專利名稱：用于控制衰老和應激的藥理活性的新型持久信息素化合物及分離和表征它的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種新型持久信息素和它的結構測定，更具體地，涉及一種持久信息素，其可以誘導線蟲(C.elegans)進入持久(dauer)幼蟲期。本發(fā)明還涉及一種用于有效分離和純化生理活性的持久信息素，和測定該物質結構的新方法。
背景技術：
信息素被定義為用于在同種物種的個體之間通訊的物質。信息素通常是通過包括有機溶劑提取和液相柱色譜法的多步分離步驟以混合物的形式獲得。
在20世紀八十年代早期，報導了線蟲可分泌一類信息素，稱為‘持久信息素’，一種用作種群密度指示物的組成型分泌物質(Golden和Riddle1982，Golden和Riddle 1984a，Golden和Riddle 1984c)，當它們面臨不利的環(huán)境條件如熱，食物缺乏，和擁擠時其可以誘導線蟲進入持久停滯期。盡管它的存在已經(jīng)已知超過二十年，但它的結構，分子量和物理性質仍然未知(Riddle，D.L.，Science，218578-580，1982)。
按照先前研究，由線蟲分泌的信息素以極低濃度存在。因為它在控制線蟲衰老和應激方面的潛力，已經(jīng)詳盡地研究持久信息素。然而，直到現(xiàn)在，因為它不能以單分子形式獲得，大多數(shù)研究者已經(jīng)使用線蟲的粗提物，其被認為包含持久信息素以及其它化合物。
因此，必須從提取物中分離純的持久信息素和表征它的結構以研究線蟲的衰老，應激和其它細胞功能。持久信息素可能通過仍未鑒定的信息素受體檢測，所述信息素受體與包括daf-11的環(huán)狀GMP信號途徑偶聯(lián)(Birnby等2000)。已經(jīng)已知線蟲的持久信息素是非常穩(wěn)定和疏水的，并具有類似于羥基化的脂肪酸和膽汁酸的那些的色譜性能。
在本文中，我們描述線蟲特異性的持久信息素的純化，鑒定，和分子表征。

發(fā)明內容
本發(fā)明人已經(jīng)進行多年詳盡的研究以便分離一種新類別的持久信息素，其可以廣泛用于衰老，應激，信號轉導和各種生物學問題的研究。結果，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)從已經(jīng)被作為各種疾病的良好動物模型研究的線蟲獲得的提取物包含一種新的持久信息素，通過逐步的分離步驟純化該提取物產(chǎn)生純的持久信息素?；谠摪l(fā)現(xiàn)，可能提供一種新的持久信息素。
因此本發(fā)明的一個目的是提供一種新的持久信息素，其包含使用一種或多種選自水，醇，和乙酸乙酯的溶劑提取線蟲和使用各種溶劑作為洗脫劑色譜分離。
本發(fā)明的另一個目的是提供6-(3，5-二羥基-6-甲基-四氫-吡喃-2-基氧基)-庚酸或其鹽，其可以由如下闡明的式I表示。
結構式I 本發(fā)明還有另一個目的是提供一種用于持久誘導活性的組合物，其包含6-(3，5-二羥基-6-甲基-四氫-吡喃-2-基氧基)-庚酸或其鹽，和藥用載體。
本發(fā)明還有另一個目的是提供一種藥物組合物，其用于誘導線蟲的持久態(tài)或控制動物的衰老態(tài)。
本發(fā)明還有另一個目的是提供一種使用幾個色譜程序分離和純化持久信息素的方法。
該方法包括以下步驟1)乙醇提取線蟲，所述線蟲已經(jīng)在S.basal液體培養(yǎng)基上通過喂飼大腸桿菌培養(yǎng)；2)乙酸乙酯提取在步驟1中制備的乙醇提取物；3)通過硅膠吸附色譜從乙酸乙酯級分中有效去除雜質；4)通過使用各種胺柱的高效液相色譜(HPLC)分離和純化持久信息素。
通過本說明書的剩余部分本發(fā)明的另外的目的和優(yōu)勢將變得明顯。
前面已經(jīng)概述本發(fā)明的更多有關目的中的一些。這些目的應當被認為是僅僅舉例說明本發(fā)明更多有關特征和應用中的一些。通過以不同方式應用本公開的發(fā)明或在本公開范圍內修改本發(fā)明可以獲得許多其它有益的結果。因此，通過參考除了由權利要求限定的本發(fā)明范圍以外的優(yōu)選實施方案的詳細描述，可以提供本發(fā)明的其它目的和更透徹的理解。
附圖簡述

圖1是示意圖，其舉例說明用于從線蟲中分離和純化發(fā)明的信息素化合物的逐步方法；圖2是典型的色譜圖，其舉例說明通過使用以蒸餾水和異丙醇作為溶劑的梯度洗脫用胺柱通過HPLC富集活性級分；圖3表示通過分子量分離的HPLC的色譜圖(W251)，其在使用甲醇作為溶劑的恒溶劑洗脫的條件下運行；圖4是通過使用氘甲醇(CD3OD)作為溶劑測量的氫核磁共振譜(1H-NMR)的圖；圖5是通過使用氘甲醇(CD3OD)作為溶劑測量的碳核磁共振譜(13C-NMR)的圖；圖6是舉例說明使用四重(quadruple)類型的質譜儀以正模式測量的分子質譜圖；圖7是舉例說明信息素的質譜結果的圖，其是使用四重類型的質譜儀在測量過程期間在乙酸鈉的存在下以正模式測量的；和圖8是舉例說明使用四重類型的質譜儀以負模式測量的質量結果的圖。
實施本發(fā)明的最佳方式以下，將更詳細地舉例說明本申請。
為了本發(fā)明的目的分離的信息素是6-(3，5-二羥基-6-甲基-四氫-吡喃-2-基氧基)-庚酸或其鹽，其可以通過以下式I表示。式I的化合物顯著誘導蠕蟲進入持久期。
結構式I 式I的化合物可以和藥用受體或載體一起被配制成藥物組合物。特別是，可以理想地將組合物用作各種實驗試劑，用于控制動物的持久期和研究衰老，應激，信號轉導，神經(jīng)疾病和代謝病的機理。
新型信息素化合物或它的鹽，是一種生理活性物質，當將該純信息素加到培養(yǎng)基上時其實際上能夠誘導線蟲進入持久幼蟲期。發(fā)現(xiàn)這是一種新型信息素化合物，其具有上述結構式I，它的化學式是6-(3，5-二羥基-6-甲基-四氫-吡喃-2-基氧基)-庚酸。
本發(fā)明的第一個目的是大量制備高度純化的線蟲的單分子持久信息素，其可以用于衰老，信號轉導，代謝調節(jié)和應激的研究。第二個目的是使用各種分析技術和生物測定來表征它的化學結構和證實分離的純持久信息素是否是新的和包含生物學功能的持久誘導化合物。
信息素化合物或它的鹽，其通過本發(fā)明分離和表征，是從線蟲中分泌的化合物，顯示持久信息素活性。
當前被許多研究人員用于研究衰老，信號轉導和應激的信息素活性級分是通過乙醇提取培養(yǎng)的線蟲制備的粗提物。因此，由于純的持久信息素的可用性，現(xiàn)在研究與持久信息素有關的衰老，信號轉導和應激是可能的。
結合后附的表和圖將更詳細地描述本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。
盡管在上文已經(jīng)詳細描述本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，應當清楚地理解可適用于本領域技術人員的本文教導的基本發(fā)明概念的許多變化和/或改進將仍屬于如后附權利要求所定義的本發(fā)明的精神和范圍以內。
實施方案在S.basal液體培養(yǎng)基上在20℃的溫度下通過喂飼大腸桿菌(OP50)培養(yǎng)線蟲5天后，通過另外給料將它們進一步培養(yǎng)10多天。
在70％以上的蠕蟲進入持久幼蟲期后進行離心分離以獲得肉湯。使用0.45μm的膜濾器通過膜式過濾去除蠕蟲和大腸桿菌獲得培養(yǎng)基的液相。
通過真空蒸發(fā)器使培養(yǎng)基完全脫水可以獲得粉末態(tài)的純培養(yǎng)基。
將乙醇加入粉末形式的培養(yǎng)基并進行使用乙醇的該溶液的提取。重復該過程3次。
為了檢驗該乙醇提取物(A)是否能誘導持久幼蟲期，在已經(jīng)在S培養(yǎng)基中生長的蠕蟲上進行持久試驗。
表1顯示A的持久誘導活性。一旦A顯示持久誘導活性，用乙酸乙酯進一步提取它。簡短地，將干燥的A溶解在重蒸餾水中并用等體積的乙酸乙酯提取。重復該提取步驟5次。
表2顯示乙酸乙酯提取物(B)對線蟲的持久誘導活性的測定結果。在證實B的持久誘導活性以后，將通過上述方法獲得的提取物加樣到已經(jīng)用己烷∶乙酸乙酯∶甲醇＝7∶7∶1平衡的硅膠吸附柱上。用甲醇洗脫吸附在柱上的活性形式持久信息素(C)。
表3概括顯示使用從硅膠柱獲得的級分(C)的持久誘導測定的結果。為了進一步純化C，使用胺柱進行HPLC分離。簡短地，將級分C溶解在甲醇中并用重蒸餾水稀釋(MeOH∶ddH2O＝1∶1)。將包含C的該溶液加樣到用異丙醇溶液(異丙醇∶水＝1∶1)平衡的胺柱上。用相同溶劑的梯度溶液洗脫與柱結合的持久信息素級分(級分D)。表4顯示從胺柱色譜獲得的與時間的洗脫曲線的模式。
表5概述使用來自胺柱色譜的活性級分D的持久誘導測定的結果。最后，通過使用甲醇作為洗脫溶液的尺寸排阻柱色譜法完全分離和純化精制持久信息素(E)。
表6概述純化的持久信息素的持久誘導活性測定結果。通過上述方法表征的純持久信息素被確定為結構式I，它的化學式是6-(3，5-二羥基-6-甲基-四氫-吡喃-2-基氧基)-庚酸或其鈉鹽。
6-(3，5-二羥基-6-甲基-四氫-吡喃-2-基氧基)-庚酸可以與堿反應以制備它的鹽形式。該堿可以是藥物可適用的堿金屬或堿土金屬鹽的一種。例如，可以將鈉，鉀，鎂，或鈣用作堿。
純持久信息素，6-(3，5-二羥基-6-甲基-四氫-吡喃-2-基氧基)-庚酸的分子量為276道爾頓，其分子式為C13H24O6。然而，它分離形式的分子量證明是299道爾頓，因為1分子鈉與它通過非共價鍵結合以便顯示生物活性。
通過分析四重串聯(lián)質譜儀發(fā)現(xiàn)純的形式和分離形式之間的分子量差異，從中1分子鈉與酸性形式非共價結合。另外，純化的信息素化合物，6-(3，5-二羥基-6-甲基-四氫-吡喃-2-基氧基)-庚酸，也可變成銨鹽形式，其導致證實它的分子量276道爾頓。
為了測定具有式I的本發(fā)明信息素的化學結構，使用氘甲醇(CD3OD)作為溶劑分析氫核磁共振譜(1H-NMR)。使用氘甲醇(CD3OD)作為溶劑還可分析碳核磁共振譜(13C-NMR)。
以ppm單位設置化學位移。通過使用二維NMR技術如1H-1HDQF-COSY譜，13C-1H HMBC獲得確定的1H-和13C-NMR化學位移。結果在表7中顯示。即，持久信息素的1H NMR(MHz)，13C NMR(MHz)的譜分析結果證實它的分子式是6-(3，5-二羥基-6-甲基-四氫-吡喃-2-基氧基)-庚酸。
工業(yè)適用性如上所述，從本發(fā)明，我們能夠從線蟲中獲得新的持久信息素和測定它的化學結構為6-(3，5-二羥基-6-甲基-四氫-吡喃-2-基氧基)-庚酸，其可以作為它的各種鹽形式存在?，F(xiàn)在我們的發(fā)明可以導致對衰老，信號轉導，應激，代謝，肥胖癥，和神經(jīng)疾病的研究。本發(fā)明進一步引導我們針對廣泛類型的多種疾病開發(fā)藥理有效的藥物候選分子。
表1


表2


表3


表4


表5


表6


表7


權利要求
1.一種持久信息素化合物或其鹽，其由下列結構式I表示，結構式I
2.權利要求1的持久信息素化合物或其鹽，其中所述信息素化合物是6-(3，5-二羥基-6-甲基-四氫-吡喃-2-基氧基)-庚酸。
3.權利要求1的持久信息素化合物或其鹽，其中所述鹽是6-(3，5-二羥基-6-甲基-四氫-吡喃-2-基氧基)-庚酸鈉鹽。
4.權利要求1的持久信息素化合物或其鹽，其中通過使6-(3，5-二羥基-6-甲基-四氫-吡喃-2-基氧基)-庚酸與堿金屬或堿土金屬鹽堿反應另外形成加成鹽。
5.權利要求1的持久信息素化合物或其鹽，其中所述持久信息素包含用一種或多種選自水，醇類，和乙酸乙酯的溶劑提取線蟲和用各種溶劑作為洗脫劑的色譜分離。
6.一種適于持久誘導活性的藥物組合物，其包含6-(3，5-二羥基-6-甲基-四氫-吡喃-2-基氧基)-庚酸或其鹽，和藥用載體。
7.權利要求6的藥物組合物，其中所述組合物誘導線蟲的持久態(tài)或控制動物的衰老態(tài)。
8.一種用于分離和表征由下列結構式I表示的持久信息素化合物或其鹽的方法，其包含以下步驟用乙醇提取線蟲的總培養(yǎng)肉湯(級分A)；在將所述乙醇提取物溶解于水中以后用乙酸乙酯提取級分A以制備級分B；通過硅膠吸附色譜法從所述級分B中去除雜質(級分C)；通過使用胺柱的HPLC分離和純化級分C以制備級分D；和通過使用分子大小排阻柱的另外的HPLC完全純化級分D以制備純的持久信息素化合物，結構式I
9.權利要求8的方法，其中所述去除步驟包含以下步驟通過在用己烷∶乙酸乙酯∶甲醇＝7∶7∶1平衡的硅膠吸附柱色譜上流動去除雜質，和然后通過用甲醇洗脫的硅膠吸附柱色譜洗脫部分純化的信息素級分。
10.權利要求9的方法，其中通過使用胺柱的HPLC，通過使用異丙醇和蒸餾水的溶液組合物的梯度洗脫方法，分離和純化所述部分純化的信息素級分來獲得信息素級分。
11.權利要求10的方法，其中通過使用柱(W251)的HPLC分離生物活性的信息素化合物，所述柱通過使用甲醇溶劑的恒溶劑洗脫通過分子量分離所述信息素級分。
12.持久信息素化合物或其鹽用于研究衰老，信號轉導和應激的應用，所述持久信息素或其鹽由下列結構式I表示，結構式I
全文摘要
本發(fā)明公開一種用于有效分離和純化與線蟲的衰老和應激有關的、具有下列結構式I的生理活性的持久信息素化合物和測定該物質的結構的方法。首先，在S.basal液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)線蟲以后通過用乙醇完全濃縮液體培養(yǎng)基制備乙醇提取物，然后用乙酸乙酯進一步提取該乙醇級分。然后，通過硅膠吸附色譜法從乙酸乙酯提取物中去除雜質，通過使用各種溶劑作為洗脫劑的胺柱色譜法程序分離和純化信息素提取物。最后，通過尺寸排阻HPLC完全分離和表征具有結構式I的信息素化合物。
文檔編號C07D309/12GK1692107SQ03801482
公開日2005年11月2日 申請日期2003年10月7日 優(yōu)先權日2002年11月14日
發(fā)明者白融基, 鄭鈑泳 申請人:白融基, Kdr生物技術有限公司