專利名稱：C末端修飾的內嗎啡肽1，內嗎啡肽2的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一類新的化合物，具體講是一類內嗎啡肽1(Endomorphin1，EM1)、內嗎啡肽2(Endomorphin2，EM2)的新類似物，以及這類化合物的制備方法與生理活性研究。
背景技術：
阿片受體主要分為三類μ，δ，Κ，分布于哺乳動物的中樞神經系統(tǒng)和多種外周器官，對應的內源性配體分別為內嗎啡肽〔見Zadina，J.E.；Hackler，L.；Ge，L.J.；Kastin，A.J.A potent and selective endogenous agonist for the μ-opiatereceptor.Nature.1997，386(6624)499-502〕(Endomorphins，EMs)，腦啡肽(Enkephalin)〔見Hughes，J.，Smith，T.W.，Kosterlitz，H.W.，Forthergill，L.A.，Morgan，B.A.，and Morris，H.R.(1975)Identification of two related pentapeptidesfrom the brain with potent opiate agonist activity.Nature 258，577-580.〕和強啡肽(Dynorphins)〔見Goldstein，A.，Tachibana，S.，Lowney，L.H.，Hunkapiller，M.，and Hood，L.(1979)Dynorphin-(1-13)，an extraordinarily potent opioid peptide.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76，6666-6670.〕，這些受體和配體都參與了痛覺調制及鎮(zhèn)痛過程。相對其他哺乳動物內源性配體，內嗎啡肽具備極高的μ阿片受體(MOR)親和性和選擇性，以MOR為介導，參與諸多的生理過程，特別是強效的鎮(zhèn)痛作用，其作用與嗎啡相當。嗎啡作為高效的鎮(zhèn)痛藥物，廣泛應用于臨床，但由于諸如呼吸抑制、心搏過緩、成癮等方面的副作用，對病人產生了很大的危害。EMs的發(fā)現為揭示阿片系統(tǒng)調節(jié)痛覺機理，開發(fā)替代嗎啡的深層次痛覺調節(jié)藥物提供了非常廣闊的前景，四個氨基酸組分所蘊含的信息和作用之豐富引起了廣泛的關注和研究熱潮。
內嗎啡肽的主要生物活性有1.鎮(zhèn)痛作用腦室注射、鞘內注射內嗎啡肽均可產生強效的鎮(zhèn)痛作用，其鎮(zhèn)痛作用與嗎啡相當，MOR阻斷劑能阻斷EMs的這種作用〔見Goldberg，I..E.；Rossi，G.C.；Letchworth，S.R.；et al.Pharmacological characterization ofendomorphin-1 and endomorphin-2 in muse brain.J Pharmacol Exp Ther.1998，286(2)1007-13〕、〔見Mizaoguchi，H.；Narita，M.；Oji，D.E.；et al.The mu-opioidreceptor gene-dose dependent reductions in G-protein activation in the pons/medullaand antinociception induced by endomorphins in μ-opioid receptor knockout mice.Neuroscience.1999，94(1)203-7〕、〔Loh，H.H.；Liu，H.C.；Cavalli，A.et al.Muopioid receptor knockout in miceeffects on ligand-induced analgesia and morphinelethality.Brain Res MolBrain Res.1991，54(2)321-6〕。
2.對心血管系統(tǒng)的作用EMs能顯著抑制小鼠、大鼠、豚鼠、兔、貓等實驗動物的心血管活動，并可以劑量依賴的降低兔、小鼠、大鼠等的整體動脈壓，這種作用可被納絡酮(naloxone，Nx)阻斷〔Champion，H.C.；Bivalacqua，T.J.；Lambert，D.G.；et al.Endomorphin1 and 2，the endogenousmu-opioid agonists，produce biphasic changes in systemic arterial pressure in thecat.Life Sci.1991，63(9)PL 131-6〕。
3.除鎮(zhèn)痛作用和降血壓的作用之外，還具有對運動、行為、呼吸、腸胃、內分泌和免疫等功能及細胞損傷的保護作用〔Lin，X.；Yang，D.J.；Cai，W.Q.；Zhao，Q.Y.；Gao，Y.F.；Chen，Q.；Wang，R.Endomorphins endogenous opioidpeptides，provide antioxidant defense in the brain agonist free radical-induceddanmage.Biochim Biophys-Acta.2003，Nov，20；1639(3)195-202〕。
作為內源性阿片肽，內嗎啡肽與其它體內的生物活性肽一樣，表現出一些缺點，從而限制了其在臨床上的應用，這些缺點主要表現在其一，在體內容易受特異性和非特異性的肽酶作用，藥物作用時間短。其二，結構上存在很大的柔性，體內構象多變，可與多種受體結合，從而降低其選擇性，在臨床治療中產生一些副作用。其三，不易突破血腦屏障(Brainblood barrier，BBB)，不利于口服和注射。
因此，對EMs進行結構修飾，以增強對酶的穩(wěn)定性，穩(wěn)定其活性構象，提高生物利用度及生物活性，延長作用時間，突破血腦屏障已經成為EMs研究的重要難題。

發(fā)明內容
構效關系(Structure-activity relationship，SAR)研究表明，EMs與嗎啡及其它的內源性阿片肽一樣，具備相同的阿片藥效團，空間上處于相同位置的陽離子酰氨、酚環(huán)及其另外一個疏水性基團，這可能是有效活性片段要求的共同特征。而且EM1(Tyr1-Pro2-Trp3-Phe4-NH2)、EM2(Tyr1-Pro2-Phe3-Phe4-NH2)、Morphiceptin(Tyr1-Pro2-Phe3-Pro4-NH2)〔Chang，K.J.，A.Killian，E.Hazum，and P.Cuatrecasas.1981.Morphiceptin(NH4-Tyr-Pro-Phe-Pro-CONH2)a potent andspecific agonist for morphine(μ)receptors.Science.21275-77.〕、PL017(Tyr1-Pro2-MePhe3-D-Pro4-NH2)〔Chang，K.J.，E.T.Wei，A.Killian，and J.-K.Chang.1983.Potent morphiceptin analogsstructure activity relationships andmorphine-like activities.J.Pharmacol.Exp.Ther.227403-408.〕、Tyr-W-MIF-1(Tyr1-Pro2-Trp3-Gly4-NH2)屬于同一級別，Pro處于第二的位置，具備很高的μ阿片受體的選擇性。這些肽的親和性很大程度上取決于第四位置氨基酸的性質，用疏水性基團替換Tyr-W-MIF-1四位的Gly活性可以提高5倍，Phe替換四位的Gly得到EM1活性可以提高50倍，這足以說明第四位氨基酸的側鏈在EM1中的作用。Masakatsu Eguchi，Richard Y.W.Shen等在美國《醫(yī)學化學》雜志〔Design，Synthesis，and Evaluation of Opioid Analogues withNon-Peptidic β-Turn ScaffoldEnkephalin and Endomorphin Mimetics.J.Med.Chem.2002，Vol.45，No.7，1397〕上運用β轉角(β-turn)肽模擬物模型，證實了EMs的二級結構活性構象為(4-1)β-turn結構。Podlogar，B.L.；Paterlin M.G.等人〔Conformational analysis of the endogenous mu-opioid agonist endomorphin-1using NMR spectroscopy and molecular modeling.FEBS Lett.1998，439，13-20〕披露，利用二維核磁和分子模擬技術在水和DMSO-D6溶液中動態(tài)地研究了EMs的溶液構象，證實EM1存在順勢(cis)和反式(trans)構象，生物活性構象可能是反式的結構上表現為伸展的構象(extended conformation)，一定結構的疏水域(hydrophbolic pocket)決定了EM1的親和性和選擇性(見圖1)。M.Germana Paterlini，Francesca Avitabile〔Stereochemical Requirements forReceptor Recognition of the m-Opioid Peptide Endomorphin-1.Biophys.J.78(2)590-599〕等合成了一系列EM1的非對映異構體，通過二維核磁及分子模擬的方法證明了Podloger的想法。Csaba Tmbly等〔Csaba Tmbly，Katalin E.Kveretal Structure-Activity Study on the Phe Side Chain Arrangement of EndomorphinsUsing Conformationally Constrained Analogues.J.Med.Chem.2004，47，735-743〕認為Phe4的側鏈x1＝-60°是EM2的活性構象，這就說明Phe4側鏈芐基朝向決定了EMs的生物活性。
圖1表示EM1的cis構象(A)，Tyr，Pro，Trp形成“三明治”模型，結構上比較緊湊；trans構象(B)，結構上比較伸展，為生物活性構象(Podloger，FEBSletter，1998)。
結合以上EMs研究結果，為了固定EMs伸展的活性構象，減少Phe4的側鏈芐基改變形成的空間位阻對其它側鏈的影響，我們把Phe4的側鏈芐基移到C-末端，四位用Gly/D-Ala/L-Ala/Sarcosine/D-Val替換Phe4，同時對芐基進行一定的結構限制，有效固定活性構象，以期能得到高效抗酶解的類似物。以非芳香環(huán)側鏈氨基酸替換Phe4，以期得到一個能成功導入糖基，胍基的短肽序列，為解決EMs不易突破血腦屏障的問題提供了新的改造方法。
本發(fā)明提供一類新的經改造的內嗎啡肽1、內嗎啡肽2類似物，尋求比內嗎啡肽具備更高的生物活性或者更低的毒副作用的一類類似物。
本發(fā)明的另一目的是提供一種內嗎啡肽1、內嗎啡肽2的制備方法。
本發(fā)明的化合物共分為兩大類。
一類是具有如下特征的EM1新類似物 更具體描敘1位是Tyr，2位是Pro，3位是Trp，原Phe4，被L-Ala或Gly或Sarcosine或β-Ala或D-Ala或D-Val，或D-Pro替換，同時C末端以芐胺結尾；或者用D-Ala替換Phe4，同時C末端以光活苯乙胺或苯丙酰胺結尾；或者用Gly替換Phe4，同時C末端以苯胺結尾。
另外一類是具有如下特征的EM2新類似物 更具體描敘1位是Tyr，2位是Pro，3位是Phe，原Phe4，被L-Ala或Gly或Sarcosine或β-Ala或D-Ala或D-Val，或D-Pro替換，同時C末端以芐胺結尾；或者用D-Ala替換Phe4，同時C末端以光活苯乙胺或苯丙酰胺結尾；或者用Gly替換Phe4，同時C末端以苯胺結尾。
本發(fā)明的化合物的制備方法采用Hosu/Dcc活化酯法接肽，“2+2”法合成EM1，EM2的新類似物。Hosu/Dcc活化酯法合成具有成本低，不易消旋，產率高，易純化，C-端不用保護等特點，“2+2”法合成大大簡化了合成線路，減少了工作量。合成路線如下合成步驟簡述如下(參見圖2)化合物a溶于無水處理的四氫呋喃中，加入Hosu(N-羥基琥珀酰亞胺)/Dec(環(huán)己基羰二亞胺)，形成活化酯以后，再加入氫氧化鈉中和的化合物b，反應得到化合物c；化合物e溶于二氯甲烷，加入化合物f，Dcc/DMAP縮合反應生成化合物g(當化合物f為鹽酸苯丙酰胺時，不用Dcc/DMAP法縮合，用Hosu/Dcc活化酯法縮合)；化合物g用鹽酸乙酸乙酯溶液脫掉Boc(若為Z保護，則溶于甲醇，用鈀碳脫保護)，以后同樣以活化酯法與化合物d縮合得到化合物h；重復上一步，化合物h脫掉保護與化合物c活化酯法縮合得到化合物i；化合物i用鈀碳脫保護得到終產物j。
本發(fā)明的化合物的離體生物活性鑒定主要包括豚鼠回腸縱型肌(guineapig ileal，GPI)結合實驗和小鼠輸精管(mouse vas deferens，MVD)結合實驗。豚鼠回腸縱型肌上存在大量的μ阿片受體及少量κ受體，GPI實驗是鑒定類似物μ受體親和性的最經典的實驗，類似物與受體結合能抑制肌條膽堿能的釋放，減弱電刺激引起的收縮。小鼠輸精管存在大量的δ受體，也存在部分μ受體和κ受體，是鑒定類似物和δ受體親和性的最經典的實驗。
本發(fā)明的化合物的在體生物活性鑒定主要包括整體血壓(Systemic arterialpressure，SAP)實驗、心率(Heart rate，HR)變化實驗和熱板鎮(zhèn)痛實驗。整體血壓實驗、心率變化實驗的結果能直接說明阿片肽對心血管系統(tǒng)的影響，也能反映類似物與外周受體結合的能力的強弱。熱刺激法系利用一定強度的溫度刺激動物軀體的某一體表部位，使其產生疼痛反應，是目前國內外篩選鎮(zhèn)痛藥的常用致痛方法；本研究采用的小白鼠熱板法試驗鎮(zhèn)痛藥的作用強度與臨床療效大致平行。
本發(fā)明的優(yōu)點和產生的有益效果化合物1e，1f，2f的trans構象伸展，芐胺末端與Tyr側鏈之間的空間位阻小，形成有利于與阿片受體結合的區(qū)域。尤其是化合物1f，2f，無論是trans，cis構象都能保持伸展的生物活性構象(經2DNMR研究證實)(見圖7)。由此可見，Tyr1-Pro2-Trp3/Phe3-D-Val4-NH-Bn這一序列能有效的固定EMs的生物活性構象，為研究EMs構效，合成更高效的阿片受體激動劑，研究開發(fā)代替嗎啡的高效鎮(zhèn)痛藥物提供了一個非常具有參考價值的序列模式。
本發(fā)明的化合物的制備方法采用Hosu/Dcc活化酯法接肽，“2+2”法合成EM1，EM2的新類似物。Hosu/Dcc活化酯法合成具有成本低，光學純度高，產率高，易純化，C-端不用保護等特點，“2+2”法合成大大簡化了合成線路，減少了工作量。


圖1為EM1的cis構象(A)與trans構象(B)圖2為內嗎啡肽1，2類似物的的合成路線圖3為靜脈注射內嗎啡肽1，2，嗎啡，化合物1e，2b，2e對wistar大鼠整體血壓影響圖4為靜脈注射內嗎啡肽1，2，嗎啡，化合物1e，2b，2e對wistar大鼠整體血壓影響的時效曲線圖5為靜脈注射內嗎啡肽1，2，嗎啡，化合物2b，1e，2e(1-30nmol/kg)血壓下降百分率和心率下降百分率柱狀圖。
圖6為內嗎啡肽1，2，嗎啡，化合物2b熱板鎮(zhèn)痛的劑量效應曲線。
圖7化合物1f(a)，2f(b)順反式低能量構象比較具體實施方式
合成的實施實例化合物1e(Tyr-Pro-Trp-D-Ala-NH-Bn)的合成反應i芐氧羰基-酪氨酸-脯氨酸(c)的合成化合物a 0.946g(3mmol)、Hosu 0.346g(3.3mmol)溶于無水四氫呋喃(THF)中，冰浴攪拌10分鐘后加入0.619g(3.6mmol)的DCC。冰浴下反應30分鐘后撤掉冰浴，室溫反應3～5小時，布氏漏斗過濾，除去反應生成的DCU(環(huán)二己基脲)得到化合物a的活化酯THF溶液。0.414g(3.6mmol)化合物b溶于等摩爾的氫氧化鈉水溶液，調節(jié)PH值至9～10，冰浴攪拌10分鐘后，加入化合物的a的活化酯THF溶液。冰浴下反應30分鐘后撤掉冰浴，室溫反應過夜。抽干THF，溶于乙酸乙酯，依次用5％的檸檬酸，飽和氯化鈉洗滌，并用無水硫酸鈉(Na2SO4)干燥。過濾，減壓蒸發(fā)掉溶劑，硅膠柱層析分純(乙酸乙酯∶石油醚∶甲醇＝3∶1∶0.1)，油泵減壓得白色粉末0.887g，產率72.1％。[α]D20＝-19(c＝1，MeOH)。ESI-Ms m/z＝446.0285(M+H)，Mp＝102～103℃反應ii叔丁氧羰基-D-丙氨酸-芐胺(g)的合成化合物e 0.1892g(1mmol)、化合物f0.165ml(1.5mmol)溶于無水二氯甲烷(DCM)中，冰浴攪拌10分鐘后加入0.247g(3.6mmol)的DCC。冰浴下反應30分鐘后撤掉冰浴，加入DMAP室溫反應過夜，布氏漏斗過濾，除去反應生成的DCU。抽干DCM，溶于乙酸乙酯，依次用飽和碳酸氫鈉溶液，5％的檸檬酸，飽和氯化鈉洗滌，并用無水硫酸鈉(Na2SO4)干燥。過濾，減壓蒸發(fā)掉溶劑。硅膠柱層析分純(乙酸乙酯∶石油醚∶＝1∶1)得到0.2244g白色固體，產率80.6％。[α]D20＝5(c＝1，MeOH)。ESI-Ms m/z＝279.0834(M+H)，Mp＝103～105℃反應iii，iv叔丁氧羰基-L-色氨酸-D-丙氨酸-芐胺(h)的合成化合物d0.263g(0.72mmol)、Hosu 0.1g(0.84mmol)溶于無水THF中，冰浴攪拌10分鐘后加入0.178g(0.84mmol)的DCC。冰浴下反應30分鐘后撤掉冰浴，室溫反應3～5小時，布氏漏斗過濾，除去反應生成的DCU得到化合物d的活化酯THF溶液?；衔飃溶于2ml的乙酸乙酯，小心滴加12.5mol/L鹽酸0.5ml于乙酸乙酯溶液中，室溫反應2～3小時，減壓抽去乙酸乙酯，加水調節(jié)到一定體積，2mol/L氫氧化鈉水溶液調節(jié)PH值至9～10，冰浴攪拌10分鐘后，加入化合物的d的活化酯THF溶液。冰浴下反應30分鐘后撤掉冰浴，室溫反應過夜。抽干THF，溶于乙酸乙酯，依次用飽和碳酸氫鈉溶液，5％的檸檬酸，飽和氯化鈉洗滌，并用無水硫酸鈉(Na2SO4)干燥。過濾，減壓蒸發(fā)掉溶劑，硅膠柱層析分純(乙酸乙酯∶石油醚＝3∶1)，減壓得白色粉末0.887g，產率87.48％。Mp＝82～84℃反應v，vi芐氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-L-色氨酸-D-丙氨酸-芐胺(i)的合成化合物c 100mg(0.24mmol)、Hosu 26mg(0.22mmol)溶于無水四氫呋喃(THF)中，冰浴攪拌10分鐘后加入45.4mg(0.24mmol)的DCC。冰浴下反應30分鐘后撤掉冰浴，室溫反應3～5小時，布氏漏斗過濾，除去反應生成的DCU得到化合物c的活化酯THF溶液?；衔飄溶于2ml的乙酸乙酯，小心滴加12.5mol/L鹽酸0.5ml于乙酸乙酯溶液中，室溫反應2～3小時，減壓抽去乙酸乙酯，加水調節(jié)到一定體積，2mol/L氫氧化鈉水溶液調節(jié)PH值至9～10，冰浴攪拌10分鐘后，加入化合物的c的活化酯THF溶液。冰浴下反應30分鐘后撤掉冰浴，室溫反應過夜。抽干THF，溶于乙酸乙酯，依次用飽和碳酸氫鈉溶液，5％的檸檬酸，飽和氯化鈉洗滌，并用無水硫酸鈉(Na2SO4)干燥。過濾，減壓蒸發(fā)掉溶劑，硅膠柱層析分純(乙酸乙酯∶石油醚∶甲醇＝5∶1∶0.2)，減壓得無色透明油狀物123.43mg，產率81.42％。
反應vii酪氨酸-脯氨酸-L-色氨酸-D-丙氨酸-芐胺(J)的合成化合物i123.43mg溶于8～10ml無水甲醇中，加入鈀碳60mg，通氫氣反應3～4小時，布氏漏斗過濾，除去鈀碳。減壓抽去甲醇，得到透明無色固體。硅膠柱層析分純(乙酸乙酯∶甲醇＝5∶1，滴加幾滴氨水)，得到白色終產物62.02mg，產率61％，ESI-Ms＝625.6(M+H)。
內嗎啡肽1，嗎啡肽2其他類似物的全合成過程與以上類似并且得到類似的結果。
所有的中間產物經過高分辨質譜確定。終產物經過[α]D、高分辨質譜分析確定，熔點測定確定結構，數據如Tab1。
Tab 1終產物鑒定數據

本發(fā)明的化合物離體生物活性鑒定GPI(μ受體親和性鑒定)試驗方法如下體重250-300g豚鼠，雌雄不限，實驗前禁食12h。處死，剖腹取出取出近盲腸端的回腸6cm兩段，浸入持續(xù)通入混合氣(95％O2，5％CO2)的Krebs液II中，剝離縱行肌，然后用零號絲線將縱行肌的一端縛在玻璃電極的小鉤上，另一端縛在JZ-1型肌肉張力傳感器上，Krebs液II、恒溫37.5±0.5℃的玻璃浴管中撫育，預負荷1g。平衡2h后開始實驗。給予電刺激，刺激參數波寬0.5-1ms，頻率6次·min-1，負載電壓40V。記錄基礎收縮強度，再給予適量嗎啡鑒定其活性；然后分別給予不同劑量的待試藥物，記錄收縮強度，計算抑制百分率。MVD實驗(δ受體親和性鑒定)方法如下30-35g雄性昆明系小白鼠，處死，剖腹取出兩側輸精管，浸入持續(xù)通入混合氣(95％O2和5％CO2)的Krebs液I中，將附著在其上的脂肪及血管剝離干凈。剪去輸精管的一端，輕輕地壓出管內的精液，變成一條空心管，然后用零號絲線將其一端縛在玻璃電極的小鉤上，另一端縛在JZ-1型肌肉張力傳感器上，Krebs液I、恒溫36±0.5℃的玻璃浴管中，預負荷250mg。平衡2h后開始實驗。給予電刺激，刺激參數頻率6次·min-1，波寬2-3ms，負載電壓50V。記錄基礎收縮強度，再給予適量嗎啡鑒定其活性；然后分別給予不同劑量的待試藥物，記錄收縮強度，計算抑制百分率。
在MVD/GPI檢定中(Tab 2)，所有化合物基本上都能100％地抑制電刺激標本引起的收縮反應，并且可分別被50nmol·L-1和10nmol·L-1的納絡酮完全逆轉，這表明了它們的阿片樣作用。MVD/GPI實驗表明化合物1e有很高的μ受體結合活性及選擇活性(μIC50＝5.2±1.03nM，比母體EM1高2.13倍，對δ受體的選擇性比母體高1.72倍)，其非對映異構體化合物1a的μ受體激動活性則基本上完全消失(μIC50＞10000nM)，這就說明四位D型為受體的立體選擇性構象。在保證第四位氨基酸為D型構象的前提下，四位上的Cα位引入-CH(CH3)2，調整芐胺的角度，改變由Tyr側鏈與芐胺末端形成結構域的性狀，化合物1f阿片受體激動活性相比母體EM1提高了3.67倍(μIC50＝3.06±0.51nM)，δ阿片受體激動活性相比母體提高了18.15倍?；衔?fμ阿片受體激動活性相比母體提高了3.13倍(μIC50＝3.09±0.65nM)，δ阿片受體激動活性相了4.75倍?；衔?b與嗎啡的鎮(zhèn)痛效果相當，而對心率的影響比嗎啡小，有效的減弱了心博過緩副作用的發(fā)生。此外化合物2b，1g，2i也具備了很高的μ阿片受體結合活性，其結構特征為四位為D型非芳香側鏈氨基酸。
Tab1.GPI/MVD鑒定結果

*1μM劑量肽類藥物的最大抑制率；#重復的動物標本數；Δ比值反映了藥物對μ受體的選擇性。
本發(fā)明化合物的在體生物活性鑒定方法中的SAP，HR實驗其方法如下體重200-250g雄性Wistar大鼠，用20％氨基甲酸乙酯(1.0-1-2g·kg-1，ip)麻醉，作氣管插管，自主呼吸；分離右側頸外靜脈，插入充滿1000u·L-1肝素鈉生理鹽水的導管供給藥用；分離左側頸總動脈插管，經YP-1型壓力換能器與泰盟301相連接，記錄平均動脈壓和心率變化。手術30min后進行實驗，整個實驗過程肛溫穩(wěn)定在37.5±0.5℃。注射體積100μl，注射時間10-15s。納絡酮拮抗組提前10min注射Nx(2mg·kg-1，iv)。
麻醉大鼠給藥前平均動脈壓為12.37±0.67kPa；給予納絡酮后對平均動脈壓無影響(P＞0.05)。EMs及其類似物均劑量依賴地降低麻醉大鼠平均動脈壓，并都可被Nx(2mg·kg-1，iv)阻斷。各化合物降血壓效應的效果(30nmol/kg，iv)的順序為化合物1e＞EM-1＞化合物2e＞EM-2＞morphine＞化合物2b(見圖3)。與其他化合物相比，化合物1e有較強的降血壓作用(P＜0.05)。iv EMs與化合物2e，化合物2b，化合物1e，時效曲線無顯著性差異(P＞0.05)，注射后30s內血壓開始下降，1-2min內達最低值，作用持續(xù)時間為4.0-6.0min(見圖4)。所有化合物靜脈給藥引起的血壓降低都能被納絡酮(2mg/kg)所拮抗。
圖3表示靜脈注射EM1，EM2，Morphine，化合物1e，2b，2e(30nmolKg-1)對wistar大鼠整體血壓影響。劑量以納摩爾每千克體重表示。各濃度數據均重復6～8次，取平均值。
圖4表示靜脈注射EM1，EM2，Morphine，化合物1e，2b，2e對wistar大鼠整體血壓影響的時效曲線。劑量以納摩爾每千克體重表示。各濃度數據均重復6～8次，取平均值。
麻醉大鼠給藥前平均心率為372±20.67次/分；給予納絡酮后對平均動脈壓無影響(P＞0.05)。EMs及其類似物均劑量依賴地降低麻醉大鼠HR，并都可被納絡酮(2mg·kg-1，iv)阻斷。與其他化合物相比，Morphine的降心率作用最為明顯，血壓下降更依賴于心率降低，心輸出量減少，這就說明EMs及類似物在心博過緩方面的副作用相比嗎啡要小(見圖5)。
圖5柱型圖比較了Morphine(100nmol/kg，300nmol/kg)，endomorphin1，2(30nmol/kg)，化合物2b(30～300nmol/kg)，化合物1e(1-30nmol/kg)，化合物2e(1-30nmol/kg)靜脈給藥時血壓下降百分率和心率下降百分率。
本發(fā)明化合物的在體生物活性鑒定方法中的熱板鎮(zhèn)痛實驗方法如下恒溫水浴維持在55±0.5℃，小鼠舔后跖為鎮(zhèn)痛潛伏期終點，截止時間(cut-offvalue，T2)為45s，以避免燙傷，加藥前小鼠的舔后跖的潛伏期(基礎痛閾)為9～30s(T0)，過于敏感和遲鈍的小鼠棄去不用。給藥后每10min測一次，記錄60min內小鼠舔后跖的潛伏期(T1)，結果以％MPE(最大可能的生物學效應)表示％MPE＝[(T1-T0)/(T2-T0)]×100。icv EMs及其類似物均可產生較強的鎮(zhèn)痛作用，且可被納絡酮完全逆轉(1mg·kg-1，ip)，說明此效應是由阿片受體介導的；它們鎮(zhèn)痛效應的強弱順序為EM-1＞morphine＞EM-2＞Compud2b(見圖6)。
權利要求
1.一類具有如下結構特征的內嗎啡肽1的類似物 結構特征是1位是Tyr，2位是Pro，3位是Trp，原Phe4，被L-Ala或Gly或Sarcosine或β-Ala或D-Ala或D-Val，或D-Pro替換，同時C末端以芐胺結尾；或者用D-Ala替換Phe4，同時C末端以光活苯乙胺或苯丙酰胺結尾；或者用Gly替換Phe4，同時C末端以苯胺結尾。
2.一類具有如下結構特征的內嗎啡肽2的類似物 結構特征是1位是Tyr，2位是Pro，3位是Phe，原Phe4，被L-Ala或Gly或Sarcosine或β-Ala或D-Ala或D-Val，或D-Pro替換，同時C末端以芐胺結尾；或者用D-Ala替換Phe4，同時C末端以光活苯乙胺或苯丙酰胺結尾；或者用Gly替換Phe4，同時C末端以苯胺結尾。
3.一種內嗎啡肽1或內嗎啡肽2類似物的制備方法化合物a溶于無水處理的四氫呋喃中，加入Hosu(N-羥基琥珀酰亞胺)/Dcc(環(huán)己基羰二亞胺)，形成活化酯以后，再加入氫氧化鈉中和的化合物b，反應得到化合物c；化合物e溶與二氯甲烷，加入化合物f，Dcc/DMAP縮合反應生成化合物g(當化合物f為鹽酸苯丙酰胺時，不用Dcc/DMAP法縮合，用Hosu/Dcc活化酯法縮合)；化合物g用鹽酸乙酸乙酯溶液脫掉Boc(若為Z保護，則溶于甲醇，用鈀碳脫保護)，以后同樣以活化酯法與化合物d縮合得到化合物h；重復上一步，化合物h脫掉保護與化合物c活化酯法縮合得到化合物i；化合物i用鈀碳脫保護得到終產物j。
全文摘要
本發(fā)明提供結構式為(I)、(II)內嗎啡肽1(Endomorphin l，EM1)、內嗎啡肽2(Endomorphin 2，EM2)的新類似物以及該類似物的制備方法，并通過離體生物活性鑒定GPI(μ受體親和性鑒定)，MVD(δ受體親和性鑒定)試驗和在體生物活性鑒定方法中的SAP，HR實驗，顯示了C末端修飾的EM1、EM2類似物具備極強的受體結合能力，良好的鎮(zhèn)痛效果，克服了嗎啡在心搏過緩方面的副作用，為開發(fā)替代嗎啡的深層次痛覺調節(jié)藥物提供了非常廣闊的前景。
文檔編號C07K14/665GK1754890SQ200410073159
公開日2006年4月5日 申請日期2004年9月30日 優(yōu)先權日2004年9月30日
發(fā)明者王銳, 于燁, 劉紅美 申請人:蘭州大學