專利名稱：一種對(duì)蝦基因及其編碼的多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種對(duì)蝦基因核苷酸序列。具體地說，本發(fā)明涉及對(duì)蝦PMAVP多肽的cDNA序列，該多肽蛋白是一種抗病毒蛋白。本發(fā)明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽，這些多核苷酸和多肽的應(yīng)用，以及所述多核苷酸和多肽的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
對(duì)蝦是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的一種很重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，但對(duì)蝦疾病自從九十年代初在世界范圍陸續(xù)爆發(fā)以來，給全球水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大損失。造成這一結(jié)果的根本原因就是病毒病，直到現(xiàn)在它仍是困擾對(duì)蝦養(yǎng)殖的主要問題。由于對(duì)蝦病毒病尚無法治療，因此目前只能從優(yōu)化養(yǎng)殖環(huán)境，阻斷病原的傳播，提高對(duì)蝦種質(zhì)，增強(qiáng)對(duì)蝦基礎(chǔ)免疫力等方面入手，以期實(shí)行對(duì)養(yǎng)殖對(duì)蝦病害的有效控制和預(yù)防。國(guó)內(nèi)外學(xué)者在這些方面做了大量的工作，也取得了一些成果。如利用滅活的弧菌疫苗，可有效地提高養(yǎng)成期及苗期日本對(duì)蝦的成活率(J of AquaticAnimal Health，1991，3151-2)；利用口服免疫增強(qiáng)劑(如β-1，3-葡聚糖和肽聚糖)可增強(qiáng)對(duì)蝦血細(xì)胞的吞噬活性及對(duì)細(xì)菌性感染的抵抗能力(Fish.Chimes.，1996，1641-42)；一些富含多糖、生物堿、有機(jī)酸等多種成分的天然物質(zhì)對(duì)對(duì)蝦有免疫刺激作用(海洋與湖沼，1995，2634-41)。但在現(xiàn)有的技術(shù)水平和養(yǎng)殖模式下這些方法都無法徹底解決問題。
利用對(duì)蝦本身的抗病因子加強(qiáng)抗病力有望成為防治其病害的根本方法。對(duì)蝦屬甲殼類無脊椎動(dòng)物，雖然它缺乏特異性免疫系統(tǒng)，但是卻具有一定的抗病能力，以抵抗環(huán)境(水體)中多種病原的侵襲，這和對(duì)蝦體內(nèi)存在眾多的抗病因子(如各種酶、酶激活劑、酶抑制劑、細(xì)胞因子、抗菌肽、凝集素等)密切相關(guān)，所以研究特異的抗病因子對(duì)病害防治具有根本意義。但無脊椎動(dòng)物包括對(duì)蝦的免疫學(xué)特別是免疫分子生物學(xué)研究水平較人類及高等動(dòng)物大為落后，以致在解決其養(yǎng)殖中的病害和良種培育等問題時(shí)缺乏科學(xué)支撐?，F(xiàn)在已經(jīng)開始從分子水平對(duì)對(duì)蝦自身的免疫機(jī)制展開研究，對(duì)蝦的一些免疫因子已被分離或克隆。如酚氧化酶原(proPO)激活系統(tǒng)是對(duì)蝦免疫系統(tǒng)的一個(gè)重要組成部分，現(xiàn)在其中的一些成分或相關(guān)成分的結(jié)構(gòu)功能乃至基因都已經(jīng)研究得比較清楚(Current Opinion in Immunology，1998，1023-28)；抗菌肽在對(duì)蝦抵抗細(xì)菌侵襲方面起著重要的作用，法國(guó)學(xué)者已從對(duì)蝦中獲得了三種抗菌肽(penaeidin)及其基因(Cell Mol.Life Sci.，2000，571260-71)；凝集素是對(duì)蝦體內(nèi)基本的識(shí)別和防御分子，目前也已有多種凝集素被純化(Aquaculture，2000，19123-44)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明中的對(duì)蝦PMAVP的cDNA核苷酸序列是如此獲得的。選擇世界養(yǎng)殖面積最大的斑節(jié)對(duì)蝦為研究對(duì)象，運(yùn)用差異顯示技術(shù)(DD-PCR法)對(duì)正常蝦和抗病蝦的mRNA表達(dá)差異進(jìn)行了比較研究，選取差異DNA條帶進(jìn)行RNA雜交鑒定，將顯陽性的差異DNA進(jìn)行測(cè)序，獲得了SEQ ID No.1的cDNA序列。然后證明它編碼的蛋白具有抗病毒功能。在本發(fā)明被公布之前，尚沒有任何人公開過本申請(qǐng)中涉及的對(duì)蝦抗病毒基因。本發(fā)明將可能為對(duì)蝦病害的防治提供新的途徑，促進(jìn)對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種新的多核苷酸，該核苷酸編碼一種新的抗病毒蛋白，此抗病毒蛋白被命名為PMAVP。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種新的對(duì)蝦抗病毒蛋白，該蛋白被命名為PMAVP。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)所述的新的對(duì)蝦抗病毒蛋白的方法。
本發(fā)明還提供了這種對(duì)蝦的抗病毒基因序列和多肽的應(yīng)用。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種分離出的DNA分子，它包括一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼對(duì)蝦PMAVP蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列與SEQ ID No.1中1-513的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述核苷酸序列能在中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID No.1中1-513的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID No.2所示的序列。更佳地，該序列具有SEQ ID No.1中1-513位的核苷酸序列。
在本方面的另一方面，提供了一種分離的PMAVP蛋白多肽，它包括具有SEQID No.2氨基酸序列的多肽、或者其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID No.2序列的多肽。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種載體，它含有上述分離出的DNA。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種產(chǎn)生具有PMAVP蛋白活性的多肽的方法。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明中分離的多核苷酸全長(zhǎng)為776個(gè)核苷酸，其詳細(xì)序列見SEQ ID No.1，其中開放讀框位于1-513位核苷酸。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組分分開，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。“嚴(yán)謹(jǐn)條件”是指雜交的條件，如溫度和緩沖液成分等產(chǎn)生的雜交嚴(yán)謹(jǐn)程度的等級(jí)。
在本發(fā)明中，術(shù)語“PMAVP蛋白(或多肽)編碼序列”是指編碼具有PMAVP蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID No.1中的1-513位核苷酸序列及其簡(jiǎn)并序列。該簡(jiǎn)并序列是指，位于SEQ ID No.1序列的編碼框1-513位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，所以與SEQ ID No.1中1-513位核苷酸同源性低至約70％的簡(jiǎn)并序列也能編碼出SEQ ID No.2所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴(yán)謹(jǐn)條件下，更佳地在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下，與SEQ ID No.1中從核苷酸1-513位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語還包括與SEQ ID No.1中1-513的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
該術(shù)語還包括能編碼具有與對(duì)蝦PMAVP相同功能的蛋白的、SEQ ID No.1序列的變異形式。這些變異形式包括若干個(gè)(通常為1-90個(gè)，較佳地1-60個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi)，較佳地為30個(gè)以內(nèi)，更佳地10個(gè)以內(nèi)，最佳地5個(gè)以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，“純的”蛋白質(zhì)或多肽是指其至少占樣品總物質(zhì)的至少50％，較佳地至少75％，更佳地至少90％(按干重或濕重計(jì))。純化可以用任何合適的方法進(jìn)行測(cè)量，如用柱層析、PAGE或HPLC測(cè)量多肽的純度。
在本發(fā)明中，術(shù)語“PMAVP蛋白多肽”指具有PMAVP蛋白活性的SEQ ID No.2序列的多肽。該術(shù)語還包括具有抗病毒功能的、SEQ ID No.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括PMAVP蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、修飾形式、在高或低的嚴(yán)謹(jǐn)度條件下能與PMAVP DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗PMAVP多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其它多肽，如包含PMAVP多肽或者其片段的融合蛋白。除了幾乎全長(zhǎng)的多肽外，本發(fā)明還包括了PMAVP多肽的可溶性片段。通常，該片段具有PMAVP多肽序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸。
本發(fā)明還提供PMAVP蛋白或多肽的類似物，這些類似物與天然PMAVP多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體，誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其它已知分子生物學(xué)技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性多肽。
修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基的序列，還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
本發(fā)明還包括一種探針分子，該分子通常具有PMAVP多肽編碼序列的8-100個(gè)，較佳地15-50個(gè)連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測(cè)樣品中是否存在編碼PMAVP的核酸分子。
本發(fā)明還包括檢測(cè)PMAVP核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測(cè)探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對(duì)應(yīng)于PMAVP多肽的編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長(zhǎng)度一般為15-50個(gè)核苷酸。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如CHO、COS細(xì)胞等。
另一方面，本發(fā)明還包括對(duì)PMAVP DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體或單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于PMAVP基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與PMAVP基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制PMAVP蛋白的分子，也包括那些并不影響PMAVP蛋白功能的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或(Fab)2片段、抗體重鏈、抗體輕鏈、遺傳工程改造的單鏈Fv分子或嵌合抗體。
本發(fā)明的抗體抗原通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的PMAVP基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)PMAVP或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動(dòng)物以生產(chǎn)抗體。片段可以利用重組方法制備或利用合成儀合成。單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，2001)中所述的實(shí)驗(yàn)條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1 PMAVP cDNA序列的克隆和測(cè)定1.DD-PCR提取正常對(duì)蝦和抗病對(duì)蝦肝胰腺T-RNA，并用DNase I處理。然后分別用FluoroDD試劑盒(購(gòu)自Beckmann-Coulter)中的錨定引物AP6進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄程序42℃ 10min，50℃ 60min，70℃ 15min，4℃暫存。
AP6序列5’-ACG ACT CAC TAT AGG GCT TTT TTT TTT TTC C-3’T7啟動(dòng)子引物序列以此逆轉(zhuǎn)錄混合物為模板，用試劑盒中的隨機(jī)引物ARP2(上有TMR熒光標(biāo)記)和AP6配對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
ARP2序列5’-ACA ATT TCA CAC AGG AGC TAG CAT GG-3’M13(-48)引物序列PCR程序①95℃ 2min②4個(gè)循環(huán)92℃ 15sec；50℃ 30sec；72℃ 2min③30個(gè)循環(huán)92℃ 15sec；60℃ 30sec；72℃ 2min④72℃ 7min2.電泳、掃描分析和切膠回收PCR產(chǎn)物在GenomyxLR儀器上進(jìn)行5.6％變性PAGE電泳，然后在GenomyxSC熒光掃描儀中將電泳圖譜掃描成圖像，掃描軟件為AcquireSC。最后用軟件PhotoShop對(duì)比分析正常蝦和抗病蝦的mRNA經(jīng)DD-PCR后產(chǎn)生的差異DNA條帶，并進(jìn)行精確定位。再在切膠工作臺(tái)上定位，并無菌手術(shù)刀片切下差異條帶。切下的膠帶加入50μl TE在37℃處理1hr后取洗脫液保存于-20℃。
3.重?cái)U(kuò)增、測(cè)序以上述膠洗脫液為模板，以M13(-48)引物和T7啟動(dòng)子引物配對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR程序同DD-PCR。將PCR產(chǎn)物用M13(-48)引物進(jìn)行DNA測(cè)序，詳細(xì)序列見SEQID No.1，其中開放讀框位于1-513位核苷酸。
根據(jù)得到的核苷酸序列推導(dǎo)出PMAVP的氨基酸序列，共170個(gè)氨基酸殘基，其氨基酸序列詳見SEQ ID No.2。
實(shí)施例2 PMAVP在大腸桿菌中的表達(dá)1.PMAVP cDNA的擴(kuò)增將編碼PMAVP的cDNA序列用對(duì)應(yīng)于該DNA的開讀框的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得PMAVP插入片段。
5’寡核苷酸引物為5′-TAGTGCATGCATATGCGTCATACAATCCTA-3′(SEQ IDNo.3)，該引物含有Sph I限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)，在該位點(diǎn)后是由起始密碼子開始的PMAVP編碼序列的18個(gè)核苷酸。3’寡核苷酸引物為5’-CTGTCTCGAGTTAGTGATGGTGATGGTGATGTGTCCTGCTTTCACA-3’(SEQID No.4)，該引物含有XhoI限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)、終止密碼子、編碼6個(gè)組氨酸(His)的密碼子和PMAVP部分編碼序列。
PCR程序①95℃ 2min
②4個(gè)循環(huán)94℃ 15sec；50℃ 30sec；68℃ 1min③30個(gè)循環(huán)94℃ 15sec；60℃ 30sec；68℃ 1min④68℃ 10min2.PMAVP DNA的重組上述引物上的限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于細(xì)菌表達(dá)載體pThioHisC(Invitrogen)上的酶切位點(diǎn)。用Sph I和Xho I消化pThioHisC載體，隨后將擴(kuò)增的PMAVP片段連接到此載體。然后用連接混合物轉(zhuǎn)化XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞(Stratagene)，涂布在LB平板(含Amp 100μg/ml)上。挑取菌落，提取質(zhì)粒，用PCR、酶切和測(cè)序的方法鑒定PMAVP的DNA片段已正確插入了載體。
3.PMAVP重組蛋白的表達(dá)、純化和復(fù)性挑取含有PMAVP重組質(zhì)粒的單菌落于4ml LB液體培養(yǎng)基(含Amp 100μg/ml)，37℃搖培過夜。吸取1ml菌液于新的200ml LB液體培養(yǎng)基(含Amp 100μg/ml)，37℃搖培至OD600為0.6左右，加入IPTG至終濃度0.5mM，繼續(xù)搖培4hr。
離心菌液去上清，將細(xì)胞重懸于含有8M尿素的裂解緩沖液中，超聲裂解，離心去沉淀，上清中的PMAVP重組蛋白用鎳柱進(jìn)行親和純化。
采用分步透析法進(jìn)行純化PMAVP蛋白的復(fù)性，即將變性劑尿素的濃度由8M逐步降低，6M，4M，2M，1M，0.5M，最后用不含尿素的溶液透析兩次，將尿素完全透析掉。用SDS-PAGE鑒定純化蛋白的分子量和純度。
實(shí)施例3抗體制備將實(shí)施例2中獲得的純化的重組蛋白用等體積的完全Freund’s佐劑乳化，用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白對(duì)小鼠進(jìn)行皮下注射。10天后用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣劑量的同樣抗原再注射進(jìn)行加強(qiáng)免疫來免疫動(dòng)物以產(chǎn)生抗體，每隔10天進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，至少進(jìn)行3次。分析所獲抗血清的滴度和特異性。
在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)和修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表1.SEQ ID No.1的信息(1)序列特征(A)長(zhǎng)度776bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(2)分子類型cDNA(3)序列描述SEQ ID No.11 ATGCGTCATA CAATCCTAGT TTTCCTTTCC CTCGGTGTTG TTGGGTCGGC TGTGGCAACA61TCATACGAGA AAAGTGCCAA TGATTCCAAG GCTGTCTGCT ATAGCCCCTA TACTGCCATT121 GCGGATCGCT GTTTGTTTGT CGATCACCAG ACAGATGGAA GCTGGTATGA CATGCGAGAG181 TACTGTAACC TTATAAATGG AGACTTTCTC AAGCTGGATG ACGCTAATCT CCTTACTGAT241 ATCGTTGAGT ACATTACTTA CCAAGTGGGT GTGAACAGAG ACTACTGGAT CGGGGGGAGT301 GACGAGAACC ACGAGGGTCT TTGGCTGTGG ACGGACGGAA CTCTCATGCG GACAGGTGTT361 CCCTTGTGGT ACCATTGCAC CTCCATCTCT CAACAACCAG ATGGTGGCTC CTCAGAGAAC421 TGTGCCGTCA TGCGCTGGGA CTCATTTTAC CATATCCATG ATGTGTCTTG CTACACTTCT481 CGGTCTGTCA TTTGTGAAAG CAGGACACAT TAATCTAACA AGTTTTGGCC ACAGAAAAGA541 TATACAAATT GTTTTTTATT ACAAATTTTC TTTTATATCA TATTGTGCCA CAAGCCGAGA601 TCATTGGCAA AGTACACATT AACCAAATGA TATCTATATA CTATGTACAT TCGTTTATCA661 CGCTGCCCGT GGCCACACTG CCTTATGCAT TTAACTTTTC TAATCTGTCC TGAAATCTTT721 TTTAGCTGTA ACATTGCAAG AATAAATATT CTAAAGGAAA AAAAAAAAAA AAAAAA2.SEQ ID No.2的信息(1)序列特征(A)長(zhǎng)度170個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(2)分子類型多肽(3)序列描述SEQ ID No.21 MRHTILVFLS LGVVGSAVAT SYEKSANDSK AVCYSPYTAI ADRCLFVDHQ TDGSWYDMRE61YCNLINGDFL KLDDANLLTD IVEYITYQVG VNRDYWIGGS DENHEGLWLW TDGTLMRTGV121 PLWYHCTSIS QQPDGGSSEN CAVMRWDSFY HIHDVSCYTS RSVICESRTH3.SEQ ID No.3的信息(1)序列特征(A)長(zhǎng)度30bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(2)分子類型寡核苷酸(3)序列描述SEQ ID No.3TAGTGCATGC ATATGCGTCA TACAATCCTA 304.SEQ ID No.4的信息(1)序列特征(A)長(zhǎng)度46bp(B)類型核酸
(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(2)分子類型寡核苷酸(3)序列描述SEQ ID No.4CTGTCTCGAG TTAGTGATGG TGATGGTGAT GTGTCCTGCT TTCACA4權(quán)利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼對(duì)蝦PMAVP蛋白活性的多肽的核苷酸序列，或者所述核苷酸序列與SEQ ID No.1中1-513的核苷酸序列有至少70％的同源性，或者所述核苷酸序列能在中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ IDNo.1中1-513位的核苷酸序列雜交。
2.如權(quán)利要求1中所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID No.2所示的序列。
3.如權(quán)利要求1中所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQ ID No.1中從核苷酸1-513的核苷酸序列。
4.一種分離的PMAVP蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列的多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
5.如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID No.2序列的多肽。
6.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA。
7.一種產(chǎn)生具有PMAVP蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括(a)將編碼具有PMAVP蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成PMAVP蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID No.1中從核苷酸1-513位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成PMAVP蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)PMAVP蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有PMAVP蛋白活性的多肽。
8.如權(quán)利要求7中所述的方法，其特征在于，該重組的編碼多肽的核苷酸序列為SEQ ID No.1中從核苷酸1-513位。
9.一種能與權(quán)利要求4所述的PMAVP蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。
10.種探針分子，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述DNA分子中約8-100個(gè)連續(xù)核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了從對(duì)蝦中分離得到1個(gè)抗病毒基因，它編碼1種抗病毒蛋白PMAVP，它們可用于進(jìn)行對(duì)蝦抗病的研究。本發(fā)明選擇通過世界養(yǎng)殖面積最大的斑節(jié)對(duì)蝦為研究對(duì)象，運(yùn)用差異顯示技術(shù)(DD－PCR法)對(duì)正常蝦和抗病蝦的mRNA表達(dá)差異進(jìn)行了比較研究，選取差異DNA條帶進(jìn)行RNA雜交鑒定，將顯陽性的差異DNA進(jìn)行測(cè)序，獲得了SEQID No.1的cDNA序列。本發(fā)明將可能為對(duì)蝦病害的防治提供新的途徑，促進(jìn)對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展。
文檔編號(hào)C07K14/435GK1539969SQ0312281
公開日2004年10月27日 申請(qǐng)日期2003年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月21日
發(fā)明者章曉波, 邵宗澤, 羅田, 徐洵 申請(qǐng)人:國(guó)家海洋局第三海洋研究所