專利名稱：光學(xué)編碼微載體的批量制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及光學(xué)編碼微載體的批量制備方法，尤其是將含顏色物質(zhì)或者熒光物質(zhì)的液態(tài)材料采用接觸印刷或者非接觸印刷方法分配至基底上并固化以形成顏色或者熒光的微顆粒，從基底上分離收集光學(xué)編碼微顆粒并在微顆粒上固定傳感敏感材料而成為光學(xué)編碼微載體。該方法具有操作簡單，成本低廉及能夠批量制備的特點。
背景技術(shù)：
懸浮陣列芯片技術(shù)也稱微載體技術(shù)，它是一種通過編碼微顆粒上固定的傳感敏感材料與待測樣品間特異性相互作用而在流體中進(jìn)行多目標(biāo)檢測分析的工具。它不僅具有通常多目標(biāo)檢測分析技術(shù)所具備的信息量大、檢測時間短、所需檢測樣品體積小以及檢測成本相對傳統(tǒng)檢測方法低的特點，而且無論是制備還是使用它均較另外一種多目標(biāo)檢測分析技術(shù)-平面微陣列芯片技術(shù)有著許多突出的優(yōu)勢更大的產(chǎn)量、更靈活的檢測目標(biāo)安排、更快速的反應(yīng)以及更高質(zhì)量的實驗結(jié)果。因此，懸浮陣列芯片的研發(fā)正越來越受到了人們的高度關(guān)注并逐漸在藥物篩選、醫(yī)療衛(wèi)生、食品安全、反恐等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。
懸浮陣列芯片包括三項關(guān)鍵技術(shù)即微載體的制備、微載體的編碼及微載體的解碼與信號讀取。伴隨該領(lǐng)域研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)流式細(xì)胞術(shù)具有技術(shù)成熟，檢測方便快速的特點，且有熒光編碼微載體與之兼容的優(yōu)勢，因此成為目前懸浮陣列芯片中的主導(dǎo)解碼與信號讀取方法，而與之匹配的包括熒光編碼在內(nèi)的光學(xué)編碼方法也成為微載體的最重要的編碼方法。其中具代表性的例子是美國的Luminex公司的雙熒光標(biāo)記微球技術(shù)，借助于兩種熒光染料在10種不同濃度下產(chǎn)生100種編碼的技術(shù)，Luminex公司的雙熒光標(biāo)記微球已經(jīng)成功地獲得了商業(yè)應(yīng)用。目前光學(xué)編碼微載體的制備方法主要是液相合成法，而懸浮陣列芯片微載體的其它常用方法如模板法及石印法則偶有出現(xiàn)。這些制備方法雖然能夠制備出人們所需要的光學(xué)編碼微載體，但是在制備速度、制備質(zhì)量及制備成本上卻還有待改進(jìn)以滿足人們不斷增長的相關(guān)需求。為此本申請首次將包括接觸印刷及非接觸印刷在內(nèi)的印刷技術(shù)引入光學(xué)編碼微載體的制備，以期為懸浮陣列芯片的發(fā)展及應(yīng)用做出貢獻(xiàn)。發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的是提供光學(xué)編碼微載體的印刷制備方法，即以接觸印刷技術(shù)或者非接觸印刷技術(shù)批量制備光學(xué)編碼微載體以期促進(jìn)懸浮陣列芯片的進(jìn)一步發(fā)展和應(yīng)用。
技術(shù)方案為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種光學(xué)編碼微載體的批量制備方法，該方法包括如下步驟a、將光學(xué)編碼材料分散在可固化液態(tài)材料中形成含光學(xué)編碼材料的可固化液態(tài)材料；b、將含光學(xué)編碼材料的可固化液態(tài)材料通過接觸印刷方法或者非接觸印刷方法分配到基底上并固化液態(tài)材料以形成光學(xué)編碼微顆粒；C、從基底上分離收集光學(xué)編碼微顆粒并固定傳感敏感材料而成為光學(xué)編碼微載體； d、重復(fù)步驟a、b、c分別制備不同光學(xué)編碼的微載體。
優(yōu)選的，所述固定傳感敏感材料是指在液態(tài)材料中添加傳感敏感材料并在隨后的微顆粒固化過程中固定在微顆粒上或者在液態(tài)材料中添加傳感敏感材料的模板并在微顆粒固化后去除模板而暴露傳感敏感材料或者在微顆粒固化后連接傳感敏感材料而固定傳感敏感材料。
優(yōu)選的，所述基底滿足可固化液態(tài)材料在基底上的接觸角大于10度，且可固化液態(tài)材料固化后的微顆粒與基底間的界面張力小于微顆粒的表面能及基底的表面能。
優(yōu)選的，步驟a中，所述可固化液態(tài)材料是通過溶劑揮發(fā)溶質(zhì)沉積、液態(tài)材料聚合或者液態(tài)材料凝固而固化。
優(yōu)選的，所述光學(xué)編碼材料為光致發(fā)光材料、光吸收材料及結(jié)構(gòu)色材料中一種或者超過一種的混合物。
優(yōu)選的，步驟b中，所述接觸印刷方法為通過轉(zhuǎn)移媒介將液態(tài)材料在與基底接觸的情況下轉(zhuǎn)移至基底上的方法。
優(yōu)選的，所述非接觸印刷方法為由噴嘴在與基底不接觸的情況下將液態(tài)材料轉(zhuǎn)移至基底上的方法。
有益效果本發(fā)明首次將包括接觸印刷及非接觸印刷在內(nèi)的印刷技術(shù)用于批量制備光學(xué)編碼微載體，由于通過該技術(shù)生產(chǎn)的光學(xué)編碼微載體產(chǎn)量大、成本低從而可以獲得廉價、高效可同步檢測多種生物、化學(xué)物質(zhì)的光學(xué)編碼微載體。具體實施方式

下面將參照附圖
對本發(fā)明進(jìn)行說明。
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
本發(fā)明提供的光學(xué)編碼微載體的批量制備方法，該方法包括如下步驟a、將光學(xué)編碼材料分散在可固化液態(tài)材料中形成含光學(xué)編碼材料的可固化液態(tài)材料；b、將含光學(xué)編碼材料的可固化液態(tài)材料通過接觸印刷方法或者非接觸印刷方法分配到基底上并固化液態(tài)材料以形成光學(xué)編碼微顆粒；C、從基底上分離收集光學(xué)編碼微顆粒并固定傳感敏感材料而成為光學(xué)編碼微載體； d、重復(fù)步驟a、b、c分別制備不同光學(xué)編碼的微載體。
所述固定傳感敏感材料是指在液態(tài)材料中添加傳感敏感材料并在隨后的微顆粒固化過程中固定在微顆粒上或者在液態(tài)材料中添加傳感敏感材料的模板并在微顆粒固化后去除模板而暴露傳感敏感材料或者在微顆粒固化后連接傳感敏感材料而固定傳感敏感材料。
所述基底滿足可固化液態(tài)材料在基底上的接觸角大于10度，且可固化液態(tài)材料固化后的微顆粒與基底間的界面張力小于微顆粒的表面能及基底的表面能。
步驟a中，所述可固化液態(tài)材料是通過溶劑揮發(fā)溶質(zhì)沉積、液態(tài)材料聚合或者液態(tài)材料凝固而固化。
所述光學(xué)編碼材料為光致發(fā)光材料、光吸收材料及結(jié)構(gòu)色材料中一種或者超過一種的混合物。
步驟b中，所述接觸印刷方法為通過轉(zhuǎn)移媒介將液態(tài)材料在與基底接觸的情況下轉(zhuǎn)移至基底上的方法。
所述非接觸印刷方法為由噴嘴在與基底不接觸的情況下將液態(tài)材料轉(zhuǎn)移至基底上的方法。
實施例一先通過愛普生R230噴墨打印機將濃度為20wt%的單分散的尺寸為220納米的交聯(lián)聚甲基丙烯酸甲酯微球含40%的乙二醇的水溶液在投影片基(溶液的接觸角為80度)上打印出間距為500微米尺寸為350微米的點陣列。室溫干燥后在150攝氏度下處理1小時，然后通過去離子水將交聯(lián)聚甲基丙烯酸甲酯構(gòu)建的綠色微顆粒從投影片基上沖洗下來并清洗干燥。將所獲得的綠色交聯(lián)聚甲基丙烯酸甲酯微顆粒先通過氨等離子處理1分鐘后，將其置于1%的戊二醛PB緩沖液室溫反應(yīng)4小時，隨后用PBS緩沖液10分鐘清洗三次。然后用0. 2mg/ml的甲肝抗體的PBS緩沖溶液4攝氏度反應(yīng)12小時。未反應(yīng)的戊二醛用1%的 BSA的PBS緩沖溶液反應(yīng)2小時進(jìn)行阻塞。PBS緩沖液清洗后，以3_4個/10微升的濃度儲存于4攝氏度的PBS緩沖液中，得到能夠檢測甲肝的綠色編碼微載體。通過愛普生R230噴墨打印機重復(fù)制備由250納米單分散交聯(lián)聚甲基丙烯酸甲酯微球構(gòu)建的能夠檢測乙肝的黃色編碼微載體及由300納米單分散交聯(lián)聚甲基丙烯酸甲酯微球構(gòu)建的能夠檢測丙肝的紅色編碼微載體。
檢測前各取10微升的綠色編碼微載體儲存液、黃色編碼微載體的儲存液及紅色編碼微載體的儲存液混合并在37攝氏度與待測樣品在振蕩器中以ISOrpm速度孵育2小時，然后用PBST溶液清洗三次。加入4微克/毫升的CT3標(biāo)記甲肝抗體、乙肝抗體及丙肝抗體PBS緩沖溶液，在37攝氏度以60RPM的速度孵育1小時，隨后用PBS清洗三次。隨后將三種微載體置于載玻片上并首先通過光纖光譜儀對不同微載體讀取顏色以解碼，然后在熒光顯微鏡下觀察不同微載體上的熒光并與光纖光譜儀的解碼結(jié)果對照即可判斷待測樣品中甲肝病毒、乙肝病毒及丙肝病毒的有無。例如，如果綠色編碼微載體上有熒光則待測樣品中有甲肝病毒。
實施例二 先配制含0. 05wt%的油溶黃45L的15 丨％聚苯乙烯(Mn=IOOOOO)的含10%2_甲基吡咯烷酮的甲苯溶液。然后通過佳能iP4760噴墨打印機在PET投影片基通過兩面膠支持的聚丙烯膜上打印出由黃色聚苯乙烯構(gòu)成圓片狀微載體。其中圓片尺寸約為350微米而間隔約 500微米。待薄膜干燥后將薄膜浸入去離子水中并輕微振蕩將聚苯乙烯圓片狀微顆粒從聚丙烯膜上分離，則由黃色編碼聚苯乙烯圓片微顆粒分散在水中。用去離子水徹底清洗后干燥得到由聚苯乙烯構(gòu)成的黃色編碼微顆粒。將將所獲得的黃色編碼聚苯乙烯圓片狀微顆粒先通過氨等離子處理1分鐘后，將其置于1%的戊二醛PB緩沖液室溫反應(yīng)4小時，隨后用 PBS緩沖液10分鐘清洗三次。然后用0. 2mg/ml的甲肝抗體的PBS緩沖溶液4攝氏度反應(yīng) 12小時。未反應(yīng)的戊二醛用1%的BSA的PBS緩沖溶液反應(yīng)2小時進(jìn)行阻塞。PBS緩沖液清洗后，得到能夠檢測甲肝的黃色編碼圓片狀微載體。通過佳能iP4760噴墨打印機重復(fù)制備能夠檢測乙肝的通過添加0. 05wt%的油溶紅35L而構(gòu)建的紅色編碼圓片狀微載體及能夠檢測丙肝的通過添加0. 05wt%的油溶蘭03L而構(gòu)建的蘭色編碼圓片狀微載體。
檢測前各取三個的黃色編碼微載體、紅色編碼微載體及蘭色編碼微載體的儲存液混合并在37攝氏度與待測樣品在振蕩器中以ISOrpm速度孵育2小時，然后用PBST溶液清洗三次。加入4微克/毫升的CY3標(biāo)記甲肝抗體、乙肝抗體及丙肝抗體PBS緩沖溶液，在37 攝氏度以60RPM的速度孵育1小時，隨后用PBS清洗三次。隨后將三種微載體置于載玻片上并首先通過光纖光譜儀對不同微載體讀取顏色以解碼，然后在熒光顯微鏡下觀察不同微載體上的熒光并與光纖光譜儀的解碼結(jié)果對照即可判斷待測樣品中甲肝病毒、乙肝病毒及丙肝病毒的有無。例如，如果紅色編碼微載體上有熒光則待測樣品中有乙肝病毒。
實施例三將濃度為15wt%尺寸為200納米的二氧化硅溶膠含10%乙二醇的水溶液通過點樣儀以 1納升/每點的方式分配至表面氧化硅片上。待溶劑揮發(fā)完后，在500攝氏度處理8小時， 得到由200納米二氧化硅溶膠形成的膠體晶體微顆粒陣列。將該微顆粒陣列用30%雙氧水與70%濃硫酸混合液清洗6小時后，用去離子水清洗并用氮氣干燥。然后將清洗過的微顆粒陣列用1%的氨丙基三乙氧基硅烷乙醇溶液處理4小時。然后1用1%的戊二醛PB緩沖液室溫反應(yīng)4小時，隨后用PBS緩沖液10分鐘清洗三次。然后用0. 2mg/ml的甲肝抗體的PBS 緩沖溶液4攝氏度反應(yīng)12小時。未反應(yīng)的戊二醛用1%的BSA的PBS緩沖溶液反應(yīng)2小時進(jìn)行阻塞。去離子水清洗后，室溫干燥。另外配制由10wt%丙烯酰胺，5襯％甲叉雙丙烯酰胺及l(fā)wt%過硫酸氨的丙烯酰胺預(yù)聚溶液。將丙烯酰胺預(yù)聚溶液以1納升/每點的方式通過點樣儀分配至連接了甲肝抗體的二氧化硅膠體晶體微顆粒上。丙烯酰胺預(yù)聚溶液進(jìn)入二氧化硅膠體晶體的空隙中，然后在四甲基乙二胺飽和的氮氣氣氛下聚合12小時。在丙烯酰胺聚合完成后，將硅片置于1%氫氟酸水溶液中反應(yīng)2小時以去除二氧化硅。將從硅片上分離的聚丙烯酰胺微顆粒在0. IM乙酸水溶液中清洗2小時后，用去離子水清洗3次。則獲得由于具有甲肝抗體印跡而對甲肝抗體敏感的藍(lán)色聚丙烯酰胺微載體。以250納米的二氧化硅溶膠采用上述方法制備對乙肝抗體敏感的黃綠色聚丙烯酰胺微載體。以300納米的二氧化硅溶膠采用上述方法制備對丙肝抗體敏感的紅色聚丙烯酰胺微載體。將三種微載體與待測樣品反應(yīng)后用PBS緩沖液清洗，檢測三種微載體在與待測樣品反應(yīng)前后吸收光譜的變化即可獲悉待測樣品是否含有甲肝抗體、乙肝抗體或者丙肝抗體。例如如果紅色的微載體光譜在與抗原作用前后發(fā)生變化則表明由300納米二氧化硅制備的微載體檢測到了丙肝抗體， 即待檢樣品含有丙肝抗體。
實施例四首先分別獲取CY3及TMR標(biāo)記的膠體金顆粒。然后配制含1%不同配比CY3及TMR標(biāo)記的膠體金、1%聚乙烯醇1750，10%丙烯酰胺和5% N, N-亞甲基雙丙烯酰胺的水溶液，混合均勻后在用前加入1%過硫酸銨(APS)的溶液，備用。然后通過佳能iP4760噴墨打印機在 PET投影片基通過兩面膠支持的三張聚丙烯膜上分別打印出CY3及TMR標(biāo)記膠體金比例為 1 :0，1 :1及0 :1的半球形丙烯酰胺混合液液滴。將打印了丙烯酰胺液滴的三張聚丙烯膜置于濕度大于90%RH的氮氣環(huán)境中聚合8小時。隨后用去離子水分別將三種不同半球形聚丙烯酰胺微顆粒從聚丙烯膜上沖入三個容器中并用去離子水清洗三次。得到三種尺寸約為 350微米的由CY3和/或TMR標(biāo)記的聚丙烯酰胺半球形微顆粒。將三種標(biāo)記的聚丙烯酰胺半球形微顆粒通過戊二醛分別連接甲型肝炎抗體、乙型肝炎抗體及丙型肝炎抗體(這些抗體為傳感敏感材料)即獲得由CY3和/或TMR拉曼編碼的聚丙烯酰胺微載體。分別取少量連接了甲肝抗體、乙肝抗體及丙肝抗體的拉曼編碼聚丙烯酰胺半球形微載體與人的血清樣在37攝氏度混合反應(yīng)池后，用PBS緩沖液清洗，再與CY3熒光標(biāo)記的甲肝抗體、乙肝抗體、 丙肝抗體溶液反應(yīng)Ih并清洗。隨后通過光纖耦合的拉曼光譜儀對三種微載體通過獲取其拉曼光譜而解碼，然后通過分析不同拉曼編碼微載體的熒光即可判斷人體血清樣品中是否含有甲肝病毒、乙肝病毒或者丙肝病毒。
實施例五配制含1%丙烯酰氧基在5’位修飾的核酸探針序列，0. 5%珠光染料及0. 1%偶氮二異丁腈光引發(fā)劑的35wt%的平均分子量為700的聚乙二醇雙丙烯酸酯PBS緩沖溶液。核酸探針序列即傳感敏感材料分別為a :5，_丙烯酰氧基-TTT TGA TGT AGA TGT TTT ATT AGG GTT GT-3，； b :5，-丙烯酰氧基-TAT TGA TGT AGA TGT TTT ATT AGG GTT GT-3，；c :5，-丙烯酰氧基-TCT TGA TGT AGA TGT TTT ATT AGG GTT GT-3’ ； d :5’ -丙烯酰氧基-TGT TGA TGT AGA TGT TTT ATT AGG GTT GT-3’ ；將含有a核酸探針序列的溶液配青色珠光染料通過針式接觸式點樣儀在疏水的投影片基上制備出間距為500微米尺寸約為200微米的青色半球形液滴。在飽和水蒸氣及氮氣的保護(hù)下于16瓦紫外燈的照射反應(yīng)12小時后，用去離子水清洗，獲得能夠檢測核酸序列a青色半球形微載體。重復(fù)制備能夠檢測核酸序列b的橙色半球形微載體、能夠檢測核酸序列c的紫色半球形微載體及能夠檢測核酸序列d的藍(lán)色半球形微載體。從四種微載體中各取三個微載體與0. 2M的氯化鈉及含0. 05%的Tween-20的 Tris-EDTA緩沖液中的生物素連接待測樣品雜交后用PBS緩沖液清洗。隨后將微載體進(jìn)一步與連接有藻紅蛋白的抗生蛋白鏈菌素的PBST緩沖液在37攝氏度混合孵育30分鐘。隨后用PBS清洗。首先在不開啟熒光光源的情況下在熒光顯微鏡下觀察不同微載體的顏色編碼，然后開啟熒光光源觀察不同微載體的熒光即可判斷核酸序列a、b、c及d的有或者無。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施方式，本發(fā)明的保護(hù)范圍并不以上述實施方式為限，但凡本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明所揭示內(nèi)容所作的等效修飾或變化，皆應(yīng)納入權(quán)利要求書中記載的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種光學(xué)編碼微載體的批量制備方法，其特征在于，該方法包括如下步驟 將光學(xué)編碼材料分散在可固化液態(tài)材料中形成含光學(xué)編碼材料的可固化液態(tài)材料； 將含光學(xué)編碼材料的可固化液態(tài)材料通過接觸印刷方法或者非接觸印刷方法分配到基底上并固化液態(tài)材料以形成光學(xué)編碼微顆粒；C、從基底上分離收集光學(xué)編碼微顆粒并固定傳感敏感材料而成為光學(xué)編碼微載體； d、重復(fù)步驟a、b、c分別制備不同光學(xué)編碼的微載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的光學(xué)編碼微載體的批量制備方法，其特征在于，所述固定傳感敏感材料是指，在液態(tài)材料中添加傳感敏感材料并在隨后的微顆粒固化過程中固定在微顆粒上或者在液態(tài)材料中添加傳感敏感材料的模板并在微顆粒固化后去除模板而暴露傳感敏感材料或者在微顆粒固化后連接傳感敏感材料而固定傳感敏感材料。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的光學(xué)編碼微載體的批量制備方法，其特征在于，所述基底滿足可固化液態(tài)材料在基底上的接觸角大于10度，且可固化液態(tài)材料固化后的微顆粒與基底間的界面張力小于微顆粒的表面能及基底的表面能。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的光學(xué)編碼微載體的批量制備方法，其特征在于，步驟a中，所述可固化液態(tài)材料是通過溶劑揮發(fā)溶質(zhì)沉積、液態(tài)材料聚合或者液態(tài)材料凝固而固化。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的光學(xué)編碼微載體的批量制備方法，其特征在于，所述光學(xué)編碼材料為光致發(fā)光材料、光吸收材料及結(jié)構(gòu)色材料中一種或者超過一種的混合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的光學(xué)編碼微載體的批量制備方法，其特征在于，步驟b中，所述接觸印刷方法為通過轉(zhuǎn)移媒介將液態(tài)材料在與基底接觸的情況下轉(zhuǎn)移至基底上的方法。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的光學(xué)編碼微載體的批量制備方法，其特征在于所述非接觸印刷方法為在噴嘴與基底不接觸的情況下將液態(tài)材料轉(zhuǎn)移至基底上的方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種光學(xué)編碼微載體的批量制備方法，其特征在于，該方法包括如下步驟a、將光學(xué)編碼材料分散在可固化液態(tài)材料中形成含光學(xué)編碼材料的可固化液態(tài)材料；b、將含光學(xué)編碼材料的可固化液態(tài)材料通過接觸印刷方法或者非接觸印刷方法分配到基底上并固化液態(tài)材料以形成光學(xué)編碼微顆粒；c、從基底上分離收集光學(xué)編碼微顆粒并固定傳感敏感材料而成為光學(xué)編碼微載體；d、重復(fù)步驟a、b、c分別制備不同光學(xué)編碼的微載體。本發(fā)明通過該技術(shù)生產(chǎn)的光學(xué)編碼微載體產(chǎn)量大、成本低從而可以獲得廉價、高效可同步檢測多種生物、化學(xué)物質(zhì)的光學(xué)編碼微載體。
文檔編號B41M5/382GK102514415SQ2011104080
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月9日
發(fā)明者張繼中 申請人:東南大學(xué)