專利名稱：一種抗hcv ns3/4a蛋白的人源性單鏈抗體基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因，尤其是涉及一種抗HCV NS3/4A蛋白的人源性單鏈抗體基因及其重組載體和表達(dá)產(chǎn)物，屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
自 1989 年 Choo 等(Choo，Q L, Kuo, G, Weiner, A J, Overby, L R, Bradley,M.1solation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viralhepatitis genome. Science, 1989, 244:359.)確認(rèn)丙型肝炎病毒(HCV)是非甲非型乙肝炎的主要病原因子以來，抗病毒一直是HCV研究的一個(gè)重要領(lǐng)域。迄今僅有的治療方案是長效干擾素與利巴韋林聯(lián)合使用，但它在各亞型中總的療效低于50%。而且這種療法副作用大，成本高。因此，尋找特異有效的治療藥物和改進(jìn)現(xiàn)有的治療方法是抗HCV研究的重要方向。NS3/4A蛋白酶是NS3N末端的180aa和共作用因子NS4A蛋白組成的異源二聚體。它具有胰 靡蛋白樣絲氨酸蛋白酶活性，在多聚蛋白前體加工成熟中起著重要作用(BartenschlagerR,Ahlborn-Laake L, Mous J, et al. Kinetic and structural analyses of hepatitis Cvirus polyprotein processing. Journal of virology, 1994，68 (8) : 5045-55)。多項(xiàng)石開究表明NS3/4A絲氨酸蛋白酶通過調(diào)控干擾素調(diào)控因子-3 (IRF-3)的表達(dá)水平，從而破壞細(xì)胞內(nèi)免疫通路，這提示該酶抑制劑有雙重作用，即阻斷病毒加工成熟和恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)免疫防御反應(yīng)(Gale M Jr, Foy EM. Evasion of intracellular host defence by hepatitisC virus. Nature, 2005, 436(7053) :939-45)。以NS3/4A絲氨酸蛋白酶為靶點(diǎn)的抑制劑聯(lián)合治療方案在臨床抗病毒治療中亦取得較好的治療效果，然而編碼這些蛋白的病毒基因變異很快，長期用藥后變異病毒株很容易對治療藥物產(chǎn)生耐藥性，將會限制這些藥物的廣泛應(yīng)用(Reesink H. ff. , Zeuzem S. , Weegink C. J. , et al. , Rapid decline ofviral RNA inhepatitis C patients treated with VX-950:a phase lb, placebo-controlled, randomized study. Gastroenterology, 2006. 131 (4) :p. 997)。因此需要對新的抗HCV治療策略進(jìn)行更廣泛的探索。鑒于抗原抗體之間的共價(jià)結(jié)合具有特異、穩(wěn)定等特點(diǎn)，如用單鏈抗體(ScFv)拮抗NS3/4A絲氨酸蛋白酶活性，可能會為抗HCV感染帶來新的途徑。ScFv是一種新型的基因工程抗體，由抗體的重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)通過一段短肽(Linker)連接而成，其相對分子質(zhì)量小，結(jié)構(gòu)簡單,免疫原性低,但卻較好地保持了親和力。ScFv的基因通過載體攜帶進(jìn)入靶細(xì)胞后表達(dá)抗體蛋白，或者與蛋白穿膜結(jié)構(gòu)域(PTD)重組并表達(dá)出融合抗體蛋白，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與相應(yīng)的目標(biāo)分子結(jié)合，從而阻止這些分子生物學(xué)功能的發(fā)揮，達(dá)到使目標(biāo)分子功能失活的目的。這種在細(xì)胞內(nèi)的抗體通過抗原抗體特異結(jié)合，調(diào)節(jié)靶分子構(gòu)型轉(zhuǎn)換與細(xì)胞內(nèi)定位影響其生物功能的發(fā)揮，即可將病毒復(fù)制及裝配過程中的關(guān)鍵分子選擇性的“敲除”，是目前一種新的抗感染治療方法(Lobato MN, et al, Intracellular antibodies as specific reagents for functionalablation : future therapeutic molecules. Curr Mol Med.4(5):519-28 (2004).Hope-Stone, L. Sena, J. Martin, K. L. Adamson, A. Robbins, M. Stocks, Intrabodies as drugdiscovery tools and therapeutics, Curr Opin Chem Biol (2005)。譬如，Tewari 等將HIV pl7的ScFv編碼基因轉(zhuǎn)染HIV感染細(xì)胞中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生具有感染能力的HIV病毒顆粒的數(shù)量顯著降低(Tewari D, et al. cDNA encoding a single-chain antibody to HIVpl7with cytoplasmic or nuclear retention signals inhibits HIV-1replication.J Immunol. 161(5) :2642-7 (1998))。Herschhorn等利用卩遼菌體抗體庫技術(shù)得到逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)的ScFv基因，將其轉(zhuǎn)染HIV感染細(xì)胞后，產(chǎn)生的單鏈抗體可以結(jié)合RT，并且能夠抑制 HIV RNA 的復(fù)制(Herschhorn A, et al Recombinant human antibodies against thereverse transcriptase of human immunodeficiency virus type-1. Biochim BiophysActa. 1648(1-2) :154-63 (2003)。Jendreyko (2005)。由此可見，ScFv 在細(xì)胞內(nèi)可以阻斷或調(diào)節(jié)靶分子的生物功能達(dá)到治療的目的。人源性ScFv免疫源性小，被認(rèn)為是最為安全的一種形式。核糖體展示抗體庫技術(shù)在制備ScFv，尤其是人源抗體方面有著巨大的優(yōu)勢整個(gè)過程均在細(xì)胞外進(jìn)行，不需要轉(zhuǎn)化細(xì)胞，因此可獲得大容量庫(IO11 -1O13);避免了細(xì)胞內(nèi)、外操作的頻繁轉(zhuǎn)換，大大縮短篩選周期，簡化了操作；可以調(diào)整篩選壓力，如添加競爭性抗原或篩選延時(shí)等從而改善抗 體識別表位及穩(wěn)定性、親和力等特性；與體外突變方法的偶聯(lián)，如結(jié)合定點(diǎn)突變技術(shù)、DNAshuffling等,可短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)單鏈抗體的體外親和力成熟。該技術(shù)制備ScFv的主要流程首先構(gòu)建ScFv (Vj1-Linker-Vlj)的cDNA文庫；建立其核糖體展示模板；該模板在體外轉(zhuǎn)錄與翻譯系統(tǒng)下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯，形成ScFv-核糖體-mRNA三聚體；將目標(biāo)蛋白特異性的配基固相化，篩選含有ScFv的核糖體三聚體；對篩選分離得到的復(fù)合物進(jìn)行分解，釋放出的mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶鏈聚合反應(yīng)，PCR產(chǎn)物進(jìn)入下一輪循環(huán)，經(jīng)過多次循環(huán)，最終可使ScFv及其編碼的基因序列得到富集和分離。核糖體展示技術(shù)具有上述明顯優(yōu)勢，因此備受關(guān)注和重視，例如英國劍橋抗體技術(shù)工程中心已將該技術(shù)作為核心技術(shù)平臺開發(fā)完全人源性的治療抗體(He M, Cooley N，Production of human single-chain antibodies by ribosomedisplay. Methods Mol Biol.248:177-89 (2004 ；Groves MA, et al, Applications ofribosome display to antibody drug discovery. Expert Opin Biol Ther. 5 (I):125-35(2005)。基于上述理論和技術(shù)的發(fā)展，我們以在HCV蛋白前體加工成熟起著關(guān)鍵作用的NS3/4A絲氨酸蛋白酶為靶標(biāo)，從HCV陽性的患者PBLs中提取mRNA構(gòu)建ScFv基因文庫，利用完全體外篩選、高庫容的核糖體展示庫技術(shù)來制備針對NS3/4A絲氨酸蛋白酶的人源性ScFv,將篩選到的ScFv基因構(gòu)建表達(dá)載體并進(jìn)行表達(dá)和初步鑒定。這對于利用人ScFv作為治療抗體進(jìn)行抗HCV研究具有重要的理論和實(shí)踐意義，同時(shí)為制備人源基因工程抗體開辟新的途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種抗HCV NS3/4A蛋白的人源性單鏈抗體基因，并提供所述抗HCV NS3/4A蛋白的人源性單鏈抗體基因的制備方法和表達(dá)載體構(gòu)建及表達(dá)。本發(fā)明的技術(shù)方案是一種抗HCV NS3/4A蛋白的人源性單鏈抗體基因，其特征是所述抗HCV NS3/4A蛋白的人源性單鏈抗體基因是由連接肽連接抗體的VL和VH基因組成。
所述連接肽連接抗體的VL和VH基因共由729個(gè)堿基組成，Nol :其核苷酸序列ATGGAGGTGCAGCTCGAGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGCGGTGGTAACACATACTACGCAGAGTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACGATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTTCTGTGCGAAAGTAAGGTTCGGGGAGTTATCATCAATTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGGAGTGCATCCGCCCCAACCCTTTTCCCCCTCGTCTCCGACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCTCCCTGGCTGCATCTGTGGGGGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCGAGCCAGCATATTAGCAATTCTTTGGCCTGGTATCAGCAGAGACCAGGCAAAGTTCCCAGTCTCCTGATCTATAGGGCGTCCACTTTACAATCAGGGGTCACATCTCGCTTCAGCGGCAGTGGATTTGGGACGCACTTCGCTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAGGATGTTGCGACTTACTAT TGTCAAATGCATGACAGCGCCCCCGGCACTTTTGGCCAGGGGACCAAGGTGGAGATCAATCGAACTNo2:其氨基酸序列MEVQLEESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGNTYYAESVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAKVRFGELSSIDYWGQGTLVTVSSGSASAPTLFPLVSDIQMTQSPSSLAASVGDRVTITCRASQHISNSLAWYQQRPGKVPSLLIYRASTLQSGVTSRFSGSGFGTHFALTISSLQPEDVATYYCQMHDSAPGTFGQGTKVEINRT**為終止碼。所述抗HCV NS3/4A蛋白的人源性單鏈抗體基因的制備方法包括如下步驟步驟
I)制備核糖展示單鏈抗體文庫；步驟2)克隆抗NS3/4A蛋白的單鏈抗體基因；步驟3)構(gòu)建蛋白穿膜域PTD與抗NS3/4A蛋白的單鏈抗體基因融合表達(dá)載體；步驟4)制備PTD-NS3/4A scFv的蛋白表達(dá)；步驟5) PTD-NS3/4A scFv蛋白阻斷HCV復(fù)制的效應(yīng)評價(jià)。所述制備核糖展示單鏈抗體文庫是用分離的HCV陽性患者外周血淋巴細(xì)胞提取mRNA，合成cDNA并擴(kuò)增重鏈和輕鏈可變區(qū)基因，構(gòu)建核糖體展示單鏈抗體文庫。所述克隆抗NS3/4A蛋白的單鏈抗體基因是將步驟I)獲得的核糖體展示單鏈抗體庫制備ScFv-核糖體-mRNA復(fù)合物，以表達(dá)純化的NS3/4A蛋白固相化于磁珠上進(jìn)行篩選，經(jīng)過3輪篩選和富集，最后一輪DNA轉(zhuǎn)入到噬菌體pHENl載體并轉(zhuǎn)化HB2151，誘導(dǎo)表達(dá)后取上清進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，確定I個(gè)結(jié)合活性最強(qiáng)的單鏈抗體。所述構(gòu)建蛋白穿膜域PTD與抗NS3/4A蛋白的單鏈抗體基因融合表達(dá)載體是將步驟2)獲得單鏈抗體基因克隆入pET-PTD載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，獲得重組表達(dá)載體pET-PTD-NS3/4A-scFv。所述制備PTD-NS3/4A scFv的蛋白表達(dá)是用LB培養(yǎng)液培養(yǎng)步驟3)重組表達(dá)載體pET-PTD-NS3/4A-scFv，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)8小時(shí)，SDS-PAGE顯示表達(dá)率可達(dá)25%以上。所述PTD-NS3/4A scFv蛋白阻斷HCV復(fù)制的效應(yīng)評價(jià)是將步驟4)制備的PTD-NS3/4A scFv蛋白按照不同劑量加入HCV感染細(xì)胞Huh7. 5JFH-1 ;48h后收集細(xì)胞，提取RNA后進(jìn)行Real-time PCR定量檢測HCV RNA ;從而觀察PTD-NS3/4A scFv蛋白在HCV感染細(xì)胞內(nèi)的抑制效應(yīng)
本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明提供抗HCV NS3/4A蛋白的人源性單鏈抗體是具有潛在抑制HCV病毒復(fù)制的單鏈抗體。抗HCV NS3/4A蛋白的人源性單鏈抗體基因是由一條連接肽將VL和VH基因連在一起所形成的單一肽鏈，通過正確折疊們兩個(gè)可變區(qū)由非共價(jià)鍵形成具有抗原結(jié)合功能的片段，抗HCV NS3/4A蛋白的人源性單鏈抗體分子量小，而且與NS3/4A蛋白具有較強(qiáng)的親和力，與蛋白穿膜域融合后進(jìn)入HCV感染細(xì)胞內(nèi)抑制NS3/4A蛋白酶活性，從而降低病毒的復(fù)制水平。下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖對本發(fā)明進(jìn)一步說明，但不作為本發(fā)明的限定。


圖1為抗NS3/4A蛋白的單鏈抗體基因的表達(dá)載體不意圖；圖2 為 PTD-NS3/4A_scFv 蛋白表達(dá)的 SDS-PAGE 表達(dá)圖；·其中，M: Marker;1:未誘導(dǎo)的BL21菌；2:1PTG誘導(dǎo)的BL21全菌；3:誘導(dǎo)菌經(jīng)超聲波處理過的上清；4:誘導(dǎo)菌經(jīng)超聲波處理過的沉淀。箭頭所指的為NS3/4A蛋白的單鏈抗體表達(dá)條帶；圖3為PTD-NS3/4A scFv蛋白阻斷HCV復(fù)制效應(yīng)的結(jié)果；可以看出，隨著PTD-NS3/4A scFv蛋白濃度的增加，與PBS相比，HCV感染細(xì)胞Huh7. 5-JFH-1中病毒RNA拷貝數(shù)呈減少趨勢，使HCV復(fù)制水平可降低IO3數(shù)量級。
具體實(shí)施例方式1.核糖展示單鏈抗體文庫的構(gòu)建抽取HCV陽性志愿者外周血50mL，每毫升血加入5個(gè)單位肝素。用等量PBS稀釋外周血，并與淋巴細(xì)胞分離液以1:1的比例混合。2500rpm，離心20min，吸取淋巴細(xì)胞層。按每5 X IO6個(gè)淋巴細(xì)胞加入Iml TRIzol的比例裂解淋巴細(xì)胞，提取總RNA。利用NanoDropND-1000紫外分光光度計(jì)和甲醛變性電泳檢測提取RNA的濃度和純度。以O(shè)ligo(ClT)18為引物，利用M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA第一鏈。以一段HuIgM基因做為重鏈與輕鏈之間的連接肽序列，設(shè)計(jì)并合成一組特異性引物。以cDNA第一條鏈為模板，分別擴(kuò)增9種VH-1inker基因、6種Vk基因、11種VA基因以及作為核糖體展示模板間隔區(qū)的Ck基因。反應(yīng)條件為94°C變性5min，然后進(jìn)人循環(huán)，94°C變性30S，56°C退火30S，72°C延伸Imin，共30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸7min。切膠回收各種PCR產(chǎn)物，并用紫外分光光度計(jì)測定OD28tl值。將9種VH-1 inker PCR純化產(chǎn)物等量混合、6種V k PCR純化產(chǎn)物等量混合、11種V入PCR純化產(chǎn)物等量混合。利用引物上設(shè)計(jì)的互補(bǔ)序列，采用帶有17啟動子和Kozak序列的I7Ab/back引物進(jìn)行S0E-PCR，將單鏈抗體基因片段進(jìn)行拼接，構(gòu)建起完整的核糖體展示模板。2.NS3/4A蛋白抗體可變區(qū)基因的克隆核糖體展示模板在I7RNA聚合酶催化下進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)兔網(wǎng)織紅細(xì)胞系統(tǒng)翻譯，獲得ScFv-核糖體-mRNA，即單鏈抗體文庫，行SDS-PAGE進(jìn)行鑒定。將NS3/4A蛋白固相化到磁珠上，對上述獲得ScFv-核糖體-mRNA復(fù)合物經(jīng)過3輪篩選和富集。取最后一次富集后的單鏈抗體文庫DNA轉(zhuǎn)入到噬菌體pHENl載體并轉(zhuǎn)化HB2151，誘導(dǎo)表達(dá)后取上清進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，其中有I個(gè)單鏈抗體結(jié)合活性較強(qiáng)。將其送到公司測序后，根據(jù)單鏈抗體的測序結(jié)果推算氨基酸序列，運(yùn)用V-base軟件分析框架區(qū)和⑶R區(qū)，顯示具有完整的抗體互補(bǔ)決定區(qū)⑶R1，⑶R2，CDR3以及抗體骨架區(qū)FRl，F(xiàn)R2，F(xiàn)R3和FR4。3.蛋白穿膜結(jié)構(gòu)域PTD與抗NS3/4A蛋白的單鏈抗體基因融合表達(dá)載體的構(gòu)建將上述單鏈抗體基因和表達(dá)載體pET-PTD經(jīng)NdeI和BamHI雙切后行瓊脂糖電泳，純化回收后按照摩爾濃度1:3比例混合表達(dá)scFv基因和表達(dá)載體，用T4連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21，獲得重組表達(dá)載體pET-PTD-NS3/4A-scFv。(見圖1)4. PTD-NS3/4A-scFv 蛋白表達(dá)將重組表達(dá)載體pET16b-NS3/4A-scFv轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株BL21感受態(tài)細(xì)胞， 鋪平板后置于37°C孵箱中。次日挑取單個(gè)菌落于5mL LB培養(yǎng)基中，37°C振搖過夜。按1:50將過夜菌加入5mL LB培養(yǎng)基中37°C振搖:T4小時(shí)h后，測定OD值。約0. 4^0. 6時(shí)加入IPTG至終濃度lmmol/L，37°C繼續(xù)振搖4飛小時(shí)后。收集ImL菌液沉淀，加入100裂解緩沖液在冰浴上超聲破碎，離心后分別取上清和沉淀。經(jīng)上樣Buffer處理后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠浸泡于考馬斯亮藍(lán)染液染I小時(shí)。脫色液脫色至背景清晰。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)8小時(shí)，SDS-PAGE顯示表達(dá)率可達(dá)25%以上(見圖2)。5. PTD-NS3/4A scFv蛋白阻斷HCV復(fù)制的效應(yīng)評價(jià)將PTD-NS3/4A scFv蛋白按照0. 5、1、2、4、8 y g/ml的劑量分別加入HCV感染細(xì)胞Huh7. 5JFH-1。48h后收集細(xì)胞，提取RNA后進(jìn)行Real-time PCR定量檢測HCV RNA。結(jié)果顯示，與PBS對照組相比，隨著PTD-scFvPTD-NS3/4A scFv劑量的增加，JFH_lHuh7. 5細(xì)胞中病毒RNA拷貝數(shù)呈減少趨勢，使HCV復(fù)制水平可降低3個(gè)數(shù)量級(見圖3)。由以上可制得本發(fā)明這種一種抗HCV NS3/4A蛋白的人源性單鏈抗體基因及其重組載體和表達(dá)產(chǎn)物。所述抗HCV NS3/4A蛋白的人源性單鏈抗體基因是由連接肽連接抗體的VL和VH基因組成；所述連接肽連接抗體的VL和VH基因是由729個(gè)堿基組成；Nol :其核苷酸序列ATGGAGGTGCAGCTCGAGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGCGGTGGTAACACATACTACGCAGAGTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACGATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTTCTGTGCGAAAGTAAGGTTCGGGGAGTTATCATCAATTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGGAGTGCATCCGCCCCAACCCTTTTCCCCCTCGTCTCCGACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCTCCCTGGCTGCATCTGTGGGGGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCGAGCCAGCATATTAGCAATTCTTTGGCCTGGTATCAGCAGAGACCAGGCAAAGTTCCCAGTCTCCTGATCTATAGGGCGTCCACTTTACAATCAGGGGTCACATCTCGCTTCAGCGGCAGTGGATTTGGGACGCACTTCGCTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAGGATGTTGCGACTTACTATTGTCAAATGCATGACAGCGCCCCCGGCACTTTTGGCCAGGGGACCAAGGTGGAGATCAATCGAACTNo2 :其氨基酸序列MEVQLEESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGNTYYAESVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAKVRFGELSSIDYWGQGTLVTVSSGSASAPTLFPLVSDIQMTQSPSSLAASVGDRVTITCRASQHISNSLAWYQQRPGKVPSLLIYRASTLQSGVTSRFSGSGFGTHFALTISSLQPEDVATYYCQMHDSAPGTFGQGTKVEINRT**為終止碼。所述一種抗HCV NS3/4A蛋白的人源性單鏈抗體基因，并通過構(gòu)建表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)。 本發(fā)明的特點(diǎn)是一種抗HCV NS3/4A蛋白的人源性單鏈抗體基因，是由連接肽連接抗體的VL和VH基因組成。由于該人單鏈抗體與NS3/4A蛋白具有很高的親和力，與蛋白穿膜域PTD融合后可進(jìn)入HCV感染細(xì)胞內(nèi)抑制NS3/4A蛋白酶活性，從而降低病毒的復(fù)制水平。本實(shí)施例沒有詳細(xì)敘述的部分和英文縮寫屬本行業(yè)的公知常識，在網(wǎng)上可以搜索 至IJ，這里不一一敘述。序列表Nol :其核苷酸序列ATGGAGGTGCAGCTCGAGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGCGGTGGTAACACATACTACGCAGAGTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACGATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTTCTGTGCGAAAGTAAGGTTCGGGGAGTTATCATCAATTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGGAGTGCATCCGCCCCAACCCTTTTCCCCCTCGTCTCCGACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCTCCCTGGCTGCATCTGTGGGGGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCGAGCCAGCATATTAGCAATTCTTTGGCCTGGTATCAGCAGAGACCAGGCAAAGTTCCCAGTCTCCTGATCTATAGGGCGTCCACTTTACAATCAGGGGTCACATCTCGCTTCAGCGGCAGTGGATTTGGGACGCACTTCGCTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAGGATGTTGCGACTTACTATTGTCAAATGCATGACAGCGCCCCCGGCACTTTTGGCCAGGGGACCAAGGTGGAGATCAATCGAACTNo2 :其氨基酸序列MEVQLEESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGNTYYAESVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAKVRFGELSSIDYWGQGTLVTVSSGSASAPTLFPLVSDIQMTQSPSSLAASVGDRVTITCRASQHISNSLAWYQQRPGKVPSLLIYRASTLQSGVTSRFSGSGFGTHFALTISSLQPEDVATYYCQMHDSAPGTFGQGTKVEINRT**為終止碼。
權(quán)利要求
1.一種抗HCV NS3/4A蛋白的人源性單鏈抗體基因，其特征是所述抗HCV NS3/4A蛋白的人源性單鏈抗體基因是由連接肽連接抗體的VL和VH基因組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗HCVNS3/4A蛋白的人源性單鏈抗體基因，其特征是所述連接肽連接抗體的VL和VH基因共由729個(gè)堿基組成， Nol :其核苷酸序列ATGGAGGTGCAGCTCGAGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGCGGTGGTAACACATACTACGCAGAGTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACGATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTTCTGTGCGAAAGTAAGGTTCGGGGAGTTATCATCAATTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGGAGTGCATCCGCCCCAACCCTTTTCCCCCTCGTCTCCGACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCTCCCTGGCTGCATCTGTGGGGGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCGAGCCAGCATATTAGCAATTCTTTGGCCTGGTATCAGCAGAGACCAGGCAAAGTTCCCAGTCTCCTGATCTATAGGGCGTCCACTTTACAATCAGGGGTCACATCTCGCTTCAGCGGCAGTGGATTTGGGACGCACTTCGCTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAGGATGTTGCGACTTACTATTGTCAAATGCATGACAGCGCCCCCGGCACTTTTGGCCAGGGGACCAAGGTGGAGATCAATCGAACT No2 :其氨基酸序列MEVQLEESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGNTYYAESVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAKVRFGELSSIDYWGQGTLVTVSSGSASAPTLFPLVSDIQMTQSPSSLAASV⑶RVTITCRASQHISNSLAWYQQRPGKVPSLLIYRASTLQSGVTSRFSGSGFGTHFALTISSLQPEDVATYYCQMHDSAPGTFGQGTKVEINRT* *為終止碼。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗HCVNS3/4A蛋白的人源性單鏈抗體基因，其特征是所述抗HCV NS3/4A蛋白的人源性單鏈抗體基因的制備方法包括如下步驟步驟I)制備核糖展示單鏈抗體文庫； 步驟2)克隆抗NS3/4A蛋白的單鏈抗體基因； 步驟3)構(gòu)建蛋白穿膜域PTD與抗NS3/4A蛋白的單鏈抗體基因融合表達(dá)載體； 步驟4)制備PTD-NS3/4A scFv的蛋白表達(dá)； 步驟5) PTD-NS3/4A scFv蛋白阻斷HCV復(fù)制的效應(yīng)評價(jià)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種抗HCVNS3/4A蛋白的人源性單鏈抗體基因，其特征是所述制備核糖展示單鏈抗體文庫是用分離的HCV陽性患者外周血淋巴細(xì)胞提取mRNA，合成cDNA并擴(kuò)增重鏈和輕鏈可變區(qū)基因，構(gòu)建核糖體展示單鏈抗體文庫。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種抗HCVNS3/4A蛋白的人源性單鏈抗體基因，其特征是所述克隆抗NS3/4A蛋白的單鏈抗體基因是將步驟I)獲得的核糖體展示單鏈抗體庫制備ScFv-核糖體-mRNA復(fù)合物，以表達(dá)純化的NS3/4A蛋白固相化于磁珠上進(jìn)行篩選，經(jīng)過3輪篩選和富集，最后一輪DNA轉(zhuǎn)入到噬菌體pHENl載體并轉(zhuǎn)化HB2151，誘導(dǎo)表達(dá)后取上清進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，確定I個(gè)結(jié)合活性最強(qiáng)的單鏈抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種抗HCVNS3/4A蛋白的人源性單鏈抗體基因，其特征是所述構(gòu)建蛋白穿膜域PTD與抗NS3/4A蛋白的單鏈抗體基因融合表達(dá)載體是將步驟2)獲得單鏈抗體基因克隆入pET-PTD載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，獲得重組表達(dá)載體pET-PTD-NS3/4A-scFv0
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種抗HCVNS3/4A蛋白的人源性單鏈抗體基因，其特征是所述制備PTD-NS3/4A scFv的蛋白表達(dá)是用LB培養(yǎng)液培養(yǎng)步驟3)重組表達(dá)載體 pET-PTD-NS3/4A-scFv，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)8小時(shí)，SDS-PAGE顯示表達(dá)率可達(dá)25%以上。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種抗HCVNS3/4A蛋白的人源性單鏈抗體基因，其特征是所述PTD-NS3/4A scFv蛋白阻斷HCV復(fù)制的效應(yīng)評價(jià)是將步驟4)制備的PTD-NS3/4A scFv蛋白按照不同劑量加入HCV感染細(xì)胞Huh7. 5JFH-1 ；48h后收集細(xì)胞，提取RNA后進(jìn)行 Real-time PCR定量檢測HCV RNA ;從而觀察PTD-NS3/4A scFv蛋白在HCV感染細(xì)胞內(nèi)的抑制效應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明涉一種抗HCV NS3/4A蛋白的人源性單鏈抗體基因，并提供所述抗HCV NS3/4A蛋白的人源性單鏈抗體基因的制備方法和表達(dá)載體構(gòu)建及表達(dá)。所述抗HCV NS3/4A蛋白的人源性單鏈抗體基因，是由連接肽連接抗體的VL和VH基因建立，所述抗HCV NS3/4A蛋白的人源性單鏈抗體基因具體共由729個(gè)堿基組成。由于該人單鏈抗體與NS3/4A蛋白具有很高的親和力，與蛋白穿膜域融合表達(dá)可進(jìn)入HCV感染細(xì)胞抑制病毒的復(fù)制水平。
文檔編號C40B50/06GK103014011SQ201210493408
公開日2013年4月3日 申請日期2012年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月27日
發(fā)明者楊敬, 徐志凱, 雷迎峰, 陳仁安, 汪樺, 尹文, 呂欣, 田江紅 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)