本發(fā)明涉及微生物肥料，具體地說，涉及一種提高酸性土壤磷素有效性的解磷誘導(dǎo)肥及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：
磷是植物生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)元素，也是限制作物產(chǎn)量的主要營養(yǎng)元素之一。南方地區(qū)紅壤自身嚴(yán)重缺磷，土壤中95％以上的磷為無效磷，植物很難利用。土壤缺磷和磷肥利用率低的狀況，使得糧食的大幅度增產(chǎn)總是伴隨著磷肥的大量投入，這不僅造成有限磷肥資源的浪費，也必然導(dǎo)致田徑流中磷濃度的提高，引起水體的富營養(yǎng)化，造成環(huán)境的污染。因此，尋求溶解土壤中作物難以利用磷的途徑和方法，提高磷肥利用率，對農(nóng)業(yè)的持續(xù)發(fā)展和生態(tài)系的維護(hù)，都具有重要的意義。溶磷菌(Phosphate～solubilizingmicroorganisms，PSM)是土壤中一種特殊的微生物類群，能夠?qū)⒅参镫y以吸收利用的磷轉(zhuǎn)化為可吸收利用的形態(tài)。解磷微生物包括解磷細(xì)菌、解磷真菌、放線菌等多種類群的微生物。目前人們研究得最多的為溶磷細(xì)菌，其種類有芽孢桿菌屬(Bacillus)、歐文氏菌屬(Erwinia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、色桿菌屬(Clromobacterium)等；溶磷真菌的溶磷能力一般要強于細(xì)菌，但其在數(shù)量和種類上都少于溶磷細(xì)菌，主要有青霉菌屬(Penicillium)、曲霉菌屬(Aspergillus)、根霉菌屬(Rhizopus)等；放線菌主要是鏈霉菌屬(Streptomyces)溶磷。根據(jù)溶解底物的不同，還將溶磷菌分為無機溶磷菌和有機溶磷菌。能把土壤中難溶性的不能被作物直接吸收利用的無機態(tài)磷化物溶解轉(zhuǎn)化為作物可以吸收利用的有效態(tài)磷化物的一類微生物叫做無機溶磷菌，能在土壤中分解有機態(tài)磷化物(卵磷脂、核酸和植素等)的有益微生物叫有機溶磷菌。另外還有很大一部分解磷菌既能解無機磷化合物，又能解有機磷化合物，它們主要是節(jié)桿菌屬和鏈霉菌屬的一些種?？偟膩碚f，解磷菌種類繁多，分解機制不盡相同且較復(fù)雜，給人們研究解磷菌造成了一定困擾。篩選高效溶磷菌生產(chǎn)具備高效解磷功能的解磷菌肥，從而，是提高植物對磷素的利用效率行之有效的途徑。目前人們主要通過選用高富集能力的培養(yǎng)基來篩選分離得到某種高效解磷菌，并通過接種劑加以擴繁和利用制備解磷菌肥。培養(yǎng)基培養(yǎng)法可以富集得到某種特定的高效解磷菌株，但培養(yǎng)基所能培養(yǎng)分離的菌株只占到微生物總數(shù)的1％。而由于解磷微生物的種類繁多，分解機制不盡相同且較復(fù)雜，使得這一篩選方法所能獲得的高效解磷菌非常有限，加之在實驗室可控環(huán)境下分離得到的高效菌株進(jìn)入大田后因小生境的改變影響其解磷作用的發(fā)揮，解磷菌肥在大田中的實施效果很難得到保障。目前解磷菌特別是適合酸性土壤的解磷菌的篩選和生產(chǎn)受到很大的局限，亟待開發(fā)更多更豐富的解磷菌資源。本研究發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)基質(zhì)中添加磷素，并采用酸雨脅迫，可有效增加其中多種解磷菌數(shù)量及種類，之后不再采用培養(yǎng)基富集分離，直接把含多種解磷菌(其中包含大量不可培養(yǎng)的解磷菌種群)的誘導(dǎo)基質(zhì)施入土壤中，使多種解磷菌可依托原有的小生境在土壤中繼續(xù)擴繁，發(fā)揮解磷作用。此種方式生產(chǎn)的解磷菌混合堆肥可有效避免單純采用富集培養(yǎng)基培養(yǎng)的局限性，成本低廉，操作簡便。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種提高酸性土壤磷素有效性的解磷菌肥及其應(yīng)用。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：第一方面，本發(fā)明提供了一種提高酸性土壤磷素有效性的解磷菌誘導(dǎo)肥，所述解磷菌誘導(dǎo)肥通過在誘導(dǎo)基質(zhì)中添加磷肥，并經(jīng)pH3.5～4.5的人工酸雨脅迫處理后，再經(jīng)擴繁培養(yǎng)得到的含大量不可培養(yǎng)的解磷微生物的誘導(dǎo)肥。經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)，利用pH3.5～4.5的人工酸雨對添加磷肥的誘導(dǎo)基質(zhì)進(jìn)行脅迫處理，基質(zhì)中解磷微生物的基因條帶最為豐富，條帶色度最深，表明其解磷菌數(shù)量和種群最多。進(jìn)一步地，所述誘導(dǎo)基質(zhì)由枯枝葉、牛糞、粉煤灰土以及秸稈混合后充分腐熟發(fā)酵而成，C/N為24～30，含水率為50～60％，有機質(zhì)含量為50～60％。滿足上述條件的誘導(dǎo)基質(zhì)，成本低廉，容易獲得，并能夠提供足夠豐富的微生物種群資源，適于作為解磷微生物的誘導(dǎo)基質(zhì)。在誘導(dǎo)基質(zhì)中添加磷肥時，所述磷肥相對于誘導(dǎo)基質(zhì)的添加量為1-5g·kg-1，即每1kg誘導(dǎo)基質(zhì)中添加含1-5g磷肥。該添加量能夠刺激解磷微生物的繁殖，又不會造成后期酸雨淋溶時磷的淋失。所述磷肥為有機磷肥和無機磷肥的混合物。本發(fā)明經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)且證實，在誘導(dǎo)基質(zhì)中添加有機磷肥和無機磷肥處理后再經(jīng)酸雨脅迫處理，所激活得到的解磷微生物數(shù)量最為豐富。作為優(yōu)選，所述有機磷肥為磷礦粉，所述無機磷肥為過磷酸鈣。進(jìn)一步地，所述人工酸雨由硫酸和硝酸按摩爾比3:1配成人工酸雨母液后，加水配成。該配比參照了目前的我國自然界酸雨的S:N比，淋溶進(jìn)入土壤時，能有效模擬自然界土壤酸化環(huán)境。所述人工酸雨處理為每1kg堆肥配置淋溶80～100ml人工酸雨，每次緩慢均勻淋溶，每48小時淋溶一次，淋溶持續(xù)30天。該處理方式可使得每次噴淋酸液充分浸潤透所有基質(zhì)，間歇48小時土壤濕度降低后再度淋溶，使淋溶液不會滲出而造成基質(zhì)的養(yǎng)分淋失。淋溶時，使用圓柱型平底塑料桶作為盛裝工具，盛裝誘導(dǎo)基質(zhì)1.0～3.0kg。塑料桶底開小孔用以漏水，漏嘴下安放承接瓶。將已添加磷肥并混勻的堆肥裝入塑料桶，裝完后在表面再放置數(shù)根橫豎交錯的玻璃纖維，既保證淋溶均勻，又可以防止噴灑酸雨時肥粒濺出。需要說明的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用任何手段進(jìn)行淋溶并保證淋溶均勻，并不局限與上述方法。進(jìn)一步地，人工酸雨處理后，在25～37℃的好氧條件下擴繁培養(yǎng)7～10天。第二方面，本發(fā)明提供了所述解磷菌誘導(dǎo)肥在提高酸性土壤磷素有效性中的應(yīng)用。所述應(yīng)用具體為：將所述解磷菌誘導(dǎo)肥按相對于耕層土壤10～15％的質(zhì)量比施入耕層土壤。本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明在富含微生物的誘導(dǎo)基質(zhì)中中添加有機磷肥和無機磷肥，混合均勻后，采用一定酸度的酸性水溶液間歇淋溶，激發(fā)誘導(dǎo)基質(zhì)中各種解磷微生物的繁殖，繼而不再通過特定富集培養(yǎng)基篩選高效解磷菌，而是將被激活的富含多種解磷菌群的誘導(dǎo)基質(zhì)好氧培養(yǎng)后，整體作為解磷菌誘導(dǎo)肥施用。如此，得到的解磷菌誘導(dǎo)肥中包含了不能被特定培養(yǎng)基分離純化的解磷菌群，拓寬了解磷菌的生物資源。解磷菌誘導(dǎo)肥在原生態(tài)中直接施用，也顯著提高了解磷菌群在大田施用時的定值能力和解磷能力。該制備方法操作簡便，成本低廉，制備得到的復(fù)合解磷菌群適應(yīng)性強，是行之有效的提高酸性土壤磷素植物有效磷的解磷菌復(fù)合肥的制備方法。附圖說明圖1為本發(fā)明對比例2中土壤微生物的DGGE圖譜；圖2為本發(fā)明對比例2中土壤解磷微生物系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育分析樹。具體實施方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例1解磷菌誘導(dǎo)的制備1.選取已腐熟好的堆料作為誘導(dǎo)基質(zhì)，主要成分為枯枝葉、牛糞、粉煤灰土以及秸稈，C/N為25.7，含水率55.5％，有機質(zhì)含量45.6％。2.使用內(nèi)徑18cm、高28cm的圓柱型平底塑料桶，每桶盛裝1kg誘導(dǎo)基質(zhì)，添加無機磷肥(1g過磷酸鈣)和有機磷肥(5g磷礦粉)充分?jǐn)嚢杌靹颉?.用分析純硫酸和硝酸按摩爾比3:1配成人工酸雨母液后，加自來水(pH7.0)配成pH3.5的酸性水溶液。4.每桶噴淋酸性水溶液100ml，均勻緩慢淋溶，淋溶時先噴淋50ml，停歇數(shù)分鐘待基質(zhì)充分潤濕后再噴淋50ml。使得每次噴淋酸液可充分浸潤基質(zhì)又不會淋出而造成養(yǎng)分淋失。每隔48小時噴淋一次。持續(xù)噴淋30天。5.淋溶結(jié)束后，將已激活的解磷菌誘導(dǎo)肥在37℃好氧條件下擴繁培養(yǎng)10天，混合均勻，即得。對比例11.選取已腐熟好的堆料作為誘導(dǎo)基質(zhì)，主要成分為枯枝葉、牛糞、粉煤灰土以及秸稈，C/N為25.7，含水率55.5％，有機質(zhì)含量45.6％。2.使用內(nèi)徑18cm、高28cm的圓柱型平底塑料桶，每桶盛裝1kg誘導(dǎo)基質(zhì)，分為添加有機磷肥(5g磷礦粉)、添加無機磷肥(1g過磷酸鈣)，同時添加無機磷肥(1g過磷酸鈣)和有機磷肥(5g磷礦粉)四個處理，對照為不添加磷肥，充分?jǐn)嚢杌靹?，每個處理設(shè)置5個重復(fù)，共計20盆。3.用分析純硫酸和硝酸按摩爾比3:1配成人工酸雨母液后，加自來水(pH7.0)配成pH4.1的酸性水溶液。4.每桶噴淋酸性水溶液100ml，均勻緩慢淋溶，淋溶時先噴淋50ml，停歇數(shù)分鐘待基質(zhì)充分潤濕后再噴淋50ml。使得每次噴淋酸液可充分浸潤基質(zhì)又不會淋出而造成養(yǎng)分淋失。每隔48小時噴淋一次。持續(xù)噴淋30天。5.淋溶結(jié)束后，將已激活的解磷菌誘導(dǎo)肥在37℃好氧條件下擴繁培養(yǎng)10天，混合均勻。采用培養(yǎng)法檢測其解磷微生物數(shù)量如表1所示：表1不同磷肥添加方式的解磷菌誘導(dǎo)肥的解磷微生物數(shù)量可見，在誘導(dǎo)基質(zhì)中添加有機磷肥和無機磷肥處理后再經(jīng)酸雨脅迫處理，所激活得到的解磷微生物數(shù)量最為豐富。對比例21.選取已經(jīng)腐熟好的堆料，主要成分為枯枝葉、牛糞、粉煤灰土以及秸稈，C/N為26.7，含水率為52.8％，有機質(zhì)含量為55.3％。2.使用內(nèi)徑12cm、高20cm的圓柱型平底塑料桶盛裝1000g堆料，施入2.0g過磷酸鈣，5g磷礦粉，充分?jǐn)嚢杌靹颉?.用分析純硫酸和硝酸按摩爾比3:1配成人工酸雨母液后，加自來水(pH6.5左右)分別配成pH值為3.5、4.5、5.5、6.5的酸性水溶液，對照為自來水。每個pH值處理5盆。4.每隔48小時取不同pH值的酸性水溶液80ml淋溶，持續(xù)30天。5.淋溶結(jié)束后取誘導(dǎo)基質(zhì)樣品10g，37℃好氧條件下培養(yǎng)10天后，采用分子生物技術(shù)分析其解磷細(xì)菌基因豐富度。取土壤微生物總DNA，采用PCR—DGGE結(jié)合測序分析土壤解磷功能微生物變化。依托酸性磷酸酶功能基因設(shè)計引物，獲得的pH3.5、pH4.5、pH5.5、pH6.5酸雨淋溶后土壤解磷微生物種群基因多樣性變化。土壤微生物總DNA提取：采用美國Mo～Bio試劑盒提取土壤微生物DNA。擴增引物采用ALPS～F730和ALPS～R1101。PCR引物序列為:ALPS～F730：5`～ACTCCTACGGGAGGCAGCAG～3`；ALPS～R1101：ATTACCGCGGCTGCTGG～3`。PCR反應(yīng)體系：采用50μL擴增體系，包括：10×PCRBuffer5μL；dNTPMixture(各2.5mM)4μL；引物338F(20μM)1μL；引物534R(20μM)1μL；模板DNA2.5ng；TaKaRarTaq(5U/μL)0.25μL；ddH2O補至50μL。PCR擴增程序：94℃10min，接著30個循環(huán){94℃變性1min，55℃退火1min(每個循環(huán)降低0.1℃)，72℃延伸1min30s}，最終72℃延伸10min。DGGE圖譜分析：采用Shannon指數(shù)(H＝－∑(Pi)(log2Pi)分析磷素轉(zhuǎn)化微生物多樣性變化。采用Phylip4.0軟件計算分離度，并采用Mega3.1分析作聚類分析。DGGE回收條帶克?。翰捎肨aKaRa生產(chǎn)的PMD19～T載體(TaKaRa編號：D102A/D102B)，DH5α感受態(tài)細(xì)胞(TaKaRa編號：D9057S/D9057A)，IPTG(TaKaRa編號D9030A)，X～Gal(TaKaRa編號：D9031A)進(jìn)行克隆。研究結(jié)論：分子生物學(xué)技術(shù)可以有效檢測到土壤98％的微生物種類及功能變化，與傳統(tǒng)的培養(yǎng)法相比能更全面地了解微生物群落信息。本研究中土壤微生物總DNA的PCR圖譜中PCR產(chǎn)物在250bp位置，判斷為目的片段。DGGE電泳結(jié)果如圖1。研究發(fā)現(xiàn)，與對照pH6.5相比，pH3.5酸度環(huán)境下土壤解磷微生物基因條帶最為豐富，條帶色度最深，表明其解磷菌數(shù)量和種群最多。選擇不同處理下的特異條帶克隆測序，條帶編號為：1，11，16，20，21，23，26，28共8個條帶(圖1)。在平板上隨機挑取3個陽性克隆進(jìn)行測序分析，菌液測序，測序引物：M13F(-47)。經(jīng)NCBI測序比對分析(表2)，共獲得同源性好的13個不同土壤微生物菌株。表2NCBI測序比對分析進(jìn)一步對同源性好的13個菌株作系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育分析樹如圖2，發(fā)現(xiàn)其中pH4.5條件下出現(xiàn)的特異解磷微生物有MassiliaaerilataB101(HF585364.1)、Acinetobactersp.strainB2188(KF295190.1)RaoultellaterrigenastrainPKG-3X-1D(KJ685494.1)、Acinetobacterlwoffiistrain214(AB976100.1)等菌群。pH3.5條件下出現(xiàn)的有Actinomycessp.V172011441(KF926012.1)和不可培養(yǎng)的UnculturedTepidimonassp.cloneNJFUSLX-S357(KC775702.1)等菌群。這一研究成果為今后拓寬酸性土壤中解磷微生物種群范圍提供了依據(jù)。對比例3不同解磷菌肥對油菜苗期吸磷及土壤磷素的影響采用盆栽試驗，土壤采集自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)校內(nèi)，土壤pH值為4.6，全磷0.78g.kg-1，速效磷5.11mg.kg-1，有機質(zhì)22.9％。試驗自2013年10月始在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院溫室內(nèi)進(jìn)行。試驗采用15cm×20cm塑料盆進(jìn)行，每盆裝土5kg，每處理所施底肥為N0.15g.kg-1，K2O0.1g.kg-1，磷肥共設(shè)3個P水平，10mg.kg-1(P1)、50mg.kg-1(P2)和100mg.kg-1(P3)，每處理4個重復(fù)，每盆留苗5株。油菜生長期間常規(guī)管理，5月2日收獲植株，采集土壤樣品。測定土壤速效磷及植株含磷量。使用的不同菌肥分別如下：A.解磷單菌:供試菌株供試菌種為保存于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實驗室的解磷菌PW-246。使用前按1:10與普通堆肥混合。B.解磷混合菌肥：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院研制的混合解磷菌(將拉恩式菌、假單胞菌在高密度發(fā)酵罐中混合發(fā)酵，發(fā)酵好的混合磷細(xì)菌菌液與普通堆肥按1:10的比例混勻，制成磷細(xì)菌生物基質(zhì)，該菌群有效活菌數(shù)≥0.5×107cfu.g-1，有機質(zhì)含量≥50％)。C.實施例1所述的解磷菌誘導(dǎo)肥。施入大田時按誘導(dǎo)肥與耕層土壤10～15％的質(zhì)量比混合施入耕層土壤中。實驗結(jié)果見表3。表3不同處理對油菜苗期吸磷量及土壤磷素的影響由以上可見，與對照相比，施用解磷單菌，解磷混合菌，解磷菌誘導(dǎo)肥均能有效提高土壤速效磷和油菜植株吸磷量，其中解磷菌誘導(dǎo)肥效果更為明顯。對比例4不同解磷菌肥對玉米苗期吸磷量和土壤磷素有效性的影響采用田間小區(qū)試驗。2013年5月開始播種玉米，試驗地位于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)校內(nèi)，土壤pH值5.2，速效磷7.62mg.kg-1，全磷0.82g.kg-1，有機質(zhì)22.9％。共設(shè)置A(解磷單菌肥)、B(混合解磷菌)、C(實施例1所述的解磷菌誘導(dǎo)肥)3個處理，對照為不施用任何菌肥，。每個小區(qū)面積為2.5*8＝20m2。每個處理3個重復(fù)，共240m2。P肥用量50mg.kg-1，其他管理同常規(guī)方法。玉米生長45d后收獲，測定玉米株高、鮮重，105℃下殺青30min，75℃烘干至恒重并稱干重。植株樣品粉碎后鉬銻抗比色法測定磷含量，結(jié)果見表4、表5。表4不同處理對玉米苗期地上部和地下部根含磷量的影響地下部根含磷量地上部植株含磷量CK1.92±0.32a10.42±2.61aA2.24±0.23b12.85±3.22bB2.45±0.45b13.55±3.34cC2.82±0.56c14.81±4.45d表5不同處理對玉米苗期生長的影響株高cm根干重g植株干重gCK54.43±7.16a2.11±0.61a6.14±1.16aA72.15±11.22b2.71±0.45b6.77±1.53bB74.21±12.12b2.72±0.67b7.02±2.12bC77.52±8.36c2.89±0.88c7.93±2.77c由以上實驗可知，與對照相比，單施解磷菌、混合菌、解磷菌誘導(dǎo)肥菌等均促進(jìn)了玉米生長。相比，解磷菌誘導(dǎo)肥C更能有效提高了玉米植株的地下部含磷量和地上部含磷量，明顯促進(jìn)了株高和植株干重。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。