專利名稱：水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及化工領(lǐng)域，特別是一種水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物的制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
自2004年，英國(guó)曼徹斯特大學(xué)Giem AK和Novoselov KS制備出石墨烯(graphene)以來(lái)，這一新型材料以其優(yōu)異的性能，如較高的機(jī)械強(qiáng)度(>1060GPa)，導(dǎo)熱系數(shù)( 3000W.πΓ1.Γ1),電子遷移率(15000 cm2.Γ1.s-1)，以及比表面積(2600m2.g-1)，引起了科學(xué)家的廣泛關(guān)注。石墨烯是由單層碳原子組成的世界上最薄的二維納米材料，被認(rèn)為是富勒烯、碳納米管(CNT)、石墨的基本結(jié)構(gòu)單元。而氧化石墨烯(GO)是石墨烯的衍生物，它的結(jié)構(gòu)與石墨烯大體相同，只是在一層碳原子構(gòu)成的二維空間無(wú)限延伸的基面上連有羰基、羥基、羧基等大量的親水性官能團(tuán)，在生物環(huán)境中具有良好的分散性能、極高的載藥量和一定的緩釋特性且藥效明顯提高等特點(diǎn)，可克服單獨(dú)使用藥物時(shí)的易團(tuán)聚和藥效作用時(shí)間短等問(wèn)題，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域主要應(yīng)用于載藥體系、生物檢測(cè)、生物成像、腫瘤治療等方面。生物系統(tǒng)對(duì)700 1，IOOnm范圍的近紅外光具有高度透過(guò)性，而GO在此范圍內(nèi)具有高吸收的特性，可以利用GO在此范圍內(nèi)的光熱轉(zhuǎn)換特性對(duì)腫瘤進(jìn)行激光熱療。將GO腫瘤靶向給藥系統(tǒng)和激光熱療聯(lián)合應(yīng)用可以達(dá)到更加有效的抗腫瘤作用。磁性納米材料因其易于制備、無(wú)毒且具有超順磁性和良好的生物相容性，已被廣泛應(yīng)用于信息存儲(chǔ)、磁共振成像、藥物載體、癌癥的診斷與治療以及生物樣品的分離與提純等方面，也因此被認(rèn)為是最有前途的材料之一。作為生物磁性載體材料應(yīng)具有粒徑較小，毒性較低，磁性較好，造價(jià)低廉，物理化學(xué)性能穩(wěn)定以及生物相容性良好等特性。功能化的磁性氧化石墨烯具有水溶性好，粒徑小，物理化學(xué)性能優(yōu)異且磁性能良好，而且表面接上的水溶性功能基團(tuán)可以顯著改善氧化石墨烯在動(dòng)物體液中的生物相容性和流動(dòng)性，有利于在外磁場(chǎng)作用下將藥物直接輸運(yùn)至病灶，`從而增強(qiáng)療效、減少副作用，因此成為靶向載體材料研究的熱點(diǎn)。功能化的磁性氧化石墨烯，利用其超順磁性，通過(guò)外加梯度磁場(chǎng)檢測(cè)物質(zhì)所發(fā)射出的電磁波，可以繪制成物體內(nèi)部的結(jié)構(gòu)圖像，對(duì)病灶能更好地進(jìn)行定位定性，應(yīng)用于磁共振成像領(lǐng)域。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述情況，為解決現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物的制備方法及其應(yīng)用，可有效解決現(xiàn)有技術(shù)療效低，副作用大的問(wèn)題。其解決的技術(shù)方案是:一種水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物，是氧化石墨烯與三價(jià)鐵鹽反應(yīng)，將氧化石墨烯(市場(chǎng)上已有售，如:南京吉倉(cāng)納米科技有限公司)表面負(fù)載上具有磁性的四氧化三鐵后，再連接上親水基團(tuán)，最終得到水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物，該氧化石墨烯衍生物中，四氧化三鐵和氧化石墨烯的質(zhì)量比為1-11:1 ;所述的氧化石墨烯為納米級(jí)氧化石墨烯。水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物的制備方法，包括以下步驟:
1)將氧化石墨烯45-55mg充分溶解于18_22ml體積比為1:19的乙二醇和二縮醇組成的混合溶劑中，加入醋酸鈉1.35-1.65g，三價(jià)鐵鹽0.48-0.60g，超聲溶解后移至反應(yīng)釜中，200°C反應(yīng)10h，反應(yīng)后的產(chǎn)物每次用20-25ml的無(wú)水乙醇，洗滌3_4次，再每次用25_30ml的超純水，洗滌4-5次，之后，20-60°C抽真空干燥24-56h，得到四氧化三鐵負(fù)載的氧化石墨烯；所述三價(jià)鐵鹽為氯化鐵、溴化鐵、碘酸鐵、高氯酸鐵、次氯酸鐵、硝酸鐵、硫酸鐵、硫化鐵、磷酸鐵、磷酸一氫鐵、磷酸二氫鐵、碳酸鐵、醋酸鐵、硅酸鐵、高錳酸鐵中的一種；
2)將上述四氧化三鐵負(fù)載的氧化石墨烯45-55mg，水溶性物質(zhì)180_220mg，1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽170-190mg，N-羥基琥珀酰亞胺100_120mg超聲分散于45-55ml磷酸鹽緩沖液中，室溫18-25°C反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后，加入50-100ml無(wú)水乙醇使其沉淀，抽濾，然后每次用20-25ml的無(wú)水乙醇，洗滌8-10次，20_60°C抽真空干燥24-56h，得到水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物；所述水溶性物質(zhì)為氨基聚乙二醇2000、氨基聚乙二醇4000、氨基聚乙二醇6000、氨基聚乙二醇8000、聚乙烯亞胺、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、氨基透明質(zhì)酸、氨基酸、核酸、氨基淀粉類、氨基纖維素中的一種。水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物作為熱敏劑在腫瘤治療中的應(yīng)用分為體外和體內(nèi)兩部分:
I)將制得的水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物溶于水中制成溶液，加入到癌細(xì)胞A中進(jìn)行培養(yǎng)，給藥后3h后用光源B光照，光照l(shuí)-5min，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，測(cè)定癌細(xì)胞A的存活率。2)將制得的 水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物溶于水中制成溶液，靜脈注射到荷瘤小鼠C體內(nèi)，給藥后3h后用光源D光照，光照時(shí)間為l-5min，測(cè)量荷瘤小鼠C的腫瘤體積大小。上述步驟I中的癌細(xì)胞A為:器官表面或者內(nèi)部出現(xiàn)的各種實(shí)體瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大腸癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血病，胰腺癌，宮頸癌，喉癌，甲狀腺癌，舌癌，腦瘤(顱內(nèi)腫瘤)，小腸腫瘤，膽囊癌，膽管癌，腎癌，前列腺癌，陰莖癌，睪丸腫瘤，子宮內(nèi)膜癌，絨毛膜癌，陰道惡性腫瘤，外陰惡性腫瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮膚癌，惡性黑色素瘤中的一種。上述步驟I中的光源B為:780-1100nm波長(zhǎng)的寬波長(zhǎng)光源或者激光中的一種。優(yōu)選808nm激光。上述步驟2中的荷瘤小鼠C為:器官表面或者內(nèi)部出現(xiàn)的各種實(shí)體瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大腸癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血病，胰腺癌，宮頸癌，喉癌，甲狀腺癌，舌癌，腦瘤(顱內(nèi)腫瘤)，小腸腫瘤，膽囊癌，膽管癌，腎癌，前列腺癌，陰莖癌，睪丸腫瘤，子宮內(nèi)膜癌，絨毛膜癌，陰道惡性腫瘤，外陰惡性腫瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮膚癌，惡性黑色素瘤中的一種。上述步驟2中的光源D為:780-1100nm波長(zhǎng)的寬波長(zhǎng)光源或者激光中的一種。優(yōu)選808nm激光。本發(fā)明的水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物作為熱敏劑來(lái)進(jìn)行熱敏治療體內(nèi)深度腫瘤時(shí)，808nm激光能夠深度穿透生物體，可以用于治療生物腫瘤。本發(fā)明的水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物作為熱敏劑可以制成任意的藥物制劑劑型，比如:注射劑、注射用無(wú)菌粉針、分散劑、貼劑、凝膠劑、植入劑等。本發(fā)明的氧化石墨烯衍生物可以加入各種制劑的添加劑，比如:生理鹽水、葡萄糖、緩沖溶液和防腐劑等以便于制備成需要的劑型。給藥方式可以為:靜脈注射、肌肉注射、瘤內(nèi)注射和皮下注射、透皮給藥、體內(nèi)植入方式等。水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物作為藥物轉(zhuǎn)運(yùn)載體在腫瘤治療中的應(yīng)用，分為以下幾個(gè)步驟:
I)將制得的水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物和抗腫瘤藥物A通過(guò)方式B進(jìn)行結(jié)合。2)將裝載藥物的水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物進(jìn)行抗腫瘤細(xì)胞C和抑制體內(nèi)腫瘤D的評(píng)價(jià)。上述步驟I中的抗腫瘤藥物A為:難溶性抗腫瘤藥物、水溶性藥物和核酸藥物，比如:多西紫杉醇、紫杉醇、阿霉素、順鉬、卡鉬、柔紅霉素、寡義反核苷酸、小干擾RNA和酶類藥物中的一種或幾種。上述步驟I中的方式B為:超聲、攪拌、探超和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)中的一種或幾種。上述步驟2中的腫瘤細(xì)胞C為:器官表面或者內(nèi)部出現(xiàn)的各種實(shí)體瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大腸癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血病，胰腺癌，宮頸癌，喉癌，甲狀腺癌，舌癌，腦瘤(顱內(nèi)腫瘤)，小腸腫瘤，膽囊癌，膽管癌，腎癌，前列腺癌，陰莖癌，睪丸腫瘤，子宮內(nèi)膜癌，絨毛膜癌，陰道惡性腫瘤，外陰惡性腫瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮膚癌，惡性黑色素瘤中的一種。上述步驟2中的腫瘤D為:器官表面或者內(nèi)部出現(xiàn)的各種實(shí)體瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大腸癌，乳`腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血病，胰腺癌，宮頸癌，喉癌，甲狀腺癌，舌癌，腦瘤(顱內(nèi)腫瘤)，小腸腫瘤，膽囊癌，膽管癌，腎癌，前列腺癌，陰莖癌，睪丸腫瘤，子宮內(nèi)膜癌，絨毛膜癌，陰道惡性腫瘤，外陰惡性腫瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮膚癌，惡性黑色素瘤中的一種。在外加磁場(chǎng)的作用下，本發(fā)明的水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物作為藥物轉(zhuǎn)運(yùn)載體，可以靶向性地聚集于腫瘤區(qū)域，與正常組織相比，它可以長(zhǎng)期的高濃度的保留在腫瘤區(qū)域中，這樣當(dāng)采用適當(dāng)?shù)氖侄问褂霉庠催M(jìn)行照射時(shí)能夠在腫瘤組織中產(chǎn)生更多的活性氧，并且可以使其裝載的藥物在腫瘤部位濃度提高，產(chǎn)生更好的療效，而且對(duì)正常組織無(wú)損傷。本發(fā)明的水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物作為藥物轉(zhuǎn)運(yùn)載體可以制成任意的藥物制劑劑型，比如:注射劑、注射用無(wú)菌粉針、分散劑、貼劑、凝膠劑、植入劑等。本發(fā)明的水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物可以加入各種制劑的添加劑，比如:生理鹽水、葡萄糖、緩沖溶液和防腐劑等以便于制備成需要的劑型。給藥方式可以為:靜脈注射、肌肉注射、瘤內(nèi)注射和皮下注射等。水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物作為磁共振成像造影劑在腫瘤治療中的應(yīng)用分為體外和體內(nèi)兩個(gè)部分:
1)將制得的水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物溶于水中制成溶液，進(jìn)行磁共振成像；
2)將制得的水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物溶于水中制成溶液，靜脈注射到荷瘤小鼠A體內(nèi)，進(jìn)行磁共振成像。上述步驟2中的荷瘤小鼠A為:器官表面或者內(nèi)部出現(xiàn)的各種實(shí)體瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大腸癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血病，胰腺癌，宮頸癌，喉癌，甲狀腺癌，舌癌，腦瘤(顱內(nèi)腫瘤)，小腸腫瘤，膽囊癌，膽管癌，腎癌，前列腺癌，陰莖癌，睪丸腫瘤，子宮內(nèi)膜癌，絨毛膜癌，陰道惡性腫瘤，外陰惡性腫瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮膚癌，惡性黑色素瘤中的一種。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例 對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例1
1)將氧化石墨烯50mg充分溶解于20ml體積比為1:19的乙二醇和二縮醇組成的混合溶劑中，加入醋酸鈉1.5g，三氯化鐵0.54g，超聲溶解后移至反應(yīng)釜中，2000C反應(yīng)10h，反應(yīng)后的產(chǎn)物每次用20ml的無(wú)水乙醇，洗滌3次，再每次用25ml的超純水，洗滌5次，之后，60°C抽真空干燥24h，得到四氧化三鐵負(fù)載的氧化石墨烯85mg ；
2)取上述四氧化三鐵負(fù)載的氧化石墨烯50mg，聚乙酰亞胺200mg，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽180mg,N-輕基琥拍酰亞胺IlOmg,超聲分散于50ml磷酸鹽緩沖液中，室溫18-25°C反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后，加入60ml無(wú)水乙醇使其沉淀，抽濾，然后每次用20ml的無(wú)水乙醇，洗滌10次，60°C抽真空干燥24h，得到水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物 35mg。實(shí)施例2
1)將氧化石墨烯54mg充分溶解于21ml體積比為1:19的乙二醇和二縮醇組成的混合溶劑中，加入醋酸鈉1.6g，三氯化鐵0.58g，超聲溶解后移至反應(yīng)釜中，200°C反應(yīng)10h，產(chǎn)物每次用23ml的無(wú)水乙醇，洗滌4次，再每次用28ml的超純水，洗滌5次，之后，55°C抽真空干燥24h,得到四氧化三鐵負(fù)載的氧化石墨烯88mg ；
2)將上述四氧化三鐵負(fù)載的氧化石墨烯54mg，氨基聚乙二醇2000218mg，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽190mg, N-輕基琥拍酰亞胺118mg,超聲充分分散于53ml磷酸鹽緩沖液中，室溫18-25°C反應(yīng)24h,反應(yīng)結(jié)束后,加入80ml無(wú)水乙醇使其沉淀，抽濾，然后每次用20ml的無(wú)水乙醇，洗滌10次，50°C抽真空干燥48h，得到水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物40mg。實(shí)施例3
1)將氧化石墨烯45mg充分溶解于18ml體積比為1:19的乙二醇和二縮醇組成的混合溶劑中，加入醋酸鈉1.35g，三氯化鐵0.48g，超聲溶解后移至反應(yīng)釜中，2000C反應(yīng)10h，產(chǎn)物每次用20ml的無(wú)水乙醇，洗滌3次，再每次用30ml的超純水，洗滌4次，之后，55°C抽真空干燥36h,得到四氧化三鐵負(fù)載的氧化石墨烯80mg ；
2)將上述四氧化三鐵負(fù)載的氧化石墨烯52mg，氨基葡萄糖210mg，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽185mg, N-輕基琥拍酰亞胺112mg,超聲充分分散于52ml磷酸鹽緩沖液中，室溫18-25°C反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后，加入60ml無(wú)水乙醇使其沉淀,抽濾,然后每次用25ml的無(wú)水乙醇，洗滌8次，60°C抽真空干燥24h，得到水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物36mg。
相關(guān)試驗(yàn)資料如下:
一、本發(fā)明在具體實(shí)施中，使用光照射水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制活性的測(cè)定:
通過(guò)光照射水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物在體外抗腫瘤活性:將PC3前列腺癌細(xì)胞(由上海細(xì)胞庫(kù)提供)用作待考察的癌細(xì)胞。將PC3細(xì)胞培養(yǎng)在含胎牛血清(FBS) 10%，青鏈霉素混合液1%的RPMI1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱條件為37°C、5% CO2，每2 3天傳代一次。收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，96孔板每孔加入200 μ 1，鋪板使待測(cè)細(xì)胞調(diào)密度至6 X IO3個(gè)/孔，(邊緣孔用無(wú)菌PBS填充)。置于5% CO2, 37 °C孵育24 h，至細(xì)胞單層鋪滿孔底(96孔平底板)，加入濃度梯度(12.5、25、50、100μ g/ml)的實(shí)例I中的水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物，設(shè)置復(fù)孔為4 6個(gè)。光照組放置在808nm近紅外光2W中2min，保持光照過(guò)程中溫度在37°C，光照結(jié)束后用鋁箔包裹細(xì)胞板置于CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，對(duì)于不光照組而言，則直接用鋁箔包裹細(xì)胞板置于CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，終止培養(yǎng)，吸出含藥培養(yǎng)基，每孔用150 μ I PBS洗2遍，加入預(yù)冷的10% TCA 200 yl，4°C放置I h。倒掉固定液，每孔用去離子水洗5遍，甩干，空氣干燥。每孔加入100 μ I的SRB溶液，靜置放置10min，未與蛋白結(jié)合的SRB用1%醋酸洗5遍，空氣干燥。結(jié)合的SRB用150 μ I 10 mmol/L非緩沖Tris堿溶解。在808 nm處測(cè)定每孔的OD值。存活率的計(jì)算公式:存活率=實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值，其中實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均為扣除空白對(duì)照組后的值。已經(jīng)證實(shí)當(dāng)用光照射2min，本發(fā)明水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物的加入直接影響了 PC3細(xì)胞的增殖。二、光照射時(shí)，本發(fā)明水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物的體內(nèi)抗腫瘤活性測(cè)定:
取小鼠S180腹水瘤細(xì)胞，用注射用生理鹽水以3:1比例稀釋后，每只小鼠于腹腔注射0.3 ml，小鼠喂養(yǎng)7 天后，抽取小鼠S180腹水瘤細(xì)胞，計(jì)數(shù)后以注射用生理鹽水稀釋成濃度為2X IO6個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，皮下接種與小鼠右前肢上部。小鼠接種腫瘤7 d后，取其中24只腫瘤體積彡100 mm3昆明小鼠，隨機(jī)分為4組，每組6只。具體分組如下:
(I)對(duì)照組(NS組):生理鹽水；(2)生理鹽水激光組；(3)水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物組；(4)水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物激光組。4組均采用靜脈給藥的方式，其中光照組使用的光源為808nm近紅外光源，功率為2W，給藥3h后激光照射腫瘤部位，一次照射時(shí)間為2min。每2 d給藥一次，每次注射生理鹽水或者2mg/ml的水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物100 μ 1，共給藥7次。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每日觀察小鼠生活狀態(tài)，每2 d稱其體重并使用游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠肉瘤的長(zhǎng)徑(A)與短徑(B)，按公式腫瘤體積V=
￥計(jì)算腫瘤體積。當(dāng)給藥本發(fā)明水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物合并激光照射時(shí)，小鼠的腫瘤體積的增加得到了明顯的抑制。三、本發(fā)明水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物作為藥物轉(zhuǎn)運(yùn)載體在腫瘤治療中的應(yīng)用:
取本發(fā)明水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物IOmg和多西紫杉醇(由北京怡和生物科技有限公司提供)20mg，加入超純水2mL，混合均勻后，探頭超聲(工作3s，間隔6s，工作12次，功率為400W)，將探超完成的樣品進(jìn)行離心(4000rpm，15min)除去大顆粒。得到了以實(shí)例I中水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物為載體的抗腫瘤藥物多西紫杉醇給藥系統(tǒng)。通過(guò)40倍(體積比)乙醇提取出給藥系統(tǒng)中包封的多西紫杉醇，紫外分光光度計(jì)測(cè)定實(shí)例I為載體包封的多西紫杉醇的含量，載藥量為2.1 mg/mL。已經(jīng)證實(shí)，本發(fā)明水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物可以吸附抗腫瘤藥物多西紫杉醇，提高了多西紫杉醇在水中的溶解度，可以作為抗腫瘤藥物的載體使用。四、本發(fā)明水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物多西紫杉醇給藥系統(tǒng)的粒子大小和表面帶電量的確定:
使用Nano-ZS90型激光粒度分析儀進(jìn)行測(cè)定，折射率設(shè)置為1.590，吸收系數(shù)設(shè)置為0.010，溫度設(shè)置為25 °C，測(cè)量模式設(shè)置為自動(dòng)，以Z平均統(tǒng)計(jì)值作為測(cè)定結(jié)果。每一水平縮合體均配制3份，每份測(cè)量一次，取三次測(cè)量值的平均值作為測(cè)量結(jié)果。介電常數(shù)設(shè)置為79，黏度系數(shù)設(shè)置為0.8872，溫度設(shè)置為25 °C，測(cè)量模式設(shè)置為自動(dòng)。每一水平縮合體均配制3份，每份測(cè)量一次，取三次測(cè)量值的平均值作為測(cè)量結(jié)果，所得結(jié)果為粒徑為100 200nm,電位為 _40mV。五、本發(fā)明水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物多西紫杉醇給藥系統(tǒng)的體外抗腫瘤活性:
將PC3前列腺癌細(xì)胞(由上海細(xì)胞庫(kù)提供)用作待考察的癌細(xì)胞。將PC3細(xì)胞培養(yǎng)在含胎牛血清(FBS) 10%，青鏈霉素混合液1%的RPMI1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱條件為37°C、5% CO2,每2 3天傳代一次。收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，96孔板每孔加入200 μ ，鋪板使待測(cè)細(xì)胞調(diào)密度至6 X IO3個(gè)/孔，(邊緣孔用無(wú)菌PBS填充)。置于5% CO2, 37 °〇孵育24 h，至細(xì)胞單層鋪滿孔底(96孔平底板)，加入濃度梯度(0、0.5、1、2、4、6、8μ8/πι1)的實(shí)例4中的水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物多西紫杉醇，不加入實(shí)例4中的水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物多西紫杉醇為對(duì)照組，設(shè)置復(fù)孔為4 6個(gè)。光照組放置在808nm近紅外光2W中2min，保持光照過(guò)程`中溫度在37 °C，光照結(jié)束后用鋁箔包裹細(xì)胞板置于CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，對(duì)于不光照組而言，則直接用鋁箔包裹細(xì)胞板置于CO2培養(yǎng)箱中孵育24h，終止培養(yǎng)，吸出含藥培養(yǎng)基，每孔用150 μ I PBS洗2遍，加入預(yù)冷的10% TCA 200 μ I,4 °C放置I h。倒掉固定液，每孔用去離子水洗5遍，甩干，空氣干燥。每孔加入100 μ 的SRB溶液，靜置放置10 min，未與蛋白結(jié)合的SRB用1%醋酸洗5遍，空氣干燥。結(jié)合的SRB用150 μ I 10 mmol/L非緩沖Tris堿溶解。在808 nm處測(cè)定每孔的OD值。抑制率的計(jì)算公式:抑制率=1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值，其中實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均為扣除空白對(duì)照組后的值。已經(jīng)證實(shí)，本發(fā)明水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物作為藥物載體時(shí)能裝載藥物進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)部，更好的發(fā)揮出抗腫瘤藥物的療效，而且結(jié)合光照后，能夠更明顯的抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。六、本發(fā)明水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物多西紫杉醇給藥系統(tǒng)的體內(nèi)抗腫瘤活性:
取小鼠S180腹水瘤細(xì)胞，用注射用生理鹽水以3:1比例稀釋后，每只小鼠于腹腔注射
0.3 ml,小鼠喂養(yǎng)7天后，抽取小鼠S180腹水瘤細(xì)胞，計(jì)數(shù)后以注射用生理鹽水稀釋成濃度為2X IO6個(gè)/ml的細(xì)胞懸液,皮下接種與小鼠右前肢上部。小鼠接種腫瘤7 d后,取其中24只腫瘤體積彡100 mm3昆明小鼠，隨機(jī)分為4組，每組6只。具體分組如下:(I)對(duì)照組(NS組):生理鹽水；(2)多西紫杉醇注射液組；(3)水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物多西紫杉醇；(4)水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物多西紫杉醇光照組。多西紫杉醇注射液組、水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物多西紫杉醇和水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物多西紫杉醇光照組的多西紫杉醇給藥劑量相等，都為25.125mg/kg。4組均采用靜脈給藥的方式，其中光照組使用的光源為808nm近紅外光源，功率為2W，給藥3h后激光照射腫瘤部位，一次照射時(shí)間為2min。每2 d給藥一次，共給藥7次。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每日觀察小鼠生活狀態(tài)，每2 d稱其體重并使用游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠肉瘤的長(zhǎng)徑(A)與短徑(B)，按公式腫瘤體
積V=計(jì)算腫瘤體積。當(dāng)給藥實(shí)例4的水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物多西紫杉醇時(shí)，小鼠的腫瘤體積的增加比起多西紫杉醇注射液得到了明顯的抑制。合并激光照射時(shí)，小鼠的腫瘤體積的增加得到了更加明顯的抑制。在做上述實(shí)驗(yàn)的同時(shí)，還采用抗腫瘤藥物做了類似的實(shí)驗(yàn)，均取得了相同和相類似的結(jié)果，本發(fā)明分組科學(xué)，方法穩(wěn)定可靠，其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果不再一一列舉。七、本發(fā)明水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物作為磁共振成像劑在腫瘤治療中的應(yīng)用:
將接種老鼠乳腺癌腫瘤的12只小鼠完全隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，6只實(shí)驗(yàn)組小鼠經(jīng)尾靜脈注入2mg/ml的G0-10NP-PEI溶液200μ1。而6只對(duì)照組小鼠不作處理。小鼠麻醉方法為3%戊巴比妥鈉0.04ml，腹腔注射，并在注射G0-10NP-PEI溶液前(即Oh)及注射GO—IONP-PEI后24h進(jìn)行MR成像。在Oh及24h在實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組小鼠的腫瘤區(qū)域的T2WI圖像上繪制大小一致的感興趣區(qū)ROI測(cè)量腫瘤實(shí)體部分信號(hào)強(qiáng)度(SIt)，取其平均值，測(cè)量面積不小于6mm2。用spssl9.0統(tǒng)計(jì)軟件包,測(cè)量數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布表示為x土 s,不符的用中位數(shù)(M)表示。Oh時(shí)及24h時(shí)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間的腫瘤實(shí)體部分信號(hào)強(qiáng)度(SIt)比較用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。p〈 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p<0.01認(rèn)為差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。已經(jīng)證實(shí)，本發(fā)明水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物可以作為磁共振成像造影齊U，用于腫瘤的早期診斷。本發(fā)明提供了一種新的水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物，其制備方法以及其作為熱敏劑、藥物轉(zhuǎn)運(yùn)載體和磁共振成像造影劑在應(yīng)用。本發(fā)明的新的水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物不會(huì)對(duì)氧化石墨烯本身的特性進(jìn)行破壞，測(cè)試結(jié)果表明，本發(fā)明的新的氧化石墨烯水溶性磁性衍生物，水分散性強(qiáng)，對(duì)生物體的毒性很低，物理以及化學(xué)穩(wěn)定性良好，質(zhì)量好，制備的條件容易滿足，原料來(lái)源豐富，成本低。本發(fā)明提供的水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物可以作為抗腫瘤熱敏治療的一種良好的熱敏劑，測(cè)試表明無(wú)論是體外還是體內(nèi)在光照的情況下都可以很好的抑制腫瘤細(xì)胞以及組織的發(fā)生和發(fā)展，而在不光照的情況下本發(fā)明提供的新的水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物對(duì)正常細(xì)胞以及組織毒副作用很小。本發(fā)明提供的水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物可以作為一種良好的抗腫瘤藥物的載體，本身有著極小的毒性，較強(qiáng)的水溶性，生物相容性好，比表面積大，化學(xué)惰性高等優(yōu)點(diǎn)。測(cè)試結(jié)果表明，本發(fā)明提供的水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物作為抗腫瘤藥物的載體時(shí)，粒徑均勻，能夠提高水不溶性抗腫瘤藥物的水溶性，能夠起到一定的緩釋作用，而且還能夠更多的到達(dá)腫瘤組織中起到靶向給藥的作用，結(jié)合光照還可以發(fā)揮出更為優(yōu)秀的抗腫瘤活性。本發(fā)明提供的水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物可以作為一種良好的磁共振成像造影劑。測(cè)試表明，該衍生物具有良好的負(fù)性增強(qiáng)效果，MR對(duì)腫瘤顯影的效果良好，并可以通過(guò)體內(nèi)光熱治療，利用MR對(duì)腫瘤治療效果進(jìn)行監(jiān)測(cè)。因此，該水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物衍生物有望在腫瘤的診斷和治療中大有作為。預(yù)期可以用于治療腫瘤的一種良好的熱敏劑，可以作為化學(xué)藥物、蛋白質(zhì)、核酸的轉(zhuǎn)運(yùn)載體，還可以作為磁共振成像造影劑，是藥物制備上的一大創(chuàng)新。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下突出的有益技術(shù)效果: I)本發(fā)明的新的水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物不會(huì)對(duì)氧化石墨烯本身的特性進(jìn)行破壞，水分散性強(qiáng)，對(duì)生物體的毒性很低，物理以及化學(xué)穩(wěn)定性良好，質(zhì)量好，制備的條件容易滿足，原料來(lái)源豐富，成本低。2)本發(fā)明提供的水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物可以作為抗腫瘤熱敏治療的一種良好的熱敏劑，光照時(shí)產(chǎn)生熱能夠發(fā)揮抗腫瘤活性，而不光照時(shí)則毒副副作用很小，可以根據(jù)光的聚焦等手段來(lái)選擇性的殺傷腫瘤組織和細(xì)胞。3)本發(fā)明提供的水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物可以作為一種良好的抗腫瘤藥物的載體，有著極小的毒性，較強(qiáng)的水溶性,生物相容性好，比表面積大,化學(xué)惰性高,具有緩釋性和靶向性，結(jié)合激光還可以發(fā)揮出更為優(yōu)秀的抗腫瘤效果。4)本發(fā)明提供的水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物可以作為一種良好的磁共振成像造影劑，有著較好的負(fù)性增強(qiáng)效果，腫瘤顯影效果好，并可以通過(guò)體內(nèi)光熱治療，利用磁共振對(duì)腫瘤治療效果進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
權(quán)利要求
1.一種水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物，其特征在于，將氧化石墨烯通過(guò)化學(xué)沉淀法負(fù)載上具有磁性的四氧化三鐵，然后連接上親水基團(tuán)，即成水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物，該氧化石墨烯衍生物中，四氧化三鐵和氧化石墨烯的質(zhì)量比為1-11:1 ;所述的氧化石墨烯為納米級(jí)氧化石墨烯。
2.權(quán)利要求1所述的水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)將氧化石墨烯45-55mg充分溶解于18_22ml體積比為1:19的乙二醇和二縮醇組成的混合溶劑中，加入醋酸鈉1.35-1.65g，三價(jià)鐵鹽0.48-0.60g，超聲溶解后移至反應(yīng)釜中，200°C反應(yīng)10h，反應(yīng)后的產(chǎn)物每次用20-25ml的無(wú)水乙醇，洗滌3_4次，再每次用25_30ml的超純水，洗滌4-5次，之后，20-60°C抽真空干燥24-56h，得到四氧化三鐵負(fù)載的氧化石墨烯；所述三價(jià)鐵鹽為氯化鐵、溴化鐵、碘酸鐵、高氯酸鐵、次氯酸鐵、硝酸鐵、硫酸鐵、硫化鐵、磷酸鐵、磷酸一氫鐵、磷酸二氫鐵、碳酸鐵、醋酸鐵、硅酸鐵、高錳酸鐵中的一種； 2)將上述四氧化三鐵負(fù)載的氧化石墨烯45-55mg，水溶性物質(zhì)180_220mg，1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽170-190mg，N-羥基琥珀酰亞胺100_120mg超聲分散于45-55ml磷酸鹽緩沖液中，室溫18_25°C反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后，加入50-100ml無(wú)水乙醇使其沉淀，抽濾，然后每次用20-25ml的無(wú)水乙醇，洗滌8-10次，20_60°C抽真空干燥24-56h，得到水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物；所述水溶性物質(zhì)為氨基聚乙二醇2000、氨基聚乙二醇4000、氨基聚乙二醇6000、氨基聚乙二醇8000、聚乙烯亞胺、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、氨基透明質(zhì)酸、氨基酸、核酸、氨基淀粉類、氨基纖維素中的一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物的制備方法，其特征在于，I)將氧化石墨烯50mg充分溶解于20ml體積比為1:19的乙二醇和二縮醇組成的混合溶劑中，加入醋酸鈉1.5g，三氯化鐵0.54g，超聲溶解后移至反應(yīng)釜中，2000C反應(yīng)10h，反應(yīng)后的產(chǎn)物每次用20ml的無(wú)水乙醇，洗滌3次，再每次用25ml的超純水，洗滌5次，之后，60°C抽真空干燥24h，得到四氧化三鐵負(fù)載的氧化石墨烯85mg ； 2)取上述四氧化三鐵負(fù)載的氧化石墨烯50mg，聚乙酰亞胺200mg，1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽180mg,N-輕基琥拍酰亞胺IlOmg,超聲分散于50ml磷酸鹽緩沖液中，室溫18-25°C反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后，加入60ml無(wú)水乙醇使其沉淀，抽濾，然后每次用20ml的無(wú)水乙醇，洗滌10次，60°C抽真空干燥24h，得到水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物 35mg。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物的制備方法，其特征在于，I)將氧化石墨烯54mg充分溶解于21ml體積比為1:19的乙二醇和二縮醇組成的混合溶劑中，加入醋酸鈉1.6g，三氯化鐵0.58g，超聲溶解后移至反應(yīng)釜中，200°C反應(yīng)10h，產(chǎn)物每次用23ml的無(wú)水乙醇，洗滌4次，再每次用28ml的超純水，洗滌5次，之后，55°C抽真空干燥24h,得到四氧化三鐵負(fù)載的氧化石墨烯88mg ； 2)將上述四氧化三鐵負(fù)載的氧化石墨烯54mg，氨基聚乙二醇2000 218mg，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽190mg, N-輕基琥拍酰亞胺118mg,超聲充分分散于53ml磷酸鹽緩沖液中，室溫18-25°C反應(yīng)24h,反應(yīng)結(jié)束后,加入80ml無(wú)水乙醇使其沉淀，抽濾，然后每次用20ml的無(wú)水乙醇，洗滌10次，50°C抽真空干燥48h，得到水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物40mg。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物的制備方法，其特征在于，I)將氧化石墨烯45mg充分溶解于18ml體積比為1:19的乙二醇和二縮醇組成的混合溶劑中，加入醋酸鈉1.35g，三氯化鐵0.48g，超聲溶解后移至反應(yīng)釜中，200°C反應(yīng)10h，產(chǎn)物每次用20ml的無(wú)水乙醇，洗滌3次，再每次用30ml的超純水，洗滌4次，之后，55°C抽真空干燥36h,得到四氧化三鐵負(fù)載的氧化石墨烯80mg ； 2)將上述四氧化三鐵負(fù)載的氧化石墨烯52mg，氨基葡萄糖210mg，1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽185mg, N-輕基琥拍酰亞胺112mg,超聲充分分散于52ml磷酸鹽緩沖液中，室溫18-25°C反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后，加入60ml無(wú)水乙醇使其沉淀,抽濾,然后每次用25ml的無(wú)水乙醇，洗滌8次，60°C抽真空干燥24h，得到水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物36mg。
6.權(quán)利要求1或2-5任一項(xiàng)所述的水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物，其特征在于，該水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物以納米聚集物的形式存在。
7.權(quán)利要求1或2-5任一項(xiàng)所述的水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物的粒徑為100_200nmo
8.權(quán)利要求1或2-5任一項(xiàng)所述的水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物在抗腫瘤熱動(dòng)力治療熱敏劑中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1或2-5任一項(xiàng)所述的水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物作為藥物載體在抗腫瘤藥物中的 應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1或2-5任一項(xiàng)所述的水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物在磁共振成像造影劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物的制備方法及其應(yīng)用，可有效解決現(xiàn)有技術(shù)療效低，副作用大的問(wèn)題，其解決的技術(shù)方案是，將氧化石墨烯通過(guò)化學(xué)沉淀法負(fù)載上具有磁性的四氧化三鐵，然后連接上親水基團(tuán)，即成水溶性磁靶向性氧化石墨烯衍生物，該氧化石墨烯衍生物中，四氧化三鐵和氧化石墨烯的質(zhì)量比為1-11:1；所述的氧化石墨烯為納米級(jí)氧化石墨烯，本發(fā)明物理以及化學(xué)穩(wěn)定性良好，原料來(lái)源豐富，成本低，生物相容性好，具有緩釋性和靶向性，是抗腫瘤藥物上的創(chuàng)新。
文檔編號(hào)C01B3/00GK103183311SQ201310138540
公開(kāi)日2013年7月3日 申請(qǐng)日期2013年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月19日
發(fā)明者史進(jìn)進(jìn), 高君, 王蕾, 劉瑞瑗, 張振中, 張靜, 余曉媛, 劉艷, 馬柔柔, 馬丹 申請(qǐng)人:鄭州大學(xué)