本發(fā)明屬于納米材料和生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種單層包覆的水溶性超順磁性四氧化三鐵納米粒子的制備方法，屬于生物醫(yī)學領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

納米技術(shù)是指在納米范圍內(nèi)研究物質(zhì)的結(jié)構(gòu)及其變化規(guī)律，并應(yīng)用于生產(chǎn)生活之中的技術(shù)。納米粒子也叫超微顆粒，一般是指尺寸在1-100nm之間的粒子，是處在原子簇和宏觀物體交界的過渡區(qū)域，從通常的關(guān)于微觀和宏觀的觀點看，這樣的系統(tǒng)既非典型的微觀系統(tǒng)亦非典型的宏觀系統(tǒng)，是一種典型介觀系統(tǒng)。納米材料處于從單個原子到塊體材料的過渡區(qū)，因而造成了其表面電子結(jié)構(gòu)和晶體結(jié)構(gòu)變異，從而使得其具有區(qū)別塊材的特殊效應(yīng)，如小尺寸效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)等納米效應(yīng)，使得它們在磁、光、電、敏感等方面呈現(xiàn)出常規(guī)材料不具備的顯著特征，從而在磁性材料、電子材料、光學材料、高致密度材料的燒結(jié)、催化、傳感、陶瓷增韌等許多領(lǐng)域呈現(xiàn)廣闊的應(yīng)用前景。

近年來，磁性納米材料由于其特殊的物理化學性能在磁共振成像(mri)、磁流體、催化和生物工程/生物醫(yī)藥等應(yīng)用方面得到研究人員的廣泛關(guān)注。四氧化三鐵(fe3o4)納米粒子是近年來發(fā)展一種新型納米材料，由于其獨特的磁學特性：超順磁性和高矯頑力，同時因其具有小尺寸效應(yīng)、良好的磁導向性、低毒性和良好的生物相容性等特點，廣泛應(yīng)用于mri及藥物靶向等生物醫(yī)學領(lǐng)域，并表現(xiàn)出巨大的潛力。目前，磁性氧化鐵納米粒子的合成方法有很多種，一般分為減小尺寸法(球磨法)、液相沉淀法、高溫熱解法、微生物法(趨磁菌培養(yǎng))等。fe3o4納米粒子的粒徑大小、晶型以及磁飽和強度對其應(yīng)用有著直接或間接影響，因而制備出具備組分均勻、形貌均一、尺寸分布窄以及可控等特點的高性能磁性納米材料是其在生物和醫(yī)學領(lǐng)域應(yīng)用的前提，這使得fe3o4納米粒子的合成與修飾具有重要意義。相對于其他的fe3o4納米粒子制備方法，高溫熱解法制備出的磁性納米粒子具有晶型較好、分散性好、粒徑分布均一的特點，但是其水溶性較差，從而限制了它在生物醫(yī)學等領(lǐng)域的應(yīng)用。為了得到理想的功能化磁性納米顆粒，對合成的納米顆粒進行表面修飾改性以提高其在水溶液中的分散穩(wěn)定性就顯得十分必要。近年來，許多研究工作者都嘗試用不同的方法對fe3o4納米粒子進行修飾，以提高納米粒子的水溶性、分散性、穩(wěn)定性和生物相容性，比如prakash等人用脂肪酸對油溶性的fe3o4納米粒子進行修飾，在形成雙層納米晶體的過程中，脂肪酸的碳鏈端朝向fe3o4納米粒子表面原有的油性鏈，而其親水端朝向水溶液，最終在納米粒子表面形成第二層涂覆層，同時修飾后的納米粒子具有良好的水分散性。xu等人用帶有雙官能團的二巰基琥珀酸(dmsa)對油溶性fe3o4納米粒子表面的油酸進行配體交換，使納米粒子由油相轉(zhuǎn)化為水相。

作為一種天然生物活性多糖類化合物，肝素是獲得美國食品藥品管理局(fda)認證的最有效、使用最廣泛的抗凝血藥物之一。肝素(heparin)于1935年首先被提純并命名，同年作為抗凝劑應(yīng)用于治療血栓性疾病，主要是由硫酸-d-葡萄糖胺、硫酸-d-艾杜糖醛酸和d-葡萄糖醛酸中兩種雙糖單位交替連接而成，是分子量為4～40kda的混合物。除了抗凝血作用，肝素分子中還含有與多種生長因子結(jié)合的位點，能夠促進生長因子對細胞增殖、組織或器官修復和再生的作用。因此，近年來，肝素功能化生物材料受到極大關(guān)注。

由于羧基對氧化鐵納米粒子表面的結(jié)合能力較強，為了將肝素更好的包覆在納米粒子表面，該發(fā)明首先用琥珀酸酐對肝素進行酯化以增加肝素結(jié)構(gòu)中的羧基，然后將該琥珀酰肝素對油溶性fe3o4納米粒子進行修飾，以提高納米粒子的水溶性、分散性、穩(wěn)定性和生物相容性。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明擬解決的技術(shù)問題是提供一種單層包覆的水溶性超順磁性四氧化三鐵納米粒子的制備方法，首先采用高溫熱分解法合成超順磁性四氧化三鐵納米粒子，并用帶大量羧基的多齒聚合物對得到的油溶性四氧化三鐵納米粒子進行表面修飾，制備出在水中具有良好分散性的超順磁性四氧化三鐵納米粒子。本發(fā)明產(chǎn)品采用的琥珀酰肝素具有較好的親水性和生物相容性等優(yōu)異性能，可以在對納米粒子粒徑影響較小的情況下，

有效提高四氧化三鐵納米粒子的水溶性、分散性、穩(wěn)定性和生物相容性。

本發(fā)明產(chǎn)品由如下步驟制備：

1.高溫熱解法制備四氧化三鐵納米粒子參照文獻[sun，shouheng，andhaozeng.″size-controlledsynthesisofmagnetitenanoparticles.″journaloftheamericanchemicalsociety124.28(2002)：8204-8205.]。

2.琥珀酰肝素的制備：參照文獻[wang，ying，etal.″target-specificcellularuptakeoftaxol-loasedheparin-peg-folatenanoparticles.″biomacromolecules11.12(2010)：3531-3538.]。

3.單層包覆的水溶性超順磁性四氧化三鐵納米粒子的制備：將1mg-100mg(1)步驟所得的超順磁性四氧化三鐵納米粒子溶于10ml-500ml干燥溶劑三氯甲烷中，并將1mg-500mg(2)步驟所得的琥珀酰肝素的三丁基銨鹽加入到反應(yīng)液中，室溫下攪拌48h-96h后，用磁鐵分離，得到的黑色固體，用適量己烷和二氯甲烷分別洗滌1-5次，最后，將形成的單層包覆的水溶性超順磁性四氧化三鐵納米粒子保持于去離子水中，待用。

所述步驟3中超順磁性四氧化三鐵納米粒子與琥珀酰肝素的三丁基銨鹽的質(zhì)量比為1∶0.1-1∶100。

所述步驟3中超順磁性四氧化三鐵納米粒子的濃度為0.01mg/ml～10mg/ml。

所述步驟3中琥珀酰肝素的三丁基銨鹽的分子量為2000～20000。

所述步驟3中琥珀酰肝素的三丁基銨鹽可溶解于非極性有機溶劑-三氯甲烷中，并呈現(xiàn)良好的穩(wěn)定狀態(tài)。

所述步驟3中琥珀酰肝素的三丁基銨鹽的濃度為0.01mg/ml～10mg/ml。

(1)高溫熱解法制備油溶性超順磁性四氧化三鐵納米粒子：將0.1g-5.0g乙酰丙酮鐵，0.1g-5.0g油酸，0.1g-5.0g油胺和5ml-50ml二苯醚氮氣保護下混合攪拌均勻，并逐漸升溫至100℃-300℃，反應(yīng)0.5h-3h后，生成粒徑為一的超順磁性四氧化三鐵納米粒子，并用此方法，以小粒徑的四氧化三鐵納米粒子為種子制備粒徑為6nm-20nm的超順磁性四氧化三鐵納米粒子；

(2)琥珀酰肝素的制備：0.1g-1.0g的肝素鈉溶解在10ml-20ml水中，并將該溶液滲透通過酸化過的凝膠柱(h+形式，50ml-200ml)，之后用三丁胺溶液將溶液的ph調(diào)至6.0-7.0，將該溶液冷凍干燥，得到肝素的三丁基銨鹽(0.1g-2.0g)。該將三丁基銨鹽(0.1g-2.0g)溶解在5ml-40ml的干燥溶劑n，n二甲基甲酰胺(dmf)中，在氮氣下保護下，將0.1-5.0g琥珀酸酐，0.1g-5.0g三乙胺和0.01g-5.0g4-二甲基氨基嘌呤(dmap)依次加入反應(yīng)液，反應(yīng)在室溫下進行24h-72h后，將過量的溶劑蒸發(fā)掉，用適量的去離子水稀釋后，將該溶液滲透通過酸化過的凝膠柱(h⁺形式，50ml-200ml)，之后用三丁胺溶液將溶液的ph調(diào)至6.0-7.0，將該溶液冷凍干燥，得到琥珀酰肝素的三丁基銨鹽(0.1g-5.0g)；

(3)單層包覆的水溶性超順磁性四氧化三鐵納米粒子的制備：將1mg-100mg(1)步驟所得的超順磁性四氧化三鐵納米粒子溶于10ml-500ml干燥溶劑三氯甲烷中，并將1mg-500mg(2)步驟所得的琥珀酰肝素的三丁基銨鹽加入到反應(yīng)液中，室溫下攪拌48h-96h后，用磁鐵分離，得到的黑色固體，用適量己烷和二氯甲烷分別洗滌1-5次，最后，將形成的單層包覆的水溶性超順磁性四氧化三鐵納米粒子保持于去離子水中，待用。

具體實施方式

實施例1：

(1)高溫熱解法制備油溶性超順磁性四氧化三鐵納米粒子：將0.706g乙酰丙酮鐵，0.565g油酸，0.535g油胺和20ml二苯醚氮氣保護下混合攪拌均勻，并逐漸升溫至265℃，反應(yīng)1h后，生成粒徑為一的4nm超順磁性四氧化三鐵納米粒子，并用此方法，以小粒徑的四氧化三鐵納米粒子為種子制備粒徑為12nm的超順磁性四氧化三鐵納米粒子；

(2)琥珀酰肝素的制備：1.0g的肝素鈉溶解在5ml水中，并將該溶液滲透通過酸化過的凝膠柱(h+形式，200ml)，之后用三丁胺溶液將溶液的ph調(diào)至7.0，將該溶液冷凍干燥，得到肝素的三丁基銨鹽(1.5g)。該將三丁基銨鹽(1.5g)溶解在30ml的干燥溶劑n，n二甲基甲酰胺(dmf)中，在氮氣下保護下，將5.0g琥珀酸酐，0.5g三乙胺和1.0g4-二甲基氨基嘌呤(dmap)依次加入反應(yīng)液，反應(yīng)在室溫下進行48h后，將過量的溶劑蒸發(fā)掉，用適量的去離子水稀釋后，將該溶液滲透通過酸化過的凝膠柱(h⁺形式，200ml)，之后用三丁胺溶液將溶液的ph調(diào)至7.0，將該溶液冷凍干燥，得到琥珀酰肝素的三丁基銨鹽(2.0g)；

(3)單層包覆的水溶性超順磁性四氧化三鐵納米粒子的制備：將10mg(1)步驟所得的超順磁性四氧化三鐵納米粒子溶于50ml干燥溶劑三氯甲烷中，并將50mg(2)步驟所得的琥珀酰肝素的三丁基銨鹽加入到反應(yīng)液中，室溫下攪拌48h后，用磁鐵分離，得到的黑色固體，用適量己烷和二氯甲烷分別洗滌2次，最后，將形成的單層包覆的水溶性超順磁性四氧化三鐵納米粒子保持于去離子水中，待用。

實施例2：

(1)同實施例1；

(2)同實施例1；

(3)單層包覆的水溶性超順磁性四氧化三鐵納米粒子的制備：將20mg(1)步驟所得的超順磁性四氧化三鐵納米粒子溶于50ml干燥溶劑三氯甲烷中，并將50mg(2)步驟所得的琥珀酰肝素的三丁基銨鹽加入到反應(yīng)液中，室溫下攪拌72h后，用磁鐵分離，得到的黑色固體，用適量己烷和二氯甲烷分別洗滌2次，最后，將形成的單層包覆的水溶性超順磁性四氧化三鐵納米粒子保持于去離子水中，待用。

實施例3：

(1)高溫熱解法制備油溶性超順磁性四氧化三鐵納米粒子：將0.706g乙酰丙酮鐵，0.565g油酸，0.535g油胺和20ml二卞醚氮氣保護下混合攪拌均勻，并逐漸升溫至300℃，反應(yīng)3h后，生成粒徑為一的6nm超順磁性四氧化三鐵納米粒子，并用此方法，以小粒徑的四氧化三鐵納米粒子為種子制備粒徑為14nm的超順磁性四氧化三鐵納米粒子；同實施例1；

(2)單層包覆的水溶性超順磁性四氧化三鐵納米粒子的制備：將30mg(1)步驟所得的超順磁性四氧化三鐵納米粒子溶于40ml干燥溶劑三氯甲烷中，并將40mg(2)步驟所得的琥珀酰肝素的三丁基銨鹽加入到反應(yīng)液中，室溫下攪拌72h后，用磁鐵分離，得到的黑色固體，用適量己烷和二氯甲烷分別洗滌3次，最后，將形成的單層包覆的水溶性超順磁性四氧化三鐵納米粒子保持于去離子水中，待用。

例3中制備出的水溶性超順磁性四氧化三鐵納米粒子進行動態(tài)光散射測試，結(jié)果顯示多齒聚合物涂層的厚度僅為2nm，且該水溶性超順磁性四氧化三鐵納米粒子在水中的分散穩(wěn)定性高達6個月。