本發(fā)明涉及一種構(gòu)建植物中pre-miRNA 3’RACE-seq文庫(kù)的方法。
背景技術(shù)：
隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組和降解組的測(cè)序日漸普遍，作為二代測(cè)序技術(shù)的基礎(chǔ)，文庫(kù)的構(gòu)建對(duì)測(cè)序結(jié)果起著決定性作用?，F(xiàn)在市場(chǎng)上已經(jīng)出現(xiàn)了很多種RNA文庫(kù)的構(gòu)建已經(jīng)很成熟，但是在植物中，對(duì)pre-miRNA 3’RACE-seq的文庫(kù)構(gòu)建方法還沒(méi)有報(bào)道。Pre-miRNA作為miRNA的前體，是miRNA加工過(guò)程中的重要中間產(chǎn)物，其3’段修飾對(duì)于成熟miRNA的形成至關(guān)重要，所以探明3’pre-miRNA的核苷酸的變化情況對(duì)于研究miRNA的形成具有重要的生物學(xué)意義。然而，由于植物中pre-miRNA的豐度很低，長(zhǎng)度較長(zhǎng)(100bp-600bp)，且無(wú)ploy(A)結(jié)構(gòu)，現(xiàn)成的建庫(kù)方法都無(wú)法適用于pre-miRNA 3’RACE-seq文庫(kù)的構(gòu)建。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對(duì)上述不足之處，本發(fā)明提供一種構(gòu)建植物中pre-miRNA 3’RACE-seq文庫(kù)的方法，本方法采用SDS-PAGE進(jìn)行RNA的分離，添加3’端接頭，反轉(zhuǎn)錄，成功構(gòu)建了pre-miRNA 3’RACE-seq文庫(kù)。
本發(fā)明所采用的技術(shù)如下：一種構(gòu)建植物中pre-miRNA 3’RACE-seq文庫(kù)的方法，包括如下：
(1)、植物總RNA的提??；
(2)、RNA的準(zhǔn)備：
利用SDS-PAGE對(duì)所提取的植物總RNA進(jìn)行分離，對(duì)50bp-400bp之間的RNA進(jìn)行切膠回收；
(3)、連接：
回收好的RNA的長(zhǎng)度集中在50bp-400bp，通過(guò)連接酶在RNA的3’末端連接一種特殊的DNA接頭，序列如序列表SEQ ID No.1所示；
(4)、反轉(zhuǎn)錄：
利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，對(duì)已經(jīng)加好接頭的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄成cDNA；
(5)、巢式PCR反應(yīng)：
利用5’端的特殊引物，以步驟(4)的反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，進(jìn)行第一輪PCR；PCR產(chǎn)物跑PAGE膠回收后，再利用第二輪引物進(jìn)行第二輪PCR，PCR產(chǎn)物回收后即可送去測(cè)序。
本發(fā)明還具有如下技術(shù)特征：如上步驟(5)所述的第一輪PCR，上引物如序列表SEQ ID No.2-SEQ ID No.79所示，下引物如序列表SEQ ID No.80所示；第二輪PCR，上引物如序列表SEQ ID No.81所示，下引物如序列表SEQ ID No.82所示。
本方法利用pre-miRNA 5’端的特殊引物設(shè)計(jì)，巧妙的解決了以上問(wèn)題，構(gòu)建出了高質(zhì)量的pre-miRNA 3’RACE-seq文庫(kù)。本方法是一種利用SDS-PAGE RNA分離技術(shù)、3’-RACE加接頭技術(shù)和巢式PCR等技術(shù)，通過(guò)5’端的特殊引物設(shè)計(jì)，特異且全面的構(gòu)建3’pre-miRNA文庫(kù)的方法，利用該技術(shù)可通過(guò)二代高通量測(cè)序技術(shù)分析植物中pre-miRNA的3’端在不同的基因突變下的變化情況
附圖說(shuō)明
圖1為本發(fā)明建庫(kù)流程簡(jiǎn)圖。
具體實(shí)施方式
下面根據(jù)說(shuō)明書舉例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步解釋：
實(shí)施例1
如圖1所示，一種構(gòu)建植物中pre-miRNA 3’RACE-seq文庫(kù)的方法，步驟如下
一、植物總RNA的提取
1、取100mg新鮮的植物組織于干凈的1.5mL離心管中。
2、將植物組織在液氮中速凍，用槍頭搗碎。
3、加入1mL TRIZOL上下顛倒混勻，室溫下靜置5min。
4、加入200μL氯仿，顛倒混勻，室溫靜置15min。
5、12000X g離心15min，吸取上清400μL。
6、加入400μL異丙醇，顛倒混勻，-20℃靜置30min淀RNA。
7、4℃，12000X g離心15min，棄上清。
8、加入1mL 75％的乙醇洗滌RNA，4℃，12000X g離心5min。
9、室溫干燥RNA，加入30μL ddH2O溶解RNA。
10、將提取的RNA存放于-80℃保存。
二、RNA的準(zhǔn)備(50-400)
1、配置15％尿素-PAGE膠，共15mL：
將膠倒入夾板，放上梳子，凝膠至少30min。
2、在30μL的總RNA中，加入等量的2×small RNA loading dye，混勻后70℃變性5min，然后立即放在冰上。
2×small RNA loading dye：80％formamide(甲酰胺)；0.1％Xylene FF(二甲苯FF)；0.1％Brophenol Blue(溴酚藍(lán))
3、點(diǎn)樣，并加入10μL 10bp的DNA marker，150V電泳1-1.5h。(Running buffer:0.5×TBE)
4、EB染色5min。
5、切膠，回收50-400bp的膠到1.5mL離心管，并用1mL的槍頭將膠磋碎。
6、加入500μL 0.4N NaCl-DEPC到離心管，并確保膠在翻轉(zhuǎn)離心管的時(shí)候能夠流動(dòng)。
7、4℃保持持離心管翻轉(zhuǎn)6h或者過(guò)夜。
8、4℃，13200r/m離心1min，將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中。重復(fù)2-3次，直到去除所有的膠。
9、加入1μL Glycogen(糖元)，50μL NaOAc和1mL 100％乙醇，混勻后放入-20℃6h或者過(guò)夜。
10、離心并用70％的乙醇洗滌RNA。
11、用20μL DEPC-水溶解RNA，此RNA用來(lái)建庫(kù)。
三、連接
(一)連接
上述連接體系中Linker的序列為：
5′-rAppTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG–NH2-3′；
反應(yīng)條件：
1、25℃反應(yīng)2h。
2、65℃反應(yīng)20min使酶變性。
(二)回收(50bp–420bp)
1、配置15％尿素-PAGE膠。
2、在30μL的總RNA中，加入等量的2×small RNA loading dye，混勻后70℃變性5min，然后立即放在冰上。
3、點(diǎn)樣，并加入10μL 10bp的DNA marker，150V電泳1-1.5h。
4、EB染色5min。
5、切膠，回收50-400bp或者50-250bp的膠到1.5mL離心管，并用1mL槍頭將膠戳碎。
6、加入500μL 0.4N NaCl-DEPC到離心管，并確保膠在翻轉(zhuǎn)離心管的時(shí)候能夠流動(dòng)。
7、4℃保持離心管翻轉(zhuǎn)6h或者過(guò)夜。
8、4℃，13200r/m離心1min，將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中。重復(fù)2-3次，直到去除所有的膠。
9、加入1μL Glycogen(糖元)，50μL NaOAc和1mL 100％乙醇，混勻后放入-20℃6h或者過(guò)夜。
10、離心并用70％的乙醇洗RNA，烘干后溶于20μL DEPC-水，-80℃保存。
四、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
(一)反轉(zhuǎn)錄
1.預(yù)變性
Ligated RNA 12μL
RT Primer 1μL
70℃反應(yīng)10min，迅速放冰上2min。
2、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(20μL體系)
30℃10min，42℃1h，70℃15min變性后，4℃保存。
(二)回收
12％的native polyacrylamide gel回收50-420bp的片段。
制備12％的PAGE膠(共15mL)
1、加入10μL 6×DNA loading dye到PCR產(chǎn)物中，將所有的DNA點(diǎn)入膠孔,同時(shí)點(diǎn)上10μL 10bp DNA marker。
2、進(jìn)行凝膠電泳150V，1.5h。
3、切50-420bp的DNA條帶，用回收小RNA的方法回收DNA。
4、離心，洗滌，干燥。
5、用70％的乙醇洗DNA，烘干后溶于20μL DEPC-水，-80℃保存。
五、巢式PCR反應(yīng)
兩輪PCR反應(yīng)(LA Taq)
(一)第一輪10個(gè)循環(huán)(20μL體系)
引物：
Sense:1st PCR Forward primer(將以下78條引物混合)
PCR反應(yīng)體系：
反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性3min；98℃變性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共10個(gè)循環(huán)；72℃終延伸5min，12℃∞。
(二)回收
12％的native polyacrylamide gel回收50-200bp的片段。
1、制備12％的PAGE膠
2、加入10μL 6×DNA loading dye到PCR產(chǎn)物中，將所有的DNA點(diǎn)入膠孔，同時(shí)點(diǎn)上10μL 10bp DNA marker。
3、進(jìn)行凝膠電泳150V，1.5h；
4、切50-200bp的DNA條帶，用回收小RNA的方法回收DNA；
5、離心，洗滌，干燥；
6、用20-30μL的水溶解DNA。
(三)第二輪PCR(16個(gè)循環(huán))
引物：
Sense:2nd PCR Forward primer：
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA2nd PCR Anti-sense Anti-sense:
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA
PCR體系：(20μL體系)
反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性3min；98℃變性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共16個(gè)循環(huán)；72℃終延伸5min，12℃∞。
(四)回收(12％的native polyacrylamide gel回收100-300bp的片段)
1、制備12％的PAGE膠
2、加入10μL 6×DNA loading dye到PCR產(chǎn)物中，將所有的DNA點(diǎn)入膠孔，同時(shí)點(diǎn)上10μL 10bp DNA marker
3、進(jìn)行凝膠電泳150V，1.5h。
4、切100-300bp的DNA條帶，用回收小RNA的方法回收DNA。
5、離心，洗滌，干燥。
6、用20-30μL的水溶解DNA，用以測(cè)序。
＜110＞深圳大學(xué)
＜120＞一種構(gòu)建植物中pre-miRNA 3’RACE-seq文庫(kù)的方法
＜160＞ 82
＜210＞ 1
＜211＞21
＜212＞DNA
＜213＞Linker
＜400＞ 1
TGGAATTCTC GGGTGCCAAG G
＜210＞ 2
＜211＞38
＜212＞DNA
＜213＞miR156a
＜400＞ 2
GAGTTCTACA GTCCGACGAT CCACAAAGGC AATTTGCA
＜210＞ 3
＜211＞44
＜212＞DNA
＜213＞miR156b
＜400＞ 3
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCGTCT ATAACTTTGC GTGT
＜210＞ 4
＜211＞43
＜212＞DNA
＜213＞miR156c
＜400＞ 4
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCGGCA CTTTGCATGT TCG
＜210＞ 5
＜211＞47
＜212＞DNA
＜213＞miR156d
＜400＞ 5
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCGGAA GTTGTATAAA AGTTTTG
＜210＞ 6
＜211＞43
＜212＞DNA
＜213＞miR156e
＜400＞ 6
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCCATG GTGGTTTCTT GCA
＜210＞ 7
＜211＞43
＜212＞DNA
＜213＞miR156f
＜400＞ 7
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCATGG TGGCTTTCTT GCA
＜210＞8
＜211＞43
＜212＞DNA
＜213＞miR156h
＜400＞8
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCGCAC AACCTGGGAT TAG
＜210＞ 9
＜211＞49
＜212＞DNA
＜213＞miR157a
＜400＞ 9
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCAGAT GATGAGATAC AATTCGGAG
＜210＞ 10
＜211＞49
＜212＞DNA
＜213＞miR157b
＜400＞ 10
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCCAGA TGATAAGATA CAATTCCTC
＜210＞ 11
＜211＞43
＜212＞DNA
＜213＞miR157c
＜400＞ 11
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCCTCT ACTCTTTTGT GCT
＜210＞ 12
＜211＞49
＜212＞DNA
＜213＞miR157d
＜400＞ 12
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCAAGA GCTAGAAGAC TATCTGCAT
＜210＞ 13
＜211＞49
＜212＞DNA
＜213＞miR158a
＜400＞ 13
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCCTTC TTTGTCTACA ATTTTGGAA
＜210＞ 14
＜211＞43
＜212＞DNA
＜213＞miR158b
＜400＞ 14
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCTTGG AAAAGGTGAT GAT
＜210＞ 15
＜211＞45
＜212＞DNA
＜213＞miR159b
＜400＞ 15
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCAGCT TTCACTTACC CCTTT
＜210＞ 16
＜211＞43
＜212＞DNA
＜213＞miR160a
＜400＞ 16
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCGCCT GGCTCCCTGT ATG
＜210＞ 17
＜211＞43
＜212＞DNA
＜213＞miR160b
＜400＞ 17
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCTGCC TGGCTCCCTG TAT
＜210＞ 18
＜211＞43
＜212＞DNA
＜213＞miR160c
＜400＞ 18
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCCCTG GCTCCCTGTA TGC
＜210＞ 19
＜211＞48
＜212＞DNA
＜213＞miR162a
＜400＞ 19
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCAATG TAAAAGCATG AATAGATC
＜210＞ 20
＜211＞43
＜212＞DNA
＜213＞miR162b
＜400＞ 20
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCTGGA GGCAGCGGTT CAT
＜210＞21
＜211＞43
＜212＞DNA
＜213＞miR163
＜400＞21
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCAGAG CACGGTCGAA GAA
＜210＞22
＜211＞47
＜212＞DNA
＜213＞miR164a
＜400＞22
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCCAAA CCAACAAACA CGAAATC
＜210＞23
＜211＞43
＜212＞DNA
＜213＞miR164b
＜400＞23
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCATGC GGAATTTTGT GAT
＜210＞24
＜211＞43
＜212＞DNA
＜213＞miR164c
＜400＞24
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCTGGA GAAGCAGGGC ACG
＜210＞25
＜211＞43
＜212＞DNA
＜213＞miR165a
＜400＞25
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCGTTG TCTGGATCGA GGA
＜210＞26
＜211＞43
＜212＞DNA
＜213＞miR165b
＜400＞26
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCGCCA CATGGTATCG TCG
＜210＞27
＜211＞46
＜212＞DNA
＜213＞miR166a
＜400＞27
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCTCTA ACAATCGAAT TGAACC
＜210＞28
＜211＞43
＜212＞DNA
＜213＞miR166b
＜400＞28
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCCTGG CTCGAGGACT CTT
＜210＞29
＜211＞44
＜212＞DNA
＜213＞miR166e
＜400＞29
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCCTCT TCTTTATTCA TTAG
＜210＞30
＜211＞43
＜212＞DNA
＜213＞miR166f
＜400＞30
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCGAAT GATGCCTGGC TCG
＜210＞31
＜211＞43
＜212＞DNA
＜213＞miR166g
＜400＞31
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCTGGC TCGAGGTCAT GGA
＜210＞32
＜211＞45
＜212＞DNA
＜213＞miR167a
＜400＞32
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCCTTT CTTTATCCTT TGTTG
＜210＞33
＜211＞46
＜212＞DNA
＜213＞miR167c
＜400＞33
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCATAT TTCTTGTTCT TACAAG
＜210＞34
＜211＞45
＜212＞DNA
＜213＞miR168a
＜400＞34
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCTTGG TTTGTGAGCA GGGAT
＜210＞35
＜211＞43
＜212＞DNA
＜213＞miR168b
＜400＞35
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCTTGG CTGACACCGA CAC
＜210＞36
＜211＞44
＜212＞DNA
＜213＞miR169a
＜400＞36
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCTTCC GTATAAAATA CAAG
＜210＞37
＜211＞49
＜212＞DNA
＜213＞miR169d
＜400＞37
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCACAA ATCTTAACTG ATTTTGGTG
＜210＞38
＜211＞47
＜212＞DNA
＜213＞miR169f
＜400＞38
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCTTCA CAATCTGTTG ATTCGTG
＜210＞39
＜211＞45
＜212＞DNA
＜213＞miR169h
＜400＞39
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCGGTT GGTCGTCAGG CAGTC
＜210＞40
＜211＞43
＜212＞DNA
＜213＞miR169i
＜400＞40
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCATGA CCATTTTGCT TAT
＜210＞41
＜211＞45
＜212＞DNA
＜213＞miR169j
＜400＞41
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCTGTT GAATCTTGCG GGTTA
＜210＞42
＜211＞43
＜212＞DNA
＜213＞miR169k
＜400＞42
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCAATA GACATCAGGC AGT
＜210＞43
＜211＞47
＜212＞DNA
＜213＞miR169m
＜400＞43
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCCTCA TCAAAAGACA TCAGGCA
＜210＞44
＜211＞45
＜212＞DNA
＜213＞miR169n
＜400＞44
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCTGTT GAATCTTGCG GGTTA
＜210＞45
＜211＞43
＜212＞DNA
＜213＞miR170
＜400＞45
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCTGGC CTGGTTCACT CAG
＜210＞46
＜211＞49
＜212＞DNA
＜213＞miR171a
＜400＞46
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCGTTC ACTCAGATCT TACCTGACC
＜210＞47
＜211＞46
＜212＞DNA
＜213＞miR171b
＜400＞47
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCGGTT CAATCAAATA GTCGTC
＜210＞48
＜211＞43
＜212＞DNA
＜213＞miR171c
＜400＞48
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCGGTG CGGTTCAATC AGA
＜210＞49
＜211＞43
＜212＞DNA
＜213＞miR172a
＜400＞49
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCATGG ACGGTGGTGA TTC
＜210＞50
＜211＞47
＜212＞DNA
＜213＞miR172b
＜400＞50
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCACAT GGAAATTGAT AAATACC
＜210＞51
＜211＞43
＜212＞DNA
＜213＞miR172d
＜400＞51
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCGGGT TTTCTTTTGA GCC
＜210＞52
＜211＞43
＜212＞DNA
＜213＞miR172e
＜400＞52
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCGTTC CCTTTGCTTT CGC
＜210＞53
＜211＞43
＜212＞DNA
＜213＞miR173
＜400＞53
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCTACT TTCGCTTGCA GAG
＜210＞54
＜211＞47
＜212＞DNA
＜213＞miR319b
＜400＞54
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCAAAT GAATGAATGA TGCGAGA
＜210＞55
＜211＞43
＜212＞DNA
＜213＞miR390a
＜400＞55
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCCGCC ATGATGATCA CAT
＜210＞56
＜211＞43
＜212＞DNA
＜213＞miR390b
＜400＞56
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCTGGC TCACCAGTGC TGT
＜210＞57
＜211＞43
＜212＞DNA
＜213＞miR391
＜400＞57
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCAGTG GTGACGGTAT CTC
＜210＞58
＜211＞43
＜212＞DNA
＜213＞miR393a
＜400＞58
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCTTGG CAAATAAATC ACA
＜210＞59
＜211＞43
＜212＞DNA
＜213＞miR393b
＜400＞59
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCTCAA TCGAAAGATG GAA
＜210＞60
＜211＞43
＜212＞DNA
＜213＞miR394a
＜400＞60
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCGCAT TCTGTCCACC TCC
＜210＞61
＜211＞49
＜212＞DNA
＜213＞miR394b
＜400＞61
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCAATA AGTGTACGTA TCTACGGTG
＜210＞62
＜211＞44
＜212＞DNA
＜213＞miR396a
＜400＞62
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCCTTA CGCATAAAAT AGTG
＜210＞63
＜211＞46
＜212＞DNA
＜213＞miR396b
＜400＞63
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCTCTT AAACAAAAGT AAGAAG
＜210＞64
＜211＞43
＜212＞DNA
＜213＞miR398a
＜400＞64
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCGGAG TGGCATGTGA ACA
＜210＞65
＜211＞43
＜212＞DNA
＜213＞miR398b
＜400＞65
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCACGG CTGTAATGAC GCT
＜210＞66
＜211＞44
＜212＞DNA
＜213＞miR398c
＜400＞66
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCCGAG CAATCAACGG CTAT
＜210＞67
＜211＞43
＜212＞DNA
＜213＞miR399c
＜400＞67
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCGCAG GCGACTTGGC TAT
＜210＞68
＜211＞44
＜212＞DNA
＜213＞miR400
＜400＞68
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCTCAC TACATTTGGT AAGC
＜210＞69
＜211＞43
＜212＞DNA
＜213＞miR403
＜400＞69
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCATTC AACAGGCTTT ATG
＜210＞70
＜211＞43
＜212＞DNA
＜213＞miR408
＜400＞70
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCCCTC TTCCCTGGCT CCC
＜210＞71
＜211＞43
＜212＞DNA
＜213＞miR5663
＜400＞71
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCGGAT TTGCATTCTC ATG
＜210＞72
＜211＞43
＜212＞DNA
＜213＞miR822
＜400＞72
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCAATG CTTTCTACAG GAA
＜210＞73
＜211＞43
＜212＞DNA
＜213＞miR824
＜400＞73
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCTTGG GGAGTGGGGA GAT
＜210＞74
＜211＞49
＜212＞DNA
＜213＞miR837
＜400＞74
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCTACA CTCATAATCT TGAAACGAA
＜210＞75
＜211＞43
＜212＞DNA
＜213＞miR840
＜400＞75
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCAATC CGCACGATGA TCT
＜210＞76
＜211＞45
＜212＞DNA
＜213＞miR844
＜400＞76
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCCTTC TACGCATTGG GCTTA
＜210＞77
＜211＞49
＜212＞DNA
＜213＞miR846
＜400＞77
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCTAGT TTTGAATTGA AGTGCTTGA
＜210＞78
＜211＞45
＜212＞DNA
＜213＞miR851
＜400＞78
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCTGAA AACAATCATC ACGAG
＜210＞79
＜211＞48
＜212＞DNA
＜213＞miR864
＜400＞79
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCAAAT ACCTTGAAAC TATAAACC
＜210＞80
＜211＞22
＜212＞DNA
＜213＞Anti-sense
＜400＞80
GCCTTGGCAC CCGAGAATTC CA
＜210＞81
＜211＞50
＜212＞DNA
＜213＞2nd PCR Forward primer
＜400＞81
AATGATACGG CGACCACCGA GATCTACACG TTCAGAGTTC TACAGTCCGA
＜210＞82
＜211＞63
＜212＞DNA
＜213＞2nd PCR Anti-sense
＜400＞82
CAAGCAGAAG ACGGCATACG AGATCGTGAT GTGACTGGAG TTCCTTGGCA CCCGAGAATT 60
CCA 63