一種使用dna納米結構對疏水性納米粒子相轉換的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物分析W及生物醫(yī)學應用領域，具體設及合成一種含有適配體的 DNA納米結構，并將該DNA納米結構用于疏水性納米粒子的相轉換。
【背景技術】
[0002] 疏水性納米顆粒具有特殊的物理和化學性質，隨著納米科學與技術的發(fā)展，它們 在生物醫(yī)生上的潛在應用價值，引起了各相關領域研究者的關注，例如生物傳感，細胞成像 和癌癥治療等。氧化鐵納米顆粒的高磁敏性、化學穩(wěn)定性和低毒性已被深入研究，運些特性 使得它不僅可W用作磁共振成像的巧t影劑，而且在藥物遞送，細胞追蹤W及磁熱療等方 面也得到廣泛應用。
[0003] 當前，商業(yè)化的納米粒子通常是在水介質中通過共沉淀的方法合成，但是由于水 的沸點低，導致運種條件合成的納米粒子尺寸范圍分布較廣且結晶性能較差。為了制備高 質量且顆粒尺寸分布均勻的納米粒子，很多高沸點的非極性溶劑被用作制備納米顆粒的反 應介質。但是，納米粒子用非極性溶劑合成常常包裹疏水性配體，運些配體不溶于水，導致 氧化鐵納米粒子在生物應用上受到限制。
[0004] 一般方法合成的納米粒子水溶性和生物相容性都較差，且容易團聚，運就使得它 們需要進行表面修飾和功能化之后，才能滿足生物醫(yī)學應用上的要求。最近，很多相轉換試 劑通過配體交換的方法來進行疏水性納米粒子的相轉換，比如二琉基下二酸，硅烷等。通過 相轉換方法將疏水性納米粒子轉換成親水性納米粒子，一般都是單功能的，它們必須與生 物基團結合進行進一步的表面功能化修飾才具有分子識別的功能，運樣就使整個過程變得 繁瑣費時。因此，發(fā)展一種溫和而通用的疏水性納米粒子的相轉換方法，并且實現(xiàn)納米粒子 表面生物功能化成為一個迫切的需求。本發(fā)明提供的相轉換方法在進行疏水性納米粒子轉 換成親水性納米粒子的同時也對納米粒子進行表面生物功能化，方法快速簡便。
[0005] 1990年，Seeman和Mirkin等首先合成功能化的DNA納米結構，很快就掀起了人們 對DNA功能化的興趣。通過DNA自組裝可W形成不同形狀和結構的分子，其中，Ξ維的DNA 四面體納米結構具有極好的機械硬度和結構穩(wěn)定性。DNA四面體結構類似金字塔，四個面均 為Ξ角形，六條邊由雙鏈DNA組成，可W通過四條單鏈DNA退火而迅速自組裝起來，而且每 個頂點都可W用化學基團或者生物分子進行功能化修飾。利用運些特性，DNA四面體在傳 感構建器，藥物遞送W及分子邏輯學上有著廣泛的應用范圍。本發(fā)明將DNA納米結構作為 相轉換試劑進行疏水性納米粒子的相轉換，在國內(nèi)外有關DNA納米結構方面的文獻和專利 中，還未有用DNA納米結構進行疏水性納米粒子相轉換的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明目的在于制備高質量且顆粒尺寸分布均勻的納米粒子，提供了一種使用 DNA納米結構對疏水性納米粒子相轉換的方法。本發(fā)明克服了現(xiàn)有相轉換試劑單功能的不 足，成功對疏水性納米粒子進行表面生物功能化，轉換后的親水性納米粒子具有祀向功能， 可w提高被細胞攝取的能力，用于細胞成像。
[0007] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案： 一種使用DNA納米結構對疏水性納米粒子進行相轉換的簡易方法的具體步驟為： (1)制備含有適配體的DNA四面體溶液：用緩沖液將等量的DNA鏈A，B，C，D混合，加熱 到95°C，然后迅速冷卻到4°C，制得DNA四面體溶液。
[0008] 其中，所述DNA鏈A、B、C、D序列如SEQIDNO. 1-4所示；所述緩沖液為TM緩沖 液。DNA包括Ξ條具有簇基修飾的DNA鏈(鏈A，B，C)和一條含有適配體序列的DNA鏈(鏈 D)(具體序列見表1)。鏈D含有的適配體序列可W特異性結合在癌細胞膜表面高表達的核 仁蛋白，從而提高了被細胞攝取的能力，并使帶有磁性納米粒子功能化的DNA四面體對癌 細胞具有祀向能力。
[0009] (2)合成DNA四面體功能化的親水性納米粒子：步驟（2)所述合成DNA四面體功 能化的親水性納米粒子具體操作為：將0. 2ml10〇μκ/ιΛ疏水性納米粒子與步驟（1)制得的 0. 2mLΙΟμΜDNA四面體溶液混合，放在4°C下劇烈震蕩1化后，移去有機溶劑，離屯、洗涂，即 得到分散在水溶液中的親水性納米粒子。所述的疏水性納米粒子為氧化鐵納米粒子或稀± 上轉換發(fā)光納米粒子。所述的疏水性納米粒子是分散在有機溶劑中的，其中：氧化鐵納米粒 子分散在氯仿中，稀±上轉換發(fā)光納米粒子分散在環(huán)乙燒中。
[0010] (3)W分散在氯仿中被油酸包裹的氧化鐵納米粒子為例，推測機理為：DNA四面體 的Ξ個頂點存在簇基，簇基對氧化鐵納米粒子表面的Ξ價鐵粒子具有強親和力，因此，DNA 四面體納米結構可W通過配體交換與油酸包裹的氧化鐵納米粒子牢牢結合，從而使顆粒具 有水溶性。
[0011] 本發(fā)明的顯著優(yōu)點在于： 本發(fā)明將DNA納米結構作為相轉換試劑，不僅無毒高效，而且在進行相轉換的同時也 完成了對納米粒子的表面功能修飾，快速簡便，轉換后的親水性納米粒子不僅具有祀向功 能，而且提升了被細胞攝取的能力。
[0012] 本發(fā)明使用DNA納米結構發(fā)展了一種簡易而普遍的方法用于相轉換的同時也將 疏水性納米粒子進行了表面生物功能化。所設計的DNA四面體納米結構不僅可W將氧化鐵 納米粒子從有機相拖到水相，而且給予了它們特殊的祀向性。值得關注的是，該方法基本上 可W適用于不同類型的疏水性納米粒子，比如上轉換稀±納米粒子。此外，功能核酸比如適 配體，DNAzymes，siRNA，或反義DNA都可W很容易被修飾到所要的四面體DNA納米結構中去 構建多功能的相轉換試劑?；谶\些顯著的優(yōu)點，本發(fā)明提供的相轉換方法將為擴大疏水 性納米粒子在生物醫(yī)學上的應用提供一個新的機遇。
【附圖說明】
[0013] 圖1為12. 5%聚丙締酷胺凝膠電泳分析圖。
[0014] 圖2 (a)為相轉換之前氧化鐵納米粒子分散在氯仿中的透射電鏡圖；（b)為相轉 換之后氧化鐵納米粒子分散在水中的透射電鏡圖；（C)相轉換前后氧化鐵納米粒子在溶劑 中的分散性。（d)相轉換后親水性氧化鐵納米粒子的磁分離現(xiàn)象。
【具體實施方式】
[0015] 為了驗證設計的可行性，下面結合【具體實施方式】對本發(fā)明所述的技術方案做進一 步的說明，但是本發(fā)明應用不僅限于此。
[001引實施例1 合成功能化的DNA四面體 將DNA鏈A，B，C和D在TM緩沖液（10mlTris-肥l，50mMMgClz，抑8. 0)中等摩爾混 合，終濃度為10μΜ。將DNA混合后加熱到95°C再迅速冷卻到4°C，即可得到含有適配 體的DNA四面體溶液。通過聚丙締酷胺凝膠電泳可驗證已形成DNA四面體納米結構（見圖 1)。
[0017] 表1本發(fā)明所用到的DNA序列詳細信息
實施例2 分散在氯仿中的氧化鐵磁性納米粒子的相轉換 將含有100μκ/ηΙ氧化鐵納米粒子的0.2mL氯仿溶液(從美國大洋納米科技公司 (Springdale,AR，USA)購買)緩慢加入0.2血含有10μΜDNA四面體溶液中，混合液劇烈 震蕩反應12h之后，氧化鐵納米粒子就從氯仿層轉到水層。然后將水溶液移到微型管中， 用TM緩沖液離屯、分離洗涂后，重新分散在TM緩沖液中即得水溶性氧化鐵納米粒子。
[0018] 附圖2曰、化是相轉換前后氧化鐵納米顆粒的透射電子顯微鏡圖。附圖2c是相轉 換前后的氧化鐵納米粒子在氯仿中和在水中的分散圖，附圖2d是相轉換后氧化鐵納米粒 子在水溶液中的磁性分離現(xiàn)象圖。
[001引 實施例3 分散在環(huán)己燒中的稀±上轉換發(fā)光納米粒子的相轉換 將含有100μκ/ιΛ稀±上轉換發(fā)光納米粒子的0. 2mL環(huán)乙燒溶液緩慢加入0. 2mL包 含10μΜDNA四面體的水溶液中，混合液劇烈攬拌12h之后，稀±上轉換發(fā)光納米粒子就 從環(huán)乙燒層轉到水層了，將水層溶液轉移到微型管中。多余的DNA四面體通過離屯、分離和 洗涂后，從親水性稀±上轉換發(fā)光納米粒子水溶液中移出。最后，將親水性稀±上轉換發(fā)光 納米粒子重新分散在TM緩沖液中即得分散在水溶液中的稀±上轉換發(fā)光納米粒子。
[0020] W上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與 修飾，皆應屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【主權項】
1. 一種使用DNA納米結構對疏水性納米粒子相轉換的方法，其特征在于：將DNA四面 體納米結構作為相轉換試劑，與不能在水溶液中分散的疏水性納米粒子充分混合震蕩后， 即將疏水性納米粒子轉換成親水性納米粒子。2. -種使用DNA納米結構對疏水性納米粒子相轉換的方法，其特征在于：具體步驟 為： (1) 制備含有適配體的DNA四面體溶液； (2) 合成DNA四面體功能化的親水性納米粒子。3. 根據(jù)權利要求2所述的使用DNA納米結構對疏水性納米粒子相轉換的方法，其特征 在于：步驟（1)所述制備含有適配體的DNA四面體溶液，具體操作為：用緩沖液將等摩爾的 DNA鏈A、B、C、D混合，加熱到95°C，然后迅速冷卻到4°C，制得DNA四面體溶液。4. 根據(jù)權利要求3所述的使用DNA納米結構對疏水性納米粒子相轉換的方法，其特征 在于：所述DNA鏈A、B、C、D序列如SEQIDNO. 1-4所示；所述緩沖液為TM緩沖液。5. 根據(jù)權利要求2所述的使用DNA納米結構對疏水性納米粒子相轉換的方法，其特 征在于：步驟（2)所述合成DNA四面體功能化的親水性納米粒子具體操作為：將0. 2ml lOOPg/mL疏水性納米粒子與步驟（1)制得的0. 2mL1〇μΜDNA四面體溶液混合，放在4°C下 劇烈震蕩12h后，移去有機溶劑，離心洗滌，即得到分散在水溶液中的親水性納米粒子。6. 根據(jù)權利要求5所述的使用DNA納米結構對疏水性納米粒子相轉換的方法，其特征 在于：所述的疏水性納米粒子為氧化鐵納米粒子或稀土上轉換發(fā)光納米粒子。7. 根據(jù)權利要求5所述的使用DNA納米結構對疏水性納米粒子相轉換的方法，其特征 在于：所述的疏水性納米粒子是分散在有機溶劑中的，其中：氧化鐵納米粒子分散在氯仿 中，稀土上轉換發(fā)光納米粒子分散在環(huán)乙烷中。
【專利摘要】疏水性納米粒子在生物分析以及生物醫(yī)學應用上具有巨大的潛能，本發(fā)明提供了一個簡易的方法，使用DNA納米結構作為相轉換試劑，該DNA納米結構是由四條單鏈DNA自組裝而形成的DNA四面體結構，其中三條鏈末端修飾羧基，另外一條單鏈DNA含有適配體，該適配體可以特異性結合癌細胞膜表面高表達的核仁蛋白，從而增加了納米粒子的靶向能力并且提高了細胞的攝取能力。使用DNA四面體作為相轉換試劑，不僅無毒，方便，而且只需進行簡單的分離，便可制得穩(wěn)定性高和分散性好的親水性納米粒子。
【IPC分類】C01G49/06
【公開號】CN105366730
【申請?zhí)枴緾N201510834218
【發(fā)明人】許小平, 吳淑賢, 楊黃浩, 李娟 , 洪誠毅
【申請人】福州大學
【公開日】2016年3月2日
【申請日】2015年11月26日