專利名稱：普拉克索用于治療肌萎縮性側(cè)索硬化的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用普拉克索(2-氨基-4，5，6，7-四氫-6-丙氨基苯并噻唑)治療神經(jīng)變性疾病。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及基本上純的立體異構(gòu)體R(+)2-氨基-4，5，6，7-四氫-6-丙氨基苯并噻唑(benzathiazole)和其藥理學(xué)上可接受的鹽作為神經(jīng)保護(hù)劑用以治療神經(jīng)變性疾病的用途。
背景技術(shù)：
神經(jīng)變性疾病(NDD)例如阿爾茨海默氏病(AD)和帕金森氏癥(PD)是由大腦中的某些種群的神經(jīng)元的加速損失所引起的。帕金森氏病(PD)和阿爾茨海默(AD)疾病通常都是零星地出現(xiàn)，沒(méi)有任何明顯的孟德?tīng)栠z傳方式，但是可以表現(xiàn)出母性偏向。雖然成年人的NDD存在稀見(jiàn)的或罕有的遺傳形式，但是在這些常染色體遺傳變異中，發(fā)病機(jī)理的相關(guān)性以更加普遍地零星形式出現(xiàn)是一個(gè)激烈討論的話題。
累積的跡象令人信服的表明偶發(fā)性成年人的NDD的主要發(fā)病機(jī)理與線粒體功能障礙有關(guān)，并因此引起細(xì)胞氧化應(yīng)激增加。PD和AD腦和非-CNS組織顯示線粒體電子傳遞鏈(ETC)活性降低。當(dāng)在胞質(zhì)雜交(″cybrid″)細(xì)胞模型中進(jìn)行選擇性放大時(shí)，從PD(Swerdlow等人，Exp Neurol 153135-42，1998)和AD(Swerdlow等人，ExpNeurol 153135-42 1997)患者中得到的線粒體基因概括出ETC缺乏，引起氧化應(yīng)激的增加和各種其它重要的線粒體和細(xì)胞的功能障礙。綜合組織研究和偶發(fā)性PD和AD的胞質(zhì)雜種模型的證據(jù)表明通過(guò)能捕獲氧自由基和保護(hù)細(xì)胞免受線粒體造成的細(xì)胞死亡的試劑，以緩減氧化應(yīng)激，被認(rèn)為是作為神經(jīng)保護(hù)劑用于治療這些疾病的化合物的一個(gè)主要特征(Beal，Exp Neurol 153135-42，2000)。
氧化應(yīng)激還與致命的神經(jīng)變性疾病肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)有關(guān)。ALS，又名Lou Gehrig氏病，是一種漸進(jìn)的致命性的神經(jīng)變性疾病，其涉及到皮層、腦干和脊髓的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。它是一種上下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的變性疾病，其導(dǎo)致隨意肌的逐漸衰弱，最終導(dǎo)致死亡。這種疾病通常發(fā)生在四十或五十歲的人中間，并且在發(fā)病后的2-5年內(nèi)導(dǎo)致個(gè)體死亡。ALS以偶發(fā)性的和家族性的形式發(fā)生。
在所有ALS患者當(dāng)中，約10％是家族性的病例，其中20％在過(guò)氧化物歧化酶1(SOD1)基因(以前被稱為Cu、Zn-SOD)中產(chǎn)生突變，這表明異常功能的Cu、Zn-SOD酶在發(fā)病機(jī)理和家族性肌萎縮性側(cè)索硬化(FALS)的進(jìn)展上可以起到一個(gè)關(guān)鍵性的作用。人們相信，由于突變SOD1引起的氧自由基尤其是羥基自由基的增加，是導(dǎo)致FALS中的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死亡的一系列事件的最初因素。此假設(shè)被最新的報(bào)道所證實(shí)，即，轉(zhuǎn)染了的突變SOD1的神經(jīng)元前體細(xì)胞導(dǎo)致羥基自由基產(chǎn)生的增加并且通過(guò)細(xì)胞凋亡加快細(xì)胞死亡的速率。此外，申請(qǐng)人認(rèn)為在偶發(fā)性形式的ALS中，氧化應(yīng)激同樣造成運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死亡。
最新的研究表明在與ALS有關(guān)的過(guò)早神經(jīng)元死亡中，一種可能的刺激情況是存在突變的線粒體基因(線粒體DNA，mtDNA)。這些mtDNA突變導(dǎo)致線粒體中能量產(chǎn)生途徑功能上的異常，導(dǎo)致產(chǎn)生過(guò)量的損害性氧衍生物，其被稱為″活性氧物種″(ROS)，包括稱為″氧自由基″的實(shí)體。當(dāng)產(chǎn)生的ROS超過(guò)細(xì)胞自身能夠消除/滅活ROS的能力時(shí)，這種情況被稱為存在″氧化應(yīng)激″。
氧化應(yīng)激可以損傷許多細(xì)胞成分。通過(guò)發(fā)明人的工作，表明在AD和PD的細(xì)胞模型中，由氧化應(yīng)激損傷的一種關(guān)鍵性細(xì)胞成分是一種特殊的線粒體蛋白質(zhì)絡(luò)合物，其被稱為″線粒體過(guò)渡孔隙絡(luò)合物″(MTPC)。正常活性的MTPC對(duì)保持線粒體膜之間的生物電勢(shì)(ΔΨ)是必不可少的，其反過(guò)來(lái)被用于儲(chǔ)存能量的化學(xué)物質(zhì)例如ATP的線粒體合成。ΔΨ的損失將引起線粒體的去極化并引發(fā)一系列生物化學(xué)反應(yīng)，最終通過(guò)一種被稱為″細(xì)胞程序死亡″或″細(xì)胞凋亡″的機(jī)理，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。細(xì)胞凋亡機(jī)理不僅在AD和PD中觀察到，而且還在其它NDD例如肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)和亨廷頓氏病中觀察到。
因此，治療這些各種神經(jīng)變性疾病的一種方法是給予一種神經(jīng)保護(hù)劑。用于這些虛弱的和致命的疾病的有效的神經(jīng)保護(hù)劑不僅應(yīng)該在這些疾病的細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物模型中是有效的，而且其實(shí)現(xiàn)對(duì)神經(jīng)組織治療效果所需的足夠高的劑量必須是能被長(zhǎng)期耐受的。理想地，這樣的藥劑還應(yīng)是以細(xì)胞成分為靶點(diǎn)涉及控制細(xì)胞死亡途徑以及阻斷疾病的病理生理過(guò)程。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方案，本發(fā)明提供一種治療神經(jīng)變性疾病例如ALS的方法。該方法包括將普拉克索給予個(gè)體的步驟，其中普拉克索的給藥量應(yīng)可以有效地減少個(gè)體中的氧化應(yīng)激。
普拉克索(PPX，2-氨基-4，5，6，7-四氫-6-丙氨基苯并噻唑)以兩種立體異構(gòu)體形式存在 S(-)對(duì)映體在D2族多巴胺受體上是一種有效的激動(dòng)劑，廣泛地在PD的癥狀控制中使用。在US 4,843,086、4,886,812和5,112,842中描述了普拉克索的合成、制劑和給藥，這些文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容在此引入作為參考。數(shù)個(gè)群組表明S(-)PPX在氧化應(yīng)激增強(qiáng)的細(xì)胞和動(dòng)物模型中是起神經(jīng)保護(hù)作用的，包括多巴胺神經(jīng)元的MPTP毒性(參見(jiàn)US560,420和6,156,777，這些文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容在此引入作為參考)。S(-)PPX減少由帕金森氏病的神經(jīng)毒素和ETC絡(luò)合物I抑制劑甲基吡啶鎓(MPP+)引起的氧化應(yīng)激，兩者在體外和在體內(nèi)都可以阻礙由MPP+和其它刺激誘發(fā)的線粒體過(guò)渡孔隙(MTP)的打開(kāi)(Cassarino等人，1998)。PPX的親脂性陽(yáng)離子結(jié)構(gòu)提示這樣的一種可能性，即PPX通過(guò)ΔΨM的富集于線粒體中，結(jié)合它的低還原電勢(shì)(320mV)，可以解釋這些理想的神經(jīng)保護(hù)性質(zhì)。
S(-)PPX是強(qiáng)效的多巴胺激動(dòng)劑，應(yīng)控制其對(duì)人的用藥量從而限制限制能達(dá)到大腦的藥物水平。由于PPX的R(+)對(duì)映體具有微乎其微的多巴胺激動(dòng)劑活性(Schneider and Mierau，J Med Chem30494-498，1987)，但是可以保持S(-)PPX的理想的分子/抗氧化劑性質(zhì)，因此該化合物在此被建議作為在神經(jīng)變性疾病中出現(xiàn)的細(xì)胞死亡串聯(lián)的激活和生活力損失的一種有效抑制劑。
發(fā)明概述本發(fā)明提供預(yù)防和/或延遲，或者緩和與各種神經(jīng)變性疾病有關(guān)的癥狀的方法。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及包含普拉克索的組合物和使用這種組合物治療肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)的方法。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1A表示的細(xì)胞色素C的MPP+-誘發(fā)釋放的時(shí)間過(guò)程，圖1B表示將MPP+-誘發(fā)激活天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3的時(shí)間過(guò)程。SH-SY5Y細(xì)胞在5mM的MPP+中培育不同時(shí)間，然后采集。在圖1A中，細(xì)胞在等滲蔗糖中均質(zhì)化，離心，將100ug上清液蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)入尼龍膜，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)對(duì)細(xì)胞色素C進(jìn)行免疫染色。最左邊的帶(在X軸上叫做″0hr″)與線粒體細(xì)胞色素C在時(shí)間″0″處對(duì)應(yīng)，其它的帶表示電泳過(guò)的細(xì)胞色素C免疫染色的胞漿蛋白。MW標(biāo)記的位置表示在y軸上。其它批次細(xì)胞的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3的試驗(yàn)使用一種商業(yè)體系，根據(jù)制造商的教導(dǎo)(Biomol)。在圖1B中所示的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶的試驗(yàn)是3-4個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。與在0.25小時(shí)的活性相比，*p＜0.05。
圖2表示通過(guò)PPX、米酵菌酸和馬兜鈴酸抑制MPP+-誘發(fā)的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3的激活的數(shù)據(jù)。在有或沒(méi)有1mM的S(-)PPX、1mM的R(+)PPX、250μM的米酵菌酸(BKA)或25μM的馬兜鈴酸(ARA)或它們的組合存在下，SH-SY5Y細(xì)胞和5mM MPP+一起培育24小時(shí)。然后，細(xì)胞進(jìn)行天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3活性的分析。表示在圖2中的是4-5個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均的+/-SEM。條帶A-F表示與下列化合物一起培育的細(xì)胞的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3活性A，對(duì)照組(沒(méi)有加入化合物)；B，MPP+；C，MPP+/BKA；D，MPP+/S(-)PPX；E，MPP+/R(+)PPX；F，MPP+/ARA。對(duì)于條帶B，與對(duì)照組相比，p＜0.05；對(duì)于條帶C-F，與MPP+處理的細(xì)胞(條帶B)相比，p＜0.05。
圖3表示通過(guò)PPX、米酵菌酸和馬兜鈴酸抑制MPP+-誘發(fā)的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶9的活性的數(shù)據(jù)。有或沒(méi)有1mM的S(-)PPX、1mM的R(+)PPX、250μM的米酵菌酸(BKA)或25μM的馬兜鈴酸(ARA)存在下，SH-SY5Y細(xì)胞與5mM MPP+一起培育4或8小時(shí)。然后，細(xì)胞進(jìn)行天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶9活性的分析。表示在圖3中的是3-4個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均的+/-SEM。條帶A-I表示與下列化合物一起培育的細(xì)胞的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶9活性A，對(duì)照組(沒(méi)有加入化合物)；B，15分鐘MPP+；C，4小時(shí)MPP+；D，4小時(shí)MPP+/PPX；E，8小時(shí)MPP+；F，8小時(shí)MPP+/BKA；G，8小時(shí)MPP+/S(-)PPX；H，8小時(shí)MPP+/R(+)PPX；I，8小時(shí)MPP+/ARA。對(duì)于條帶C和E，與對(duì)照組相比，p＜0.01；對(duì)于條帶F、G、H和I，對(duì)照組相比，p＜0.05。
圖4A與4B。通過(guò)PPX對(duì)映體，MPP+-誘發(fā)的細(xì)胞死亡的抑制。在有或沒(méi)有增加濃度的S(-)PPX(圖4A)或R(+)PPX(圖4B)存在下，SH-SY5Y細(xì)胞與5mM MPP+一起培育24小時(shí)。條帶A-F表示分別用0nM、3nM、30nM、300nM、3uM和30um的PPX處理的細(xì)胞。然后，細(xì)胞與鈣黃綠素-AM一起培育，洗滌，然后在熒光板讀數(shù)器上讀數(shù)。獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的數(shù)目標(biāo)在每根棒中，為了與沒(méi)有PPX(僅僅MPP+)的進(jìn)行比較，通過(guò)t檢驗(yàn)獲得的P值表示在每根棒上。在MPP+存在下，3nM的R(+)PPX比S(-)PPX(p＝0.035)造成更大的鈣黃綠素滯留，3uM的S(-)PPX比R(+)PPX(p＝0.027)造成更大的鈣黃綠素滯留。
圖5是患者給予1.3克阿斯匹林后，在ALS和對(duì)照組(CTL)中血漿中的2，3-DHBA水平隨時(shí)間改變的圖示。圖5A表示血漿中的2，3-DHBA濃度改變的平均+/-SEM；圖5B表示血漿中2，3-DHBA濃度與水楊酸鹽濃度的比值；圖5C表示整個(gè)時(shí)間過(guò)程的血漿水楊酸鹽濃度。
圖6是普拉克索對(duì)血漿2，3-DHBA濃度的作用的圖示。圖6A表示用普拉克索治療前后，單個(gè)患者中的DHBA濃度?；颊?，3，7和12是不走動(dòng)的?；颊?和7是上呼吸機(jī)的。圖6B提供在普拉克索治療前后，2，3-DHBA的平均+/-SEM血槳水平。圖6C提供在普拉克索治療前后，2，3-DHBA濃度/水楊酸鹽的平均+/-SEM血槳水平。
圖7.小鼠在它們的飲用水中給予R(+)PPX，然后用一種增加大腦中氧化應(yīng)激的神經(jīng)毒素(N-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶，MPTP)進(jìn)行處理，然后測(cè)定大腦和前腦中2，3-DHBA的含量。
發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明定義在本發(fā)明的說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中，將根據(jù)下面所述的定義，使用以下術(shù)語(yǔ)。
在此使用的術(shù)語(yǔ)″純凈″及類似術(shù)語(yǔ)是指與分子或化合物的分離其形式是基本上除去了在原始或自然環(huán)境中分子或化合物的通常的伴生雜質(zhì)。
在此使用的術(shù)語(yǔ)″治療″包括特定疾病或病癥的預(yù)防，或與特定疾病或病癥有關(guān)的癥狀的減輕和/或預(yù)防或消除所述的癥狀。
在此使用的″有效量″是指足以產(chǎn)生選定效果的數(shù)量。例如，普拉克索或其衍生物的有效量包括這樣的數(shù)量，其抑制存在于個(gè)體中的活性氧物種的生成或降低活性氧物種的含量。
在此使用的術(shù)語(yǔ)″鹵素″是指Cl、Br、F和I。尤其優(yōu)選的鹵素包括Cl、Br和F。在此使用的術(shù)語(yǔ)″鹵代烷基″是指帶有至少一個(gè)鹵素取代基的C1-C4烷基，例如氯甲基、氟代乙基或三氟甲基等等。
在此使用的術(shù)語(yǔ)″C1-Cn烷基″其中n是一個(gè)整數(shù)，表示具有一個(gè)至指定數(shù)目個(gè)碳原子的分枝的或線性的烷基。典型地C1-C6烷基包括，但是不局限于，甲基、乙基、正丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基等等。
在此使用的術(shù)語(yǔ)″C2-Cn鏈烯基″其中n是一個(gè)整數(shù)，表示具有2至指定數(shù)目個(gè)碳原子的和至少具有一個(gè)雙鍵的烯屬不飽和的分枝的或線性基團(tuán)。這樣的基團(tuán)的例子包括，但是不局限于，1-丙烯基、2-丙烯基、1，3-丁二烯基、1-丁烯基、己烯基、戊烯基等等。
在此使用的術(shù)語(yǔ)″C2-Cn炔基″其中n是一個(gè)整數(shù)，表示具有2至指定數(shù)目個(gè)碳原子的和至少具有一個(gè)三鍵的不飽和的分枝或線性的基團(tuán)。這樣的基團(tuán)的例子包括，但是不局限于，1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基等等。
術(shù)語(yǔ)″C3-Cn環(huán)烷基″其中n＝8，表示環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基和環(huán)辛基。
在此使用的術(shù)語(yǔ)″芳基″是指具有一個(gè)或兩個(gè)芳香環(huán)的單-或雙環(huán)的碳環(huán)體系，包括但不限于，苯基、芐基、萘基、四氫萘基、茚滿基、茚基等等。術(shù)語(yǔ)(C5-C8烷基)芳基是指通過(guò)烷基與母體部分相連的任何芳基。
術(shù)語(yǔ)″雜環(huán)基″是指含一個(gè)至三個(gè)選自氧、硫和氮的雜原子的單-或雙環(huán)的碳環(huán)體系。
在此使用的術(shù)語(yǔ)″雜芳基″是指具有一個(gè)或兩個(gè)含有一個(gè)至三個(gè)雜原子的芳香環(huán)的單-或雙環(huán)的碳環(huán)體系，包括但是不局限于，呋喃基、噻吩基、吡啶基等等。
術(shù)語(yǔ)″雙環(huán)的″表示不飽和的或飽和的穩(wěn)定的7-至12-元橋連的或稠合的雙環(huán)碳環(huán)。雙環(huán)可以在任何提供一種穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的碳原子處連接。術(shù)語(yǔ)包括，但是不局限于，萘基、雙環(huán)己基、雙環(huán)己烯基等等。
本發(fā)明的化合物包括在分子中含有一個(gè)或多個(gè)不對(duì)稱中心的那些化合物。根據(jù)本發(fā)明，沒(méi)有標(biāo)明立體化學(xué)的結(jié)構(gòu)將被理解為包括所有各種光學(xué)異構(gòu)體和其外消旋混合物。
在此使用的術(shù)語(yǔ)神經(jīng)保護(hù)劑是指一種藥劑，其預(yù)防或減緩神經(jīng)元退化的進(jìn)程和/或預(yù)防神經(jīng)元細(xì)胞死亡。
發(fā)明本發(fā)明涉及使用四氫苯并噻唑類化合物治療神經(jīng)變性疾病，包括ALS。更具體地說(shuō)，本發(fā)明的四氫苯并噻唑類化合物具有通式
其中R1、R2、R3和R4獨(dú)立地選自H、C1-C3烷基和C1-C3鏈烯烴。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，NR3R4基在6-位上。在另一種實(shí)施方案中，R1、R2和R4是H，R3是C1-C3烷基，NR3R4基在6-位上。在一種實(shí)施方案中，化合物具有式I的通式結(jié)構(gòu)，其中R1和R2每個(gè)是H，R3和R4是H或C1-C3烷基。
根據(jù)一種實(shí)施方案，本發(fā)明涉及一種治療ALS的方法。該方法包括給患者服用一種下面通式結(jié)構(gòu)的化合物 其中R1和R2是H，R3和R4是H或C1-C3烷基。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，R1、R2和R4是H，R3是丙基。在另一種實(shí)施方案中，組合物包括普拉克索，其中普拉克索組分基本上由普拉克索的兩種立體異構(gòu)體(R(+)-2-氨基-4，5，6，7-四氫-6-丙氨基苯并噻唑或S(-)-2-氨基-4，5，6，7-四氫-6-丙氨基苯并噻唑)之一組成。在一種實(shí)施方案中，組合物的活性劑由普拉克索立體異構(gòu)體R(+)-2-氨基-4，5，6，7-四氫-6-丙氨基苯并噻唑二鹽酸化物或其它藥理學(xué)上可接受的鹽組成，基本上不含它的S(-)對(duì)映體。在一種實(shí)施方案中，提供一種組合物，其中在組合物中存在的大于80％普拉克索化合物是R(+)構(gòu)型，更優(yōu)選大于90％或大于95％的以R(+)構(gòu)型的普拉克索化合物。在一種實(shí)施方案中，提供一種包括普拉克索的組合物，其中大于99％的普拉克索化合物以R(+)構(gòu)型存在。
在一種實(shí)施方案中，提供一種組合物，其包括一種基本上由R(+)-2-氨基-4，5，6，7-四氫-6-丙氨基苯并噻唑二鹽酸化物或它的其它藥理學(xué)上可接受的鹽組成的活性劑，以及一種藥學(xué)上可接受的載體。此組合物可以長(zhǎng)期口服給予，用于預(yù)防NDD中的神經(jīng)細(xì)胞損失(更特別地在ALS患者中減少氧化應(yīng)激)，或者它可以制劑后通過(guò)靜脈給藥用于預(yù)防急性腦損傷中的神經(jīng)細(xì)胞損傷。
本發(fā)明組合物的神經(jīng)保護(hù)作用通過(guò)至少三個(gè)機(jī)理中的一個(gè)，至少部分地從活性化合物的能力得到以預(yù)防神經(jīng)細(xì)胞死亡。第一，本發(fā)明的四氫苯并噻唑類化合物能夠減少由可以效仿PD的神經(jīng)毒素引起的ROS的生成(在小鼠大腦體內(nèi)和線粒體能量生成受損的體外細(xì)胞)。以這種方式，四氫苯并噻唑類化合物起″自由基清除劑″的作用。第二，四氫苯并噻唑類化合物可以部分恢復(fù)與AD和PD線粒體有關(guān)的減少了的ΔΨ。第三，四氫苯并噻唑類化合物可以阻礙細(xì)胞凋亡途徑，其通過(guò)AD和PD線粒體損傷的藥理學(xué)模型產(chǎn)生。
根據(jù)一種實(shí)施方案，提供一種在ALS患者中減少氧化應(yīng)激的方法。本發(fā)明的目的是減少氧化應(yīng)激，包括任何減少存在于患者體內(nèi)的活性氧物質(zhì)的含量，例如包括減少血漿中ROS的含量，其通過(guò)將水楊酸鹽轉(zhuǎn)化為2，3DHBA進(jìn)行測(cè)定。該方法包括給予有效量的具有下列通式的四氫苯并噻唑 其中R1、R2和R4是H，R3是C1-C3烷基。在一種實(shí)施方案中，四氫苯并噻唑類化合物是R(+)-2-氨基-4，5，6，7-四氫-6-丙氨基苯并噻唑或S(-)-2-氨基-4，5，6，7-四氫-6-丙氨基苯并噻唑或R(+)和S(-)立體異構(gòu)體的外消旋混合物。用于治療ALS的四氫苯并噻唑類化合物的給藥量將隨給藥途徑以及其它因素而變化，其它因素包括年齡、體重、健康的一般狀況、癥狀的嚴(yán)重程度、治療的頻率和在治療期間是否伴隨其它的藥物。通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的常規(guī)方法可以容易地確定活性化合物的給藥劑量。
或者，本發(fā)明提供一種增加了線粒體能量生成受損的細(xì)胞線粒體膜之間的生物電勢(shì)(Ψ)的方法。該方法包括損傷的線粒體能量生成的細(xì)胞與包含普拉克索活性劑和一種藥學(xué)上可接受的載體的組合物接觸的步驟。在一種實(shí)施方案中，普拉克索活性劑基本上由R(+)2-氨基-4，5，6，7-四氫-6-丙氨基苯并噻唑立體異構(gòu)體和其藥理學(xué)上可接受的鹽組成。
許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和病癥導(dǎo)致神經(jīng)元損傷，這些病癥中的每一個(gè)可以用本發(fā)明的四氫苯并噻唑類化合物的組合物進(jìn)行治療?？梢詫?dǎo)致神經(jīng)損傷的病癥包括原發(fā)性神經(jīng)變性疾??；亨廷頓氏舞蹈??；中風(fēng)和其它缺氧或局部缺血性疾?。簧窠?jīng)外傷；代謝引起的神經(jīng)性損傷；腦病發(fā)作引起的后遺癥；出血性中風(fēng)；繼發(fā)性神經(jīng)變性病(代謝性或毒性疾病)；帕金森氏癥；阿爾茨海默氏?。话柎暮Ｄ偷睦夏晷园V呆(SDAT)；與認(rèn)知功能障礙有關(guān)的老化；血管性癡呆，多梗塞性癡呆，雷維小體癡呆或神經(jīng)變性癡呆。
對(duì)人給藥本發(fā)明的藥物也是安全的。S(-)普拉克索，其是一種有效的批準(zhǔn)用于治療PD癥狀的多巴胺激動(dòng)劑，是R(+)普拉克索的對(duì)映體。但是，R(+)普拉克索缺乏藥理學(xué)多巴胺活性。因此，R(+)2-氨基-4，5，6，7-四氫-6-丙氨基苯并噻唑和其藥理學(xué)上可接受的鹽可以比S(-)普拉克索以更大劑量給予，并可以提供神經(jīng)保護(hù)的大腦水平。根據(jù)一種實(shí)施方案，通過(guò)ALS通過(guò)給予R(+)或R(-)普拉克索進(jìn)行治療，然而，給予R(+)2-氨基-4，5，6，7-四氫-6-丙氨基苯并噻唑是優(yōu)選的，因?yàn)榭梢越o予更高的劑量。如實(shí)施例1所示，S(-)和R(+)異構(gòu)體在減少氧化應(yīng)激方面大約是等效的。但是，R(+)異構(gòu)體允許使用更高的劑量，因此可以減少更多的毒性氧自由基。因此，在一種實(shí)施方案中，提供一種減少患有肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)的患者的神經(jīng)細(xì)胞死亡的方法，其中患者給予一種包含一種下面通式結(jié)構(gòu)的藥物組合物 在EP 186 087和它的同族專利US 4,886,812中描述了普拉克索的合成，這些文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容在此引入作為參考。
在一種實(shí)施方案中，普拉克索，更優(yōu)選R(+)-2-氨基-4，5，6，7-四氫-6-丙氨基苯并噻唑，與粘合劑混合，得到口服片劑，或與本領(lǐng)域已知的物質(zhì)混合，得到一種持續(xù)給藥的經(jīng)皮貼劑(″皮膚貼劑″)。或者，普拉克索可以與所需的穩(wěn)定劑一起配制成一種溶液，其可以胃腸外給藥(即靜脈內(nèi)、肌內(nèi)注射、皮下)。本發(fā)明的口服和/或經(jīng)皮制劑被用于減少患有NDD(即阿爾茨海默氏病、帕金森氏癥、亨廷頓氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化)的患者的神經(jīng)細(xì)胞死亡。本發(fā)明的腸胃外制劑被用來(lái)減少患有急性腦損傷(即中風(fēng)、蛛網(wǎng)膜下腔出血、缺氧-局部缺血性腦損傷、癲癇持續(xù)狀態(tài)、外傷性腦損傷、低血糖性腦損傷)的患者的神經(jīng)細(xì)胞死亡。
使用R(+)普拉克索治療NDD，由于它是多巴胺激動(dòng)劑S(-)普拉克索(Mirapex，Pharmacia and Upjohn)的一種相對(duì)不活潑的立體異構(gòu)體，解決了使用S(-)普拉克索作為多巴胺激動(dòng)劑的一個(gè)重要難題。由于對(duì)血壓和精神的多巴胺能副作用，Mirapex的劑量是受到限制的。R(+)-2-氨基-4，5，6，7-四氫-6-丙氨基苯并噻唑具有1％或更少的效力，以引起由使用S(-)普拉克索產(chǎn)生的副作用。因此，本發(fā)明可以更安全地給予AD患者，這些患者通常甚至不能容忍小劑量的多巴胺激動(dòng)劑藥物治療。本發(fā)明還可以以比S(-)普拉克索大的多的劑量靜脈內(nèi)給予。因此，它可以安全地用于降低血壓時(shí)可能產(chǎn)生危害的病癥例如中風(fēng)。
在一種實(shí)施方案中，提供一種治療患有神經(jīng)變性疾病的患者的方法，同時(shí)減少多巴胺能副作用的風(fēng)險(xiǎn)。該方法包括步驟給藥一種包含一種普拉克索活性劑和一種藥學(xué)上可接受的載體的組合物，其中普拉克索活性劑基本上由R(+)2-氨基-4，5，6，7-四氫-6-丙氨基苯并噻唑立體異構(gòu)體和其藥理學(xué)上可接受的鹽組成。在一種實(shí)施方案中，被治療的神經(jīng)變性疾病選自ALS、阿爾茨海默氏病和帕金森氏癥，所給予的組合物的劑量為每天約10mg-約500mg的R(+)2-氨基-4，5，6，7-四氫-6-丙氨基苯并噻唑或其藥理學(xué)上可接受的鹽。
所使用的劑量當(dāng)然隨被治療的具體疾病以及其它因素而定，其它因素包括年齡、體重、健康的一般狀況、癥狀的嚴(yán)重程度、治療的頻率和在治療期間是否伴隨其它的藥物。通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的常規(guī)方法可以容易地確定每個(gè)活性化合物的使用劑量。例如，可以口服給予患有NDD的人日總劑量為10mg至500mg之間的本發(fā)明的四氫苯并噻唑類化合物。或者，可以胃腸外給予患有急性腦損傷的人單個(gè)劑量在10mg至100mg之間的四氫苯并噻唑類化合物，和/或通過(guò)持續(xù)靜脈內(nèi)輸液給予日劑量在10mg至500mg之間的四氫苯并噻唑類化合物。
在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，R(+)2-氨基-4，5，6，7-四氫-6-丙氨基苯并噻唑(或其藥理學(xué)上可接受的鹽)給予患有神經(jīng)變性疾病例如ALS的患者以治療該疾病。在此使用的術(shù)語(yǔ)″治療″包括特定疾病或病癥的癥狀的減輕，和/或預(yù)防或消除所述的癥狀。更具體地說(shuō)，給予患者一種組合物，其包括一種普拉克索活性劑和一種藥學(xué)上可接受的載體，以預(yù)防或顯著減少神經(jīng)細(xì)胞死亡，其中普拉克索活性劑基本上由普拉克索的R(+)2-氨基-4，5，6，7-四氫-6-丙氨基苯并噻唑(和其藥理學(xué)上可接受的鹽)立體異構(gòu)體組成。在US 4,843,086、4,886,812和5,112,842中描述了普拉克索的合成、制劑和給藥，這些文獻(xiàn)在此引入作為參考。
在個(gè)體組織中產(chǎn)生的羥基自由基引起水楊酸鹽轉(zhuǎn)化為2，3二羥基苯甲酸(DHBA)的增加(Floyd et al.(1984)J.Biochem.Biophys.Methods 10221-235；Hall et al.(1993)J.Neurochem.60588-594)。因此，在人體血漿中累積的2，3DHBA可以作為個(gè)體所遭受的氧化應(yīng)激水平的指示物。研究了R(+)2-氨基-4，5，6，7-四氫-6-丙氨基苯并噻唑或S(-)2-氨基-4，5，6，7-四氫-6-丙氨基苯并噻唑?qū)?，3二羥基苯甲酸(DHBA)血清濃度水平的影響。如圖5和6所示，ALS患者用S(-)2-氨基-4，5，6，7-四氫-6-丙氨基苯并噻唑治療后，人體2，3DHBA的血清濃度水平減少了。這些數(shù)據(jù)表明用普拉克索治療減少了ALS患者體內(nèi)的氧化應(yīng)激。
此外，如圖7所示，在小鼠身上進(jìn)行了其它的研究，表明普拉克索在減少體內(nèi)氧化應(yīng)激方面的效力。在此研究中，以3個(gè)不同的日劑量，在小鼠的飲用水中給予R(+)PPX 8周，然后給予一種神經(jīng)毒素(N-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶，MPTP)其增加了大腦中的氧化應(yīng)激。然后分析腦組織氧自由基的產(chǎn)生。數(shù)據(jù)表明30mg/kg/day和100mg/kg/day的劑量顯著地減少大腦中的自由基水平。
還進(jìn)行了毒理學(xué)研究，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)副作用的證據(jù)。具體地，在小鼠的飲用水中加入R(+)PPX，進(jìn)行8周的毒理學(xué)研究。對(duì)它們所有的主要器官進(jìn)行病理檢查，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)損害。雖然這并不能表明R(+)PPX作為神經(jīng)保護(hù)劑有效性的問(wèn)題，但是它表明人類長(zhǎng)期給予非常高劑量的藥物的潛在的安全性(和由此的可行性)。
本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的四氫苯并噻唑類化合物的藥物組合物。更具體地說(shuō)，可以使用標(biāo)準(zhǔn)的本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所熟知的藥學(xué)上可接受的載體、填料、增溶劑和穩(wěn)定劑將四氫苯并噻唑類化合物配制成藥物組合物。
包含四氫苯并噻唑類化合物的藥物組合物通過(guò)許多途徑中的任一種給予需要這種藥物的個(gè)體，包括但不限于，局部、口服、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、髓內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、經(jīng)皮、皮下、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、腸、局部、舌下或直腸方式。
本發(fā)明還提供一種包含一個(gè)或多個(gè)容器的藥包或試劑盒，其中容器中充滿一種或多種本發(fā)明藥物組合物的成分。根據(jù)一種實(shí)施方案，本發(fā)明提供一種用于治療ALS患者的試劑盒。在該實(shí)施方案中，試劑盒包含一種或多種本發(fā)明的四氫苯并噻唑類化合物，更具體地說(shuō)，四氫苯并噻唑類化合物是R(+)2-氨基-4，5，6，7-四氫-6-丙氨基苯并噻唑立體異構(gòu)體。這些藥物可以包裝在各種各樣的容器中，例如藥水瓶、試管、微量孔板、瓶子等等。優(yōu)選地，試劑盒還包括使用說(shuō)明書(shū)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1R(+)和S(-)PPX是細(xì)胞死亡串聯(lián)激活的有效抑制劑。
材料和方法。
細(xì)胞培養(yǎng)從American Tissue Culture Collection(www.atcc.org)處獲得SH-SY5Y人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，并將其以一種復(fù)制狀況供養(yǎng)在培養(yǎng)物中。為了分析天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶試驗(yàn)和研究細(xì)胞色素C釋放，在5％的CO2氣氛中，在37℃，將它們置于含10％胎牛血清的DMEM/高糖、抗生素/antimicotic(100IU/ml的青霉素，100μg/ml的硫酸鏈霉素，0.25μg/ml的兩性霉素B)和50μg/ml的尿苷和100μg ml的丙酮酸鹽在T75培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，以進(jìn)行近乎完全的融合(2×107細(xì)胞/培養(yǎng)瓶)。然后，它們用5mM甲基吡啶鎓碘化物(MPP+；Sigma；www.sigma-aldrich.com)或100μM25-35或35-25βamyioid肽(Bachem；www.bachem.com)培養(yǎng)不同的時(shí)間，然后采集。為了進(jìn)行細(xì)胞死亡研究，將細(xì)胞放入96孔黑底平板中，接觸毒素之前，將細(xì)胞在DMEM介質(zhì)中生長(zhǎng)24小時(shí)。
天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶試驗(yàn)。
暴露于MPP+或β淀粉狀肽后，在PBS中收集細(xì)胞，在4℃下在450xg中離心6分鐘。將細(xì)胞小球以2×107細(xì)胞/100μl lysis緩沖液的濃度再懸浮在低張細(xì)胞lysis緩沖液中[25mM HEPES，5mM MgCl2，5mM EDTA，1M DTT和蛋白酶抑制劑雞尾酒(Sigma Chemical)]。溶解產(chǎn)物進(jìn)行四個(gè)循環(huán)的凍融。然后，細(xì)胞溶解產(chǎn)物在4℃下以16,000xg離心30分鐘。收集上層清液部分，通過(guò)Lowry試驗(yàn)(BioRad)測(cè)定蛋白質(zhì)含量。在96孔平板中，100μg蛋白質(zhì)用來(lái)測(cè)定天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶活性，試驗(yàn)一式四份。使用試驗(yàn)緩沖液測(cè)定活性，原始記錄由廠家提供。(Biomol，caspase 3；Promega，caspases 3and 9)。天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶活性基于合成肽底物的裂解，引起有顏色的(對(duì)硝基苯胺(p-NA)，Biomol)或有熒光性的(aminomethylcoumarin(AMC)，Promega)生色團(tuán)的釋放。只有激活的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶能夠裂解這些底物，當(dāng)每個(gè)試驗(yàn)試劑盒配備的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶抑制劑用于試驗(yàn)中時(shí)，生色團(tuán)的產(chǎn)生被完全禁止。在所示的試驗(yàn)條件下，在2小時(shí)內(nèi)觀察到生色團(tuán)以線性速度產(chǎn)生。生色團(tuán)吸收度(p-NA)在OptiMax平皿讀數(shù)器上測(cè)定或生色團(tuán)熒光(AMC)在SpectraMax Gemini平皿讀數(shù)器37℃下培育0時(shí)間和30分鐘后，估算相對(duì)的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶活性。在30分鐘時(shí)的讀數(shù)減去在零時(shí)間時(shí)的色原信號(hào)。
細(xì)胞死亡細(xì)胞死亡通過(guò)測(cè)定鈣黃綠素保留的損失進(jìn)行評(píng)價(jià)，在細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中用″Live-Dead″分析(Molecular Probes；www.molecularprobes.com)，按照制造商的教導(dǎo)在96孔板中與鈣黃綠素-AM一起培養(yǎng)。鈣黃綠素信號(hào)在SpectraMax Gemini可調(diào)節(jié)熒光板讀數(shù)器(分子裝置)中進(jìn)行分析。所有讀數(shù)都減去作為背景值的與甲醇一起預(yù)培養(yǎng)的細(xì)胞的鈣黃綠素?zé)晒?。每個(gè)分析用8孔/例進(jìn)行，取平均值。為了在本范例中評(píng)價(jià)S(-)和R(+)PPX的寬范圍的濃度，進(jìn)行3-8個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。
細(xì)胞色素C Western印跡細(xì)胞色素C由Western印跡測(cè)定，100μg細(xì)胞上清液蛋白經(jīng)聚丙烯酰胺電泳后轉(zhuǎn)入尼龍膜。初生抗體是一種老鼠單克隆抗細(xì)胞色素C，自Pharmingen中獲得并且以1∶10,000稀釋度使用。用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(Pierce)進(jìn)行檢測(cè)，并且在BioRad FluorS圖像位置成像。
藥物R(+)和S(-)PPX(Pharmacia Corporation贈(zèng)送)以其二鹽酸鹽的方式獲得并將其直接溶解到培養(yǎng)基中。米酵霉酸、腺苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體上的ATP結(jié)合位點(diǎn)拮抗劑以溶液形式配制到1M的NH4OH中。馬兜鈴酸(鈉鹽)，一種磷酸脂酶A2抑制劑，從Sigma Chemical Co獲得。在天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶實(shí)驗(yàn)中，在MPP+或β淀粉狀肽前1小時(shí)加入藥物。在鈣黃綠素/細(xì)胞死亡實(shí)驗(yàn)中，在MPP+前4小時(shí)加入藥物。
結(jié)果天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(caspases)由MPP+和BA 25-35激活。
圖1B表示用5mM的MPP+培養(yǎng)SH SY5Y細(xì)胞期間，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3活性的時(shí)間過(guò)程。在4小時(shí)的時(shí)候可檢測(cè)到活性增加，在24小時(shí)的時(shí)候活性增加約2倍。圖1A表示細(xì)胞色素C蛋白釋放到細(xì)胞質(zhì)中的Western印跡結(jié)果。與生化活性曲線相似，在4小時(shí)時(shí)可檢測(cè)到少量的細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞色素C，在12小時(shí)時(shí)細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞色素C有明顯增加。
圖2表示在MPP+暴露期間R(+)和S(-)PPX對(duì)映體兩者都抑制天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3的激活。由MPP+誘導(dǎo)的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3活性的增加還被米酵菌酸阻礙，米酵菌酸腺苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的內(nèi)膜位置上的ATP結(jié)合位點(diǎn)的一種特殊拮抗劑。馬兜鈴酸、一種磷酸脂酶A2抑制劑，以前顯示其阻礙MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡(Fall and Bennett，1998)，同樣阻止天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3活性的增加。由MPP+和BA 25-35肽誘發(fā)的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶的活性被PPX對(duì)映體和在線粒體過(guò)渡孔處活潑的試劑阻礙。S(-)PPX使得用BA 25-35肽培養(yǎng)后天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3活性的增加減少約70％，其本身沒(méi)有抑制作用。與MPP+接觸還增加了天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶9的活性，其時(shí)間過(guò)程與天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3的活性相似(參見(jiàn)圖3)。天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶9活性的增加也被S(-)和R(+)PPX、米酵菌酸和馬兜鈴酸阻礙。
圖4表示不同濃度的R(+)或S(-)PPX，在接觸5mM的MPP+之前24小時(shí)，對(duì)所培養(yǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞的細(xì)胞鈣黃綠素滯留的作用。鈣黃綠素是一種熒光染料，其保留在細(xì)胞內(nèi)，具有維持質(zhì)膜電勢(shì)的能力。MPP+僅僅降低約60％的鈣黃綠素吸收。在30nM水平時(shí)，兩個(gè)PPX對(duì)映體都顯著地恢復(fù)鈣黃綠素吸收，這種保護(hù)作用通過(guò)30μM的PPX被保持。
討論本研究為使用神經(jīng)毒素MPP+和25-35β淀粉狀肽加入到作為細(xì)胞培養(yǎng)模型的復(fù)制SH-SY5Y成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞中，用于研究潛在的可分別用于帕金森氏病和阿爾茨海默氏病的神經(jīng)保護(hù)化合物。SH-SY5Y細(xì)胞是神經(jīng)外胚層起源的贅生性、分裂細(xì)胞，沒(méi)有初生神經(jīng)元。由于Ras突變，引起MAPK/ERK信號(hào)的慢性激活，它們進(jìn)行有絲分裂。在短期MPP+培養(yǎng)中，與初生神經(jīng)元相比，SH-SY5Y細(xì)胞是相對(duì)遲鈍的。申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)2.5和5mM、但不是1mM的MPP+在18-24小時(shí)內(nèi)生產(chǎn)細(xì)胞凋亡的形態(tài)和DNA固縮片段。然而，用較低濃度的MPP+培養(yǎng)更長(zhǎng)的時(shí)間可以更接近動(dòng)物中PD的體內(nèi)MPTP模型，已經(jīng)報(bào)道，更長(zhǎng)時(shí)間接觸較低MPP+水平仍可活化線粒體細(xì)胞死亡串聯(lián)。
SH-SY5Y細(xì)胞還對(duì)β淀粉狀肽敏感。Li等人(1996)發(fā)現(xiàn)，接觸100μM的β淀粉狀2S-3S 3天后，缺少血清的SH-SY5Y顯示出廣泛的DNA微缺末尾標(biāo)記以及表現(xiàn)出一種濃度依賴的DNA梯的增加。β淀粉狀肽誘導(dǎo)的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶的激活在SH-SY5Y中沒(méi)有清楚地描述，但是若干報(bào)道表明，在各種初生神經(jīng)元系中，因接觸β淀粉狀肽天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶激活。這些包括由25-35類似物激活的小腦粒細(xì)胞中的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-2、-3和-6，以及大鼠初生皮層神經(jīng)元中的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3的激活。因此，一點(diǎn)也不驚訝，SH(-)SY5Y接觸100μM的β淀粉狀25-35后觀察到天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3活性(DEVDase)，接觸反轉(zhuǎn)35-25序列后，沒(méi)有觀察到天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶的激活。
本實(shí)驗(yàn)的焦點(diǎn)是確定是否PPX對(duì)映體可以阻止天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶的激活以及在接觸急性毒素、AD和PD的細(xì)胞培養(yǎng)模型中是否可以促進(jìn)作為細(xì)胞存活率標(biāo)記的鈣黃綠素滯留。在PD的MPP+模型中，″引發(fā)子″天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶9和″執(zhí)行子″天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3的激活都被兩個(gè)PPX對(duì)映體阻滯，以及在AD的BA 25-3S模型中，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3的活性被S(-)PPX阻滯。在PD的MPP+模型中，納摩爾級(jí)的兩個(gè)PPX對(duì)映體都可以促進(jìn)細(xì)胞存活。因此，本發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步增加了對(duì)PPX的神經(jīng)保護(hù)作用的研究的增長(zhǎng)體，并且暗示這一類化合物在神經(jīng)變性疾病中潛在的臨床應(yīng)用。
雖然本研究沒(méi)有確定PPX作用的最接近位點(diǎn)，但是在這些細(xì)胞模型中的若干發(fā)現(xiàn)暗示了線粒體過(guò)渡孔復(fù)合物(MTPC)。首先，米酵菌酸，一種MTP開(kāi)放的選擇性腺苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體拮抗劑和抑制劑，阻滯MPP+誘導(dǎo)的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶9和3的激活。這與MPP+或直接或通過(guò)包括氧化應(yīng)激的機(jī)理引起MTP開(kāi)放相一致，。在離體肝臟線粒體中，MPP+可以引起標(biāo)準(zhǔn)的MTP開(kāi)放，其被自由基捕獲酶不完全阻滯以及被S(-)PPX徹底阻滯。在離體線粒體中，毒害神經(jīng)的25-35BA肽還可以刺激MTP開(kāi)放。在體內(nèi)的大腦微量滲析研究中和在體外的神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)物中，MPP+和2S-35BA肽增加氧化應(yīng)激，S(-)PPX已經(jīng)表明可以減少體外和體內(nèi)的MPP+誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。
實(shí)施例2使用普拉克索治療ALS在家族性肌萎縮性側(cè)索硬化(FALS)和常見(jiàn)的偶發(fā)性ALS(SALS)中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)氧化性異常。2，3-DHBA是一種羥基化的水楊酸鹽副產(chǎn)物，其被證明是一種可靠的自由基活性增加的體內(nèi)標(biāo)記物并且由HPLC可靠地進(jìn)行測(cè)定。口服給予水楊酸鹽后，在SALS患者中觀察到2，3-二羥基苯甲酸(2，3-DHBA)和DHBA/水楊酸鹽的血清水平增加了。在此使用12個(gè)SALS患者研究確定使用普拉克索治療前后的2，3-DHBA水平。
方法參與的制劑本研究分兩個(gè)階段進(jìn)行。在第一階段，十一個(gè)確定的SALS患者，其符合Airlie House標(biāo)準(zhǔn)，并研究了7個(gè)對(duì)照組。這些參與者服用阿斯匹林后進(jìn)行2，3-DHBA分析。口服1.3克阿司匹林后，2、3和4小時(shí)后抽取血液。分離血清，冷凍并儲(chǔ)存在-80度。隨后對(duì)等分試樣的血清進(jìn)行編號(hào)和混盲，用于2，3-DHBA和水楊酸鹽測(cè)定。
在第二階段，隨機(jī)地選擇17個(gè)患有確定SALS的患者?；颊呖诜?.3克阿司匹林后，3小時(shí)后抽取血液。獲得這些基線樣品后，SALS參與者開(kāi)始用普拉克索進(jìn)行治療。與PD病人相似，逐漸增大劑量使其最終劑量達(dá)到1.5mg一天三次-一天四次，接著進(jìn)行7周滴定法。每個(gè)參與者達(dá)到他的/她的最高普拉克索劑量三星期后，再次進(jìn)行服用阿斯匹林研究。最初十七個(gè)SALS患者中的十二個(gè)可以完成普拉克索逐漸增大階段。在這些當(dāng)中，只有兩個(gè)不能達(dá)到6mg每天的普拉克索劑量，所有的患者都可以獲得至少3mg每天的劑量。然后，每個(gè)參與者提供繼續(xù)進(jìn)行普拉克索治療的機(jī)會(huì)。
試樣制備血清的制備在4℃下0.9ml血清與0.2ml 1M的高氯酸混合，在冷凍微量離心機(jī)中以15,000rpm離心10分鐘。
2，3-DHBA測(cè)定將20μL上清液分兩份注射到C18″兒茶酚胺″Adsorbosphere柱(Alltech)上，以0.6ml/min的速度用緩沖劑灌注，該緩沖劑由125ml/L的乙腈、1.5gm/L的庚烷磺酸鈉、3ml/L的三乙胺、100mg/L的Na2EDTA組成并且最后用磷酸將pH值調(diào)節(jié)到2.8。使用CouloChem II flow-through電化學(xué)檢測(cè)器(ESA，具有下列設(shè)定保衛(wèi)細(xì)胞＝+600mV；E1＝-100mV；E2＝+400mV)進(jìn)行檢測(cè)。在這些條件下2，3-DHBA在10-10.5分鐘被洗脫出。
水楊酸鹽測(cè)定50μL上清液分兩次注射到C8 Kromosil HPLC柱(Alltech)上，以0.8-1.0ml/min的速度用70％甲醇/30％水/0.5％三氟乙酸進(jìn)行洗脫。在這些條件下水楊酸鹽在6-7分鐘的時(shí)候被洗脫出來(lái)，并且通過(guò)315nM出的紫外吸收測(cè)定。
結(jié)果圖5A表示在第一階段研究中的11個(gè)SALS患者(59.2±12.3歲)和7個(gè)年齡相當(dāng)?shù)膶?duì)照患者(56.7±10.7歲)的2，3-DHBA血清水平增加的時(shí)間過(guò)程。SALS患者表現(xiàn)出10-156個(gè)月的的病史，代表這種疾病的急性和慢性階段。SALS患者服用阿斯匹林3小時(shí)后，檢測(cè)到最大的2，3DHBA水平，這個(gè)時(shí)間點(diǎn)在第二階段階段被選用。此外，當(dāng)SALS組和對(duì)照組隨時(shí)間推移進(jìn)行對(duì)比時(shí)，二因素方差分析顯示在2，3-DHBA的產(chǎn)生中存在差別。兩組受試者在p＝0.033水平有顯著差異；post-hoc檢驗(yàn)(圖基檢驗(yàn))在各時(shí)間點(diǎn)之間沒(méi)有顯示任何顯著差異。
作為另一個(gè)比較，隨時(shí)間推移比較兩組受試者之間的2，3-DHBA/水楊酸鹽的比值。給予阿斯匹林3小時(shí)后，ALS組顯示常規(guī)標(biāo)記物2，3-DHBA產(chǎn)生的正?；瘶?biāo)記增加約1.5倍。二因素方差分析顯示在p＝0.06水平時(shí)(圖5B)有顯著差別。在ALS和CTL受試組(圖5C)之間，隨著時(shí)間的推移，血清中水楊酸鹽含量沒(méi)有顯著的區(qū)別。在進(jìn)入第二階段研究的最初的17個(gè)患者當(dāng)中，5個(gè)患者由于疾病的并發(fā)癥或不能忍受藥物治療而中途退出。其余的參加者為8男和4女。平均年齡是63.2歲。這些ALS患者很好地忍受了普拉克索治療。這些參加者沒(méi)有表現(xiàn)出任何臨床癡呆證據(jù)，它們也沒(méi)有顯著的心血管不穩(wěn)定性。
參加該研究的患者代表疾病進(jìn)展的各個(gè)臨床階段。四個(gè)參加者是是不能走動(dòng)的，其中兩個(gè)是依賴于呼吸機(jī)的。其它八個(gè)在開(kāi)始研究的時(shí)候是能走動(dòng)的。從進(jìn)入研究到最后抽取血液的平均時(shí)間為76.6天，時(shí)間的范圍是49-105天。
在用普拉克索治療前后，比較2，3-DHBA的血清濃度水平。毫無(wú)例外，個(gè)體2，3-DHBA的血清濃度水平降低了(圖6A)。圖6B表示獲得穩(wěn)定的普拉克索劑量前后，ALS患者的血漿中的2，3-DHBA濃度的均值+/-SEM。平均降低約45％，在p＝0.015水平時(shí)是顯著的。在使用普拉克索治療之前(18.8+/-7.2，S.D.)和期間(20.2+/-5.5，S.D.)，血清水楊酸鹽含量(μM)沒(méi)有變化。圖6C表示對(duì)于每個(gè)患者，通過(guò)普拉克索治療，以水楊酸鹽水平為基準(zhǔn)的2，3-DHBA的血清濃度水平平均降低了59％；t檢驗(yàn)顯示在p＝0.010水平時(shí)存在顯著差異。
討論本研究顯示ALS患者口服阿斯匹林后，基于增加產(chǎn)生的2，3-DHBA，觀察到體內(nèi)氧化應(yīng)激增加了約兩倍。臨床疾病進(jìn)展的各個(gè)階段觀察到2，3-DHBA的增加，表明這種代謝物在整個(gè)疾病過(guò)程中可以作為增加的氧化應(yīng)激的可靠指標(biāo)，尤其可用于通常難以確診的疾病早期階段。因?yàn)槭茉囌呷藬?shù)較少，沒(méi)有研究2，3-DHBA產(chǎn)生的水平與疾病階段的相關(guān)性。
本研究還顯示普拉克索治療，以帕金森氏癥通?？梢阅褪艿膭┝拷o予，可以降低ALS患者體內(nèi)氧化應(yīng)激。12個(gè)患者的血清在達(dá)到普拉克索的最大忍受劑量之前和幾個(gè)星期后顯示降低約45％的基線2，3-DHBA，以水楊酸鹽水平為基準(zhǔn)的基線2，3-DHBA降低約59％?？赡苁怯捎谒淖杂苫东@/抗氧化劑性質(zhì)，普拉克索導(dǎo)致這種在ROS產(chǎn)生方面的降低。在體外的SY5Y成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞和大鼠體內(nèi)受到被甲基吡啶抑制的絡(luò)合物I急劇影響的紋狀體中，普拉克索已經(jīng)顯示能夠降低ROS產(chǎn)生的能力(Cassarino et al.，J.Neurochem 1998；71295-301)。體內(nèi)試驗(yàn)中，普拉克索還降低注入神經(jīng)毒素6-羥基多巴胺后大腦內(nèi)的ROS產(chǎn)生，(Ferger et al.Brain Res 2000；883216-23)，抑制用前神經(jīng)毒素MPTP[16]處理后導(dǎo)致的細(xì)胞色素C的釋放和降低體內(nèi)大腦脂質(zhì)氧化。
由于在R(+)和S(-)對(duì)映體中觀察到約等當(dāng)量的普拉克索的神經(jīng)保護(hù)作用，以及由于多巴胺激動(dòng)劑作用主要存在于S(-)對(duì)映體，ROS捕獲作用可能與多巴胺激動(dòng)劑性質(zhì)沒(méi)有關(guān)系。如果這是真的話，那么普拉克索的R(+)對(duì)映體應(yīng)具有比在本研究中使用的S(-)對(duì)映體高很多的耐受劑量，在體內(nèi)具有增加的抗氧化作用的潛力。
在偶發(fā)性ALS中很好地建立了氧化應(yīng)激物，但是氧化應(yīng)激增加的病因?qū)W仍是不清楚的。在ALS中，CNS氧化應(yīng)激損傷的標(biāo)記物包括腰椎脊髓中的增加的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的免疫組化染色、脊髓液中水平增加的硝基酪氨酸和亞硝基化的二氧化錳歧化酶。這些結(jié)果與由包括氧化氮衍生物的ROS造成的ALS組織增加的損傷一致。
ALS的動(dòng)物模型和細(xì)胞模型還提供對(duì)氧化應(yīng)激和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元易獲病性的了解。ALS脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元降低了細(xì)胞色素C氧化酶的活性(研究的組織化學(xué))，這種降低的電子傳輸鏈作用可以用于增加氧自由基產(chǎn)生。攜帶突變體人類SOD1 FALS基因的小鼠的脊髓微量透析表明ROS產(chǎn)生和丙二醛含量的增加，與那個(gè)概念一致。另外，還報(bào)道CuZn-SOD FALS突變?cè)黾恿艘蚺d奮性中毒導(dǎo)致脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死亡的脆弱性，其機(jī)理包括氧化應(yīng)激增加。最后，ALS患者氧化應(yīng)激增加使得在ALS患者脊髓中可以觀察到細(xì)胞凋亡過(guò)程標(biāo)記物的增加，使得在FALS老鼠模型中在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死亡中包含天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶。
線粒體病狀發(fā)生在實(shí)驗(yàn)性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病的早期。這些結(jié)構(gòu)不僅僅對(duì)氧化性損傷敏感，而且它們的功能障礙加速自由基的產(chǎn)生并且可能對(duì)線粒體DNA產(chǎn)生損傷。觀察ALS肌肉活組織切片檢查中線粒體功能顯示了絡(luò)合物I的活性降低，以及對(duì)ALS前角細(xì)胞樹(shù)突的超微結(jié)構(gòu)分析顯示了聚集的、黑暗的線粒體。在ALS中，變性前角細(xì)胞周圍的神經(jīng)膠質(zhì)興奮性氨基酸載體-2(EAAT2)的選擇性損失可能反映出其他的蛋白質(zhì)損傷，這些蛋白質(zhì)損傷可以促進(jìn)興奮性中毒增加。
因此，ALS中的氧化性損傷可以代表一種初生神經(jīng)變性過(guò)程，一種運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元線粒體病理學(xué)的繼發(fā)性偶發(fā)癥狀，或者兩者的結(jié)合。用SALS線粒體基因擴(kuò)增進(jìn)行研究的胞質(zhì)雜交表明SALS的氧化應(yīng)激增加可以用初生線粒體遺傳病因?qū)W來(lái)理解。在SALS中，目前還不知道線粒體DNA如何變?yōu)橛腥毕莸模荒赶颠z傳和偶發(fā)性獲得機(jī)理都是可能的。
服用水楊酸鹽和2，3-DHBA測(cè)定法作為評(píng)價(jià)體內(nèi)相對(duì)氧化應(yīng)激水平的尺度已經(jīng)應(yīng)用到成年人初始的糖尿病、酒精方面的肝臟功能障礙和關(guān)節(jié)炎上。許多氧化性物質(zhì)可以促進(jìn)2，3-DHBA產(chǎn)生，包括羥基自由基和過(guò)亞硝酸陰離子。因此，無(wú)法指定所觀測(cè)到的2，3-DHBA的特定ROS源，也不能確定水楊酸鹽羥基化作用增加的組織來(lái)源。
總之，在一群SALS患者中發(fā)現(xiàn)2，3-DHBA(一種氧化應(yīng)激標(biāo)記物)的基礎(chǔ)血清濃度水平增加了，這些水平用普拉克索治療后降低了。如圖6所示，ALS患者用S(-)2-氨基-4，5，6，7-四氫-6-丙氨基苯并噻唑治療后，個(gè)體2，3DHBA的血清濃度水平降低了。特別地，患者口服給予日劑量為3-6mg的S(-)2-氨基-4，5，6，7-四氫-6-丙氨基苯并噻唑七周。七周后，采集血清樣品，測(cè)定2，3DHBA的濃度，與在治療前采集的血清樣品中的2，3DHBA水平相比。這些數(shù)據(jù)表明用普拉克索治療減少了ALS患者體內(nèi)的氧化應(yīng)激。
實(shí)施例3普拉克索在降低體內(nèi)Mptp誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激中的有效性方法雄性C57BL/6小鼠每天在飲用水中接受R(+)普拉克索二鹽酸化物8周，劑量分別為0、10、30或100mg/kg/天。在進(jìn)行研究的當(dāng)天，給小鼠皮下注射30 mg/kg的神經(jīng)毒素N-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)以增加大腦中的氧化應(yīng)激。1小時(shí)后，給小鼠腹膜內(nèi)注射100mg/kg的水楊酸鈉。水楊酸鹽注射1小時(shí)后，處死小鼠，分析前腦中2，3-二羥基苯甲酸(2，3-DHBA)含量。
如圖7所示，結(jié)果表明用劑量分別為30和100mg/kg/天的R(+)普拉克索進(jìn)行治療，可以顯著地降低由MPTP產(chǎn)生的前腦氧化應(yīng)激。還進(jìn)行了毒理學(xué)研究，沒(méi)有檢測(cè)到副作用的證據(jù)。特別地，在小鼠的飲用水中加入R(+)PPX，進(jìn)行8周的毒理學(xué)研究。對(duì)它們所有的主要器官進(jìn)行病理檢查，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)損害。
權(quán)利要求
1.一種治療ALS患者的方法，所述方法包括給予所述患者一種包含下面通式結(jié)構(gòu)的四氫苯并噻唑的組合物的步驟 其中R1、R2、R3和R4獨(dú)立地選自H和C1-C3烷基。
2.權(quán)利要求1的方法，其中R1、R2和R4是H，R3是C1-C3烷基。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述的四氫苯并噻唑是普拉克索。
4.權(quán)利要求3的方法，在所述的組合物中，大于90％的普拉克索是R(+)2-氨基-4，5，6，7-四氫-6-丙氨基苯并噻唑。
5.一種增加線粒體能量產(chǎn)生受損細(xì)胞的線粒體膜之間的生物電勢(shì)(ΔΨ)的方法，所述的方法包括步驟將所述的細(xì)胞與包含具有下面通式結(jié)構(gòu)的四氫苯并噻唑的組合物接觸， 其中R1、R2、R3和R4獨(dú)立地選自H和C1-C3烷基。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述的四氫苯并噻唑是普拉克索。
7.權(quán)利要求6的方法，其中大于90％的普拉克索化合物是R(+)2-氨基-4，5，6，7-四氫-6-丙氨基苯并噻唑。
8.一種降低ALS患者氧化應(yīng)激的方法，所述的方法包括給予所述患者一種包含下面通式結(jié)構(gòu)的四氫苯并噻唑的組合物的步驟 其中R1、R2和R3是H，R4是C1-C3烷基。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述的四氫苯并噻唑是普拉克索。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述的普拉克索是R(+)2-氨基-4，5，6，7-四氫-6-丙氨基苯并噻唑。
全文摘要
本發(fā)明涉及包括普拉克索的組合物和使用這種組合物治療神經(jīng)變性疾病例如肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)的用途。如圖6B所示，普拉克索治療后，1 2個(gè)ALS參考與者的平均+1－SEM血清2，3－DHBA含量顯著地降低。
文檔編號(hào)C07D277/82GK1617720SQ02827825
公開(kāi)日2005年5月18日 申請(qǐng)日期2002年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月11日
發(fā)明者J·P·小貝內(nèi)特 申請(qǐng)人:弗吉尼亞大學(xué)專利基金會(huì)