專利名稱：利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生產(chǎn)人促紅細(xì)胞生成素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種調(diào)控外源基因(如人促紅細(xì)胞生成素)在動(dòng)物乳腺組織特異性表達(dá)的載體，以及在動(dòng)物乳腺中特異性表達(dá)外源基因的方法。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)人促紅細(xì)胞生成素的新方法。
背景技術(shù)：
促紅細(xì)胞生成素(EPO)是一種多功能的糖蛋白，具有刺激紅細(xì)胞增殖分化等作用，臨床主要用于治療腎性貧血，是一種有重要價(jià)值的醫(yī)用蛋白。EPO的生產(chǎn)方法主要是通過微生物發(fā)酵，然而目前的生產(chǎn)工藝成本較高，設(shè)備投入需要較多的資金，且對(duì)環(huán)境的污染也較嚴(yán)重。
動(dòng)物乳腺組織具有較強(qiáng)的合成蛋白的功能，如能利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將外源基因特別是有重要醫(yī)療價(jià)值的基因如人促紅細(xì)胞生成素基因，人生長(zhǎng)激素基因等轉(zhuǎn)入動(dòng)物體內(nèi)，就有可能生產(chǎn)出大量的藥用蛋白。人體內(nèi)的許多蛋白的生理活性與翻譯后修飾有關(guān)，通過原核表達(dá)的蛋白通常因?yàn)槿鄙俜g后修飾而不具備生物活性。以真核細(xì)胞培養(yǎng)來表達(dá)這些蛋白需要較高的成本，以轉(zhuǎn)基因動(dòng)物來表達(dá)外源蛋白，其產(chǎn)物接近天然即具有較高的生物活性、表達(dá)量高而且成本底。
用顯微注射的方法轉(zhuǎn)入動(dòng)物體內(nèi)的基因，其在動(dòng)物體內(nèi)的基因組的整合及表達(dá)是隨機(jī)的，如果外源基因產(chǎn)物具有較強(qiáng)的生物活性，外源基因的隨機(jī)表達(dá)或異位表達(dá)就有可能造成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物體的疾病甚至死亡。如促紅細(xì)胞生成素的異位表達(dá)會(huì)引起高紅細(xì)胞血癥。迄今為止，本領(lǐng)域還沒有通過乳腺反應(yīng)器(轉(zhuǎn)基因羊或牛的乳腺)來生產(chǎn)EPO的報(bào)道。
因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的成本低、污染小的生產(chǎn)EPO的新方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種成本低、污染小的生產(chǎn)促紅細(xì)胞生成素的方法，即利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生產(chǎn)人促紅細(xì)胞生成素，從而在動(dòng)物乳腺中大量表達(dá)人促紅細(xì)胞生成素。
本發(fā)明的另一目的是提供具有乳腺組織特異性的有關(guān)的表達(dá)融合基因、高效表達(dá)外源基因的載體、乳腺特異性表達(dá)EP0的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種乳腺特異性表達(dá)融合基因，該融合基因從5′至3′依次包含以下元件牛乳球蛋白的5′側(cè)翼序列、人促紅細(xì)胞生成素基因組DNA序列、和牛乳球蛋白3′側(cè)翼序列。
在一優(yōu)選例中，該融合基因從5′至3′依次包含以下元件牛乳球蛋白的5′側(cè)翼序列、外顯子1非編碼序列、人促紅細(xì)胞生成素基因組DNA序列、牛乳球蛋白外顯子1編碼序列、牛乳球蛋白內(nèi)含子1、牛乳球蛋白外顯子2、牛乳球蛋白內(nèi)含子2、牛乳球蛋白外顯子3、牛乳球蛋白外顯子6、牛乳球蛋白內(nèi)含子6、牛乳球蛋白外顯子7及牛乳球蛋白3′側(cè)翼序列。
在一優(yōu)選例中，所述的融合基因在牛乳球蛋白的5′側(cè)翼序列及外顯子1非編碼序列與人促紅細(xì)胞生成素基因組DNA序列之間還有接頭序列；和/或在人促紅細(xì)胞生成素基因組DNA序列與牛乳球蛋白外顯子1編碼序列之間還有接頭序列。
在另一優(yōu)選例中，所述的融合基因中的牛乳球蛋白的5′側(cè)翼序列、外顯子1非編碼序列具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列；人促紅細(xì)胞生成素基因組DNA序列具有SEQ ID NO2所示的核苷酸序列；牛乳球蛋白外顯子1、牛乳球蛋白內(nèi)含子1、牛乳球蛋白外顯子2、牛乳球蛋白內(nèi)含子2、牛乳球蛋白外顯子3具有SEQ ID NO3所示的核苷酸序列；牛乳球蛋白外顯子6、牛乳球蛋白內(nèi)含子6、牛乳球蛋白外顯子7及牛乳球蛋白3′側(cè)翼序列具有SEQ ID NO4所示的核苷酸序列。
在第二方面，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法，它包括步驟(a)將本發(fā)明上述的乳腺特異性表達(dá)融合基因，顯微注射動(dòng)物受精卵原核，制得基因組中整合有融合基因的受精卵；(b)將步驟(a)中的基因組中整合有融合基因的受精卵發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，該動(dòng)物在其乳腺中有人促紅細(xì)胞生成素的特異表達(dá)。
較佳地，該動(dòng)物選自下組羊、牛。
在第三方面，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)人促紅細(xì)胞生成素的方法，它包括步驟(3)培養(yǎng)用本發(fā)明上述方法制得的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，從動(dòng)物乳腺分泌的乳汁中分離純化出表達(dá)的人促紅細(xì)胞生成素。
在第四方面，本發(fā)明提供了一種調(diào)控外源基因在動(dòng)物乳腺中特異性表達(dá)的載體，該載體含有權(quán)利要求1所述的融合基因。
在第五方面，本發(fā)明提供了一種乳汁，它含有濃度10-100,000ug/ml的人促紅細(xì)胞生成素。更佳地，所述的乳汁含有濃度50-50,000ug/ml的人促紅細(xì)胞生成素。


圖1是BLG-EPO融合基因元件構(gòu)成示意圖。
圖2是BLG-EPO融合基因構(gòu)建流程圖。
圖3是BLG-EPO融合基因酶切圖譜。其中各酶切位點(diǎn)下方的數(shù)字為各位點(diǎn)的相對(duì)位置。
圖4是融合基因BLG-EPO羊基因組的整合檢測(cè)。其中，P為陽(yáng)性對(duì)照，N為陰性對(duì)照，73、132、134、138為整合檢測(cè)陽(yáng)性的羊編號(hào)。
圖5顯示了轉(zhuǎn)基因羊促紅細(xì)胞生成素乳腺表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果。其中圖5A為蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜后的全蛋白麗春紅染色；圖5B為對(duì)醋酸纖維素膜進(jìn)行抗體雜交后顯色結(jié)果。各泳道如下泳道1為分子量標(biāo)記；泳道2為EPO標(biāo)準(zhǔn)品(沈陽(yáng)三生)，分子量為34KD，上樣量為30IU；泳道3、4、5分別為134號(hào)羊催乳后第3、2、1天羊奶樣品，上樣量為0.5ul；泳道6、7、8分別為138號(hào)羊催乳后第3、2、1天羊奶樣品，上樣量為0.5ul。
圖6是MTT法檢測(cè)EPO活性標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖7顯示了乳腺表達(dá)的促紅細(xì)胞生成素氨基酸序列。斜體表示信號(hào)肽序列，黑體表示成熟肽序列。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明首先發(fā)現(xiàn)，利用牛乳球蛋白的5′側(cè)翼序列和牛乳球蛋白3′側(cè)翼序列，可以有效地使外源基因在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的乳腺中特異性表達(dá)。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
在本發(fā)明的優(yōu)選例中，所使用的牛乳球蛋白的序列包括從5′至3′依次包含以下元件牛乳球蛋白的5′側(cè)翼序列、外顯子1非編碼序列、牛乳球蛋白外顯子1編碼序列、牛乳球蛋白內(nèi)含子1、牛乳球蛋白外顯子2、牛乳球蛋白內(nèi)含子2、牛乳球蛋白外顯子3、牛乳球蛋白外顯子6、牛乳球蛋白內(nèi)含子6、牛乳球蛋白外顯子7及牛乳球蛋白3′側(cè)翼序列。其中，一種更優(yōu)選的方式是在外顯子1非編碼序列和牛乳球蛋白外顯子1編碼序列之間插入外源基因。
當(dāng)然，在外源基因(如EPO基因)與牛乳球蛋白基因之間還可含有接頭序列，例如在牛乳球蛋白的5′側(cè)翼序列及外顯子1非編碼序列與人促紅細(xì)胞生成素基因組DNA序列之間還有接頭序列A；和/或在人促紅細(xì)胞生成素基因組DNA序列與牛乳球蛋白外顯子1編碼序列之間還有接頭序列B。接頭序列的作用主要是便于克隆操作。設(shè)計(jì)和選用各種接頭序列在本領(lǐng)域的技術(shù)人員技能之內(nèi)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，所示的接頭序列是接頭序列A是5′-ctcgagtcacc-3′(SEQ ID NO15)；該接頭序列B是5′-ccatgtcgagt-3′(SEQ ID NO16)。
本發(fā)明還提供了一種調(diào)控外源基因在動(dòng)物乳腺組織特異性表達(dá)的載體。為了使外源基因(人促紅細(xì)胞生成素)在動(dòng)物乳腺中特異表達(dá)，本發(fā)明利用牛乳蛋白基因的乳腺特異表達(dá)調(diào)控元件構(gòu)建了乳腺特異表達(dá)的載體。一種優(yōu)選的載體包括牛乳球蛋白基因的5′側(cè)翼序列，部分外顯子和內(nèi)含子序列，3′側(cè)翼序列。位于5′側(cè)翼序列下游的供外源基因插入的多克隆位點(diǎn)，以及供載體連同插入其上的外源基因在大腸桿菌中復(fù)制的pGEM-Teasy序列。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所構(gòu)建的載體的具有如下序列元件一、包括了牛乳球蛋白基因(BLG)的5′調(diào)控序列(-1216～+45bp)；二、包含了牛乳球蛋白基因外顯子1至外顯子3(+48～+1878bp)、外顯子6至外顯子7(+4109～+4723)及3′側(cè)翼序列(734bp)。
在本發(fā)明另一實(shí)施例中，還以該特異性表達(dá)載體為基礎(chǔ)，構(gòu)建了表達(dá)人促紅細(xì)胞生成素的融合基因BLG-EPO，該融合基因的特點(diǎn)為EPO全長(zhǎng)編碼序列基因組DNA 5′端以BstEII補(bǔ)平連于BLG的5′調(diào)控序列及外顯子1非編碼序列的下游，3′端以NcoI補(bǔ)平連于BLG外顯子1編碼序列至3′側(cè)翼序列的上游。該融合基因的EPO基因組DNA位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的下游，緊鄰BLG的5′-UTR，因而EPO能在BLG啟動(dòng)子作用下而轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄體為融合mRNA，其編碼序列為EPO基因組DNA，而5′-UTR及3′-UTR來源于BLG和EPO。因EPO基因組DNA提供了終止密碼，因而只有EPO蛋白被編碼，而BLG不被翻譯。
本發(fā)明的載體/融合基因所包含的調(diào)控序列含有乳腺特異表達(dá)的元件，能保證外源基因在乳腺特異表達(dá)。
在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，將以此載體構(gòu)建能在乳腺特異表達(dá)人促紅細(xì)胞生成素的融合基因BLG-EPO轉(zhuǎn)入動(dòng)物時(shí)，從而在動(dòng)物乳腺中大量表達(dá)人促紅細(xì)胞生成素。
可用于本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物沒有特別限制，可以是任何哺乳動(dòng)物，較佳地，該動(dòng)物選自下組羊、牛、兔，更佳地選自下組羊、牛。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1EPO乳腺表達(dá)載體的構(gòu)建該實(shí)施例的基因構(gòu)建過程如圖2所示，該基因構(gòu)建物即為BLG-EPO融合基因，其中調(diào)控序列來源于牛BLG和EPO，編碼序列來源于EPO。
pBLG-EPO的制備1.各部分元件的來源1)牛BLG5′側(cè)翼序列和外顯子1非編碼序列部分根據(jù)GENBANK X14710報(bào)道的序列設(shè)計(jì)并合成如下引物5′-cggccgggggtctgctcc-3′(SEQ ID NO5)和5′-ctcgagggctgcagctggggtcac-3′(SEQ IDNO6)，以?；蚪MDNA為模板，用PCR法(94℃，5min；94℃，1min；60℃45s；72℃90s，30個(gè)循環(huán))擴(kuò)增BLG5′側(cè)翼序列及外顯子1非編碼部分序列(SEQ ID NO1)。PCR產(chǎn)物并克隆于pGEM-Teasy載體(Promega公司)，得質(zhì)粒pBLG5′。
2)牛BLG外顯子1-3及外顯子6-7和3′側(cè)翼序列根據(jù)GENBANK X14710報(bào)道的序列設(shè)計(jì)并合成如下引物5′-ctcgagtagtgcctcctgcttgccctg-3′(SEQ ID NO7)和5′-atcgatcttgaacaccgcagg-3′(SEQ ID NO8)，以?；蚪MDNA為模板，通過PCR(94℃，5min；94℃，1min；58℃45s；72℃90s，30個(gè)循環(huán))擴(kuò)增出外顯子1-3序列(SEQ ID NO3)并將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆于pGEM-Teasy載體得質(zhì)粒pBLG 1-3。
根據(jù)GENBANK X14710報(bào)道的序列設(shè)計(jì)并合成如下引物5′-atcgatgtgagcccctgccggcgc-3′(SEQ ID NO9)和5′-gcatgccaggcctttctgtc-3′(SEQ IDNO10)，以牛基因組DNA為模板，通過PCR通過PCR(94℃，5min；94℃，60s；56℃60s；72℃90s，35個(gè)循環(huán))擴(kuò)增出BLG外顯子6～7及3′側(cè)翼序列(SEQ ID NO4)，并將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆于pGEM-Teasy載體得質(zhì)粒pBLG6-3′。
3)以人基因組DNA為模板，采用如下引物5′-atgagggcccccggtgtg-3′(SEQ IDNO11)和5′-agtgtccatgggacaggctg-3′(SEQ ID NO12)，通過PCR法獲得EPO全長(zhǎng)編碼序列基因組DNA及部分5′-UTR和3′-UTR序列(SEQ ID NO2)，并將其克隆入pGEM-Teasy載體，得質(zhì)粒pEPO。
2.pBLG-EPO的構(gòu)建以Cla I和Sal I雙酶切pBLG6-3′回收外顯子6-3′片段(約1350bp)將該片段連于pBLG1-3的Cla I和Sal I位點(diǎn)得pBLG1-3′；以Xho I和Sal I雙酶切pBLG1-3′回收BLG1-3′片段(約3.1Kb)將該片段連于pBLG5′的XhoI和Sal I位點(diǎn)得pBLG；以BstEII和Nco I雙酶切pEPO回收EPO片段(約2.3KB)將該片段平端連于pBLG的Xho I位點(diǎn)得pBLG-EPO。(構(gòu)建過程詳見圖2)。
pBLG-EPO乳腺特異表達(dá)融合基因的酶切圖譜，參見圖3。
在pBLG-EPO中，EPO與BLG5′接頭及其鄰近序列如下轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn) BLG5′-UTR接頭序列 EPO 5′-UTRCCTCCACTCCCTGCAGAGCTCAGAAGCGTGACCCCAGCTGCAGCCCTCGAGTCACCCGGGCGCGCCCCAGGTCGCTGAGGGACCCCGGCCACGCGCGGAGATG(SEQ ID NO13)起始密碼子
EPO與BLG 3′接頭及鄰近序列如下EPO3′-UTR 接頭序列 BLG3′-UTRTCGAGGGGCTGTCAGCTCAGCGCCAGCCTGTCCCATGTCGAGTAGTGCCTCCTGCTTGCCCTGGCCCTCACTTGTGGCGC參見圖1，在人促紅細(xì)胞生成素乳腺特異性表達(dá)載體pBLG-EPO或融合基因BLG-EPO中，各元件的功能如下陰影框部分為BLG的5′側(cè)翼序列，該部分是BLG啟動(dòng)子，負(fù)責(zé)驅(qū)動(dòng)外源基因的表達(dá)，保證外源基因表達(dá)是乳腺特異性的。→表示BLG5′非翻譯區(qū)(5′-UTR)，5′-UTR為外源基因翻譯編碼形成蛋白提供核糖體結(jié)合位點(diǎn)。其詳細(xì)序列參見附圖4和SEQ ID NO1。
空心框部分為外源基因EPO全長(zhǎng)編碼序列。包括翻譯起始密碼及終止密碼子。序列詳見SEQ ID NO2。
實(shí)心框部分為牛BLG外顯子1至外顯子3，外顯子6～7和3′側(cè)翼序列，其作用是提供轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)及加Poly A信號(hào)。外顯子部分向外源基因提供3′非翻譯區(qū)，內(nèi)含子部分及3′側(cè)翼序列與乳腺特異性高效表達(dá)的調(diào)控有關(guān)，序列詳見SEQID NO3，以及SEQ ID NO4。
人EPO的氨基酸序列如圖7和SEQ ID NO17所示。
實(shí)施例2融合基因pBLG-EPO轉(zhuǎn)基因山羊的制備1.轉(zhuǎn)基因用質(zhì)粒DNA的制備1)質(zhì)粒pBLG-EPO轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH52，液體培養(yǎng)含pBLG-EPO質(zhì)粒的DH52菌株，培養(yǎng)量根據(jù)需要可為100ml-1000ml，然后收集細(xì)菌，用快速抽提法或大規(guī)模抽提法制備pBLG-EPO(詳細(xì)操作參考曼尼安蒂斯主編的分子克隆手冊(cè))。
提取的pBLG-EPO質(zhì)粒用NotI酶切，瓊脂糖凝膠電泳，用SephaglassBabndprep(pharmacia biotech)試劑盒回收純化6.82Kb的片段備用。
2)用顯微注射DNA稀釋液將純化后DNA稀釋至2ug/ml，離心(12000rpm，30min)，分裝，即可作顯微注射用。
2.制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物將融合基因BLG-EPO通過顯微注射的方法導(dǎo)入到奶山羊受精卵雄原核內(nèi)，然后再移植到同步發(fā)情的受體山羊輸卵管內(nèi)，待其妊娠產(chǎn)仔。
實(shí)施例3.融合基因pBLG-EPO轉(zhuǎn)基因山羊基因組整合的檢測(cè)1.樣品處理未轉(zhuǎn)基因山羊和待測(cè)轉(zhuǎn)基因山羊，按常規(guī)操作取羊耳(長(zhǎng)度小于1厘米)，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 2.檢測(cè)方法1)基因組DNA的快速抽提，將羊耳置于1.5ml離心管中，加0.5ml的LysisBuffer(4M Urea power，10mM EDTA(pH8.0)，0.5％Sarkosyl(Sigma L5 125)，0.1MTris-Cl(pH8.0)，0.2M NaCl)，50μl的蛋白酶K(10mg/ml)置于55℃的雜交爐中振搖過夜。離心(14000rpm)5min，轉(zhuǎn)移上清至一個(gè)干凈的離心管中，加入1ml無水乙醇輕輕混合后強(qiáng)烈振搖，用Tip頭輕輕挑起絮狀DNA沉淀，用250-300μl的0.1×TE或雙蒸水重懸DNA，吹打混勻，4℃保存。
2)酶切及電泳取基因組DNA約10微克采用限制性內(nèi)切酶EcoR I在37℃酶切12小時(shí)以上。酶切產(chǎn)物以1％瓊脂糖凝膠電泳，1-2V/cm電壓，電泳12小時(shí)以上。
變性及中和加入變性液(1.5M NaCl 0.5M NaOH)使膠變性45分鐘(輕搖)，加入中和液(1.5M NaCl 0.5M Tris-Hcl(PH8.0)輕搖中和45分鐘(輕搖)3)轉(zhuǎn)膜將尼龍膜均勻鋪在膠上，上面鋪3MM Waterman吸水紙3張，再鋪紙塔(5-10厘米)，壓上重物，轉(zhuǎn)膜18小時(shí)；用5×SSC沖洗膜以去除膜表面的凝膠碎片；在室溫下晾干，80℃固定2小時(shí)。
4)探針制備以EcoR I和Xho I雙酶切質(zhì)粒pBLG-EPO，回收3.5kb條帶，產(chǎn)量應(yīng)在500ng-1000ng間，采用隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒標(biāo)記探針。
5)預(yù)雜交及雜交轉(zhuǎn)印膜在預(yù)雜交液(5×SSPE，5×Denhardt′s Solution，0.1％SDS，100μg/ml nonhomologous Salmon sperm blocking DNA，50％Formamide)中42℃預(yù)雜交4小時(shí)。將探針加入到預(yù)雜交液中，42℃雜交16小時(shí)。
6)洗膜壓片洗片采用Wash Solution(1×SSC，0.1％SDS)65℃洗滌1小時(shí)，重復(fù)此步驟，直到本底降到10以下。把洗后的膜用保險(xiǎn)膜固定，暗室中放入X光片，-70℃保存兩天。暗室中取出X光片，顯影5分鐘，定影15分鐘，檢查光片上所顯示的結(jié)果，2.檢測(cè)結(jié)果結(jié)果見附圖4，泳道P為陽(yáng)性對(duì)照轉(zhuǎn)基因構(gòu)件BLG-EPO以EcoR I酶切；泳道N為陰性對(duì)照未轉(zhuǎn)基因山羊基因組DNA；其余泳道為待測(cè)轉(zhuǎn)基因山羊基因組DNA。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因山羊(73、132、134、138)的基因組DNA中有BLG-EPO的整合。
實(shí)施例4.Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)基因山羊乳汁中人促紅細(xì)胞生成素1.樣品處理1)轉(zhuǎn)基因奶山羊的人工誘乳選取奶山羊，每天肌肉注射苯甲酸雌二醇及黃體酮二次，每次劑量分別為2mg及20mg，共七天。然后分別于第8，10，12，14天肌肉注射利血平0.5mg。于第12天收集乳汁供EPO表達(dá)檢測(cè)用收集羊奶，脫脂處理(4000rpm，4℃，20min)，加入等體積的TBS緩沖液(0.1mol/L Tris-堿，0.3mol/L NaCl，0.2mol/L EDTA，PH6.5)，過0.22um濾膜除菌，樣品中加入1×SDS凝膠加樣緩沖液，于100℃煮沸3分鐘，使蛋白變性。
2.檢測(cè)方法蛋白電泳經(jīng)處理樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，積層膠4％膠濃度，50V；分離膠7.5％膠濃度，100V。
蛋白轉(zhuǎn)印電泳后在80mA電流下進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)印2小時(shí)，將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，以麗春紅染色檢測(cè)轉(zhuǎn)印效果。轉(zhuǎn)印膜用Tris-NaCl溶液(0.05mol/L Tris-堿，0.15mol/L NaCl，pH7.5)洗去結(jié)合在蛋白上的麗春紅染料后用于雜交抗體。
抗體雜交將轉(zhuǎn)印膜放入平皿，加入適量封閉液(10％脫脂奶粉)，以1∶3000的濃度加入第一抗體(鼠抗人促紅細(xì)胞生成素抗體)，于平緩搖動(dòng)的搖床上室溫雜交四小時(shí)；雜交結(jié)束，用Tris-NaCl溶液漂洗濾膜3次，每次10分鐘；以1∶2000的濃度加入酶聯(lián)二級(jí)抗體，室溫雜交二小時(shí)；雜交結(jié)束，用Tris-NaCl溶液漂洗膜3次，每次10分鐘，然后進(jìn)行顯色反應(yīng)。
顯色在膜上加入適量底物(堿性磷酸酶用BCIP/NBT)，暗反應(yīng)約20分鐘，就能看到蛋白條帶。
3.檢測(cè)結(jié)果結(jié)果見附圖5，圖中泳道1為分子量標(biāo)準(zhǔn)物；泳道2為陽(yáng)性對(duì)照EPO標(biāo)準(zhǔn)品(沈陽(yáng)三生)；泳道3，4，5，6，7，8為待測(cè)轉(zhuǎn)基因山羊乳蛋白。
結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因山羊134、138(泳道3，4，5，6，7，8)的乳汁中有人促紅細(xì)胞生成素的特異性條帶顯示。
實(shí)施例5.轉(zhuǎn)基因山羊乳汁中人促紅細(xì)胞生成素(EPO)體外生物活性測(cè)定(MTT法)活細(xì)胞特別是增殖的細(xì)胞中能量代謝旺盛，利用線粒體能量代謝過程中產(chǎn)生的琥珀酸脫氫酶可將淡黃色的MTT還原為藍(lán)紫色結(jié)晶沉積在細(xì)胞核周圍，形成的結(jié)晶與增值的細(xì)胞數(shù)成正比。利用32D細(xì)胞對(duì)EPO的生長(zhǎng)依賴特性，可檢測(cè)培養(yǎng)液中的EPO活性。
1.實(shí)驗(yàn)材料1640培養(yǎng)液按說明書配制，4度保存。
基礎(chǔ)培養(yǎng)液1640培養(yǎng)液添加10％的小牛血清，1*P/S，4度保存。
完全培養(yǎng)液基礎(chǔ)培養(yǎng)液添加EPO至終濃度1-2U/ml，4度保存。
PBSNaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HPO4、KH2PO40.24g加蒸餾水配成1000ml。121度15分鐘滅菌。
噻唑藍(lán)MTT溶液用PBS配成5.0mg/ml的溶液，經(jīng)0.22um濾器過濾除菌，4度避光保存。
裂解液10％的SDS、0.01mol/mlHCl。
32D細(xì)胞培養(yǎng)物32D細(xì)胞在完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)24-48個(gè)小時(shí)用于EPO活性測(cè)定。
EPO標(biāo)準(zhǔn)品沈陽(yáng)三生益比奧3000U/ml，4℃保存。
2.實(shí)驗(yàn)步驟空白羊奶制備空白羊奶用針頭濾器除菌過濾。用基礎(chǔ)培養(yǎng)液稀釋成10％的溶液。
樣品溶液制備除菌過濾，羊奶樣品用針頭濾器過濾除菌，用基礎(chǔ)培養(yǎng)液稀釋成10％的溶液，按樣品的含量用10％的空白羊奶稀釋成不同濃度梯度的樣品。
制備標(biāo)準(zhǔn)品樣品稀釋取益比奧用10％的空白羊奶配成12.8U/ml的溶液，然后用空白羊奶倍比稀釋成12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05U/ml。
制備細(xì)胞懸液取足量的32D細(xì)胞培養(yǎng)物離心收集32D細(xì)胞，用基礎(chǔ)培養(yǎng)液洗滌三次，重懸于基礎(chǔ)培養(yǎng)液中計(jì)數(shù)配成40萬細(xì)胞每毫升備用。在96孔板中按下表加入標(biāo)準(zhǔn)系列100ul，及樣品100ul，每個(gè)3-4復(fù)孔加入細(xì)胞懸液及培養(yǎng)每孔加入100ul細(xì)胞懸液，置37℃，5％CO2培養(yǎng)44小時(shí)(至2A-D存活細(xì)胞不足11A-D的10％)加入MTT并培養(yǎng)酶孔加入10ulMTT溶液，37℃，5％CO2培養(yǎng)4小時(shí)加入裂解液并保溫酶孔加入100ul裂解液，37℃保溫18-24小時(shí)測(cè)定光密度值在酶標(biāo)儀上比色，測(cè)定波長(zhǎng)590nm(570-600，可選用參比波長(zhǎng)630nm)，記錄測(cè)定結(jié)果。
3.結(jié)果MTT法檢測(cè)EPO活性標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖6所示。以標(biāo)準(zhǔn)系列濃度u/ml的對(duì)數(shù)對(duì)OD590作直線回歸，計(jì)算樣品EPO濃度，結(jié)果表明BLG-EPO整合羊132、134、138乳腺表達(dá)EPO分別達(dá)117U/ml、28000U/ml、19038U/ml乳汁。
MTT法檢測(cè)EPO活性標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>上海杰隆生物工程股份有限公司<120>利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生產(chǎn)人促紅細(xì)胞生成素的方法<130>022856<160>17<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1264<212>DNA<213>牛(B.taurus)<400>1cggccggggg tctgctcccg tgggtgggct ctttctggta cagtcaccaa cagtctctcc 60gggaaggaaa ccagaggcca gagagcaagc cagagctagt ctaggagatc cctgagcctc120cacccaagat gccgaccagg ccagcgggcc ccctggaaag accctacagt ctaggggggg180aacaggagcc gacccgccag gcccccgcta tcaggagaca ccccaacctt gctcctgttc240ccctacccca gtacgcccac ccgacccctg agatgagtgg tttacttgct tagaatgtca300attgaaggct tttgtacccc ctttgccagt ggcacagggc acccacagcc cgttgggtac360tgatgcccat gtggactcag ccaggaggac tgtcctgcgc cctccctgct cgggccccct420ccatactcag cgacacaccc agcaccagca ttcccaccac tcctgaggtc tgaaggcagc480tcgctgtggt ctgagcggtg cggagggaag tgccctggga gatttaaaat gtgagaggtg540ggaggtggga ggttgggtcc tgtaggcctt cccatcccac gtgcctgcac ggagccctag600tgctactcag tcatgccccc gcagcagggg tcaggtcact ttcccatcct gggggttatt660atgactgttg tcattgttgt tgccattttt gctaccctaa ctgggtagcg ggtgcttgca720gagccctcga tactgaccag gttcccccct cggagctcga cctgaacccc atgtcaccct780cgccccagcc tgcagaggga gaggtgactg cagagatccc tttacccaag gccacagtca840catggtttgg aggagatggt gcccaaggca gaagccaccc tccaggacac acctgccccc900agtgctggct ctgacctgtc cttgtctaag aggctgaccc cagaagtgtt cctggcgctg960gcagccagcc tggacccaga gcctggacaa ccccctgcgc ccccacttct ggggcgtacc 1020aggaaccgtc caggcccaga gggggccttc ccgcttggcc tcgaatggaa gaaggcctcc 1080tattgtcctc gtagaggaag caaccccagg gcccaaggaa aggccagggg ggattcgggg 1140aaccgcgtgg ctgggggccc ggcccgggct ggctggctgg ccctcctcct gtataaggcc 1200ccgagcccgc tgtctcagcc ctccactccc tgcagagctc agaagcgtga ccccagctgc 1260agcc1264<210>2<211>2309<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>2cggcgcgccc caggtcgctg agggaccccg gccaggcgcg gagatggggg tgcacggtga 60gtactcgcgg gctgggcgct cccgcccgcc cgggtccctg tttgagcggg gatttagcgc120cccggctatt ggccaggagg tggctgggtt caaggaccgg cgacttgtca aggaccccgg180aagggggagg ggggtggggc agcctccacg tgccagcggg gacttggggg agtccttggg240gatggcaaaa acctgacctg tgaaggggac acagtttggg ggttgagggg aagaaggttt300gggggttctg ctgtgccagt ggagaggaag ctgataagct gataacctgg gcgctggagc360caccacttat ctgccagagg ggaagcctct gtcacaccag gattgaagtt tggccggaga420agtggatgct ggtagctggg ggtggggtgt gcacacggca gcaggattga atgaaggcca480gggaggcagc acctgagtgc ttgcatggtt ggggacagga aggacgagct ggggcagaga540cgtggggatg aaggaagctg tccttccaca gccacccttc tccctccccg cctgactctc600agcctggcta tctgttctag aatgtcctgc ctggctgtgg cttctcctgt ccctgctgtc660gctccctctg ggcctcccag tcctgggcgc cccaccacgc ctcatctgtg acagccgagt720cctggagagg tacctcttgg aggccaagga ggccgagaat atcacggtga gaccccttcc780ccagcacatt ccacagaact cacgctcagg gcttcaggga actcctccca gatccaggaa840cctggcactt ggtttggggt ggagttggga agctagacac tgccccccta cataagaata900agtctggtgg ccccaaacca tacctggaaa ctaggcaagg agcaaagcca gcagatccta960cggcctgtgg gccagggcca gagccttcag ggacccttga ctccccgggc tgtgtgcatt 1020tcagacgggc tgtgctgaac actgcagctt gaatgagaat atcactgtcc cagacaccaa 1080agttaatttc tatgcctgga agaggatgga ggtgagttcc tttttttttt tttttccttt 1140cttttggaga atctcatttg 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gcgacctcct gttttctcct tggcagaagg 2040aagccatctc ccctccagat gcggcctcag ctgctccact ccgaacaatc actgctgaca 2100ctttccgcaa actcttccga gtctactcca atttcctccg gggaaagctg aagctgtaca 2160caggggaggc ctgcaggaca ggggacagat gaccaggtgt gtccacctgg gcatatccac 2220cacctccctc accaacattg cttgtgccac accctccccc gccactcctg aaccccgtcg 2280aggggctctc agctcagcgc cagcctgtc 2309<210>3<211>1832<212>DNA<213>牛(B.taurus)<400>3agtgcctcct gcttgccctg gccctcactt gtggcgccca ggccctcatt gtcacccaga 60ccatgaaggg cctggatatc cagaaggttc gagggtgccc gggtgggtgg tgagttgcag120ggcaggcagg ggagctgggc ctcagagacc aagggaggct gtgacgtctg ggattcccat180cagtcagcta gagccgcctg acaaatcgcc cgccagggca gcttcaacca ggcgtttagt240gtcttgcatt ctggaggctg gaagcctgca atccgggcat cggcccagct ggcttctcct300gcggccactc tccggggagc agacagccat cttctccctg tgtcctttgc gtgccctggt360ttcctcttcc tgtgaggtca ccaggcctgc tggatccacg cccgcccaca cagcctcacg420taacctttgt catctcttta aaggccgtgt ctccagtcct gtgttgaggt tctgggggtt480aatgggacac agttcagccc ctaaaagagt cgctctgccc ctcaaatttt ccccacctcc540agctatgtct ccccaagatc caaatgttgc cacgtgtgcg ggggctcatc tgggtccctc600tttgggctca gagtgagtct ggggagagca ttcctcaggg tgccgagttg gggggagcat660ctcagggctg cccaggccag ggtgggacag agagcccact gtggggctgg gggccccttc720ccgcccctgg agtgcagctc aaggtccctc cccaggtggc ggggacttgg tactccttgg780ccatggcggc cagcgacatc tccctgctgg acgcccagag tgcccccctg agagtgtatg840tggaggagct gaagcccacc cctgagggcg acctggagat cctgctgcag aaatggtggg900cgtccccccc aaaaaaagca tggaaccccc actccccagg gatatggacc cccccggggt960ggggtgcagg agggaccagg gccccagggc tggggaacgg ggcttggagt ttcctggtac 1020ccctggaggt ccacccaagg ctgcttatcc agggctttct ctttcttttt ttcccccaac 1080ttttattaat ttgatgcttc agaacatcat caagcaaatg aacacaaaac atcattttcg 1140ttaacttgga aggggagata aaatccactg aagtggaaat gcataggaaa gatacataca 1200gtaaggcagg tattctgaat tcgctgttag tttgaggatt acaaatgcac ttgagcaaca 1260gagagacgtt ttcattattt ctggtctgaa cagctcagta tctaaaatga acaagatgtc 1320atggagacaa agccggcggg ggagaggccc gtgtgaaggc cgctgggcgg ctgcagacct 1380gggtcctcgg ggcccaggca gttcccacta ccagccctgt ccaccctcag acgggggtca 1440gagtgcagga gagagctggg tgggtgtggg ggcagagatg gggacctgaa ccccaggact 1500gccttttggg gtgcctgtgg tcaaggctct ccccaacctt ttctccctgg ctccatctga 1560cttctcctgg cccatccacc cggtcacctg tggccccaga ggtgacagtg agtgcagcca 1620aggccggttg gccagccggc cccctatgcc cacgccaccc gcctccagcc cctcctgggg 1680ccgccttctg cccctggccc tcagttcatc ctgatgaaaa tggtccatgc ccgtggctca 1740gaaagcagct gtctttcagg gagaacggtg agtgtgctca gaagaagatc attgcagaaa 1800aaaccaagat ccctgcggtg ttcaagatcg at 1832<210>4<211>1347<212>DNA<213>牛(B.taurus)<400>4gtgagcccct gccggcgcct ctggggtaag ctgcctgccc tgccccacgt cctgggcaca 60cacatggggt aggggttctt gattgggccc gggagccccc attaggccct ggggtccccc120cgtaggaatg gctggaagct ggggtccttc ctggagacta cagagccggc tggccacatg180ctcgctcttg tggggtgacc tgtgtcctgg cctcactcac acgctgatct cctccacctc240cttcctggca gacctaaggg ccaaggtgga ggctcaggaa gtggacacct aagggggagg300ctaggggggt ccttctccca aggaggggcc gtcctgaatc cccagccacg gacaggctgg360caagggtctg gcaggtaccc caggaatcac aggggagccc catgtccatt tcagagcccg420ggagccttgg cccctctggg gacagacgat gtcatccccg cctgccccat caggggacca480ggaggaaccg ggaccacatt cacccctcct gggacccagg cccctccagg cccctcctgg540ggcctcctgc ttggggccgc tcctccctca gcaataaagg cgtaaacctg tgctctccct600tctgagtctt tcctggatga tgggccgggg gtggagaagg cccgggacag ggtggggagt660ggtctggctc agaggatgat ggtagggctg ggatccaggg cgtctgcatt acagtcttga720gacatctggg ggcccacaca catcactacg gctctttgaa actttcagga accaggtagg780gagtcggcag agacatctgc cagttaactt ggagtgttca gtcaacaccc aaactcgaca840aaggacagga agtggaaaat ggctgtctct tagtctaata aatattgata tgaaagctca900agttgctcat ggatcaaatt atgccttttt atgaatccag ccactacagt cggtatcaaa960cttcatgtac tcaaaacgca ctgatctttt ctgtgctaaa atgaaataaa gagatttccc 1020caagatacag gtgctgggca aaagaggtca cggttggaag gggacttgtt ctgcacacac 1080agcaaggaga tccagccagt ccatcctaaa ggagatcagt cctgggtgtt cattggaggg 1140actgatgttg aagctgaaac tccaatactt tggccacatg atgcggagag ctgactcatt 1200tgaaaagacc ctgatactgg gaaagattga gggcaggagg agaaggggat gacagaggat 1260gagatggttg gatggcatca ccgacaaaat ggacatgggt ttgggtggac tccaggagtt 1320ggtgatggac agaaaggcct ggcatgc 1347<210>5<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>5cggccggggg tctgctcc 18<210>6<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>6ctcgagggct gcagctgggg tcac 24<210>7<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>7ctcgagtagt gcctcctgct tgccctg27<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>8atcgatcttg aacaccgcag g 21<210>9<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>9atcgatgtga gcccctgccg gcgc 24<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>10gcatgccagg cctttctgtc 20<210>11<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>11atgagggccc ccggtgtg18<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>12agtgtccatg ggacaggctg 20<210>13<211>102<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>EPO與BLG5’接頭及其鄰近序列<400>13cctccactcc ctgcagagct cagaagcgtg accccagctg cagccctcga gtcacccggc60gcgccccagg tcgctgaggg accccggcca ggcgcggaga tg 102<210>14<211>80<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>EPO與BLG3’接頭及鄰近序列<400>14tcgaggggct ctcagctcag cgccagcctg tcccatgtcg agtagtgcct cctgcttgcc60ctggccctca cttgtggcgc80<210>15<211>11<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>接頭序列<400>15ctcgagtcac c 11<210>16<211>11<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>接頭序列<400>16ccatgtcgag t 11<210>17<211>193<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<220><221>misc_feature<222>(1)..(27)<223>信號(hào)肽<400>17Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu50 55 60Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg65 70 75 80Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu85 90 95Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser100105 110Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly115 120125Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu130 135140Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ilel45 150 155160Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu165170 175Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp180185 190Arg
權(quán)利要求
1.一種乳腺特異性表達(dá)融合基因，其特征在于，該融合基因從5′至3′依次包含以下元件牛乳球蛋白的5′側(cè)翼序列、人促紅細(xì)胞生成素基因組DNA序列、和牛乳球蛋白3′側(cè)翼序列。
2.如權(quán)利要求1所述的融合基因，其特征在于，該融合基因從5′至3′依次包含以下元件牛乳球蛋白的5′側(cè)翼序列、外顯子1非編碼序列、人促紅細(xì)胞生成素基因組DNA序列、牛乳球蛋白外顯子1編碼序列、牛乳球蛋白內(nèi)含子1、牛乳球蛋白外顯子2、牛乳球蛋白內(nèi)含子2、牛乳球蛋白外顯子3、牛乳球蛋白外顯子6、牛乳球蛋白內(nèi)含子6、牛乳球蛋白外顯子7及牛乳球蛋白3′側(cè)翼序列。
3.如權(quán)利要求1所述的融合基因，其特征在于，在牛乳球蛋白的5′側(cè)翼序列及外顯子1非編碼序列與人促紅細(xì)胞生成素基因組DNA序列之間還有接頭序列；和/或在人促紅細(xì)胞生成素基因組DNA序列與牛乳球蛋白外顯子1編碼序列之間還有接頭序列。更佳地，所示的接頭序列是接頭序列A是CTCGAGTCACC；該接頭序列B是CCATGTCGAGT。
4.如權(quán)利要求1所述的融合基因，其特征在于，牛乳球蛋白的5′側(cè)翼序列、外顯子1非編碼序列具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列；人促紅細(xì)胞生成素基因組DNA序列具有SEQ ID NO2所示的核苷酸序列；牛乳球蛋白外顯子1、牛乳球蛋白內(nèi)含子1、牛乳球蛋白外顯子2、牛乳球蛋白內(nèi)含子2、牛乳球蛋白外顯子3具有SEQ ID NO3所示的核苷酸序列；牛乳球蛋白外顯子6、牛乳球蛋白內(nèi)含子6、牛乳球蛋白外顯子7及牛乳球蛋白3′側(cè)翼序列具有SEQ ID NO4所示的核苷酸序列。
5.一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法，其特征在于，它包括步驟(1)將權(quán)利要求1所述的乳腺特異性表達(dá)融合基因，顯微注射動(dòng)物受精卵原核，制得基因組中整合有融合基因的受精卵；(2)將步驟(1)中的基因組中整合有融合基因的受精卵發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，該動(dòng)物在其乳腺中有人促紅細(xì)胞生成素的特異表達(dá)。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，該動(dòng)物選自下組羊、牛。
7.一種生產(chǎn)人促紅細(xì)胞生成素的方法，其特征在于，它包括步驟(3)培養(yǎng)用權(quán)利要求5所述方法制得的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，從動(dòng)物乳腺分泌的乳汁中分離純化出表達(dá)的人促紅細(xì)胞生成素。
8.一種調(diào)控外源基因在動(dòng)物乳腺中特異性表達(dá)的載體，其特征在于，該載體含有權(quán)利要求1所述的融合基因。
9.一種乳汁，其特征在于，它含有濃度10-5000ug/ml的人促紅細(xì)胞生成素。
10.如權(quán)利要求9所述的乳汁，其特征在于，含有濃度50-1000ug/ml的人促紅細(xì)胞生成素。
全文摘要
本發(fā)明提供了生產(chǎn)EPO的新方法，包括利用牛(B.taurus)的乳球蛋白(BLG)5′側(cè)翼序列、部分外顯子內(nèi)含子序列及3′側(cè)翼序列為乳腺特異表達(dá)的調(diào)控序列，以人促紅細(xì)胞生成素(EPO)全長(zhǎng)基因組DNA為編碼序列，構(gòu)建融合基因BLG－EPO，該融合基因可以在催乳山羊乳腺中瞬時(shí)表達(dá)。以該融合基因顯微注射山羊受精卵原核，獲得了人促紅細(xì)胞生成素乳腺特異高效表達(dá)的轉(zhuǎn)基因山羊。
文檔編號(hào)C07K14/47GK1459457SQ0211174
公開日2003年12月3日 申請(qǐng)日期2002年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月20日
發(fā)明者成國(guó)祥, 陳建泉, 吳國(guó)祥, 趙建陽(yáng) 申請(qǐng)人:上海杰隆生物工程股份有限公司