專利名稱：微球的隨機(jī)陣列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及生物學(xué)或傳感器微陣列技術(shù)。具體而言，本發(fā)明涉及涂覆在基片上的微陣列，其中所述基片在涂覆前不含有用來吸引微球的位置。
背景技術(shù)：
自從在二十世紀(jì)九十年代早期發(fā)明了通過在二維固體載體上以空間可尋址的形式合成生物活性探針而形成高密度陣列以來，所述高密度陣列已經(jīng)顯著改善和簡化了生物學(xué)研究和發(fā)展的過程(參見Science，251，767-773，1991)。目前，微陣列技術(shù)的關(guān)鍵在于以“空間可尋址”方式在微芯片上的單個點(diǎn)沉積生物活性劑。
目前的技術(shù)采用了各種方法來制備微陣列。例如，美國專利No.5412087和5489678證實(shí)了可以采用光刻法制備肽和DNA微陣列。這些專利教導(dǎo)了采用對光不穩(wěn)的保護(hù)基團(tuán)，通過光刻法在1cm×1cm芯片上連續(xù)循環(huán)去除對某限定點(diǎn)的保護(hù)，然后在整個表面灌滿活性氨基酸或DNA堿基，來制備肽和DNA微陣列。重復(fù)這種方法，使得能夠構(gòu)建出在陣列上不同點(diǎn)處具有數(shù)千個任意不同肽或寡核苷酸序列的肽或DNA微陣列。這種方法成本很高。其它研究人員正在采用噴墨方法(例如，美國專利No.6079283、6083762和6094966)來制備空間可尋址陣列，但是這種技術(shù)也受到高制造成本的困擾，而且陣列點(diǎn)的尺寸相對較大，為40-100微米。由于在單一芯片上放置的生物活性探針數(shù)目通常是1000-100000，所以空間尋址方法本身就很昂貴，這和芯片的制備方法無關(guān)。
可替換空間尋址方法的方法是采用整合了熒光染料的聚合物珠子來制備生物多重陣列的概念。美國專利No5981180公開了組合采用顏色編碼珠子和流式細(xì)胞儀來進(jìn)行多重生物學(xué)測定的方法。表面上綴合有DNA或單克隆抗體探針的微球采用各種比例的兩種不同熒光染料進(jìn)行內(nèi)部染色。允許數(shù)百“空間尋址”微球和生物樣品反應(yīng)，并通過一次讓一個微球通過流式細(xì)胞儀室來解碼樣品信息對“液體陣列”進(jìn)行分析。美國專利No6023540公開了采用在遠(yuǎn)端具有預(yù)蝕刻的微孔的光纖束組裝加載有染料的微球。在每個空間尋址微球表面附著獨(dú)特的生物活性劑，且使數(shù)千個攜帶不同生物活性探針的微球組合起來在光纖束的預(yù)蝕刻微孔上形成珠陣列。
最近，通過使用整合入微球中的不同大小的具有硫化鋅蓋層的硒化鎘(zinc-sulfide-capped cadmium selenide)納米晶體(nanocrystal)，實(shí)現(xiàn)了新型光學(xué)編碼的微球方法(Nature Biotech.，19，631-635，(2001))。考慮到這些納米晶體具有窄帶寬，所以這種方法顯著擴(kuò)大了微球中的光譜條形碼編碼容量(barcodingcapacity)。
即使該“光譜尋址微球”法和制備微陣列的傳統(tǒng)“空間可尋址”方法相比，在簡單性上確實(shí)有優(yōu)勢，但是本領(lǐng)域仍然需要在制備生物學(xué)微陣列時難度下降且成本降低。
2001年8月29日提交的美國系列號No.09/942241“RandomArray of Microspheres”教導(dǎo)了各種涂覆方法，而且給出了機(jī)器涂覆的例子，由此在載體上涂覆了含有分散在明膠中的微球的流體涂覆組合物，如

圖1a和1b所示。在涂覆后，即刻使載體通過涂覆機(jī)中的激冷凝固室(chill-set chamber)，在此明膠快速凝膠化并使微球固定，如圖1c所示。過量流體通過蒸發(fā)去除，如圖1d所示。雖然這種方法和現(xiàn)有技術(shù)相比具有很大的制造優(yōu)勢，但是它為了使其對本技術(shù)領(lǐng)域的所有潛在貢獻(xiàn)最大化，需要某些改進(jìn)。問題在于在這種機(jī)器涂覆和快速凝膠化過程中，膠凝劑往往會覆蓋微球的表面，如圖1e所示，從而阻止分析物(比如DNA)穿透凝膠外層以及與微球表面上的探針雜交。
2002年1月31日提交的美國系列號No.10/062326“Method ofMaking Random Array of Microspheres Using Enzyme”克服了上述問題，這通過用酶去除微球表面的膠凝劑，而不會破壞微球的完整性或者微球表面的DNA探針來實(shí)現(xiàn)。酶處理過的表面在整個DNA雜交過程中保持其物理完整性，且微陣列顯示出非常強(qiáng)的雜交信號。美國系列號No.10/062326的優(yōu)點(diǎn)在于酶消化可以很容易得到控制以便從凝膠外層去除所需的量。而且，該酶(蛋白酶)很容易得到且成本不高。但是，缺點(diǎn)在于需要額外的步驟(酶解)，這需要另外的時間和成本。
2002年3月7日提交的美國系列號No.10/092803“Random Arrayof Microspheres”，描述了一種制備隨機(jī)珠子微陣列的方法，它是通過在能夠承受溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變的接收層上涂覆微球的懸浮液進(jìn)行的，所述懸浮液不含膠凝劑，但含有膠凝劑的交聯(lián)劑，如圖2a和2b所示。微球部分浸沒到接收層里，如圖2c所示，隨后接收層交聯(lián)，如圖2d所示。來自懸浮液的過量流體通過蒸發(fā)去除，如圖2e所示，以形成微陣列。盡管這種方法是對美國系列號No.09/942241的改進(jìn)，但由于接收層中的膠凝劑會溶解到用來沉積微球的含水懸浮液里，并且在當(dāng)懸浮液鋪展在接收層上時會重新沉積到微球上，所以所述方法在防止膠凝劑沉積到微球表面上并沒有完全獲得成功，如圖2f所示。另外，懸浮液中存在交聯(lián)劑會將生物分子交聯(lián)到微球表面上，并使其不能有效地充當(dāng)探針。
需要一種方法，其中微球懸浮液可以鋪展在接收層上，其中接收層的材料不溶解到運(yùn)輸微球的懸浮液或介質(zhì)中。而且，接收層的組成必須能夠允許微球充分浸沒在接收層里，以防止微球在懸浮液中的溶劑例如通過蒸發(fā)去除時發(fā)生橫向聚集。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了制備具有微球的元件例如微陣列的方法，所述方法包括用涂層組合物涂覆載體以形成接收層，所述層的模量可以通過交聯(lián)修改；使接收層部分交聯(lián)，以獲得允許微球部分浸沒到該部分交聯(lián)的接收層里的彈性模量；在該部分交聯(lián)的接收層上涂覆微球在流體懸浮液中的分散體，所述每個微球占據(jù)一個位置；使微球能夠部分浸沒到該部分交聯(lián)的接收層里；從該部分交聯(lián)的接收層去除流體懸浮液；并使該部分交聯(lián)的接收層進(jìn)一步交聯(lián)，從而使得在濕法處理過程中和過程后微球保持各自的位置。
在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，公開了一種元件，其包含載體；載體上的水不溶性接收層，其中該接收層包括接收材料；和固定并部分浸沒在該接收層里的隨機(jī)間隔的微球，其中所述微球有表面暴露在接收層上，所述每個暴露表面附著了用于和分析物相互作用的至少一個探針，而且其中所述微球的暴露表面沒有接收層材料。
該接收層和載體的特征在于沒有設(shè)計(jì)用于和微球發(fā)生物理地或化學(xué)地特異性相互作用的位置。因此，微球的分布沒有預(yù)定或定向，而是完全隨機(jī)的。
優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明采用了獨(dú)特的涂覆技術(shù)以在基片上制備微陣列，所述基片無需如本領(lǐng)域公開的那樣預(yù)蝕刻微孔或者以任何方式預(yù)標(biāo)記上位點(diǎn)來吸引微球。通過采用沒有標(biāo)記的基片或者無需預(yù)涂覆制備的基片，本發(fā)明和現(xiàn)有技術(shù)相比具有極大的制備上的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明公開了一種方法，通過該方法將分散體中的可尋址混合微球隨機(jī)分布在沒有吸引微球的孔或位置的接收層上。
由于基片不必修飾，所以本發(fā)明和以前公開的相比提供了制備成本較低且較容易的微陣列；盡管如此，微球在基片上保持固定。
而且，本發(fā)明提供了和2001年8月29日提交的US系列號09/942241相反的微陣列，其中無需采用2002年6月3日提交的US系列號10/062326公開的額外處理步驟(酶消化)就暴露了微球表面。暴露的微球表面有助于分析物更容易達(dá)到附著在微球表面上的探針?！胺治鑫铩笔侵妇哂心軌蚝臀⑶虮砻娴奶禺惒糠?本文稱作“探針”)發(fā)生化學(xué)或物理相互作用的官能團(tuán)的分子。
本發(fā)明的關(guān)鍵因素之一是選自接收層。接收層必須具有理想的物理性質(zhì)，其使得微球可以充分浸沒到接收層里，從而防止橫向聚集。后面將詳細(xì)討論對接收層物理性能的具體要求。
附圖簡述圖1a-1e示意性示出了現(xiàn)有技術(shù)中制備微球微陣列所采用的一種方法。圖1a示出了任何合適的載體1；圖1b示出了鋪展在圖1a載體上的含有微球(珠子)3、膠凝劑和化學(xué)交聯(lián)劑的流體層2；圖1c示出了膠凝劑已經(jīng)發(fā)生溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變的流體層，由此將微球3固定在凝膠4中；圖1d示出了通過從該凝膠層4蒸發(fā)過量流體2形成的微陣列5；和圖1e示出了交聯(lián)的流體層6，它永久性固定了微陣列中的微球3，從而在微球3的表面上留下了膠凝劑薄膜7。
圖2a-2f示意性示出了現(xiàn)有技術(shù)制備隨機(jī)微球微陣列的另一種方法，其中圖2a示出了任何合適的載體1；圖2b示出了載體1上涂覆有未交聯(lián)的膠凝劑8；圖2c示出了位于圖2b的載體1上的流體層2，其中攜帶了負(fù)載有探針的微球3和針對膠凝劑8的交聯(lián)劑；圖2d示出了沉降到該未交聯(lián)的膠凝劑8中的圖2c的微球3。從圖2e可以發(fā)現(xiàn)，具有膠凝劑8的層發(fā)生溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變，以形成凝膠4，并從而固定微球3。圖2e示出了從流體層2蒸發(fā)流體；圖2f給出了最終的微陣列5，其中由于膠凝劑8溶解在流體層2中，所以微球3表面上仍有凝膠4的涂層。
圖3a-3g示意性示出了本發(fā)明的一個實(shí)施方案，其中圖3a示出了任何合適的載體1；圖3b示出了鋪展在圖3a的載體1上的可交聯(lián)組合物和化學(xué)交聯(lián)劑，以形成接收層9；圖3c示出了部分交聯(lián)的接收層10，其彈性模量經(jīng)調(diào)整后允許在其上面鋪展的流體懸浮液中的微球凹進(jìn)；圖3d示出了含有微球3的流體懸浮液11鋪展在圖3c的部分交聯(lián)的接收層10上；圖3e示出了微球3部分沉降到該部分交聯(lián)的接收層10里；圖3f示出了流體懸浮液11的蒸發(fā)暴露了微球3的表面；圖3g示出了進(jìn)一步化學(xué)交聯(lián)的接收層12，其使微陣列5變堅(jiān)固以進(jìn)行濕法處理。
圖4a-4g是本發(fā)明另一實(shí)施方案的示意圖，其中圖4a示出了任何合適的載體1；圖4b示出了在圖4a的載體1上鋪展的可交聯(lián)組合物，以形成接收層9；圖4c示出了通過輻射13，比如紫外線(UV)輻射、電離輻射或電子束照射，發(fā)生交聯(lián)的部分交聯(lián)的接收層10，得到足以允許在其上鋪展的流體懸浮液中的微球凹進(jìn)的彈性模量；圖4d示出了在圖4c的部分交聯(lián)的接收層10上鋪展的含有微球3的流體懸浮液11；圖4e示出了部分沉降到該部分交聯(lián)的接收層10中的微球3；圖4f示出了流體懸浮液11的蒸發(fā)暴露出微球3的表面；圖4g示出了由輻射13，比如UV輻射、電離輻射或電子束照射發(fā)生交聯(lián)的進(jìn)一步交聯(lián)的接收層12，以使微陣列5變堅(jiān)固以進(jìn)行濕法處理。
圖5是本發(fā)明方法的又一示意圖，其中圖5a示出了任何合適的載體1；圖5b示出了鋪展在圖5a載體上的含有膠凝劑和針對該膠凝劑的緩慢作用化學(xué)交聯(lián)劑的流體，以形成接收層9；圖5c示出了溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變后的接收層14，其中膠凝劑發(fā)生凝膠化以使彈性模量足以允許微球3的凹進(jìn)；圖5d示出了包含微球3的流體懸浮液11，其溫度低于接收層中的膠凝劑的溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變溫度，所述流體懸浮液鋪展在圖5c的已凝膠化接收層14上；圖5e示出了部分沉降到已凝膠化接收層14中的微球3；圖5f示出了流體懸浮液11的蒸發(fā)使微球3的表面暴露出來；圖5g示出了化學(xué)交聯(lián)的接收層12，其使微陣列5變堅(jiān)固以進(jìn)行濕法處理。
圖6是在1cm2面積上有1000個微球的圖，其中沒有兩個微球發(fā)生重疊。
圖7是表1數(shù)據(jù)的曲線圖，示出了圖6微球之間的最近鄰分開距離的分布。
圖8示意性示出了微球上的力。
圖9是顯示10μm微球的合理模量的上限和下限的曲線圖，其中L是30μm。
圖10是顯示5μm微球的合理模量的上限和下限的曲線圖，其中L是30μm。
圖11是顯示15μm微球的合理模量的上限和下限的曲線圖，其中L是20μm。
圖12是顯示20μm微球的合理模量的上限和下限的曲線圖，其中L是20μm。
圖13是顯示10μm微球的合理模量的上限和下限的曲線圖，其中L是5μm。
圖14是顯示20μm微球的合理模量的上限和下限的曲線圖，其中L是2.5μm。
發(fā)明詳述本文所用術(shù)語“溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變”或者“凝膠化”是指顆粒的流體溶液或懸浮液形成顯示出非穩(wěn)態(tài)流動的連續(xù)三維網(wǎng)絡(luò)的過程。這種現(xiàn)象可以在聚合物中發(fā)生，這通過存在多功能單體時的聚合；通過具有反應(yīng)性側(cè)鏈的溶解的聚合物的共價(jià)交聯(lián)；以及通過溶液中聚合物分子之間的二次鍵合，例如通過氫鍵實(shí)現(xiàn)。聚合物比如明膠表現(xiàn)出屬于最后一種類型的熱凝膠化。凝膠化或凝固過程的特征在于粘度出現(xiàn)非連續(xù)增加。參見P.I.Rose，“The Theory of the Photographic Process”，第4版，T.H.James編輯，第51-67頁。
本文所用術(shù)語“膠凝劑”是指可以承受上述凝膠化的物質(zhì)。例子包括承受熱凝膠化的材料，比如明膠、水溶性纖維素醚或聚(n-異丙基丙烯酰胺)，或者可以通過硼酸鹽化合物化學(xué)交聯(lián)的物質(zhì)，比如聚(乙烯醇)。其它膠凝劑包括可以通過輻射比如紫外線輻射、電離輻射或者電子束輻射進(jìn)行交聯(lián)的聚合物。膠凝劑的例子包括阿拉伯膠(acacia)、褐藻酸、膨潤土、卡波姆、羧甲基纖維素鈉、十六醇十八醇混合物、膠體二氧化硅、乙基纖維素、明膠、瓜耳膠、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、硅酸鋁鎂、麥芽糖糊精、甲基纖維素、聚乙烯醇、聚烯吡酮、藻酸丙二酯、褐藻酸鈉、羥基乙酸(glycolate)淀粉鈉、淀粉、黃蓍膠和黃原膠。其它本領(lǐng)域已知的膠凝劑，比如在Secundum Artem，vol.4，No.5，Lloyd V.Allen中提出的那些，也可以使用。優(yōu)選的膠凝劑是堿預(yù)處理過的明膠。
本文所用術(shù)語“隨機(jī)分布”是指沒有優(yōu)選或者偏向的元件的空間分布。隨機(jī)性可以根據(jù)與泊松分布所預(yù)期的一致性進(jìn)行測量。
本發(fā)明教導(dǎo)了在可以包括接收層的基片上制備微球(也稱作“珠子”)的隨機(jī)陣列的方法。微球在接收層上的沉積方式使得每個微球的部分表面暴露在接收層之上。微球在接收層或基片上的分布或模式是完全隨機(jī)的，且微球并沒有像本領(lǐng)域以前已知的其它方法一樣被吸引到或者保持在接收層或基片上的預(yù)標(biāo)記或預(yù)定位置上。
通過首先在任何適當(dāng)表面或載體1(圖3a、4a、5a)上涂覆含有膠凝劑以及針對該膠凝劑的化學(xué)交聯(lián)劑的流體層，形成接收層9(圖3b、4b、5b)，從而獲得隨機(jī)陣列。載體1可以是例如玻璃、紙張、金屬、聚合物材料、復(fù)合材料或其組合，只要所述載體可以提供能在上面形成接收層的表面。接收層9中的膠凝劑允許部分交聯(lián)，以形成部分交聯(lián)的接收層10(圖3c、4c、5c)。然后，在該部分交聯(lián)的接收層10上，鋪展微球3的流體懸浮液11(圖3d、4d、5d)。該部分交聯(lián)的接收層10不溶于該流體懸浮液11。微球3至少部分地沉降到該部分交聯(lián)的接收層10里(圖3e、4e、5e)。沉降程度和該部分交聯(lián)的接收層10的彈性模量、微球3的材料的界面表面能和流體懸浮液11的界面表面能相關(guān)。微球3可以沉降到全部或部分進(jìn)入該部分交聯(lián)的接收層10里。一個或多個微球可以在部分交聯(lián)的接收層10中沉降相同的深度。根據(jù)某些實(shí)施方案，至少一些微球3能夠沉降到部分交聯(lián)的接收層10的底部，從而?？吭谳d體1上。
該部分交聯(lián)的接收層10的彈性模量受部分交聯(lián)的接收層10的交聯(lián)密度控制，所述交聯(lián)密度定義為單位體積的已交聯(lián)材料的摩爾數(shù)。交聯(lián)密度反過來又和化學(xué)交聯(lián)劑的濃度，化學(xué)交聯(lián)的持續(xù)時間，輻射比如UV、電離或電子束輻射的強(qiáng)度和時間以及所用交聯(lián)類型中的一個或多個相關(guān)。
可替換地，采用物理凝膠化代替化學(xué)交聯(lián)或者輻射誘導(dǎo)的交聯(lián)是可行的。物理凝膠化基于在接收層里形成氫鍵。物理凝膠化的交聯(lián)密度和膠凝劑濃度以及該部分交聯(lián)的接收層的溫度和該部分交聯(lián)的接收層中膠凝劑的凝膠點(diǎn)或溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變溫度之間的差值相關(guān)。在這種情況下，涂覆時流體懸浮液的溫度維持在該部分交聯(lián)的接收層中膠凝劑的溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變溫度以下，以防該部分交聯(lián)的接收層中的膠凝劑溶解到該流體懸浮液里。
流體懸浮液11的蒸發(fā)可以通過在該流體懸浮液11上吹空氣、加熱該流體懸浮液11或其組合來實(shí)現(xiàn)，以使流體蒸發(fā)(圖3f、4f、5f)從而得到陣列5。陣列5制造完成后，部分交聯(lián)的接收層10的交聯(lián)反應(yīng)可以完成，以將微球3在已交聯(lián)接收層12中的適當(dāng)位置永久性地固定，所述接受層10含有通過加入交聯(lián)劑較早引發(fā)了的已交聯(lián)的膠凝劑(圖3g、5g)。如果采用明膠作為膠凝劑，則優(yōu)選交聯(lián)劑可以是化合物，比如雙(乙烯砜)甲烷、戊二醛或者丁二醛?？商鎿Q地，如圖4g所示，可以采用額外的輻射13，比如UV輻射、電離輻射或電子束照射，來實(shí)現(xiàn)額外的交聯(lián)。已交聯(lián)的接收層不溶解，從而使形成的微陣列可以進(jìn)行濕法處理，而不會導(dǎo)致該已交聯(lián)的接收層出現(xiàn)溶解或降解。
如圖3g、4g和5g所示，陣列5中的微球3在其暴露表面上沒有接收層材料附著或者覆蓋。這樣使得官能化化學(xué)或生物基團(tuán)、探針和分析物可以附著到微球的暴露表面上。
上述通過物理凝膠化、化學(xué)交聯(lián)或輻射制備部分交聯(lián)的接收層的方法被設(shè)計(jì)用于制備這種部分交聯(lián)的接收層，所述接收層能夠接收微球，具有合適的物理性質(zhì)以確保在流體懸浮液從該部分交聯(lián)的接收層蒸發(fā)形成陣列時，微球不會橫向聚集。在確定微球是否發(fā)生橫向聚集時有兩種重要因素。一個是迫使微球互相靠近的毛細(xì)力，如“PatternedColloidal Deposition Controlled by Electrostatic and CapillaryForces”，J.Aizenberg，P.Branu和P.Wiltzius，Physical ReviewLetters，第84卷，No.13，2000所述。另一個是微球在該部分交聯(lián)的接收層中的凹進(jìn)程度。施加在微球上的毛細(xì)力和流體懸浮液與微球之間的界面表面能成比例。在流體懸浮液蒸發(fā)階段，當(dāng)流體懸浮液和該部分交聯(lián)的接收層的組合厚度可以和微球大小相比時，所述毛細(xì)力往往導(dǎo)致微球在該部分交聯(lián)的接收層中橫向聚集。另一方面，微球和該部分交聯(lián)的接收層之間的表面力會導(dǎo)致微球凹進(jìn)相對軟的部分交聯(lián)的接收層，如同在“Surface Energy and the Contact of ElasticSolids”，K.Johnson等，Proc.R.Soc.Lond.，A.324，1971中所解釋的那樣，從而允許微球充分浸沒到部分交聯(lián)的接收層里，以防止通過蒸發(fā)去除流體懸浮液時出現(xiàn)橫向聚集。
從上述討論很容易發(fā)現(xiàn)，為了防止橫向聚集，部分交聯(lián)的接收層的物理性能必須滿足某些條件。如果部分交聯(lián)的接收層硬，那么微球在部分交聯(lián)的接收層中的浸沒就會非常淺，且可能發(fā)生微球的橫向聚集。另一方面，如果部分交聯(lián)的接收層太軟，那么對驅(qū)動微球橫向聚集的毛細(xì)力就幾乎沒有抵抗。部分交聯(lián)的接收層抗變形的性能可以用楊氏模量表示?？梢源_定部分交聯(lián)的接收層楊氏模量的下限和上限，在所述下限和上限內(nèi)微球不發(fā)生橫向聚集。在實(shí)施例部分，給出了確定部分交聯(lián)的接收層楊氏模量界限的方法。
本發(fā)明是基于聚合物微球的隨機(jī)微陣列，陣列中的每個微球具有將該微球和微陣列中其它微球區(qū)分開的不同標(biāo)記。這種標(biāo)記可以基于微球的顏色、形狀和大小，或其組合。對基于顏色的標(biāo)記而言，可以通過混合代表原色紅、綠和藍(lán)的三種染料產(chǎn)生顏色，以得到數(shù)千個具有不同“顏色地址”(獨(dú)特的RGB值，例如R＝0、G＝204、B＝153)的可區(qū)分微球。制備的微球表面上可以具有“活性”位置，即在這些位置上該微球和其它分子或化合物之間會發(fā)生物理或化學(xué)相互作用。這些化合物可以是有機(jī)或無機(jī)的。所述分子或化合物的例子包括有機(jī)核酸、蛋白質(zhì)或其片段、或者離子化合物，包括例如金屬離子和鹽。在每個微球的表面上，可以附著預(yù)合成的寡核苷酸、單克隆抗體或任何其它生物或化學(xué)試劑。所以，每個微球地址，例如顏色可以對應(yīng)于特定的探針。這些微球可以等量混合，且可通過例如在單層內(nèi)涂覆這些混合的微球，來制備隨機(jī)微陣列。
Edward Cohen和Edgar B.Gutoff在“Modern Coating AndDrying Technology”第一章，Interfacial Engineering Series，v.1，VCH Publishers Inc.，New York，NY(1992)中廣泛描述了涂覆微球懸浮液的涂覆方法。合適的涂覆方法可以包括刮涂、葉片涂覆(blade coating)、浸涂、棒涂(rod coating)、氣刀涂覆(air knifecoating)、照相凹版涂覆(gravure coating)、正向和反向輥涂(forwardand reverse roll coating)和開槽與擠出涂覆(slot and extrusioncoating)?？梢约尤氡绢I(lǐng)域已知的各種涂覆助劑，以輔助將微球懸浮液涂覆在基片上。例如，合適的涂覆助劑可以包括表面活性劑、稀釋劑或沖淡劑。
可以將熒光標(biāo)記的、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的或者兩者都有的生物樣品雜交到該基于微球的隨機(jī)微陣列中。來自可尋址聚合物微球以及用熒光、化學(xué)發(fā)光或兩者非選擇性標(biāo)記的生物樣品的信號，可以在通過光學(xué)系統(tǒng)放大圖像后用電荷耦合設(shè)備進(jìn)行分析。記錄下來的陣列圖像可以通過圖像處理算法自動分析，以得到基于每個微球“地址”的生物活性探針信息，例如每個微球的顏色編碼，且該信息可以和熒光/化學(xué)發(fā)光圖像進(jìn)行比較，以檢測和量化樣品中的特定生物分析物材料。為了確定標(biāo)記，可以應(yīng)用光學(xué)或其它電磁方法。
盡管形狀基本為曲線的微球或顆粒由于制備容易而優(yōu)選，但其它形狀的顆粒，比如橢圓體或立方體顆粒也可以采用。制備這些顆粒的合適方法在本領(lǐng)域是公知的，且可以包括乳狀液聚合法，例如I.Piirma的“Emulsion Polymerization”，Academic Press，New York(1982)所述，或者有限聚結(jié)法，例如T.H.Whitesides和D.R.Ross在J.Colloid Interface Science，vol.169，第48-59頁，(1985)中所述的。采用來制備顆?；蛭⑶虻木唧w聚合物是可以著色的水不混溶型合成聚合物。優(yōu)選聚合物是任何無定形水不混溶型聚合物。有用的聚合物類型的例子是聚苯乙烯、聚(甲基丙烯酸甲酯)或聚(丙烯酸丁酯)。也可以使用共聚物，比如苯乙烯和丙烯酸丁酯的共聚物。聚苯乙烯共聚物使用起來方便。形成的微球可以采用不溶性著色劑著色，該著色劑是在涂覆或后續(xù)處理過程中不溶解的顏料或染料。合適的染料實(shí)際上可以是油溶性的染料。優(yōu)選該染料當(dāng)整合到微球中時是非熒光的。
形成的微球理想的平均直徑為1-100微米，例如，1-50微米，更優(yōu)選3-30微米，且最優(yōu)選5-20微米。優(yōu)選涂層中微球濃度是100-1000000/cm2，更優(yōu)選1000-200000/cm2，且最優(yōu)選10000-100000/cm2。
微球可以在其表面上具有附著的化學(xué)或生物學(xué)官能團(tuán)，以和所需的分析物相互作用。添加化學(xué)或生物學(xué)官能團(tuán)的方法在本領(lǐng)域是已知的。
可以通過本領(lǐng)域公開的程序，例如Bangs Laboratories，Inc.Technote 205，Rev.003，30 MAR 02(Bangs Laboratories，Inc.，F(xiàn)ishers，IN)公開的方法，將生物活性劑附著到化學(xué)官能化的微球表面。一些常用化學(xué)官能團(tuán)包括但不限于羧基、氨基、羥基、酰肼、酰胺、氯甲基、環(huán)氧、醛等。生物活性劑的例子包括但不限于寡核苷酸、DNA和DNA片段、肽核酸(PNA)、肽、抗體、酶、蛋白質(zhì)和具有生物活性的合成分子。
下面將給出確定針對給定微球組合物的接收層的楊氏模量范圍的方法。
實(shí)施例在下列實(shí)施例中，應(yīng)用如同James E.Gentle在“Random NumberGeneration and Monte Carlo Methods(Statistics & Computing)”，Springer Verlag(1998)中所述的Monte Carlo模擬，來確定隨機(jī)引入的微球之間的距離。然后，將結(jié)果用于分析中以計(jì)算避免了微球橫向聚集的接收層的楊氏模量。
為了模擬本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的微球隨機(jī)分布，在1cm2面積的基片上隨機(jī)落上1000個直徑為10μ的微球，從而不出現(xiàn)兩個微球的重疊，如圖6所示。圖6所示的微球之間的最近鄰分開距離的分布如表1所示，并且繪制在圖7中。微球隨機(jī)在基片上下落20次，且所有20次模擬的平均值如表2所示。表2提供了每個最近鄰分開距離的累積平均值，等于由至少該分開距離分開的微球總數(shù)的百分比。
表2表明對本樣品(1000微球/cm2；微球直徑為10μ)而言，95％的微球和其最近鄰的微球間距至少30μ。這個距離(對本情況而言是30μ)稱作“L”，且是至少95％的微球之間分開的最小測量距離。
對幾種微球密度和微球直徑的情況重復(fù)進(jìn)行模擬，且每種情況的L是通過對每種微球直徑/密度組合如上所述重復(fù)超過20次的模擬來確定的。結(jié)果總結(jié)在表3中。
利用表3的值，人們可以確定對于部分交聯(lián)的接收層而言為了錨定微球同時不出現(xiàn)橫向聚集所需要的模量。作用在每個微球上并對橫向聚集有影響的垂直力P和橫向力F如圖8所示。垂直力P通過將微球推進(jìn)接收層里使其保持在適當(dāng)位置。P由微球半徑R和微球與部分交聯(lián)的接收層之間的界面表面能來確定，界面表面能用γ1表示，如同K.L.Johnson等在Proc.R.Soc.，London A324，301(1971)所教導(dǎo)的那樣。力P由下式確定P＝6πRγ1(1)作用在每個微球以通過橫向移動微球影響橫向聚集的水平力F由球半徑R、微球之間的距離L和微球與含微球的流體懸浮液之間的界面表面能確定，該界面表面能用γ2表示，如同Aizenburg等在PHYS.REV.LTRS.，Vol.84，No.13，(2000)所教導(dǎo)的那樣。橫向力F由下式確定F=3(R2L)γ2---(2)]]>從式(1)和式(2)可以發(fā)現(xiàn)，對給定的微球半徑和微球之間的距離L而言，表面能γ1和γ2確定了作用在每個微球上的垂直力和橫向力的量。
力P、力F和部分交聯(lián)的接收層的楊氏模量之間的關(guān)系，確定了微球在該部分交聯(lián)的接收層里的錨定是否足以抵抗橫向聚集。當(dāng)微球在流體懸浮液中涂覆到該部分交聯(lián)的接收層上時，微球通過流體懸浮液下沉到達(dá)部分交聯(lián)的接收層上。取決于微球上的垂直力P和該部分交聯(lián)的接收層的楊氏模量之間的關(guān)系，微球至少部分穿入到該部分交聯(lián)的接收層里。當(dāng)流體懸浮液通過蒸發(fā)去除并且流體懸浮液水平面變得低于微球在該部分交聯(lián)的接收層上的高度時，毛細(xì)力開始起作用，從而產(chǎn)生橫向力F。為了橫向移動，微球需要使該部分交聯(lián)的接收層變形或者在該部分交聯(lián)的接收層中穿過。這種移動受到該部分交聯(lián)的接收層抗變形能力的阻止，且這種阻止用該部分交聯(lián)的接收層的楊氏模量表示。材料的楊氏模量越高，抗變形能力越強(qiáng)，從而將微球在該部分交聯(lián)的接收層中保持在適當(dāng)位置。如果該部分交聯(lián)的接收層的楊氏模量太低，那么該部分交聯(lián)的接收層的流動性太好，從而微球很容易移動，這樣會導(dǎo)致橫向聚集。如果該部分交聯(lián)的接收層的楊氏模量太高，那么微球就不能在該部分交聯(lián)的接收層中充分穿入來阻止橫向移動，從而使微球沿著該部分交聯(lián)的接收層的表面滑動而不是使其變形。
為了確定避免橫向聚集所需的接收層的楊氏模量，采用了有限元分析。根據(jù)常規(guī)有限元分析技術(shù)，通過將微球和層分成離散單元(也稱作網(wǎng)格)來形成微球和接收層的幾何表示。對于給定垂直力和橫向力而言，有限元分析確定了對選定的楊氏模量值而言，微球是保持靜止還是橫向移動形成聚集體。該分析得到了較低的范圍，或者下限，其是微球不移動的最低模量，和較高的范圍，或者上限，是微球不會移動的最高模量。結(jié)果可以作為模量對γ1/γ2比的函數(shù)作圖，如圖9所示。
如圖9所示(微球數(shù)/cm2＝1000，微球直徑＝10μ，L＝30μ)，防止微球聚集同時使其保持在適當(dāng)位置的部分交聯(lián)的接收層的理想楊氏模量在該下限和上限之間的區(qū)域內(nèi)。結(jié)果取決于微球和該部分交聯(lián)的接收層之間的界面表面能γ1以及微球和流體懸浮液之間的界面表面能γ2。界面表面能γ1和γ2由微球、流體懸浮液和部分交聯(lián)的接收層的材料性質(zhì)推導(dǎo)出來，并表示作用在微球上的力(參見式1和式2)。例如，在圖9中，當(dāng)γ1和γ2的比值等于2時，部分交聯(lián)的接收層的模量應(yīng)該是1MPa-55MPa。圖10-14給出了表3中其它微球直徑和密度情況的結(jié)果。為實(shí)用目的，模量下限可以選為1MPa。模量的上限和下限可以根據(jù)單位面積的微球數(shù)、微球半徑和分開距離L，利用本文給出的式子進(jìn)行最優(yōu)化。
表1
表2
表3
*96％微球和其最近鄰分開的距離＞L**95％微球和其最近鄰分開的距離＞L本發(fā)明已經(jīng)具體參考某些實(shí)施方案進(jìn)行了詳細(xì)描述。在本發(fā)明精神和范圍內(nèi)，可以實(shí)施改變和修改。
部件列表1、載體2、流體層3、微球(珠子)4、凝膠5、微陣列6、交聯(lián)流體層7、膠凝劑薄膜8、非交聯(lián)膠凝劑9、接收層10、部分交聯(lián)的接收層11、流體懸浮液12、化學(xué)交聯(lián)的接收層13、輻射14、溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變的接收層
權(quán)利要求
1.制備包含位于載體上的微球陣列的元件的方法，所述方法包括a)用涂層組合物涂覆所述載體以形成接收層，所述層的模量可以通過交聯(lián)修改；b)使所述接收層部分交聯(lián)，以獲得允許微球部分浸沒到所述部分交聯(lián)的接收層的彈性模量；c)在所述部分交聯(lián)的接收層上涂覆微球在流體懸浮液中的分散體，每個微球占據(jù)一個位置；d)允許微球部分浸沒到所述部分交聯(lián)的接收層里；e)從所述部分交聯(lián)的接收層去除所述流體懸浮液；和f)使所述部分交聯(lián)的接收層進(jìn)一步交聯(lián)，從而使得在濕法處理過程中和過程后微球保持各自的位置。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述微球形成和所述部分交聯(lián)的接收層的界面，而且所述界面具有界面表面能γ1。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述微球形成和所述流體懸浮液的界面，而且所述界面具有界面表面能γ2。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述部分交聯(lián)的接收層的模量下限為1MPa。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述部分交聯(lián)的接收層的模量由γ1和γ2比值的單調(diào)增加函數(shù)確定，其中γ1是微球和接收層之間的界面表面能，γ2是微球和流體懸浮液之間的界面表面能。
6.一種元件，其包括a)載體；b)位于所述載體上的水不溶性接收層，其中所述接收層包括接收層材料；和c)固定并部分浸沒在所述接收層里的隨機(jī)間隔的微球，其中所述微球有表面暴露在所述接收層上，每個暴露表面附著了至少一個用于和分析物相互作用的探針，且其中所述微球的所述暴露表面沒有接收層材料。
7.權(quán)利要求6的元件，其中所述交聯(lián)層包含明膠。
8.權(quán)利要求6的元件，其中所述微球含有聚苯乙烯或聚(甲基丙烯酸甲酯)。
9.權(quán)利要求6的元件，其中所述載體包括玻璃紙張、金屬或聚合物。
10.權(quán)利要求6的元件，其中所述微球平均直徑為1-100μ。
11.權(quán)利要求6的元件，其中所述微球平均直徑為5-20μ。
12.權(quán)利要求6的元件，其中所述交聯(lián)層里每平方厘米的微球數(shù)是100-1000000。
13.權(quán)利要求6的元件，其中所述交聯(lián)層里每平方厘米的微球數(shù)是10000-100000。
14.權(quán)利要求6的元件，其中所述交聯(lián)層里每平方厘米的微球數(shù)是1000-200000。
15.權(quán)利要求6的元件，其中所述微球用顏色編碼。
16.權(quán)利要求15的元件，其中每個微球的顏色編碼標(biāo)識了所述微球表面上的探針。
17.權(quán)利要求6的元件，其中所述探針是蛋白質(zhì)或核酸。
18.包括微球陣列的元件，其中所述元件由包括下列的方法制備a)用涂層組合物涂覆載體以形成接收層，所述層的模量可以通過交聯(lián)修改；b)使所述接收層部分交聯(lián)，以獲得允許微球部分浸沒到所述部分交聯(lián)的接收層的彈性模量；c)在所述部分交聯(lián)的接收層上涂覆微球在流體懸浮液中的分散體，每個微球占據(jù)一個位置；d)允許微球部分浸沒到所述部分交聯(lián)的接收層里；e)從所述部分交聯(lián)的接收層去除所述流體懸浮液；和f)使所述部分交聯(lián)的接收層進(jìn)一步交聯(lián)，從而使得在濕法處理過程中和過程后微球保持各自的位置。
19.權(quán)利要求18的元件，其中所述部分交聯(lián)的接收層的模量使得在去除流體懸浮液過程中微球在所述部分交聯(lián)的接收層中不發(fā)生橫向移動。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種元件，其包含在載體上的微球陣列，和制備該元件的方法，其中該方法包括用涂層組合物涂覆所述載體以形成具有可調(diào)彈性模量的接收層；用微球在流體懸浮液中的分散體涂覆在接收層上；調(diào)整接收層的彈性模量以使得微球可以部分浸沒到接收層里；從接收層去除流體懸浮液；以及將微球固定在接收層里從而使該元件可以承受濕法處理。
文檔編號C40B70/00GK1826172SQ200480021038
公開日2006年8月30日 申請日期2004年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月23日
發(fā)明者K·查里, Z·高, J·S·塞迪塔, R·哈努曼圖, C·P·盧西南 申請人:伊斯曼柯達(dá)公司