專利名稱：一種藥物組合物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種藥物組合物及其應(yīng)用，確切的說(shuō)是，酸漿苦素 A和木樨草苷(或木樨草素)抑制LPS誘導(dǎo)RAW 264. 7細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮(NO)的協(xié)同作用，以及二者在同時(shí)控制中藥錦燈籠(酸漿)質(zhì)量方面的新用途。
背景技術(shù)：
一氧化氮(NO)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新型的細(xì)胞信使分子，它介導(dǎo)并調(diào)節(jié)包括炎癥在內(nèi)的多種生理和病理過(guò)程(陳敏珠.一氧化氮與炎癥免疫細(xì)胞.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)， 1992，8，409-415.)，在炎癥、免疫、癌癥，心腦血管調(diào)節(jié)等過(guò)程中起著重要的生物學(xué)作用。在生物體內(nèi)，NO由精氨酸胍基氮經(jīng)過(guò)一氧化氮合成酶(N0Q的催化氧化而形成，其中誘導(dǎo)型 NOS(iNOS)的表達(dá)與炎癥和腫瘤密切相關(guān)。當(dāng)巨噬細(xì)胞受到脂多糖(LPS)、干擾素(IFN)等的刺激作用時(shí)，會(huì)激活iNOS mRNA的表達(dá)，再翻譯成iNOS，進(jìn)而催化產(chǎn)生大量的N0，發(fā)揮殺傷病原微生物和腫瘤細(xì)胞的作用。但另一方面，由iNOS催化產(chǎn)生的NO釋放過(guò)多，會(huì)非選擇性造成細(xì)胞和組織的損傷，引發(fā)各種疾病，如加重炎癥反應(yīng)等。近年來(lái)研究表明NO與癌變及癌組織的增生有關(guān)，高濃度的NO會(huì)誘發(fā)基因突變和腫瘤(藏夢(mèng)維，劉景生.一氧化氮的致突變性和致癌性.國(guó)外醫(yī)學(xué)生理、病理科學(xué)與臨床分冊(cè)，1998，18(1)，37-40.)。除此之外，NO代謝異常還能導(dǎo)致哮喘、中風(fēng)、急性髓性白血病、帕金森癥、早老性癡呆等嚴(yán)重疾病的發(fā)生。酸漿始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有除煩熱，清咽利喉的功效，其后歷代本草多有收藏，《中華人民共和國(guó)藥典》各版均收載P. alkekengi L. var. francheti (酸漿)的干燥宿萼或帶果實(shí)的宿萼作為藥用，別稱“錦燈籠”。用于治療咽痛音現(xiàn)，痰熱咳嗽，小便不利；外治天皰瘡，濕疹(國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典一部[Z].北京化學(xué)工業(yè)出版社， 2010. 337-338)。酸漿苦素類留體內(nèi)酯和黃酮類化合物是錦燈籠中的兩大類主要活性成分， 具有抗癌、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等作用(Li-Xia Chen,Hao He,Feng Qiu. Natural withanolides nn overview. Natural Product R印orts，2011，沘 ，705-740.)。雖然本課題組前期對(duì)酸漿苦素和黃酮類成分抑制LPS誘導(dǎo)RAW沈4. 7細(xì)胞產(chǎn)生NO的體外活性方面進(jìn)行了研究(Li Qiu,Feng Zhao，ZhiHu Jiang，LiXia Chen，Qian Zhao，HongXia Liu，XinSheng Yao, Feng Qiu.Steroids and Flavonoids from Physalis alkekengi var. franchetii and Their Inhibitory Effects on Nitric Oxide Production. Journal of Natural Products, 2008, 71(4)，642-646 ；Li Qiu,Zhi-Hu Jiang，Hong-Xia Liu,Li-Xia Chen,Xin-Sheng Yao,Feng Qiu. A pair of 3—epimeric physalins from Physalis alkekengi L. var. franchetii, Journal of Asian Natural Product Research，2008，10 (9)，881—885 ；丘區(qū)莉，姜志虎，劉J紅霞，陳麗霞，曲戈霞，邱峰.酸漿宿萼的黃酮苷類化合物，沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，24 (12)， 744-747 ；邱莉.酸漿化學(xué)成分及其生物活性研究，沈陽(yáng)藥科大學(xué)博士學(xué)位論文，2008年.)， 但對(duì)于兩類成分抑制NO產(chǎn)生的協(xié)同作用研究還未見(jiàn)任何文獻(xiàn)和專利報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明運(yùn)用體外活性篩選體系進(jìn)行活性評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)酸漿苦素A和木樨草苷(或木樨草素)具有抑制RAW沈4.7細(xì)胞產(chǎn)生NO的協(xié)同作用，表明這兩個(gè)化合物的組合物可能具有治療由于NO代謝異常而導(dǎo)致的疾病，如炎癥、癌癥、哮喘、中風(fēng)、早老性癡呆等，同時(shí)以酸漿苦素A和木樨草苷為指標(biāo)成分可對(duì)中藥錦燈籠、及其提取物和制劑進(jìn)行質(zhì)量控制，具有良好的研究開(kāi)發(fā)前景。本發(fā)明的首要目的在于提供酸漿苦素A和木樨草苷(木樨草素)的藥物組合治療發(fā)病機(jī)制與一氧化氮的代謝異常有關(guān)聯(lián)的各種疾病。
酸漿苦素A木樨草苷本發(fā)明所述的酸漿苦素A和木樨草苷或木樨草素，均為本課題組前期研究中從錦燈籠藥材中制備獲得，純度> 98%。本發(fā)明的另一目的在于提供同時(shí)采用酸漿苦素A和木樨草苷兩個(gè)藥效成分作為指標(biāo)，控制錦燈籠藥材、及其提取物和制劑質(zhì)量的方法。本發(fā)明的應(yīng)用范圍包括各種由于NO代謝異常所導(dǎo)致的疾病。首先，酸漿苦素A和木樨草苷聯(lián)合應(yīng)用可用于治療NO代謝異常所導(dǎo)致的疾病，其中包括但不限于，全身炎癥反應(yīng)綜合癥、高血壓、腦血栓、心力衰竭、肝硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨性關(guān)節(jié)炎、脊柱關(guān)節(jié)炎、炎性腸病，急性胰腺炎、腹膜炎、膽囊炎、目尾炎、糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、皮肌炎、銀屑病、急性髓性白血病、帕金森癥、早老性癡呆、抑郁癥、敗血病、慢性阻塞性肺病、哮喘、急性胰腺炎、中樞神經(jīng)損傷等。其次，NO代謝異常還與癌變及癌組織的增生有關(guān)，高濃度的NO也會(huì)誘發(fā)基因突變和腫瘤，酸漿苦素A和木樨草苷聯(lián)合應(yīng)用可以產(chǎn)生協(xié)同作用，抑制NO釋放，從而發(fā)揮抗腫瘤的作用。適用的腫瘤例子包括但不限于各種實(shí)體腫瘤和白血病，如肺癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、骨癌、食道癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、膀胱癌、子宮頸癌、黑色素瘤、睪丸癌、支氣管癌、腎細(xì)胞癌、膽管癌、絨毛膜癌、膠質(zhì)細(xì)胞瘤、神經(jīng)纖維瘤、纖維肉瘤、淋巴管瘤等。本發(fā)明提供了酸漿苦素A和木樨草苷組合形成的藥物組合物，其重量混合比例為在有效劑量范圍內(nèi)的任意數(shù)值，較佳的比例為1 50 50 1(重量比)，更佳的比例為 1 10 10 1(重量比)。該組合物可與藥學(xué)意義上可用的各種輔料制成各種常規(guī)制劑和劑型，采用口服、胃腸外(例如，肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、腦池內(nèi)注射或者輸注、皮下注射或者植入，或通過(guò)吸入噴霧劑，或經(jīng)鼻、陰道、直腸、舌下或者局部給藥途徑)給藥的方式，用于預(yù)防和治療各種與NO代謝異常有關(guān)的疾病。由于木樨草苷屬于黃酮苷類成分，口服后在胃腸道中易轉(zhuǎn)化成木樨草素，在體內(nèi)主要以其苷元木樨草素的形式被吸收入血而發(fā)揮作用，因此我們也研究了酸漿苦素A和木
4樨草素組合物的作用情況，結(jié)果顯示具有類似的協(xié)同作用。本發(fā)明相對(duì)現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果提供了酸漿苦素A和木樨草苷(或木樨草素)聯(lián)合用藥發(fā)揮協(xié)同作用，治療各種由于NO代謝異常所導(dǎo)致的疾病。組合物涉及的單體成分來(lái)源于天然素材，具有安全可靠的特點(diǎn)。


圖1為木樨草苷的高效液相色譜圖(保留時(shí)間為12. 57min)；色譜條件色譜柱AglientZORBAX SB-C18 (4. 6 X 150mm) 5 μ m檢測(cè)波長(zhǎng)350nm流速1.0mL/min柱溫30°C樣品量10μ L(0. 2mg/mL)流動(dòng)相A (乙腈)，B (0. 2 %磷酸-水)O-IOmin(10% A — 20% A) ； 10-25min(20% A ^ 35% Α) ；25_30min(35% Α) ；30-35min(100% Α) ；35-40min (10% A)圖2為木樨草素的高效液相色譜圖(保留時(shí)間為21. 35min)；色譜條件色譜柱AgliemZORBAX SB-C18 (4. 6 X 150mm) 5 μ m檢測(cè)波長(zhǎng)350nm流速1.0mL/min柱溫30°C樣品量10 μ L (0. 2mg/mL)流動(dòng)相A (乙腈)，B (0. 2 %磷酸-水)O-IOmin(10% A ^ 20% A) ； 10-25min(20% A ^ 35% Α) ；25_30min(35% Α) ；30-35min(100% Α) ；35-40min (10% A)圖3為酸漿苦素A的高效液相色譜圖(保留時(shí)間為26. 02min)；色譜條件色譜柱AglientZORBAX SB-C18 (4. 6 X 150mm) 5 μ m檢測(cè)波長(zhǎng)220nm流速1.0mL/min柱溫30°C樣品量10 μ L (0. 2mg/mL)流動(dòng)相A (乙腈)，B (0. 2 %磷酸-水)0-10min(10%A^20%A) ；10-25min (20% A ^ 35% Α) ；25-30min (35% Α)；30-35min(100% Α) ；35-40min (10% A)
具體實(shí)施例方式本發(fā)明可通過(guò)下面的實(shí)施例加以說(shuō)明。實(shí)施例1 木樨草苷與酸漿苦素A聯(lián)合用藥對(duì)脂多糖誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264. 7釋放一氧化氮(NO)的抑制活性實(shí)驗(yàn)小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW 264. 7 (ATCC TIB-71)培養(yǎng)于含10 %熱滅活(56 °C， 30min)胎牛血清(FBS)、100U/mL 青霉素鈉(Gibco)、100 μ g/mL 鏈霉素(Gibco)的 RPMI 1640 (Gibco)培養(yǎng)液中，37°C，5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中孵育生長(zhǎng)。由于NO極不穩(wěn)定，在細(xì)胞培養(yǎng)上清液內(nèi)很快代謝成亞硝酸基(N02_)，故采用 Griess法測(cè)定樣品中N02_的濃度作為衡量NO水平的指標(biāo)。Griess試劑A :0. 1 % N-萘乙二胺鹽酸鹽(naphthylethylene diamine dihydrochloride)溶于水中；Griess試劑B 1 % 對(duì)氨基苯磺酰胺(sulphanilamide)溶于5% H3PO4中。使用前等體積混合試劑A和B。用RPMI 1640培養(yǎng)液將RAW 264. 7細(xì)胞稀釋至5 X 105cells/mL濃度，接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入200 μ L細(xì)胞懸浮液。(X)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Ih后，每孔加入脂多糖 (lipopolysaccharide，LPS) (Sigma)(終濃度1 μ g/mL)和DMSO溶解的不同濃度的測(cè)試樣品0. 4 μ L，同時(shí)設(shè)LPS組(加入LPS，但不加入測(cè)試樣品，對(duì)NO釋放的抑制率為0% )和空白對(duì)照組(不加入LPS和測(cè)試樣品，僅加入0. 4 μ LDMS0,對(duì)NO釋放的抑制率為100% )，每個(gè)樣品設(shè)4個(gè)平行孔。在37°C ,5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Mh，吸取100 μ L培養(yǎng)液上清至酶標(biāo)板中，離心(1000 X g，4°C，3min)，加入100 μ L Griess試劑，室溫避光反應(yīng)IOmin,于酶標(biāo)儀測(cè)定其^Onm處的吸光值。用濃度分別為1、5、10、50 μ mol/L的NaNO2繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線， 根據(jù)NaNO2標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO2-的濃度進(jìn)而計(jì)算測(cè)試樣品對(duì)NO釋放的抑制率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下酸漿苦素A (0. 78125 μ mol/L)單獨(dú)用藥對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW 264. 7細(xì)胞產(chǎn)生NO的抑制率為36. 5 士 9.1%。木樨草苷與酸漿苦素A聯(lián)合用藥M小時(shí)，有協(xié)同作用^!>1.15)。表1不同濃度的木樨草苷與酸漿苦素A聯(lián)合作用于RAW 264. 7細(xì)胞的結(jié)果(％ )
酸漿苦fA木樨草苷(μηιο Τ
(μιηοΙ/L) 0
0.78125
0.39063 -3.9士16.4 43.3 土 0.6 >1.15
0.78125 3.7 士 7.5 51.0土1.8 >1.15
1.5625 8.2 士 7.9 52.8±1.8 >1.15
3.125 3.9±11.5 53.2 士 2.0 >1.15
6.25 5.2±10.9 51.1±5.5 >1.15
12.5 6.0±7.3 58.4i3.6 >1.15
25 60.9 士 5.4 115.5 土 7.9 >1.15注按以下公式計(jì)算Q值并判斷兩藥的聯(lián)合效應(yīng)Q = E(A+B)/(EA+EB-EAXEB), 其中E(A+B)為兩藥合用的抑制率，EA和EB分別為兩藥單用的抑制率。Q為0. 85 1. 15 表示兩藥作用相加，Q > 1. 15表示兩藥作用協(xié)同，Q < 0. 85表示兩藥作用拮抗。實(shí)施例2 酸漿苦素A與木樨草苷聯(lián)合用藥對(duì)脂多糖誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW 264. 7釋放一氧化氮(NO)的抑制活性實(shí)驗(yàn)活性測(cè)試方法同木樨草苷與酸漿苦素A聯(lián)合用藥抑制NO釋放實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下木樨草苷(0. 78125 μ mol/L)單獨(dú)用藥對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW 264. 7細(xì)胞產(chǎn)生NO的抑制率為3.7 士 7.5%。酸漿苦素A與木樨草苷聯(lián)合用藥M小時(shí)，有協(xié)同作用0 >1.15)。表2不同濃度的木樨草苷與酸漿苦素A聯(lián)合作用于RAW 264. 7細(xì)胞的結(jié)果(％ )
權(quán)利要求
1.一種藥物組合物，其特征在于，含有酸漿苦素A和木樨草苷兩個(gè)組分。
2.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，所述的木樨草苷由木犀草素代替。
3.如權(quán)利要求1或2所述的藥物組合物，其特征在于，酸漿苦素A木樨草苷或酸漿苦素A 木犀草素的重量比為1 50 50 1。
4.如權(quán)利要求1或2所述的藥物組合物，其特征在于，酸漿苦素A木樨草苷或酸漿苦素A 木犀草素的重量比為1 20 8 1。
5.權(quán)利要求1或2所述的藥物組合物在制備治療與一氧化氮的代謝異常有關(guān)聯(lián)的疾病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了酸漿苦素A(physalin A)和木樨草苷(luteoloside或luteolin-7-O-β-D-glucopyranoside)或木樨草素(luteolin)的藥物組合在抑制脂多糖誘導(dǎo)的大鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞釋放一氧化氮(NO)體外活性方面的協(xié)同作用以及在醫(yī)藥領(lǐng)域的新用途。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)這兩類成分酸漿苦素A和木樨草苷或木樨草素在抑制NO釋放方面的協(xié)同作用，為中藥酸漿在清熱解毒、利咽化痰方面的傳統(tǒng)應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。酸漿苦素A和木樨草苷(或木樨草素)的組合物可作為發(fā)病機(jī)制與一氧化氮的代謝異常有關(guān)聯(lián)的腫瘤、炎癥、免疫等疾病的治療。
文檔編號(hào)A61P25/28GK102552301SQ201110462328
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2011年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月31日
發(fā)明者康寧, 趙烽, 邱峰, 陳麗霞 申請(qǐng)人:沈陽(yáng)藥科大學(xué)