釋度涂布三個(gè)平板；以同樣的操作，取未 經(jīng)紫外線照射處理的菌液稀釋涂平板作對照。將上述涂布均勻的平板，用黑布或報(bào)紙包好 后，置于37 °C過夜培養(yǎng)。
[0017] 統(tǒng)計(jì)不同照射時(shí)間下每個(gè)稀釋度下平板上長出的單菌落數(shù)，若在某個(gè)稀釋度下長 出的單菌落數(shù)在30~300個(gè)之間，則認(rèn)為改稀釋度合適。將該稀釋度下三個(gè)平板上長出的單 菌落數(shù)求平均值，按下列公式計(jì)算菌懸液濃度： 菌懸液濃度（CFU/mL) =某個(gè)稀釋度下的菌落平均數(shù)X稀釋倍數(shù)XlO
從表1可以看出，菌懸液經(jīng)紫外照射Imin后致死率達(dá)到95%以上，因此確定最終誘變 時(shí)間為Imin。
[0019] 1. 3脫脂奶粉平板透明圈大小初篩 從致死率為95%的LB平板上挑取菌落，劃線培養(yǎng)獲得單菌落后點(diǎn)種于脫脂奶粉(脫脂 奶粉1%，酵母粉0. 25%，蛋白胨0. 5%，NaClO. 5%，瓊脂2%)平板，每組設(shè)3個(gè)平行，同時(shí)點(diǎn)種 出發(fā)菌株作為對照。37°C培養(yǎng)36h后，均勻滴入10%三氯乙酸。選擇透明圈直徑與菌落直 徑的比值大于出發(fā)菌的單菌落再次純化，共篩選到110株突變菌株，分別命名為FN1、FN2、 FN3、......、FN110。
[0020] 1. 4搖瓶復(fù)篩 將上述篩選得到的110株突變菌分別接種于50mL搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖5%，豆餅粉 3%，麩皮3%，Na2HPO4 0. 78%，KH2PO4 0. 05%)中，37°C培養(yǎng)72h后，離心取上清液，分別測定發(fā) 酵上清液中的蛋白酶酶活，同時(shí)以出發(fā)菌株作為對照。酶活測定結(jié)果顯示：出發(fā)菌株發(fā)酵上 清液中蛋白酶酶活為239U/mL，而本發(fā)明初篩獲得的110株突變菌中蛋白酶酶活最高的菌 株分別為FN13,FN44和FN61，其發(fā)酵上清液中蛋白酶酶活分別為350U/mL，387U/mL，377 U/mL，比出發(fā)菌提高了 46. 4%，61. 9%，57. 7%。
[0021] 將突變株FN13、FN44和FN61在LB平板上傳代5次以后，挑取單菌落，分別進(jìn)行搖 瓶發(fā)酵，其蛋白酶酶活仍比出發(fā)菌提高40%以上，從而說明本發(fā)明獲得的上述3株突變株多 次傳代后，依然能保持遺傳上的穩(wěn)定性。將突變株進(jìn)行有效的搖瓶發(fā)酵 1. 5 20L罐發(fā)酵篩選 分別挑取出發(fā)菌FN，突變菌FN13、FN44和FN61的單菌落接種于0. 6LLB液體培養(yǎng)基 中，37°C，200rpm震蕩培養(yǎng)8h后，全部接種到含12L發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖5%，豆餅粉3%， 麩皮3%，Na2HPO4O. 78%，KH2PO4 0. 05%)的20L發(fā)酵罐中，30°C發(fā)酵培養(yǎng)96h，分別檢測發(fā)酵 上清液中的蛋白酶酶活。結(jié)果顯示，突變菌FN61的蛋白酶酶活最高，達(dá)到14135U/mL，比出 發(fā)菌株FN提高了 42%。多次發(fā)酵試驗(yàn)也表明FN61產(chǎn)蛋白酶的水平保持穩(wěn)定。
[0022] 申請人將上述突變菌株FN61命名為解淀粉芽孢桿菌FN61 aayWi識/efacieasFN16)，并于2015年9月14日保藏于中國武漢武漢大學(xué)的中國典型 培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO:M2015527。
[0023] 實(shí)施例2解淀粉芽孢桿菌FN61產(chǎn)蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)分析 2. 1最適作用pH分析 采用pH值分別為5. 5、6. 0、6. 5、7. 0、7. 5、8. 0、8. 5、9. 0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，pH值分別為8. 5、9. 0的硼砂-硼酸緩沖液，將上述突變菌株FN61和出發(fā)菌株FN發(fā)酵上清液 進(jìn)行稀釋，底物也分別用對應(yīng)PH值的緩沖液配制，在40°C條件下進(jìn)行蛋白酶酶活力測定， 以最高酶活為100%，計(jì)算相對酶活，做PH-相對酶活曲線。結(jié)果如圖1所示，本發(fā)明獲得的 突變菌株FN61產(chǎn)的蛋白酶最適作用pH值為7. 5,為中性蛋白酶，與出發(fā)菌株一致。但是， 突變菌FN61產(chǎn)的蛋白酶在pH6. 5-8. 5范圍內(nèi)的相對酶活普遍高于出發(fā)菌，從而說明突變菌 FN61產(chǎn)的蛋白酶比出發(fā)菌更適合在中性條件下發(fā)揮作用，應(yīng)用前景更廣。
[0024] 2. 2最適作用溫度分析 分別在 30 °C、35 °C、40 °C、45 °C、50 °C、55 °C、60 °C，pH7. 0 條件下，對上述突變菌株FN61 和出發(fā)菌株FN發(fā)酵上清液進(jìn)行蛋白酶酶活測定，以最高酶活為100%，計(jì)算相對酶活，做溫 度-相對酶活曲線。結(jié)果如圖2所示，本發(fā)明獲得的突變菌株FN61產(chǎn)的蛋白酶最適作用溫 度為40°C，與出發(fā)菌株一致。
[0025] 綜上所述，本發(fā)明通過紫外誘變方法獲得的突變菌株解淀粉芽孢桿菌FN61能顯 著提高中性蛋白酶的產(chǎn)量，20L罐發(fā)酵酶活能達(dá)到14135U/mL，較出發(fā)菌株提高了 42%，且 突變菌FN61產(chǎn)的蛋白酶比出發(fā)菌更適合在中性條件下發(fā)揮作用，取得了意料不到的技術(shù) 效果。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種解淀粉芽孢桿菌，其特征在于，所述的解淀粉芽孢桿菌的保藏號為CCTCC NO : M2015527。2. 權(quán)利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌在生產(chǎn)蛋白酶中的應(yīng)用。3. -種蛋白酶，其特征在于，所述的蛋白酶是通過權(quán)利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌 發(fā)酵得到的。4. 權(quán)利要求3所述的蛋白酶在飼料領(lǐng)域中的應(yīng)用。5. 權(quán)利要求3所述的蛋白酶在食品加工領(lǐng)域中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及功能微生物篩選技術(shù)領(lǐng)域，具體是通過紫外誘變的方法獲得一株突變菌株解淀粉芽孢桿菌FN61，保藏編號為CCTCC？NO：M2015527。所述突變菌能顯著提高中性蛋白酶的產(chǎn)量，20L罐發(fā)酵酶活高達(dá)14135？U/ml，較出發(fā)菌提高了42%。該突變菌所產(chǎn)中性蛋白酶的最適作用pH為7.5，與出發(fā)菌株一致，但突變菌產(chǎn)的蛋白酶在pH6.5-8.5范圍內(nèi)的相對酶活普遍高于出發(fā)菌，從而說明突變菌產(chǎn)的蛋白酶比出發(fā)菌更適合在中性條件下發(fā)揮作用；該突變菌產(chǎn)的蛋白酶最適作用溫度為40℃，較出發(fā)菌沒有發(fā)生改變，取得了意料不到的技術(shù)效果。本發(fā)明所述突變菌株FN61產(chǎn)中性蛋白酶可廣泛應(yīng)用于飼料和食品加工領(lǐng)域，前景廣闊。CCTCC NO: M 201552720150914
【IPC分類】C12R1/07, C12N1/20, C12N9/54
【公開號】CN105087446
【申請?zhí)枴緾N201510581422
【發(fā)明人】付娟, 齊建, 紀(jì)海濤, 劉文瑤, 郭小飛, 徐玉婷, 石增秀
【申請人】青島蔚藍(lán)生物集團(tuán)有限公司
【公開日】2015年11月25日
【申請日】2015年9月14日