一種蛹蟲(chóng)草發(fā)酵液體培養(yǎng)基及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種提高蛹蟲(chóng)草發(fā)酵液中蟲(chóng)草素含量的液體培養(yǎng)基及其制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]蟲(chóng)草素是蟲(chóng)草中主要的活性成分之一。蟲(chóng)草素具有多種生物學(xué)活性，如抗腫瘤、抗增殖、抗轉(zhuǎn)移、抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)和抗炎等。蟲(chóng)草素的制備主要有化學(xué)合成和生物合成兩種方式。由于目前化學(xué)合成蟲(chóng)草素生產(chǎn)成本高，合成工藝復(fù)雜，收率低，產(chǎn)物純化比較難，所以蟲(chóng)草素主要由生物合成法制備。生物合成法制備蟲(chóng)草素有兩種途徑:一是固體發(fā)酵獲得蟲(chóng)草子實(shí)體，再?gòu)闹刑崛。欢峭ㄟ^(guò)蟲(chóng)草液體發(fā)酵，從發(fā)酵液中直接提取。由于液體發(fā)酵比固體發(fā)酵在發(fā)酵規(guī)模、菌體生長(zhǎng)速率、生長(zhǎng)密度以及可控性上的優(yōu)勢(shì)，蟲(chóng)草液體發(fā)酵提取蟲(chóng)草素成為主要的蟲(chóng)草素制備方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種提高蛹蟲(chóng)草發(fā)酵液中蟲(chóng)草素含量的液體培養(yǎng)基。
[0004]本發(fā)明還要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供上述液體培養(yǎng)基的制備方法。
[0005]本發(fā)明最后要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供上述液體培養(yǎng)基的應(yīng)用。
[0006]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
[0007]一種蛹蟲(chóng)草發(fā)酵液體培養(yǎng)基，它包括葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、吐溫和水的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，它還包括腺嘌呤和甘油酯。
[0008]其中，腺嘌呤濃度為4.05?6.76g/L，優(yōu)選5g/L，腺嘌呤濃度的計(jì)算基準(zhǔn)為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的體積。
[0009]其中，所述的甘油酯為花生油、玉米油、大豆油、亞麻油、芝麻油、菜籽油、棉籽油、葵花籽油、紅花籽油、橄欖油和三油酸甘油酯中的任意一種或幾種的混合物；優(yōu)選甘油酯為不飽和脂肪酸含量最高的甘油酯；最優(yōu)選亞麻油。
[0010]其中，甘油酯加入量為高出基礎(chǔ)培養(yǎng)基液面2?3mm，優(yōu)選2.2mm。
[0011]其中，所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方優(yōu)選為:葡萄糖40?50g/L，酵母膏3?10g/L，蛋白胨5?15g/L，磷酸二氫鉀0.2?1.0g/L，磷酸氫二鉀0.2?1.0g/L，硫酸鎂0.2?1.0g/L，吐溫800.5?5.0g/L,溶劑為水，ρΗ5.5?6.0。
[0012]所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方最優(yōu)選為:葡萄糖42g/L，酵母膏6g/L，蛋白胨10g/L，磷酸二氫鉀0.5g/L，磷酸氫二鉀0.5g/L，硫酸鎂0.5g/L，吐溫802g/L，溶劑為水，pH5.8。
[0013]上述蛹蟲(chóng)草發(fā)酵液體培養(yǎng)基的制備方法，它包括如下步驟:
[0014]I)配制基礎(chǔ)培養(yǎng)基；
[0015]2)將步驟I)中的基礎(chǔ)培養(yǎng)基倒入發(fā)酵容器內(nèi)，加入腺嘌呤，再加入甘油酯，經(jīng)高壓蒸汽滅菌，即得。
[0016]其中，腺嘌呤濃度為4.05?6.76g/L ;甘油酯加入量為高出基礎(chǔ)培養(yǎng)基液面2?3mm ο
[0017]上述蛹蟲(chóng)草發(fā)酵液體培養(yǎng)基在發(fā)酵生產(chǎn)蟲(chóng)草素中的應(yīng)用也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0018]其中，在上述蛹蟲(chóng)草發(fā)酵液體培養(yǎng)基中接種蛹蟲(chóng)草，對(duì)于每IL培養(yǎng)基中接種濃度為5.0X 106-8.0X 16個(gè)/ml (優(yōu)選7.0X10 6個(gè)/ml)的蛹蟲(chóng)草孢子懸液50ml，置于搖床中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為22?27°C (優(yōu)選25°C )，搖床轉(zhuǎn)速為150?180r/min (優(yōu)選160r/min)，培養(yǎng)時(shí)間為21?28d(優(yōu)選25d)。
[0019]所述的蛹蟲(chóng)草為具備發(fā)酵生產(chǎn)蟲(chóng)草素能力的蛹蟲(chóng)草，例如可以是中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心的蛹蟲(chóng)草(編號(hào)為CICC 14014)。
[0020]通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研和研宄發(fā)現(xiàn)蟲(chóng)草素的直接前體是腺嘌呤，而蟲(chóng)草素的另一個(gè)結(jié)構(gòu)單元是3’ -脫氧核糖。在蛹蟲(chóng)草發(fā)酵中，我們發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入腺嘌呤能大大提高蟲(chóng)草素產(chǎn)量。而且，我們還發(fā)現(xiàn)加入植物油后蛹蟲(chóng)草發(fā)酵液中的蟲(chóng)草素含量又有進(jìn)一步升高。
[0021]蛹蟲(chóng)草傳統(tǒng)培養(yǎng)方法是應(yīng)用葡萄糖、蛋白胨和酵母膏為主要成分的發(fā)酵培養(yǎng)基。這些成分只能滿足蛹蟲(chóng)草基本的生長(zhǎng)和發(fā)育需要，蟲(chóng)草素產(chǎn)量較低。而加入腺嘌呤后提供了一定的蟲(chóng)草素前體，使得蟲(chóng)草素產(chǎn)量有所提高。但是3’ -脫氧核糖單元是通過(guò)脂肪酸代謝途徑，經(jīng)乙酰CoA，再經(jīng)過(guò)次級(jí)代謝途徑合成的，這與先前理解的3’ -脫氧核糖是通過(guò)磷酸戊糖途徑合成的有差別。因此，在缺乏乙酰CoA供給的條件下，蟲(chóng)草素含量很難再提高。而植物油等甘油酯在蛹蟲(chóng)草中通過(guò)脂肪酸代謝能夠分解為大量的乙酰CoA，進(jìn)而能夠進(jìn)一步提高蟲(chóng)草素的產(chǎn)量。
[0022]有益效果:本發(fā)明提供的蛹蟲(chóng)草液體培養(yǎng)基和發(fā)酵方法能夠極大地提高蛹蟲(chóng)草發(fā)酵液中蟲(chóng)草素的產(chǎn)量，利用本發(fā)明方法培養(yǎng)蛹蟲(chóng)草發(fā)酵液中的蟲(chóng)草素含量比用傳統(tǒng)法方法培養(yǎng)的蟲(chóng)草素含量增加50% -87.5%。
【附圖說(shuō)明】
[0023]圖1為不同培養(yǎng)基對(duì)蟲(chóng)草素含量的影響圖，其中橫坐標(biāo)I為實(shí)施例4，2為實(shí)施例5，3為實(shí)施例6，4為對(duì)比例1，5為對(duì)比例2，6為對(duì)比例3，縱坐標(biāo)代表培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)得的發(fā)酵液中蟲(chóng)草素含量。
【具體實(shí)施方式】
[0024]以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0025]若未特別指明，以下實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0026]實(shí)施例1:蛹蟲(chóng)草發(fā)酵培養(yǎng)基制備。
[0027]I)按照如下配方:葡萄糖42g/L，酵母膏6g/L，蛋白胨10g/L，磷酸二氫鉀0.5g/L，磷酸氫二鉀0.5g/L，硫酸鎂0.5g/L，吐溫802.0g/L,溶劑為水，充分?jǐn)嚢枞芙夂笳{(diào)節(jié)溶液pH值5.8，制得發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基水相。
[0028]2)將步驟I)中的發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基水相分裝到250ml三角瓶?jī)?nèi)，每瓶50ml，加入0.25g腺嘌呤，再加入2.2mm液面高度的花生油、玉米油、大豆油、亞麻油、芝麻油、菜籽油、棉籽油、葵花籽油、紅花籽油、橄欖油等量混合的甘油酯，經(jīng)高壓蒸汽滅菌，得到高產(chǎn)蟲(chóng)草素蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基。
[0029]實(shí)施例2:蛹蟲(chóng)草發(fā)酵培養(yǎng)基制備。
[0030]I)按照如下配方:葡萄糖42g/L，酵母膏6g/L，蛋白胨10g/L，磷酸二氫鉀0.5g/L，磷酸氫二鉀0.5g/L，硫酸鎂0.5g/L，吐溫805.0g/L,溶劑為水，充分?jǐn)嚢枞芙夂笳{(diào)節(jié)溶液pH值6.0，制得發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基水相。
[0031]2)將步驟I)中的發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基水相分裝到250ml三角瓶?jī)?nèi)，每瓶50ml，加入
0.2025g腺嘌呤，再加入3.0mm液面高度的三油酸甘油酯，經(jīng)高壓蒸汽滅菌，得到高產(chǎn)蟲(chóng)草素蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基。
[0032]實(shí)施例3:蛹蟲(chóng)草發(fā)酵培養(yǎng)基制備。
[0033]I)按照如下配方:葡萄糖42g/L，酵母膏6g/L，蛋白胨10g/L，磷酸二氫鉀0.5g/L，磷酸氫二鉀0.5g/L，硫酸鎂0.5g/L，吐溫800.5g/L，溶劑為水，充分?jǐn)嚢枞芙夂笳{(diào)節(jié)溶液pH值5.5，制得發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基水相。
[0034]2)將步驟I)中的發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基水相分裝到250ml三角瓶?jī)?nèi)，每瓶50ml，加入
0.3380g腺嘌呤，再加入2.0mm液面高度的亞麻油，經(jīng)高壓蒸汽滅菌，得到高產(chǎn)蟲(chóng)草素蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)基。
[0035]實(shí)施例4:蛹蟲(chóng)草發(fā)酵培養(yǎng)基在提高蛹蟲(chóng)草發(fā)酵液中蟲(chóng)草素含量上的應(yīng)用。
[0036]1、從中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心購(gòu)買的蛹蟲(chóng)草菌種(編號(hào):CICC14014)保藏在安瓿管中，處于凍干狀態(tài)，在實(shí)驗(yàn)之前需要恢復(fù)菌種活性。在超凈工作臺(tái)中，用浸過(guò)70%酒精的脫脂棉擦凈安瓿管，使安瓿管頂端在火焰上加熱，向加熱處滴幾滴無(wú)菌水使玻璃開(kāi)裂。用鑷子敲下已開(kāi)裂的安瓿管頂端，加入0.5ml 0.9%的生理鹽水，振蕩使凍干菌體溶解并呈懸浮狀。取0.2ml菌體懸浮液加至斜面培養(yǎng)基中，25°C恒溫培養(yǎng)7d。再加入5ml
0.9%的生理鹽水，振蕩后收集孢子懸液，稀釋調(diào)整濃度為7.0X 16個(gè)/ml。
[0037]2、蛹蟲(chóng)草菌種搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)
[0038]將2.5ml孢子懸液接種至實(shí)施例1制得的培養(yǎng)基中，在溫度25°C，160r/min條件下振蕩培養(yǎng)25d。
[0039]實(shí)施例5:蛹蟲(chóng)草發(fā)酵培養(yǎng)基在提高蛹蟲(chóng)草發(fā)酵液中蟲(chóng)草素含量上的應(yīng)用。
[0040]1、從中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心購(gòu)買的蛹蟲(chóng)草菌種(編號(hào):CICC14014)保藏在安瓿管中，處于凍干狀態(tài)，在實(shí)驗(yàn)之前需要恢復(fù)菌種活性。在超凈工作臺(tái)中，用浸過(guò)70%酒精的脫脂棉擦凈安瓿管，使安瓿管頂端在火焰上加熱，向加熱處滴幾滴無(wú)菌水使玻璃開(kāi)裂。用鑷子敲下已開(kāi)裂的安瓿管頂端，加入0.5ml 0.9%的生理鹽水，振蕩使凍干菌體溶解并呈懸浮狀。取0.2ml菌體懸浮液加至斜面培養(yǎng)基中，25°C恒溫培養(yǎng)7d。再加入5ml
0.9%的生理鹽水，振蕩后收集孢子懸液，稀釋調(diào)整濃度為6.0X 16個(gè)/ml。