專利名稱：鐵氧還蛋白的簡易分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種植物蛋白的分離方法。
鐵氧還蛋白(Ferredoxin，簡稱Fd)是普遍存在于植物界的一種低分子量(Mr為11000)，具有氧化還原性質(zhì)的蛋白，它參與碳同化和硝酸鹽還原等諸多生理活動(dòng)，許多涉及光合作用和生物固氮等實(shí)驗(yàn)都會(huì)用到這種生物化學(xué)試劑。雖然商品Fd試劑純度較高，但價(jià)格昂貴。而傳統(tǒng)的Fd的分離方法需耗用大量丙酮(植物生理學(xué)通訊1984(1):46-47)。該方法的主要流程為(一)用菠菜葉預(yù)先深凍(-20℃)，室溫下解凍，使細(xì)胞凍融破裂，加入0.01M Tris-HCI pH7.3緩沖液，搗碎凍融葉片，紗布過濾。(二)濾液中加入深冷(-20℃)丙酮，使之濃度到35％丙酮。經(jīng)5000×g離心，把沉淀?xiàng)壢ァＴ陔x心后的上層液中繼續(xù)加入深冷丙酮，使之濃度達(dá)到75％，靜止后，使沉淀沉降，吸去部分上清液后，余留帶有沉淀的75％濃度丙酮溶液，經(jīng)5000×g離心，收集沉淀，用冷風(fēng)吹干殘留沉淀中的丙酮，并使懸浮于0.01M Tris-HCIpH7.3緩沖液，對(duì)同樣緩沖液透析，再經(jīng)18000×g離心20分鐘，紅棕色的上層液為含F(xiàn)d的粗制品。(三)在紅棕色的樣品中加入固體NaCl，使之成0.15M NaCl濃度，并把它吸附到預(yù)先經(jīng)0.01M Tris-HCI pH7.3和0.15M NaCl平衡過的DEAE-纖維素(D-52)分離柱上。以同樣的緩沖液洗柱，未被吸附的樣品流棄。深棕紅色的Fd吸附帶呈現(xiàn)在分離柱的上端。再分次提高洗脫緩沖液中的NaCl濃度以0.2M、0.25M、0.3M……。同時(shí)觀察分離柱的上端Fd移動(dòng)的情況，直到提高NaCl濃度到棕紅色吸附帶開始下降移動(dòng)，就不再提升NaCl濃度，繼續(xù)洗脫，并收集出棕紅色的Fd制劑。(四)將收集的Fd溶液，對(duì)不含NaCl的0.01M Tris-HCI pH7.3透析脫鹽，濃縮保存、備用。但用此方法如提取1Kg菠菜葉片，共需耗丙酮6立升，大量用過的丙酮不僅對(duì)回收、處理帶來麻煩，而且由于高濃度的丙酮在操作過程中不能用塑料容器，這還對(duì)離心設(shè)備的使用帶來諸多不便，且成本高，又不安全。
本發(fā)明的目的是提供一種屏棄丙酮，省時(shí)、省錢、安全、簡便的Fd分離方法，此方法雖在得率和純度上不及丙酮提取方法，但在光合電子傳遞的離體實(shí)驗(yàn)中，由于某些成分(Fd-NADP-還原酶、銅蘭素等)未被分離掉，反而有利生化反應(yīng)的進(jìn)行。同時(shí)也解決了由于使用大量高濃度的丙酮，對(duì)離心操作帶來不便，及對(duì)廢丙酮回收處理帶來的麻煩。
本發(fā)明提出的鐵氧還蛋白的分離方法，是目前最簡單的方法，本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的(一)菠菜或豌豆葉片的深凍、搗碎、過濾、離心的提取步驟與已有技術(shù)相同，緩沖液用0.02M Tris-HCl pH7.6得到第一步提取液后，關(guān)鍵在省略了第二步，不再用35％～75％的丙酮分級(jí)沉淀，而是直接用DEAE-纖維素(D-52)吸附蛋白。(二)吸附蛋白把DEAE-纖維素(D-52)原裝干粉，直接投到提取液中，使其充分吸附提取液中的蛋白。緩慢攪拌使DEAE-纖維素分散吸脹。(三)裝柱把吸附蛋白后，呈深色的DEAE-纖維素裝到層析柱直徑4cm、長25-30cm)上，為了使DEAE均勻地在柱內(nèi)沉降，可先在柱內(nèi)裝滿緩沖液，一邊在柱上端加入吸脹的DEAE-纖維素，一邊在柱下端放出柱內(nèi)溶液，使其均勻地沉降下來，緩慢操作，連續(xù)灌注，直至完成。(四)洗脫雜蛋白用含0.15M NaCl的0.02M Tris-HCl pH7.6緩沖液洗柱，需連續(xù)洗脫不能中斷，使之洗脫過夜，大量不被吸附的蛋白被洗脫掉。流出液由起始的呈深黃色逐漸變淡呈微黃色。(五)收集Fd當(dāng)洗脫液中的NaCl濃度由0.15M提高到0.3M，繼續(xù)洗脫時(shí)，DEAE-纖維素柱的上端可以看到有一棕色環(huán)帶析出，并隨洗脫而下移，此為含F(xiàn)d成份的部分，控制流速，使其盡可能集中在體積較小的洗脫液中。收集棕紅色的洗脫液部分。(六)脫鹽及濃縮一般用水溶液法提取得到的Fd制劑較稀，需經(jīng)濃縮?？梢杂贸瑸V膜方法來脫鹽濃縮，也可以先把樣品，對(duì)不含NaCl的0.02M Tris-HCl pH7.6緩沖液，透析脫鹽，透析后的樣品連同透析袋埋于聚乙二醇(PVP 4000～6000)中，將體積縮小3～5倍后取出。冷藏、儲(chǔ)用。(七)Fd制品的濃度和純度計(jì)算本制品為Fd粗制品，含量的近似值可按克分子消光系數(shù)ε420=9.4 L·mmol-1·cm-1，分子量11000計(jì)算。Fd的質(zhì)量指標(biāo)用O.D420/O.D276吸收比值指示，比值越大，相對(duì)Fd含量越高(一般在0.2以上)。
本發(fā)明的積極效果是明顯的，本發(fā)明的改進(jìn)之處是省略了大量丙酮有機(jī)溶液，解決了安全操作及因離心容器不能使用丙酮的問題，而且DEAE-纖維素又可以再生利用，操作比原來容易得多。用本發(fā)明的方法制備得到的Fd是粗制品(尚未把其中的黃素蛋白、Fd-NADP還原酶、銅蘭素等分離開來)，但對(duì)于離體葉綠體的光合電子傳遞實(shí)驗(yàn)來說，粗制品中所含這些未被分離的成分，反而有利于光合電子傳遞的進(jìn)行。因此本發(fā)明是一種省時(shí)、省錢、安全、簡易的Fd分離方法。
以下的附圖和實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明的技術(shù)特征作進(jìn)一步的描述。


圖1Fd的氧化還原吸收光譜。
圖2依賴Fd的離體葉綠體NADP光還原。
實(shí)施例1(一)取1公斤新鮮菠菜葉片洗凈→去中脈→甩干水份→紗布包緊→-20℃冷凍2-3天→取出后用木棒擊碎成粉狀→在室溫下解凍→使細(xì)胞凍融破碎→加入0.02M·L-1Tris-HCl pH7.6緩沖液1500ml→分次用電動(dòng)搗碎機(jī)搗碎成糊狀→4層紗布和尼龍網(wǎng)布過濾→擠出液體(呈深綠色)→3000×g離心5分鐘→取上層液(呈綠色)。(二)吸附蛋白將100g原裝DEAE-纖維素(D-52)直接分散加入上層液→緩慢攪拌使其分散，吸水膨脹，靜放于冰箱(過夜)→傾去部分上層液。(三)裝柱將吸脹后的DEAE轉(zhuǎn)移至層析柱上(直徑4cm長30cm)為使DEAE均勻地在柱內(nèi)沉降，可先在柱內(nèi)灌滿緩沖液，一邊灌入吸脹的DEAE，一邊緩慢放出柱內(nèi)溶液，使其均勻沉降下來，應(yīng)連續(xù)灌注，直至完成。(四)洗脫雜蛋白用含0.15 ML-1NaCl的0.02M·L-1Tris-HClpH7.6緩沖液洗柱，連續(xù)洗脫不能中斷，洗脫過夜，約需耗用5L洗脫液。流出液由起初的深黃色逐漸稀釋成微黃色，為保持柱內(nèi)DEAE界面平整，可以在柱內(nèi)洗脫液的界面上，浮一片塑料薄片，以便洗脫液下滴時(shí)，不直接沖擊DEAE-纖維素的界面。(五)收集Fd當(dāng)洗脫緩沖液中的NaCl濃度由0.15M更換成0.3M后，柱的上部有一棕紅色的環(huán)帶析出，并洗脫液下移(此為含F(xiàn)d的部分)，洗脫液流速控制在2ml·min-1，合并Fd較集中的部分，體積約50ml。(六)脫鹽及濃縮先把0.3M NaCl洗脫下來的含F(xiàn)d樣品，用10倍體積的0.02M Tris-HCl pH7.6緩沖液透析，更換3次透析液。隨后把透析脫鹽后的樣品，連同透析袋埋于聚乙二醇(PVP 4000)，放于冰箱，待透析袋中樣品體積濃縮5～10倍后取出，低溫貯存。
將本發(fā)明鐵氧還蛋白的分離方法制取的Fd用以下實(shí)驗(yàn)(1)Fd的氧化還原吸收光譜取0.3ml Fd用0.02M·L-1Tris-HCl pH7.6緩沖液將樣品稀釋10倍，在島津UV-3000分光光度計(jì)上掃描吸收光譜?？稍?63nm處看到Fdox的特征吸收峰，此為氧化型Fd的吸收光譜。在Fd樣品比色杯中放入一小粒硼氫化鈉(強(qiáng)還原劑)，再掃描吸收光譜，此時(shí)463nm處吸收峰消失，此為還原型Fd的吸收光譜(圖1)。表明樣品具有Fd吸收光譜的典型特征。(2)需Fd的離體葉綠體NADP光還原將用菠菜葉片制備的離體葉綠體，放在含有0.05 mol·L-1Tris-HclpH7.6,5mmol·L-1MgCl2,10mmol·L-1NaCl,0.1mmol·L-1NADP的3ml反應(yīng)液中，反應(yīng)液中葉綠體含量為20μg葉綠素。分別置于兩個(gè)石英比色杯中，其中一個(gè)比色杯中加入20μlFd作為樣品，另一為對(duì)照。先在340nm處比色讀OD值。再把樣品杯置于光下定時(shí)照光，光源用白熾燈或鹵素?zé)簦⒂?0cm厚的玻璃水缸隔熱。每照光半分鐘后立即測(cè)OD值變化。從圖2可以看到，含F(xiàn)d的一組在340nm處的光密度值會(huì)隨著照光的進(jìn)程而上升，表示有NADP還原，而不含F(xiàn)d的一組，僅有微小上升，這可能是離體葉綠體制劑中殘留的內(nèi)源Fd引起。根據(jù)光暗的OD差值即可算出NADP的光還原速率。見圖2。
從上述結(jié)果表明本發(fā)明分離方法制備的Fd為粗制品，其純度雖不能與商品Fd相比，但對(duì)測(cè)定離體葉綠體NADP還原實(shí)驗(yàn)來說，反而比純化的Fd有利，因?yàn)樵诜茄h(huán)光合電子傳遞鏈上，還原的Fd向NADP傳遞電子時(shí)，還需要Fd-NADP還原酶(FNR)的催化，如果Fd很純，則反應(yīng)系統(tǒng)中還需要另加FNR，而本發(fā)明分離方法的Fd制劑中，恰好殘留有FNR等黃素蛋白，這對(duì)NADP光還原反應(yīng)的進(jìn)行是有利的，這進(jìn)一步說明了本發(fā)明的積極效果。
權(quán)利要求
1．一種鐵氧還蛋白的簡易分離方法(一)用菠菜葉預(yù)先深凍(-20℃)，室溫下解凍，使細(xì)胞凍融破裂，加入Tris-HCI 0.01M pH7.3緩沖液，搗碎凍融葉片，紗布和尼龍布過濾，(二)濾液中加入深冷(-20℃)丙酮，使之濃度到35％丙酮。經(jīng)5000×g離心，把沉淀?xiàng)壢ァＴ陔x心后的上層液中繼續(xù)加入深冷丙酮，使之濃度達(dá)到75％靜止后，使沉淀沉降，吸去部分上清液后，余留帶有沉淀的75％濃度丙酮溶液，經(jīng)5000×g離心，收集沉淀，用冷風(fēng)吹干殘留沉淀中的丙酮，并使懸浮于0.01 M Tris-HCI pH7.3緩沖液，對(duì)同樣緩沖液透析，再經(jīng)18000×g離心20分鐘，紅棕色的上層液為含F(xiàn)d的粗制品，(三)在紅棕色的樣品中加入固體NaCl，使之成0.15MNaCl濃度，并把它吸附到預(yù)先經(jīng)0.01M Tris-HCI pH7.3和0.15MNaCl平衡過的DEAE-纖維素(D-52)分離柱上，以同樣的緩沖液洗柱，未被吸附的樣品流棄，深棕紅色的Fd吸附帶呈現(xiàn)在分離柱的上端，再分次提高洗脫緩沖液中的NaCl濃度以0.2M、0.25M、0.3M……，同時(shí)觀察分離柱的上端Fd移動(dòng)的情況，直到提高NaCl濃度到棕紅色吸附帶開始下降移動(dòng)，就不再提升NaCl濃度，繼續(xù)洗脫，并收集出棕紅色的Fd制劑，(四)將收集的Fd溶液，對(duì)不含NaCl的0.01M Tris-HCI透析脫鹽，濃縮保存、備用，其特征在于省略了第二步，不再用35％～75％的丙酮分級(jí)沉淀，而直接用DEAE-纖維素吸附蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種植物鐵氧還蛋白的簡易分離方法。鐵氧還蛋白是普遍存在于植物體內(nèi)的一種低分子量具有氧化還原性質(zhì)的蛋白,它參與光合作用和生物固氮等生理活動(dòng)。是一種重要的生物化學(xué)試劑。傳統(tǒng)的分離方法需耗用大量的丙酮,本發(fā)明提供一種省略丙酮的分離步驟,解決由于使用丙酮帶來工藝上的困難。產(chǎn)品適用于對(duì)鐵氧還蛋白純度要求不是很高的生化反應(yīng),對(duì)于光合電子傳遞的離體實(shí)驗(yàn),由于某些成分未被分離,反而有利反應(yīng)進(jìn)行。
文檔編號(hào)C07K1/22GK1323801SQ0111260
公開日2001年11月28日 申請(qǐng)日期2001年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月17日
發(fā)明者葉濟(jì)寧 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院上海植物生理研究所