fā)明更優(yōu)選的化合物包括

G. 處理方法 本發(fā)明的另一方面提供了哺乳動(dòng)物中使用不同藥物的治療方法。方法包括對需要此種治療的哺乳動(dòng)物進(jìn)行施用有效量的寡核苷酸前體藥物，其已通過在這里的描述進(jìn)行制備。組合物用于，尤其是，治療腫瘤疾病，降低腫瘤重量，預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)防腫瘤/腫瘤發(fā)展、肝臟疾病、病毒病諸如哺乳動(dòng)物中HIV的復(fù)發(fā)。本發(fā)明的前體藥物無論是天然的寡核苷酸或反義寡核苷酸可用于，即腫瘤治療等等。簡單舉例來說，本發(fā)明的前體藥物可用于治療多發(fā)性骨髓瘤，慢性淋巴細(xì)胞性白血病，非-小細(xì)胞肺癌，小細(xì)胞肺癌，前列腺腫瘤及其它腫瘤或大量提及的常見腫瘤。
前體藥物施用的量取決于母體分子包括待治療的病癥。通常，治療方法中使用的前體藥物量為有效地實(shí)現(xiàn)哺乳動(dòng)物目的治療的量。自然地，不同前體藥物化合物的劑量將根據(jù)母體化合物，體內(nèi)水解的速率，聚合物的分子量等等進(jìn)行變化。上面闡述的范圍是說明性的且本領(lǐng)域技術(shù)人員將基于臨床經(jīng)驗(yàn)和治療效果確定前體藥物的最佳劑量。無需過多試驗(yàn)實(shí)際的劑量對于實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員而言是顯而易見的。
本發(fā)明的前體藥物可包含在一或多個(gè)合適的藥物組合物中來施用于哺乳動(dòng)物。藥物組合物可以是根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行制備的溶液，懸浮液，片劑，膠囊等劑型?？紤]到這些組合物的施用可以取決于技術(shù)人員需要通過口服和/或非腸道途徑來進(jìn)行。組合物的溶液和/或懸浮液可用于，例如，作為運(yùn)輸載體來通過任意本領(lǐng)域已知的方法注射或滲透組合物，例如，通過靜脈內(nèi)，肌內(nèi)，皮下注射等等進(jìn)行。
施用也可通過注入到身體間隔或腔中，以及通過吸入和/或鼻內(nèi)途徑進(jìn)行。然而，在本發(fā)明的優(yōu)選方面，前體藥物通過非腸胃方式施用于需要的哺乳動(dòng)物。
本發(fā)明的前體藥物可以與其它本領(lǐng)域已知的抗癌劑組合施用(例如，同時(shí)和/或連續(xù)地)。合適的抗癌藥物包括，例如(紫杉醇；BristolMyers Squibb)；

(伊立替康(Irinotecan)；Pfizer.)；

(Imatiinib Mesylate；Novartis)；

(美羅華(Rituximab)；Genentech/IDEC)；

(氟達(dá)拉濱(Fludarabine)；BeRlex Labs)；

(環(huán)磷酰胺；Bristol Myers Squibb)；

(多烯紫衫醇；Aventis Phannaceuticals)；

(吉妥珠單抗奧唑米星(Gemtuzumabozogamicin)；Wyeth-Ayerst)；阿糖胞苷和/或地塞米松，略舉幾個(gè)這些藥物。
實(shí)施例 下列實(shí)施例用來提供對本發(fā)明進(jìn)一步的理解，但并非以任何方式限制本發(fā)明的有效范圍。實(shí)施例中加下劃線和黑體的數(shù)字對應(yīng)于附圖中所示。在每一附圖中，糖部分和磷酸酯主鏈表示為

堿基＝A，G，C，或T 或簡單表示為-。
mPEG應(yīng)被理解表示
常規(guī)方法。PEG接頭和寡核苷酸之間的所有偶聯(lián)反應(yīng)在PBS緩沖系統(tǒng)中在室溫下進(jìn)行。通常用有機(jī)溶劑提取除去未反應(yīng)的寡核苷酸，進(jìn)一步用陰離子交換層析由未反應(yīng)的過量PEG接頭分離PEG-寡共軛物來產(chǎn)生純的產(chǎn)物。
HPLC方法通過使用具有多微波UV檢測器的

300SBC-8反相柱(150×4.6mm)或Phenomenex

300A C18反相柱(150×4.6mm)的Beckman Coulter System

HPLC裝置，利用在0.5％三氟乙酸(TFA)中的30-90％的乙腈和在50mM TEAA緩沖液中的25-35％乙腈的梯度以及4mM TBAC1的1mL/分鐘的流速，監(jiān)控反應(yīng)混合物和中間體和終產(chǎn)物的純度。在購自Applied Biosystems的Bio-Cad700E Perfusion Chromatography Workstation上，利用購自AppliedBiosystems的Poros 50HQ強(qiáng)陰離子交換樹脂或購自AmershamBiosciences的包裝在獲自Waters的AP-Empty玻璃柱中的DEAESepharose速流弱陰離子交換樹脂進(jìn)行陰離子交換色譜層析。通過利用購自Amersham Biosciences的HiPrep 26/10或PD-10脫鹽柱實(shí)現(xiàn)脫鹽。
實(shí)施例1 化合物3.化合物1(440mg，0.036mmol)和2(5mg，3.6nmol)的PBS緩沖液(10mL，pH 7.4)溶液在室溫下攪拌12小時(shí)。用二氯甲烷(DCM，3×10mL)提取反應(yīng)溶液并且干燥(MgSO4)，過濾混合的有機(jī)層，以及減壓蒸發(fā)溶劑。殘余物溶于重蒸水(1.5mL，每100mg)并且上樣在HQ/10Poros強(qiáng)陰離子交換柱(10mm×60mm，柱床體積～6mL)上。用水(3～4柱體積)洗脫未反應(yīng)的PEG接頭，然后用0.2M NH4HCO3溶液(～2柱體積)洗脫產(chǎn)物。收集含有純產(chǎn)物的組分并且冷凍干燥產(chǎn)生純化的3(19mg，1.44mmol，40％)。
實(shí)施例2-6 以類似于3的方式制備和純化化合物5，7，9，11，和12，產(chǎn)率由30％到50％。
實(shí)施例7 化合物14.向化合物13(10mg，1.7μmol)的PBS緩沖液(5mL，pH7.4)溶液中每一小時(shí)添加被分成五個(gè)相等部分的化合物10(175mg，85μmol)中并且在室溫下攪拌12小時(shí)。用DCM(3×10mL)和鹽水(10mL)提取反應(yīng)溶液，并且干燥(MgSO4)、過濾混合的有機(jī)層，以及減壓蒸發(fā)溶劑。殘余物溶于重蒸水(1.5mL)并且上樣到DEAE速流弱陰離子交換柱(10mm×60mm，柱床體積～6mL)上，陰離子交換柱用20mM tris-HCl緩沖液，pH 7.4預(yù)平衡。未反應(yīng)的PEG接頭用水(3到4柱體積)洗脫并且用在20mM Tris-HCl緩沖液pH 7.4中的0到100％的1M NaCl的梯度洗脫10分鐘，然后用100％1M NaCl以3mL/分鐘的流速洗脫10分鐘。收集含有純產(chǎn)物的組分并且用0.2MNH4HCO3溶液(～2柱體積)在PD-10脫鹽柱上脫鹽，冷凍干燥產(chǎn)生的溶液來產(chǎn)生純的14(25mg，0.95μmol，57％)。
實(shí)施例8 用與化合物14相同的方法制備和純化化合物16，產(chǎn)率為60％。
實(shí)施例9 化合物17.兩個(gè)小時(shí)內(nèi)向AS1(5mg，0.85μmol)的磷酸緩沖液溶液添加到被分成五個(gè)相等部分的化合物10(175mg，0.085mmol)中，并且在室溫下攪拌生成的溶液另外兩個(gè)小時(shí)。用DCM(3×6mL)和鹽水(5mL)提取反應(yīng)溶液，并且干燥(MgSO4)、過濾混合的有機(jī)層，以及減壓蒸發(fā)溶劑。殘余物溶于重蒸水(5mL)并且上樣到DEAE速流弱陰離子交換柱(10mm×60mm，柱床體積～6mL)上，陰離子交換柱用20mM tris-HCl緩沖液，pH 7.4預(yù)平衡。未反應(yīng)的的PEG接頭用水(3到4柱體積)洗脫并且用0到100％的1M NaCl的20mM Tris-HCl緩沖液，pH 7.4溶液的梯度洗脫10分鐘，然后用100％1M NaCl以3mL/分鐘的流速洗脫10分鐘。收集含有純產(chǎn)物的組分并且通過PD-10脫鹽柱脫鹽，冷凍干燥產(chǎn)生的溶液來產(chǎn)生純的化合物17(15mg，0.57μmol，67％)。
實(shí)施例10-11 通過與17相同的方法制備和純化化合物18和19，終產(chǎn)物產(chǎn)率67％，利用AS2和AS3代替AS1。
實(shí)施例12-15 通過和14相同的方式制備和純化化合物21，用20取代12，具有90％的產(chǎn)率。
通過和14相同的方式制備和純化化合物22，通過用20取代12，具有90％的產(chǎn)率。
通過與14相同的方法制備和純化化合物24，通過用23取代12，而且對于脫鹽而言，用水(～2柱體積)而不是0.2M NH4HCO3溶液來洗脫產(chǎn)物。終產(chǎn)率30％。
通過與24相同的方法制備和純化化合物26，用25取代23。產(chǎn)率為30％。
實(shí)施例16 化合物27.向化合物13(10mg，1.7μmol)的磷酸鹽緩沖液(5mL，pH 8.5)溶液添加分成十等分的27(180mg，0.084mmol)中，并且產(chǎn)生的溶液在室溫下攪拌4天時(shí)間。用DCM(3×10mL)和鹽水(10mL)提取反應(yīng)溶液，并且干燥(MgSO4)、過濾混合的有機(jī)層，以及減壓蒸發(fā)溶劑。殘余物溶于重蒸水(1.5mL)并且上樣到DEAE速流弱陰離子交換柱(10mm×60mm，柱床體積～6mL)上，陰離子交換柱用20mMtris-HCl緩沖液，pH 7.4預(yù)平衡。未反應(yīng)的PEG接頭用水(3到4柱體積)洗脫并且用在20mM Tris-HCl緩沖液pH 7.4中的0到100％的1MNaCl的梯度洗脫10分鐘，然后用100％1M NaCl以3mL/分鐘的流速洗脫10分鐘。收集含有純產(chǎn)物的組分并且通過PD-10脫鹽柱脫鹽，冷凍干燥產(chǎn)生的溶液來產(chǎn)生純的化合物14(105mg，0.0102mmol，60％)。通過HPLC測定產(chǎn)物的純度。
實(shí)施例17-21 通過與28相同的方法制備和純化化合物29，30和31，除了用AS1，AS2和AS3分別替代13。每一終產(chǎn)物獲得65％的產(chǎn)率。
通過和14相同的方式制備和純化化合物33，用32取代12，具有76％的產(chǎn)率。
通過與14相同的方法制備和純化化合物35，除了用活化的PEG 34代替10。最終產(chǎn)率為30％。
生物學(xué)數(shù)據(jù) PEG-寡共軛物的一些體外特性列舉如下 表4.PEG-寡共軛物的體外特性 PEI＝磷酸二酯酶I，5’-核酸外切酶，在37℃，pH 8.8TEAA緩沖液中有動(dòng)力學(xué)特性；PEII＝磷酸二酯酶II，3’-核酸外切酶，在37℃，pH6.5TEAA緩沖液中有動(dòng)力學(xué)特性，核酸酶P1＝核酸內(nèi)切酶，在37℃。pH 5.3TEAA緩沖液中有動(dòng)力學(xué)特性；所有的酶1單元釋放1μmol的寡核苷酸。
PEG-寡共軛物在ICR小鼠中的藥物動(dòng)力學(xué)。
基本方法 1)動(dòng)物飼養(yǎng)在飼養(yǎng)箱的每一籠中飼養(yǎng)6個(gè)小鼠。根據(jù)國家研究委員會的“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用指南”，確定籠的大小。
2)飲食小鼠飲用自來水并且無限制喂養(yǎng)的市售實(shí)驗(yàn)室食物。
3)化合物制備化合物13溶于4.0mL鹽水中且化合物14溶于4.1mL鹽水中。
4)施用位點(diǎn)化合物13和14通過尾部靜脈單劑量(第1天)施用。試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)下列設(shè)計(jì)，60個(gè)小鼠被分配，施用和取血，通過下表5顯示。
表5
*寡核苷酸等價(jià)物 三個(gè)未處理的小鼠通過心臟穿刺取血到含有EDTA的管中來收集未處理的對照血漿。
每一小鼠靜脈注射100μL的天然化合物13和14。然后用0.09％Avertin鎮(zhèn)靜，最后小鼠通過心臟穿刺取血～1000μl。將血液收集到含有EDTA的管瓶中。離心血液后收集血漿并且立即在干冰上-80℃冷凍。
臨床檢查 注入試驗(yàn)制品后每天目測小鼠一次，測定死亡率和對處理的反應(yīng)信號。記錄任何死亡和臨床信號。僅僅在注射當(dāng)天之前測定體重。
以類似的方式進(jìn)行化合物28和33的藥物動(dòng)力學(xué)研究。
試驗(yàn)結(jié)果 藥物動(dòng)力學(xué)結(jié)果概括在下表6中。
表6.PEG-寡共軛物的體內(nèi)特性 實(shí)施例22-25 反義PEG共軛物體外活性的證實(shí) Bcl-2蛋白已被表明在前列腺癌細(xì)胞中具有顯著的抗-細(xì)胞凋亡活性。bcl-2蛋白質(zhì)在前列腺癌細(xì)胞中的下調(diào)通過細(xì)胞死亡被證實(shí)，且通過bcl-2反義PEG共軛物誘導(dǎo)細(xì)胞死亡被用于證實(shí)反義寡核苷酸細(xì)胞內(nèi)的成功遞送。
用于實(shí)施例22-25的材料和方法 試驗(yàn)化合物列舉在下表7中。
表7
這些通過上面所述進(jìn)行制備。
細(xì)胞培養(yǎng) 將獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type CultureCollection，Rockville，MD)的無支原體的PC3細(xì)胞培養(yǎng)在Roswell ParkMemorial Institute培養(yǎng)基(″RPMI″)(Invitrogen，Grand Island，NY)中，該培養(yǎng)基添加了10％胎兒牛血清(“FBS”)，含有10％(v/v)加熱滅活(56℃)的FBS，補(bǔ)充有1％非必需氨基酸，1％丙酮酸鹽，25mM HEPES(N-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙基磺酸)緩沖液，100U/ml的青霉素G鈉和100μg/ml的鏈霉素硫酸鹽。母種培養(yǎng)物保持在37℃，濕度5％的CO2恒溫箱中。
試劑 FBS和Lipofectin(陽離子脂N-[1-(2，3-二油?；趸?丙基]-n，n，n-三甲基氯化銨的脂質(zhì)體制劑)購自Invitrogen(Grand Island，NY)?？?bcl-2單克隆抗體購自Dako(Carpinteria，CA)?？?α-微管蛋白單克隆抗體和3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(“MTT”)購自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。通過標(biāo)準(zhǔn)方法合成和純化硫代磷酸寡核苷酸。
寡核苷酸轉(zhuǎn)染 在實(shí)驗(yàn)之前一天將細(xì)胞以25×104細(xì)胞/孔的密度接種在6-孔平板中，使得實(shí)驗(yàn)當(dāng)天鋪滿60-70％。所有轉(zhuǎn)染按照生產(chǎn)商的說明在無FBS存在下在Opti-MEM培養(yǎng)基中進(jìn)行。將合適量的試劑稀釋在100μl的Opti-MEM培養(yǎng)基中來產(chǎn)生Lipofectin和寡核苷酸的最終濃度。輕輕混合溶液并且在室溫下預(yù)溫育30分鐘來形成復(fù)合物。然后，添加800μl的Opti-MEM，混合溶液，并且覆蓋在已經(jīng)預(yù)先用Opti-MEM沖洗的細(xì)胞上。寡核苷酸/Lipofectin復(fù)合物在Opti-MEM中的溫育時(shí)間為24小時(shí)，然后在含有10％FBS的完全培養(yǎng)基中溫育。在37℃細(xì)胞溶解和蛋白質(zhì)分離之前的總溫育時(shí)間通常為72小時(shí)。
Western印跡分析 用寡核苷酸-脂類復(fù)合物處理的細(xì)胞在PBS中沖洗，然后在裂解緩沖液[50mM Tris-HCl pH 7.4，1％NP-40，0.25％脫氧膽酸鈉，150mMNaCl，1mM EGTA，50μg/ml Pefabloc SC，15μg/ml抑肽酶，亮抑酶肽，胰凝乳蛋白酶抑制劑，抑胃酶肽A，1mM Na3VO4，1mM NaF]中4℃下提取1小時(shí)。通過14000g，4℃下離心20分鐘除去細(xì)胞碎片。利用Bio-Rad蛋白質(zhì)分析系統(tǒng)(Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室，Richmond，CA)測定蛋白質(zhì)濃度。細(xì)胞提取物的等分試樣，含有25-40μg的蛋白質(zhì)，通過SDS-PAGE溶解，然后轉(zhuǎn)到Hybond ECL濾紙(Amersham，AR1ingtonHeights，IL)，并且室溫下在含有0.5％Tween-20的5％BSA的PBS溶液中溫育濾紙1-2小時(shí)。然后用抗bcl-2抗體在含有0.5％Tween-20的5％BSA的PBS溶液的1∶500稀釋液于4℃過夜探針標(biāo)記濾紙。在含有0.5％Tween-20的PBS中沖洗后，室溫下在5％牛奶的含有0.5％Tween的PBS溶液中與過氧化物酶-共軛物次級抗體(Amersham)的1∶3,000稀釋液一起溫育濾紙1小時(shí)。沖洗后(3×10分鐘)，根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光檢測(“ECL″)。
細(xì)胞增殖速率的測定 通過MTT試驗(yàn)測定對PEG共軛物的細(xì)胞活性的影響。簡要地，將15-20×104細(xì)胞接種在6-孔平皿中并且允許附著過夜。然后在37℃用合適的濃度的寡核苷酸-Lipofectin復(fù)合體處理細(xì)胞24小時(shí)，然后在含有10％FBS的完全培養(yǎng)基(100μl)中溫育。每天測定細(xì)胞活性。將10μl的5mg/ml MTT的PBS溶液添加至每一孔中，然后37℃溫育4小時(shí)。然后，將100μl的10％SDS的0.04MHC1添加于每一孔中，繼之以37℃溫育過夜來溶解甲臜晶體。用Benchmark加微板分光光度計(jì)(Bio Rad，Hercules，CA)在570nm處測定吸光率。并行進(jìn)行6個(gè)實(shí)驗(yàn)，并且數(shù)據(jù)表示為平均值+/-S.D。
胞內(nèi)ROS水平的定量測定 2′，7′-二氯二氫熒光素雙乙酸鹽(H2DCF-DA)和二氫溴乙非啶(HE)用于測定活性氧的種類(“ROS”)和過氧化物水平。兩個(gè)色素是非熒光的并且可自由擴(kuò)散到細(xì)胞中。當(dāng)HE氧化為溴乙非啶(E)時(shí)，其插入到細(xì)胞DNA中并且發(fā)熒光。H2DCF-DA的氧化產(chǎn)生2’-7’二氯熒光素(DCF)，其也發(fā)熒光，并且兩種可通過流細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測。通過胰酶消化收集細(xì)胞，用PBS沖洗以及用50μM H2DCF-DA或50μM HE的無酚紅DMEM溶液在37℃染色2小時(shí)。通過流細(xì)胞計(jì)數(shù)法分別在FL-1和FL-2信道中分析DCF和E的平均熒光信道數(shù)。由每一樣品獲得最少10000個(gè)細(xì)胞并且利用CELLQuest軟件(Becton Dickinson)分析數(shù)據(jù)。直方圖以對數(shù)刻度繪制。
實(shí)施例22 Bel-2蛋白質(zhì)表達(dá)的抑制 三個(gè)靶向bcl-2表達(dá)的PEG寡核苷酸(化合物14，28和33)轉(zhuǎn)染到PC3細(xì)胞中并通過Western印跡法評價(jià)它們抑制bcl-2蛋白質(zhì)表達(dá)的能力。
Lipofectin的作用 最初，在Lipofectin存在和缺乏的條件下測定由化合物14誘導(dǎo)的PC3細(xì)胞中bcl-2蛋白質(zhì)表達(dá)的抑制程度。在Lipofectin存在或缺少的條件下用化合物14(在200，400和800nM)在Opti-MEM中處理PC3細(xì)胞24小時(shí)，然后進(jìn)一步在完全培養(yǎng)基中處理67小時(shí)。通過在物質(zhì)和方法部分描述的Western印跡法分析蛋白質(zhì)樣品(30-40μg蛋白質(zhì)/泳道)，用微管蛋白用作對照蛋白質(zhì)種類。通過激光掃描密度測定法測定與對照，未處理細(xì)胞的％抑制率的對比。Western印跡結(jié)果顯示在附圖12中。
α-微管蛋白和PKC-α的表達(dá)無變化，證明Lipofectin有助于實(shí)現(xiàn)化合物14滲透到PC-3細(xì)胞中，并且證明僅僅bcl-2蛋白質(zhì)表達(dá)通過化合物14下調(diào)節(jié)。
進(jìn)一步研究顯示化合物14和28在400nM處最有活性。PC3細(xì)胞用400，800和1000nM的化合物14，化合物28和化合物23以及Lipofectin的復(fù)合物在Opti-MEM中處理24小時(shí)，然后進(jìn)一步在完全培養(yǎng)基中處理67小時(shí)。通過在物質(zhì)和方法部分描述的Western印跡法分析蛋白質(zhì)樣品(30-40μg的蛋白質(zhì)/泳道)，用微管蛋白用作對照蛋白質(zhì)種類。通過激光掃描密度測定法測定與對照，未處理細(xì)胞的％抑制率的對比。
化合物14產(chǎn)生86％的下調(diào)節(jié)且化合物28產(chǎn)生78％的下調(diào)節(jié)。
實(shí)施例23 通過PEG寡核苷酸進(jìn)行bcl-2蛋白質(zhì)表達(dá)的劑量依賴的分析 為進(jìn)一步證明化合物14和28對bcl-2蛋白質(zhì)表達(dá)的抑制作用，用增加濃度(25，50，100，200和400nM)的化合物14，化合物28，和作為陽性對照的化合物13，與Lipofectin的復(fù)合體在Opti-MEM中處理PC3細(xì)胞24小時(shí)，然后在完全培養(yǎng)基中進(jìn)一步處理67小時(shí)。通過在上述物質(zhì)和方法部分描述的Western印跡法分析蛋白質(zhì)樣品(30-40μg的蛋白質(zhì)/泳道)。
通過Western印跡觀察化合物14和28相對于對照對于bcl-2蛋白質(zhì)表達(dá)的濃度-依賴的抑制。在50nM處觀察到約1-2％的抑制，并且400nM的濃度時(shí)增加到99％和75％。對于化合物24而言，在50nM處基本上沒有觀察抑制，但在400nM的濃度時(shí)抑制增加到77％。用化合物13的轉(zhuǎn)染用作陽性對照。α-微管蛋白的表達(dá)不受任何寡核苷酸的抑制。
用化合物24作為對照重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)。在Opti-MEM中用增加濃度的化合物35和24(25，50，100，200和400nM)以及與Lipofectin的復(fù)合體處理PC3細(xì)胞24小時(shí)，然后進(jìn)一步在完全培養(yǎng)基中處理67小時(shí)。通過在上述物質(zhì)和方法部分描述的Western印跡法分析蛋白質(zhì)樣品(30-40μg的蛋白質(zhì)/泳道)，用α-微管蛋白用作對照蛋白質(zhì)。通過激光掃描密度測定法測定與對照，未處理細(xì)胞的％抑制率的對比。
實(shí)施例24 PEG寡核苷酸對PC3細(xì)胞生長的作用 也測定化合物14和化合物28對PC3前列腺癌細(xì)胞體外生長的作用，。用寡核苷酸/Lipofectin復(fù)合物處理PC3細(xì)胞。如圖10所示，400和200nM的反義寡核苷酸化合物14的轉(zhuǎn)染強(qiáng)烈地抑制細(xì)胞生長，而化合物28僅僅稍微影響增殖速率。
實(shí)施例25 PEG寡核苷酸對PC3細(xì)胞中活性氧的影響 通過兩種流動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)方法評價(jià)PC3細(xì)胞中活性氧或ROS的產(chǎn)生。第一種基于氫化溴乙非啶(HE)向溴乙非啶(E)的氧化，其隨后插入到具有通過流細(xì)胞計(jì)數(shù)法可檢測熒光的DNA中。第二種方法利用細(xì)胞-可滲透的2′，7′-二氫二氯熒光素雙乙酸鹽氧化為發(fā)熒光的2′，7-二氯熒光素(DCF)。在PC3細(xì)胞中，用化合物14/Lipofectin(400nM/15μg/ml)復(fù)合物在Opti-MEM中處理24小時(shí)，三天后通過兩種E(比對照未處理的細(xì)胞增加1.9倍)和DCF(比對照未處理的細(xì)胞增加2)的熒光進(jìn)行流量細(xì)胞計(jì)數(shù)評價(jià)產(chǎn)生的ROS。如圖概括在圖11中的數(shù)據(jù)所證實(shí)的，化合物28對對照，未處理的細(xì)胞不產(chǎn)生任何ROS產(chǎn)生的增加。此外，ROS的產(chǎn)生與細(xì)胞增殖的速率非常相關(guān)；細(xì)胞用400nM的化合物14處理后停止生長，且這些寡核苷酸也引起ROS(DCF和HE)產(chǎn)生的增加。
序列表
<110>安龍制藥公司(ENZON PHARMACEUTICALS，INC.)
<120>聚合寡核苷酸前體藥物(POLYMERIC OLIGONUCLEOTIDE PRODRUGS)
<130>SCT054248-66
<140>
<141>
<150>60/462,070
<151>2003-04-13
<160>11
<170>Patentln Ver.3.2
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<212>DNA
<213>Artificial Sequence
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oligonucleotide
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<223>see specification as filed for detailed description of
linkages and preferred embodiments
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tctcccagcg tgtgccat18
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<213>Artificial Sequence
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<223>Description of Artificial SequenceSynthetic
oligonucleotide
<400>11
cccccaactg caggatgcct ttgtggaact gtacgg3權(quán)利要求
1. 式(1)的寡核苷酸前體藥物
其中
R1和R2獨(dú)立地為H或聚合物殘基；
L1和L4獨(dú)立地為選擇的可釋放的連接部分；
L2和L3獨(dú)立地為選擇的間隔基團(tuán)；
X1為核苷酸或寡核苷酸殘基；
m，n，o和p獨(dú)立地為零或正整數(shù)，條件是(o+n)或(p+m)≥2。
2. 權(quán)利要求1的前體藥物，其中所述核苷酸選自
其中
M是O或S；
B1和B2獨(dú)立地選自A(腺嘌呤)，G(鳥嘌呤)，C(胞嘧啶)，T(胸腺嘧啶)，U(尿嘧啶)和修飾的堿基；
R100和R101獨(dú)立地選自H，OR’其中R’是H，C1-6烷基，取代的烷基，硝基，鹵素和芳基。
3. 權(quán)利要求1的前體藥物，其中所述寡核苷酸含有約10到約1000個(gè)核苷酸。
4. 權(quán)利要求1的前體藥物，其中M是S。
5. 權(quán)利要求1的前體藥物，其中寡核苷酸是硫代磷酸酯寡核苷酸。
6. 權(quán)利要求1的前體藥物，其中所述寡核苷酸殘基是反義寡核苷酸殘基或寡脫氧核苷酸殘基。
7. 權(quán)利要求6的前體藥物，其中所述反義寡核苷酸殘基或寡脫氧核苷酸殘基選自具有磷酸二酯主鏈或硫代磷酸酯主鏈的寡核苷酸和寡脫氧核苷酸，LNA，PNA，三環(huán)-DNA，decoy ODN，RNAi，核酶，spiegelmers，和CpG寡聚物。
8. 權(quán)利要求6的前體藥物，其中所述反義寡核苷酸具有選自如下的序列SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3和SEQ ID NO4，其中SEQ ID NO4的X是任一合適的核苷酸。
9. 權(quán)利要求1的前體藥物，其中至少R1和R2之一是具有封端基團(tuán)A的聚合物殘基，封端基團(tuán)A選自O(shè)H，NH2，SH，CO2H，C1-6烷基，
其中X2和X3為獨(dú)立選擇的核苷酸或寡核苷酸殘基。
10. 權(quán)利要求9的前體藥物，選自
雙-3’-寡核苷酸，
雙-5’-寡核苷酸，
雙-5’，3’-寡核苷酸，和
雙-3’，5’-寡核苷酸。
11. 權(quán)利要求1的前體藥物，其中L4選自
其中
Y1-25獨(dú)立地選自O(shè)，S或NR9；
R6-7，R9-13，R16-25和R27-41獨(dú)立地選自氫，C1-6烷基，C3-12分支的烷基，C3-8環(huán)烷基，C1-6取代的烷基，C3-8取代的環(huán)烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，C1-6雜烷基，取代的C1-6雜烷基，C1-6烷氧基，苯氧基和C1-6雜烷氧基；
Ar為形成多-取代芬香烴或多-取代雜環(huán)基團(tuán)的部分；
L5-12獨(dú)立地為雙功能的間隔基；
Z選自主動(dòng)運(yùn)輸?shù)桨屑?xì)胞中的部分，疏水性部分，雙功能的連接部分及其組合；
c，h，k，l，r，s，v，w，v′，w′，c′，和h′獨(dú)立地為選擇的正整數(shù)；
a，e，g，j，t，z，a′，z′，e′和g′獨(dú)立地為零或正整數(shù)；和
b，d，f，i，u，q，b′，d′和f獨(dú)立地為零或一。
12. 權(quán)利要求1的前體藥物，其中L1選自
其中
Y1′-Y25′獨(dú)立地選自O(shè)，S或NR9；
R6′-7′，R9′-13′，R16′-25′，和R27′-41′獨(dú)立地選自氫，C1-6烷基，C3-12分支的烷基，C3-8環(huán)烷基，C1-6取代的烷基，C3-8取代的環(huán)烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，C1-6雜烷基，取代的C1-6雜烷基，C1-6烷氧基，苯氧基和C1-6雜烷氧基；和
L5′-12′獨(dú)立地為雙功能的間隔基。
13. 權(quán)利要求1的前體藥物，其中R1-2各自為聚醚。
14. 權(quán)利要求1的前體藥物，其中R1-2各自為聚乙二醇。
15. 權(quán)利要求1的前體藥物，其中R1-2獨(dú)立地選自
J-O-(CH2CH2O)n′-
J-O-(CH2CH2O)n，-CH2C(O)-O-，
J-O-(CH2CH2O)n′-CH2CH2NR48-，
J-O-(CH2CH2O)n′-CH2CH2SH，
-O-C(O)CH2-O-(CH2CH2O)n′-CH2C(O)-O-，
-NR48CH2CH2-O-(CH2CH2O)n′-CH2CH2NR48-，
-SHCH2CH2-O-(CH2CH2O)n′-CH2CH2SH-，
其中
n’為聚合度；
R48選自氫，C1-6烷基，C3-12分支的烷基，C3-8環(huán)烷基，C1-6取代的烷基，C3-8取代的環(huán)烷基，芳基，取代的芳基，芳烷基，C1-6雜烷基，取代的C1-6雜烷基，C1-6烷氧基，苯氧基和C1-6雜烷氧基；和
J為封端基團(tuán)。
16. 權(quán)利要求1的前體藥物，其中R1-2獨(dú)立地為
-O-(CH2CH2O)x-
其中x為選擇的正整數(shù)使得加權(quán)平均分子量至少為約2,000Da到約136,000Da。
17. 權(quán)利要求1的前體藥物，其中R1-2獨(dú)立地具有從約3,000Da到約100,000Da的加權(quán)平均分子量。
18. 權(quán)利要求1的前體藥物，其中R1-2獨(dú)立地具有從約5,000Da到約40,000Da的加權(quán)平均分子量。
19. 權(quán)利要求8的前體藥物，其中所述反義寡核苷酸為oblimersen(SEQ ID NO1)。
20. 下式的寡核苷酸前體藥物，
其中
L2為間隔基；
X1為核苷酸或寡核苷酸殘基；
u’為正整數(shù)；和
T為下組的成員
其中
D’是下述之一
且其中R61為聚合物殘基。
21. 權(quán)利要求1的化合物，選自
所有均包括SEQ ID NO1的寡核苷酸。
22. 前體藥物的制備方法，包括
將式R2-L4-離去基團(tuán)的化合物
與式H-L3-X1的化合物
在足以形成下式前體藥物的條件下反應(yīng)
R2-L4-L3-X1的前藥，
其中
R2是聚合物殘基；
L4是可釋放的連接部分；
L2為間隔基；
X1為核苷酸或寡核苷酸殘基。
23. 治療哺乳動(dòng)物的方法，包括將有效量的權(quán)利要求1的化合物施用于需要此種治療的哺乳動(dòng)物。
24. 根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中哺乳動(dòng)物被進(jìn)行腫瘤治療。
25. 根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中X1為反義寡核苷酸。
26. 根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中哺乳動(dòng)物也用第二抗癌藥物治療，所述第二抗癌藥物與寡核苷酸前體藥物同時(shí)或依次施用。
全文摘要
本發(fā)明公開了含有核苷酸和/或寡核苷酸的聚合物共軛物。
文檔編號C07H21/00GK101273051SQ200480009914
公開日2008年9月24日 申請日期2004年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月13日
發(fā)明者洪 趙, 理查德·B·格林沃爾德 申請人:安龍制藥公司